quadrante. Os papilomas ductais centrais localizados no ducto terminal são geralmente únicos e as lesões periféricas localizadas em ductos lobulares

Transcrição

1 1 INTRODUÇÃO A avaliação dos métodos de diagnóstico das lesões benignas mamárias é alvo de muitos estudos relacionados ao risco de desenvolvimento do carcinoma mamário, assim como as dificuldades do diagnóstico diferencial com neoplasias malignas 1. As lesões mamárias benignas são atualmente divididas em duas grandes categorias: as lesões não proliferativas e as proliferativas. Consideram-se como proliferativas todas as lesões com proliferação celular não carcinomatosa. As lesões proliferativas são subsequentemente dividas em lesões sem atipias e com atipias, sendo que estas podem representar até 5% dos diagnósticos das lesões benignas mamárias. As lesões não proliferativas são aquelas com baixo índice de proliferação celular 1. A importância do estudo destas lesões está no aumento do risco relativo para o desenvolvimento do carcinoma da mama, que varia de um e meio a duas vezes no caso das lesões proliferativas sem atipias, até quatro a cinco vezes em se tratando de lesões proliferativas com atipias 1. As lesões proliferativas são diagnosticadas pela identificação do aumento moderado a acentuado da multiplicação celular, em especial ao longo dos ductos mamários 1. De acordo com critérios de Dupont e Page 2 são lesões proliferativas sem atipias: a hiperplasia ductal sem atipias (moderada e acentuada), o papiloma ou papilomatose sem atipias, a adenose esclerosante, o fibroadenoma com alterações complexas e a cicatriz radial. No grupo das lesões proliferativas com atipias encontram-se a hiperplasia ductal atípica, a hiperplasia lobular atípica e a papilomatose com atipias. Dentre estas lesões mamárias proliferativas, o papiloma e a papilomatose são neoplasias benignas do epitélio ductal da mama, sendo que a avaliação morfológica destas lesões continua a ser uma das mais desafiadoras áreas da patologia mamária 3. Estas lesões localizam-se, mais frequentemente, na parte central da mama, nos ductos lactíferos, mas também podem ocorrer perifericamente em qualquer

2 2 quadrante. Os papilomas ductais centrais localizados no ducto terminal são geralmente únicos e as lesões periféricas localizadas em ductos lobulares terminais, na maioria das vezes múltiplas 3. Apresentam baixa incidência e acometem mulheres em qualquer idade, sendo os papilomas solitários mais comuns na sexta década de vida e os papilomas múltiplos na idade entre 40 e 55 anos 3. Clinicamente é observada em 72% das pacientes descarga mamilar uniductal sanguinolenta ou serosa límpida. As lesões papilares podem ser encontradas em qualquer quadrante da mama, mas são mais comuns as de localização central (86% dos casos), associadas ou não com massas ao redor ou sob a aréola 2. A secreção mamilar sanguinolenta é determinada pelas alterações degenerativas do papiloma ou pela presença do carcinoma papilífero 3. Muitas lesões periféricas são assintomáticas e detectadas apenas em exames de imagem rotineiros 3. Os papilomas solitários e centrais não apresentam risco aumentado de desenvolvimento do câncer mamário. Em contrapartida, os papilomas múltiplos têm uma associação com carcinoma ductal in situ e com aumento de risco para o surgimento de carcinoma invasor 4. As lesões papilares podem representar desde um papiloma mamário, um carcinoma papilar in situ e até um carcinoma papilífero, que embora raro (menos de 1% dos carcinomas mamários e mais encontrados em mulheres idosas), deve ser considerado no diagnóstico diferencial 4. Macroscopicamente os papilomas estão localizados em uma dilatação cística que pode conter líquido claro, sanguinolento ou sangue coagulado. Apresentam-se como um nódulo mural único, saliente na luz e na cor marrom, quando examinado a fresco. Os papilomas podem ser múltiplos ocasionalmente, separados entre si ou agrupados, friáveis e podendo obliterar toda a luz da cavidade cística. A cápsula do cisto é formada pela parede do ducto e, em geral, há alterações reativas 3. O papiloma é formado por numerosas estruturas papilares, cada uma contendo um eixo vascular no estroma, revestido por células epiteliais cúbicas ou cilíndricas e por células mioepitealiais. Projeções papilares podem se anastomosar entre si, formando espaços pseudotubulares de diversas formas, com dimensões uniformes e aspecto regular. Os núcleos são normocrômicos com nucléolos pouco

3 3 evidentes. As mitoses são raras e a lesão papilar é sempre acompanhada por células mioepiteliais 3,4. Muitas vezes as células mioepitelias são de difícil reconhecimento, havendo necessidade de técnica de imunoistoquímica (IHQ) para marcação de proteínas que as identificam, tais como a actina, a calponina, a miosina de cadeia pesada, o CD10, o p63 e a CK5/6 3. No carcinoma in situ a estrutura papilar é mantida e o eixo fibrovascular é recoberto, ao menos em parte, por células mioepiteliais, podendo ou não estar associada à hiperplasia epitelial. No carcinoma papilífero observa-se a estrutura papilar, polimorfismo nuclear e aumento do número de mitoses. A aparência citológica é variada e não se observam células mioepiteliais 4. A lesão papilar é raramente detectada pela mamografia, devido às suas pequenas dimensões e isodensidade radiológica com relação ao parênquima mamário 5. Na ultrassonografia, embora infrequente, é possível identificá-la como área nodular vegetante ou como uma área localizada de dilatação ductal 6. A ductogalactografia (mamografia realizada após injeção de contraste radiopaco no ducto que apresenta o derrame) é observada como uma falha de enchimento arredondada ou como um ponto de parada do meio de contraste. Neste caso é frequente o diagnóstico de neoplasia maligna 5. A avaliação citológica da descarga mamilar pode sugerir um quadro de papiloma, mas a sensibilidade para o diagnóstico de carcinoma é baixa 5. O diagnóstico citopatológico, transoperatório e histopatológico das lesões papilares mamárias continua sendo um dos maiores desafios da patologia mamária, pois o aspecto papilar pode ser observado diversos tipos de lesões mamárias benignas e malignas 7. A dificuldade no diagnóstico diferencial entre as lesões papilares benignas e malignas, decorrente da baixa acurácia dos exames cito-histopatológicos percutâneos e transoperatórios, reflete-se no tratamento clínico-cirúrgico destas lesões. Devido a esta dificuldade diagnóstica lesões benignas de pequeno volume são submetidas ao tratamento cirúrgico sem necessidade, embora apenas 17% destas lesões apresentem-se como carcinoma papílifero intraductal (in situ) ou invasor, 8-10.

4 4 Mesmo sendo um método consagrado para o diagnóstico das lesões mamárias, a biópsia aspirativa por agulha fina (BAAF) apresenta limitações para o diagnóstico diferencial entre o papiloma intraductal e o carcinoma papilífero 11. Alterações celulares degenerativas, tais como as decorrentes do infarto das lesões papilares, podem ocasionar hipercromasia nuclear e pleomorfismo celular, que aumentam o risco para os diagnósticos falso positivos. Assim, para melhorar a sensibilidade e a especificidade do diagnóstico das lesões mamárias papilares, há necessidade de se complementar o exame citopatológico com outros métodos morfológicos 3. O exame anatomopatológico transoperatório por congelação possibilita o diagnóstico do papiloma intraductal, mas a dificuldade para o preparo adequado do material e a dificuldade para se identificar focos de carcinoma, fazem com que haja preferência pelo estudo de material processado em parafina 3. Um dos métodos complementares que pode ser de grande auxílio no diagnóstico diferencial é a imunocitoquímica (ICQ), que utiliza anticorpos específicos para identificar antígenos celulares e tissulares por meio de uma reação antígenoanticorpo, revelada por cromógenos e que pode ser observada por microscópio ótico 12.

5 5 1.1 OBJETIVOS 1. Analisar o perfil clínico e diagnóstico anatomopatológico de casos identificados como lesão papilar em banco de dados de citopatologia mamária. 2. Avaliar o desempenho da imunocitoquímica, utilizando os marcadores Ki67 e p63 em material de biópsia aspirativa por agulha fina para o diagnóstico diferencial de lesões papilares mamárias.

6 6 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 TUMOR PAPILAR DA MAMA Os tumores papilares da mama foram classificados inicialmente, em 1905, por Warren que em seu artigo propunha uma nova classificação dos tumores benignos da mama 13. Anteriormente ao artigo, as lesões papilares mamárias eram consideradas malignas e tratadas por meio de cirurgia radical. Este foi o primeiro estudo que sugeriu a necessidade da multidisciplinaridade na abordagem das doenças da mama e nele foi enfatizada a importância da cooperação entre cirurgiões e patologistas 14. Warren classificava os papilomas como lesões benignas (cistadenoma papilar) e indicava como tratamento padrão a ressecção da lesão em substituição à mastectomia. Em 1951, Haagensen et al 15 revisaram 367 pacientes com lesões papilares intraductais benignas das mamas. O estudo determinou as características clínicas e anatomopatológicas como são bem conhecidas atualmente 3. Os critérios para distinguir os papilomas do carcinoma papilar foram propostos por Kraus e Neubecker, em , e esta classificação, com pequenas modificações, é utilizada até hoje 14. As lesões papilares das mamas são um grupo heterogêneo de lesões que se caracterizam pela grande dificuldade do diagnóstico diferencial entre benignidade ou malignidade 17. Embora seja uma doença relativamente rara, as lesões papilares têm apresentado uma maior incidência nos últimos 10 anos. Rizzo observou uma incidência de 8,1%, o que é comparativamente superior à incidência de 2% observada em publicações mais antigas 18. A característica comum a todos os tumores papilares é a formação do arranjo papilar, demonstrado como proliferação epitelial arborescente apoiada sobre um eixo fibrovascular com ou sem a presença de células mioepiteliais 19. A correta

7 7 caracterização da lesão papilar é necessária para determinar o curso do tratamento a ser realizado 14. São consideradas lesões papilares da mama o papiloma intraductal, papilomatose, papiloma atípico, os carcinomas associados a papiloma e o carcinoma ductal com ou sem invasão 19. Lesões atípicas sem características infiltrativas são melhores classificadas como neoplasia ductal intra-epitelial 19. A distinção entre estes subtipos não é uma tarefa fácil, além de se encontrar diferentes terminologias 20. Quando se utilizam os critérios clínicos dividem-se os papilomas em centrais e periféricos. Os papilomas ductais centrais localizados em ducto terminal são geralmente únicos e as lesões periféricas, localizadas em ductos lobulares terminais, na maioria das vezes são múltiplas A maior incidência de malignidade é encontrada nas lesões periféricas quando comparada com as lesões retro-areolares ou as da porção central da mama Apresentação Clínica As lesões papilares da mama apresentam baixa incidência e acometem mulheres em qualquer idade, sendo os papilomas solitários mais comuns na sexta década de vida e os papilomas múltiplos na idade entre os 40 e os 55 anos 3,19. Clinicamente é observada, em 72% dos casos, descarga mamilar uniductal sanguinolenta ou serosa límpida, sendo mais comum nas lesões centrais (86%) do que nas lesões periféricas (29%). Em alguns casos pode-se palpar uma massa ao redor ou sob a aréola, mas também em qualquer setor da mama 3. Dilatações ductais retro-areolares podem ser identificadas pela mamografia e pela ultrassonografia mamária 19. As lesões de pequeno diâmetro e muitas lesões periféricas são assintomáticas e detectadas apenas em exames de imagem realizados como medida preventiva Diagnóstico por Imagem O encontro da lesão papilar mamária por método de imagem pode ser realizado em exames de rotina, na investigação de massa palpável ou de descarga

8 8 papilar uniductal. Quando visíveis, em mamografia, as lesões únicas são geralmente redondas ou ovais, bem definidas e com densidade semelhante à de um cisto simples. Já, a papilomatose múltipla apresenta aspecto de massa nodular ou microcalficações agrupadas 14,20. Quando observada pela ultrassonografia mamária visualiza-se área nodular bem delimitada, no interior de um cisto unicameral ou dentro de um ducto dilatado. Os papilomas múltiplos podem ser identificados dentro de um sistema ductal dilatado. Papilomas intracísticos ou intraductais apresentam um pedículo vascularizado que ocasionalmente pode ser identificado ao estudo pelo doppler colorido 14,20. À mamografia e ultrassonografia, a maioria das lesões papilares é classificada pelo Breast Image Reporting and Data System (BI-RADS) na categoria Outra consideração envolvendo análise dos resultados mamográficos e ultrassonográficos é a ausência de diferenciação na aparência das lesões papilares benignas daquelas malignas, quando utilizados estes métodos de diagnóstico 21. Galactografia é o método de escolha para identificar as lesões papilares localizadas próximo ao mamilo e que apresentem descarga papilar espontânea. Contraste iodado é infundido no ducto produtor da descarga e o papiloma sólido apresenta-se como uma falha de enchimento ou uma interrupção abrupta do ducto dilatado. Papilomas múltiplos determinam várias áreas com falhas de enchimento 13. Um novo método, a ductoscopia, abre uma nova possibilidade na investigação desta doença, possibilitando a avaliação do sistema ductal com a realização de lavado direcionado ou intervenção terapêutica 20. A ressonância magnética (RM) da mama é um método altamente sensível para a detecção de papilomas intraductais, principalmente em mulheres jovens e com mamas densas, embora na injeção de contraste o realce da borda da lesão possa imitar o carcinoma invasivo 20. Nos casos de carcinoma in situ micropapilar, que se apresenta apenas como distorção do parênquima nos demais exames de imagem, a RM das mamas auxilia na análise da extensão da lesão para determinar se a cirurgia conservadora pode ser indicada 13. A RM é uma ferramenta útil para definir a extensão pré-operatória da lesão e para excluir a multifocalidade, cuja presença influencia no planejamento cirúrgico 22.

9 9 Embora o auxílio dos métodos de imagem seja grande, não são suficientemente sensíveis ou específicos para diferenciar as lesões benignas das malignas nos tumores papilares 21, Biópsia Pré-operatória e Transoperatória As técnicas empregadas para o diagnóstico pré-operatório das lesões papilares são as mesmas para qualquer tipo de apresentação clínica: a BAAF, a biopsia por agulha grossa (core biopsy) com ou sem uso de dispositivo para aspiração a vácuo. A técnica utilizada varia de acordo com cada serviço e está associada à experiência adquirida com o método empregado 13. A classificação precisa das lesões papilares mamárias, baseada na citologia, continua a ser um desafio. De particular importância é a diferenciação entre lesões benignas e malignas, para as quais vários autores descrevem técnicas que buscam auxiliar nesta determinação. Entretanto, é ainda grande a discordância entre diagnósticos citológicos e os diagnósticos efetuados com o estudo anatomopatológico de peça cirúrgica 19. Embora alguns autores sugiram que a ausência de atipias no espécime de core biopsy dos papilomas de mama possibilita o acompanhamento sem a necessidade da remoção cirúrgica, uma estrita correlação clínica e radiológica (mamografia e ultrassonografia) é necessária para o correto diagnóstico. A experiência do serviço é fundamental para a segurança e a acurácia do diagnóstico 13,19. O exame anatomopatológico transoperatório por congelação possibilita a detecção do papiloma intraductal, mas apresenta limitações técnicas, fazendo com que haja preferência pelo estudo em tecido fixado em formol e processado em parafina 3. Mesmo no encontro de sinais histopatológicos de carcinoma papilífero, principalmente na apresentação intracística, o diagnóstico pode ser suspeitado, mas não definitivo 24.

10 Macroscopia O papiloma solitário é geralmente bosselado, macio e friável, cinza avermelhado a fresco, localizado dentro de cisto formado por ducto dilatado com líquido seroso ou hemorrágico, por vezes ocupando toda a cavidade, sendo envolvido pela parede do ducto onde foi formado. Varia em tamanho, desde menor que um centímetro até dois a três centímetros quando localizado nos ductos lactíferos 3. Papilomas múltiplos podem estender-se através de ductos dilatados formando massas maiores que dois centímetros. As lesões benignas e malignas não podem ser diferenciadas macroscopicamente, embora as maiores sejam mais sugestivas de malignidade Microscopia A estrutura básica microscópica de um papiloma consiste em um eixo de estroma fibrovascular, que é revestido por uma camada de células epiteliais e mioepiteliais. As células epiteliais são colunares ou cubóides e com pouco pleomorfismo e hipercromasia nucleares e baixa atividade mitótica 3,14,19-20,24-5. O estroma papilar pode surgir de um ou de múltiplos focos da parede do ducto, e alguns papilomas desenvolvem estrutura mais complexa com crescimento excessivo do estroma e hiperplasia do epitélio ductal, o que pode ocasionar fusão dos eixos papilares que nos casos mais acentuados determina formação do papiloma intraductal sólido, onde todo o espaço entre os eixos fibrovasculares é preenchido pelo epitélio ductal proliferado 3,14,19-20,24-5. O epitélio do papiloma intraductal contém camada de células mioepiteliais, que são alongadas com núcleo achatado ao longo da membrana basal. Frequentemente não são visíveis à microscopia convencional, necessitando estudo IHQ para a sua adequada identificação. Estão ausentes no carcinoma papilífero, mas nos casos em que há esclerose intensa a detecção pode estar prejudicada. A ausência das células mioepiteliais não permite o diagnóstico conclusivo de malignidade na lesão papilar 3,14,19-20,24-5.

11 11 A colagenização do estroma fibrovascular ocorre em alguns papilomas. Se a colagenização é acompanhada pela proliferação de miofibroblastos, estes podem tornar-se distorcidos e o aspecto morfológico pode ser de carcinoma na periferia da lesão. Quando a esclerose do estroma é muito intensa a estrutura do papiloma é eliminada e a lesão residual torna-se cicatricial com escassos elementos glandulares, tornando muito difícil a diferenciação com fibroadenomas 3,14,19-20,24-5. As lesões papilares malignas acometem mulheres após os 60 anos e representam cerca de dois por cento dos casos de câncer mamário 15. Embora a presença de células mioepiteliais seja utilizada como critério para o diagnóstico diferencial entre carcinoma invasivo e carcinoma in situ, estudos imunoistoquímicos revelaram que alguns carcinomas in situ podem não conter tais células 20. O quadro 1 mostra de forma didática as diferenças entre as lesões no estudo por microscopia ótica 14. Quadro 1 Características histopatológicas do papiloma e carcinoma papilífero CARACT. HISTOPATOLÓGICA PAPILOMA CARCINOMA PAPILÍFERO Nº de tipos celulares Dois tipos Um tipo Núcleo Normocromático Hipercromático Metaplasia apócrina Presente Ausente Padrão glandular Complexo Cribiforme Tecido conetivo do estroma Proeminente Delicado ou ausente Ductos adjacentes Hiperplasia intraductal Carcinoma intraductal Adenose esclerosante Às vezes presente Geralmente ausente Modificado de Ibarra AJ. Papillary lesions of the breast. The Breast Journal. 2006; 12(3): Implicações Clínicas Os métodos consagrados para o diagnóstico das lesões papilares mamárias são a histopatologia, utilizando-se cortes corados com hematoxilina-eosina (HE) e mais recentemente os métodos IHQs 19. Ao analisar uma série de casos com tumores papilares benignos, de malignidade incerta ou malignos, Kil et al não observaram alterações significativas quanto aos sintomas clínicos e a idade das pacientes 10.

12 12 A presença, a ausência e a distribuição das células mioepiteliais é um dos recursos mais úteis para distinguir entre os vários tipos de tumor papilar da mama. Sua presença pode ser de difícil detecção com a coloração HE, sendo necessária a realização de técnica IHQ com a utilização de marcadores específicos para estas células, tais como a actina de músculo liso, calponina, miosina de cadeia pesada, p63 entre outros 7,26-8. O algoritmo representado no quadro 2 demonstra a abordagem a ser programada para as lesões papilares baseada na avaliação das células mioepiteliais nestes tumores. Quadro 2 - Algoritmo da abordagem a ser programada para as lesões papilares baseada na avaliação das células mioepiteliais Lesão Papilar presença de célula mioepitelial Sim Não Linha de núcleos de células mioepiteliais em toda a lesão Papiloma intraductal benigno Ausência de células mioepiteliais em áreas com proliferação epitelial Atipiaarquitetural ou atipiacitológica de baixo grau com proliferação epitelial Atipiacitológica de alto grau Apenas células epiteliais neoplásicas Não Sim Carcinoma papilar intracístico Papiloma intraductal benigno com hiperplasia epitelial usual <3 mm > 3 mm Hiperplasia ductalatípica dentro papiloma Carcinoma ductal in situdentro papiloma (Modificado de Mulligan AM, O Malley FP. Papillary lesions of the breast, a review. Adv Anatol Pathol. 2007; 14:108-19) Outro fator considerado é a ausência de metaplasia apócrina nas lesões papilares benignas, mas este detalhe anatomopatológico não é consenso entre os patologistas 29. Persiste acentuada divergência entre os autores sobre o manejo cirúrgico dos casos com diagnóstico pré-operatório de lesão papilar, seja em biópsia por agulha grossa ou BAAF. Mesmo com incidência que varia entre 0 a 36% de lesões malignas ou pré-malignas encontradas nas lesões papilares com diagnóstico pré-operatório

13 13 por punção, a maioria dos estudos sugere realizar a exerese da mesma para estudo histológico de todo o material 7,8,18-20,30-4. A excisão cirúrgica dos papilomas mamários é recomendada por Sakr et al baseado nos dados encontrados em seu material, que demonstra incidência de 8% de malignidade nas lesões com diagnóstico pré-operatório de benignidade em biopsia por agulha grossa. A presença de microcalcificações e a idade maior que 50 anos foram os fatores independentes relacionados com o risco de malignidade nas lesões papilares mamárias 34. Em estudo de Zografos et al, mesmo quando utilizaram biópsia por agulha grossa com aspiração à vácuo (mamotomia) foi encontrada taxa de substimação diagnóstica de 3,6%, embora tenha sido utilizada apenas a análise por microscopia ótica convencional. Os casos que apresentaram uma lesão maligna na análise da peça estavam todos associados a outras lesões proliferativas como hiperplasia ductal atípica, neoplasia lobular ou cicatriz radial. Os papilomas puros obtiveram concordância total entre a biópsia pré-operatória e o estudo anatomopatológico da peça cirúrgica 35. Mesmo enfatizando que não existe consenso e que mais estudos são necessários para comprovar a segurança do método proposto, Kil et al sugerem que lesões papilares centrais com até 1,5 cm e com biópsia por agulha grossa negativa para malignidade e com ausência de atipias possam ser apenas acompanhadas. Quando quaisquer destes parâmetros sejam discordantes a ressecção torna-se obrigatória 10. Em análise baseada na revisão de 21 biópsias por agulha grossa com diagnóstico de lesão papilar, onde comparam com o resultado definitivo do exame anatomopatológico do material fixado em parafina, Carder et al concluíram que seus resultados confirmaram a exatidão da biópsia por agulha grossa nas lesões papilares e que as lesões B3 (lesões de potencial maligno incerto na classificação do National Coordinating Committee for Breast Screening Pathology) não precisam ser necessariamente removidas 36. Em estudo que avaliava a biópsia por agulha grossa e a mamotomia nas lesões papilares mamárias, Ashkenazi et al recomendavam que aqueles casos que não apresentem atipias possam ser apenas acompanhados, sem a necessidade da exerese da lesão, desde que alguns cuidados sejam tomados: o material

14 14 anatomopatológico deve ser analisado por mais de um patologista com experiência em patologia do tecido mamário, os exames de imagem devem ser concordantes com o resultado do exame anatomopatológico, os pacientes devem concordar com um controle clínico rigoroso e por métodos de imagem repetidos por um período de dois a três anos e estarem cientes que não existe uma recomendação definitiva para a abordagem das lesões papilares 37. Quando se analisou publicação sobre a abordagem das lesões papilares mamárias em trabalho de Jung et al, realizado com avaliação pré-operatória por agulha grossa foi observado risco de 6,3% da lesão diagnosticada como benigna, mostrou-se como maligna no material excisado em cirurgia. Os fatores mais significativos desta discordância diagnóstica foram a presença de nódulo palpável ao exame clínico e a observação de uma massa à mamografia. Sugeriram que em pacientes de baixo risco a ressecção não seja realizada, embora devam ser seguidas cuidadosamente BIÓPSIA ASPIRATIVA POR AGULHA FINA (BAAF) NAS LESÕES PAPILARES DA MAMA A primeira publicação sobre a BAAF foi apresentada por Martin e Ellis, em 1930, que relatavam suas experiências no Memorial Sloan-Kettering Cancer Center de Nova Iorque 39. Foi, posteriormente, difundida na Escandinávia por Stewart onde a técnica foi aceita e realizada em especial pelos citopatologistas 40. Nos Estados Unidos, houve muita relutância para a aceitação do método. De um lado, os patologistas, inseguros em emitir diagnóstico baseado apenas na aparência das células isoladas e do outro, os cirurgiões, apreensivos pelo risco do resultado falso-positivo 41. Na Europa o ritmo de desenvolvimento da BAAF foi mantido, especialmente na Suécia. Entre 1967 e 1974, Zajicek e Franzen publicaram os resultados de seus cuidadosos e abrangentes estudos, compartilhando mundialmente suas experiências 42. Com as mudanças na economia médica nos Estados Unidos, resultando em aumento dos métodos de controle para a redução dos custos, incentivou-se a BAAF

15 15 como método diagnóstico para os tumores mamários. Além disso, estudos prospectivos demonstraram que o trauma local, determinado pela biopsia percutânea não aumentava o risco de metástase e não alterava a sobrevida das pacientes submetidas à BAAF 41. Em 1977, Bolmgren et al desenvolveram a técnica da biópsia estereotáxica para as lesões não palpáveis de mama com a utilização de agulha para a coleta de material. No mesmo ano, estudo de Nordenstrom e Zajicek comprovou que esta técnica tem a mesma acurácia da biópsia excisional 41. A biópsia aspirativa por agulha fina (BAAF) tem sido bem documentada há algumas décadas como um procedimento diagnóstico efetivo na avaliação das lesões mamárias, apresentando alta sensibilidade e especificidade para a detecção do carcinoma mamário 11-12,43, embora seja criticada, quando em comparação com a biópsia de agulha grossa, pela incapacidade de diagnosticar lesões específicas, como papilomas, no espectro das lesões proliferativas da mama 38. A mesma dificuldade é encontrada na diferenciação entre o fibroadenoma e o carcinoma de baixo grau 43. A BAAF pode, mais frequentemente, apresentar material insuficiente para análise e devido a este fato dificultar o estudo por imunomarcadores (citohistoquímicos) 44. O exato diagnóstico das lesões papilares na BAAF torna-se um desafio pela superposição das características citológicas benignas e as proliferações epiteliais As lesões papilares das mamas compreendem um grupo variado de proliferações epiteliais, que incluem hiperplasia epitelial ductal com componente de alteração microcística, papilomas solitários ou múltiplos (papilomatose), carcinoma in situ (micropapilar, sólido ou papilar intracístico) e até o carcinoma invasor (papilar puro ou como componente de carcinoma ductal) 49. O manejo das lesões papilares mamárias identificadas em diagnóstico préoperatório permanece controverso 47. A BAAF e a biópsia com agulha grossa apresentam armadilhas e a necessidade de remoção cirúrgica de todas as lesões papilares deve ser revista 23. A presença e a quantidade de células mioepiteliais, núcleos bipolares nus em segundo plano e alterações na arquitetura da célula ductal foram, de acordo com

16 16 Tse et al, as únicas características citológicas uteis e consistentes na distinção das lesões mamárias com padrão papilar no material coletado através de BAAF 48. Os esfregaços obtidos pela BAAF das lesões papilares apresentam alta celularidade, com grupamentos grandes constituídos pela mistura de tecido, estroma e células ductais e outros fragmentos menores, com proeminência de células mioepiteliais e núcleos nus bipolares, e algumas células isoladas 45. A presença de áreas estreladas e fragmentos de tecido com aspecto reticular sugerem lesão papilar, já a presença de estruturas tubulares está mais relacionada com outras alterações proliferativas não papilares 49. Revisando 23 casos de papilomas e 11 casos de carcinoma papilar no diagnóstico histológico, que haviam sido avaliados com BAAF no pré-operatório, Gomes-Aracil et al observaram erro significativo na análise comparativa entre os dois exames, com características que se sobrepõem. A presença de atipias celulares e fragmentos com papilas longas e delgadas, com bordas ramificadas, sugeriram carcinoma papilar 50. Em estudo prospectivo Field e Mark, avaliando BAAF nas lesões papilares, observaram que fragmentos de tecido com conformação estrelada e em malha associados a fragmentos papilares de tecido apresentavam um elevado valor preditivo positivo para papiloma mamário ( ) 45. Em análise retrospectiva de BAAFs utilizadas no diagnóstico pré-operatório e com diagnóstico anatomopatológico, Gomes-Aracil et al observaram vários fatores que caracterizaram diferenças entre o papiloma mamário e o carcinoma papilífero, desde o aspecto do esfregaço (hemorrágico no caso do carcinoma e seroso nos papilomas) e principalmente das características morfológicas ao estudo citológico do material. Concluíram que em muitos casos a diferenciação entre lesões benignas e malignas é possível baseada apenas no diagnóstico citológico da BAAF, mas se houver qualquer dúvida a biópsia cirúrgica deve ser realizada 50. Dawson e Multford reavaliaram 29 casos de lesões papilares com diagnóstico pré-operatório por BAAF e observaram que os casos com maior celularidade e grande número de células isoladas favoreciam o diagnóstico de carcinoma papilífero. Hiperplasia e estratificação nuclear, algumas características das células de fundo (como por exemplo, a ausência de metaplasia apócrina) ajudaram no diagnóstico diferencial 51.

17 17 O Instituto Nacional do Câncer dos Estados Unidos da América (NCI) ao elaborar as diretrizes para a BAAF mamária colocou as lesões papilares da mama na categoria indeterminada, devido aos critérios de diferenciação citológica entre lesões benignas e malignas não estarem bem estabelecidos 47. Em estudo prospectivo, Valdes et al demonstraram perda significativa na determinação de malignidade nas biopsias pré-operatórias com diagnóstico de lesão papilar quando usado biópsia estereotaxica (12%), biópsia com agulha grossa guiada por ultrassonografia (35%) ou BAAF guiada por ultrassonografia (30%) e baseado nestes dados sugeriram a obrigatoriedade da exerese cirúrgica das lesões papilares diagnosticadas por punção-biópsia, mesmo na ausência de atipias no material 31. Gendler et al avaliaram casos de punção-biópsia utilizando BAAF ou biópsia com agulha grossa, guiados por ultrassonografia ou estereotaxia com diagnóstico de lesão papilar e observaram a presença de 36% de hiperplasia ductal atípica nos diagnósticos. Considerando estas observações, sugeriram a ressecção cirúrgica de todas as lesões papilares com diagnóstico em biópsias percutâneas 52. Ao avaliarem comparativamente, em estudo retrospectivo, BAAF com biópsia com agulha grossa, Masood et al não encontraram alterações significativas no diagnóstico das lesões papilares 53. Observação que é corroborada por Gendler et al 52. Cheng et al, em estudo retrospectivo observaram maior acurácia na biópsia por agulha grossa em comparação com a BAAF no diagnóstico pré-operatório das lesões papilares mamárias 54. Em outro estudo retrospectivo, Sohn et al observaram uma inaceitável taxa de malignidade no estudo anatomopatológico das lesões papilares mamárias extirpadas, quando a punção-biópsia realizada apresentava atipias. Sugeriram que seja usada biópsia por agulha grossa no lugar da BAAF para reduzir os erros de amostragem no material. Nos diagnósticos de lesões papilares mamárias benignas (ausência de atipias) em biópsia por agulha grossa associadas à mamografia padrão BI-RADS 3 indicaram realizar vigilância com mamografia seriada. Indicações para exerese cirúrgica devem incluir casos de discordância radiológica (mamografia, ultrassonografia ou ressonância magnética), preferência do cirurgião ou da paciente, e associação com outros fatores de risco para neoplasia maligna mamária 55.

18 18 Estudo publicado por Cheng et al apresentou mudança diagnóstica, de benigno para maligno, em 9,21% das lesões papilares estudadas por biópsia com agulha grossa e BAAF. Os fatores mais significativos observados nestes casos foram a idade maior do que 45 anos e a presença de atipias celulares. Já o tamanho e o número das lesões não apresentaram significância. Ao discutirem os dados encontrados consideraram prudente a ressecção cirúrgica das lesões papilares benignas da mama identificadas no diagnóstico pré-operatório 54. Em estudo semelhante, Jayaram et al observaram que 49,2% das lesões papilares se mostraram malignas na histologia, e sugeriram a excisão urgente destas IMUNOCITOQUÍMICA (ICQ) DAS LESÕES PAPILARES DA MAMA A ICQ e a IHQ são métodos de análise molecular, que utilizando-se da reação antígeno-anticorpo, procuram identificar marcadores específicos de cada célula ou tecido, observáveis ao microscópio óptico 11. A primeira técnica de ICQ foi introduzida por Coons et al em 1942 e compreendia a conjugação de um anticorpo com um corante fluorescente. O primeiro composto a ser utilizado foi o isocianato de fluoresceína, sendo substituído posteriormente por isotiocianato de fluoresceína e por outros de maior facilidade de conjugação, como as enzimas peroxidase, fosfatase alcalina e glicose oxidase 57. Esta técnica consiste em um conjunto de reações específicas, baseada na interação antígeno com anticorpo, que ao final do processo conferem cor ou eletrodensidade à estrutura em estudo. Esta metodologia permite a conjugação de um marcador a um anticorpo, como exemplo proteína ou composto sintético, sem causar dano à ligação estabelecida entre o antígeno e o anticorpo, possibilitando a observação microscópica dos locais ocupados pelos anticorpos e consequentemente pelo antígeno, seja em um componente normal ou patológico 12. Este método é utilizado como adjuvante nos estudos de morfologia e na elucidação da natureza bioquímica complexa de uma variedade de doenças infecciosas e neoplásicas. Por auxiliar na identificação da origem anatômica e ou embriológica das células por meio da localização de marcadores intracelulares específicos, é especialmente utilizado nas neoplasias indiferenciadas auxiliando a

19 19 aumentar as possibilidades de diagnóstico na determinação no sítio primário do tumor 58. A interpretação das reações dos imunomarcadores nos esfregaços para estudo citológico é mais difícil do que no material fixado em parafina. A razão para esta dificuldade é que o citoplasma das células arrancadas de seu estroma é frequentemente frágil e difusamente disperso no fundo do esfregaço. Além disso, a presença de sangue, soro ou produtos de secreção e outros resíduos, dificultam a identificação de células coradas positivamente 51. O tipo de fixação dos esfregaços citológicos interfere na coloração ICQ. A recuperação antigênica não é possível em material fixado ao ar, como os utilizados na coloração de Giemsa, principalmente na identificação da proteína Ki67. Esfregaços citológicos fixados em álcool, utilizados quando a técnica é a de Papanicolau, permite o processamento adequado para a coloração ICQ 59. Bozzetti et al, com o intuito de melhorar a aplicabilidade da ICQ em esfregaços decorrentes de BAAF dos tumores mamários, sugeriram que as agulhas utilizadas na punção continham em seu interior material celular suficiente para ser utilizado na ICQ, o que melhorou a acurácia do método na BAAF. O estudo concluiu que é possível realizar avaliação de fatores prognósticos em material de BAAF, mas não comparou com os resultados do exame feito sobre o esfregaço já fixado em lâmina 11. Wong et al demonstraram em estudo realizado em 135 casos de lesões mamárias, que a ICQ aplicada em esfregaços de BAAF auxilia no diagnóstico diferencial entre lesões malignas e benignas, principalmente nos carcinomas de baixo grau 60. Entre os marcadores ICQs, um dos utilizados como fator prognóstico é o Ki67, que se expressa em células proliferativas nas fases G 1 tardia, S, G 2 e M, mas não na fase G 0 do ciclo celular. Pode também ser utilizado para diferenciar tumores malignos de tumores benignos 61. A expressão do Ki67 em tecido normal ou lesões benignas é baixa (< 1,5-2%) 62. Utilizado no diagnóstico diferencial de várias lesões proliferativas da linhagem linfóide como hiperplasia folicular, linfoma folicular, linfoma de Burkitt e de Hodgkin. Também pode ser aplicado como fator prognóstico em linfomas não Hodgkin, gliomas, sarcomas de partes moles e mama (neste caso seu emprego como fator prognóstico é controverso) 61.

20 20 Em uma avaliação que comparou BAAF e estudo histológico para o carcinoma primário da mama, Sianesi et al obteviveram concordância de 93,3% para o Ki67, o que demonstrou a aplicabilidade desta imunorreação no material de BAAF 63. Para o diagnóstico diferencial das lesões papilares (entre lesão benigna e maligna) utiliza-se o p63 que no tecido normal da mama apresenta imunorreatividade para células basais e co-expressão como marcador de células mioepiteliais, presentes no papiloma mamário, mas não no carcinoma papilar 13. O p63 é um marcador do núcleo da célula mioepitelial e raramente marca o núcleo da célula epitelial da lesão papilar, não apresentando reação cruzada com a célula do estroma. Por estas razões é o marcador de escolha para detecção de células mioepiteliais 3. Ainda em avaliação das neoplasias mamárias é aplicado na diferenciação de carcinoma ductal in situ e lobular in situ 14. Outras aplicações podem ser realizadas em carcinoma de próstata, linfoma não Hodgkin, melanoma e gliombastoma 61. Preocupados com a reprodutibilidade dos resultados, e, portanto com a confiabilidade dos exames de ICQ, Confortini et al analisaram resultados de pesquisa de receptores hormonais e do Ki67 realizados em material de BAAF de mama dos arquivos do Centro de Centro de Estudos e Prevenção de Câncer em Florença, revisando-os em seis outros centros italianos. Observaram que não houve discordância com relação aos receptores hormonais, mas grande discrepância com o Ki67 foi encontrada 64. Os motivos da baixa concordância entre os exames de ICQ na determinação do antígeno Ki67 estariam relacionados a resultados falsos positivos na coloração do citoplasma durante o processo de fixação e coloração, presença acentuada de células de gordura e eritrócitos, coloração heterogênea do núcleo, a procura de campos microscópicos que tenham apenas as células malignas e a não utilização de critérios pré-definidos 64. Segundo Confortini et al, para melhorar a qualidade do exame ICQ e aumentar a concordância do diagnóstico entre os laboratórios é necessário a padronização dos métodos, estabelecer pontos de corte comuns para os resultados positivos e negativos, promover intercâmbio entre os laboratórios como controle de

21 21 qualidade dos exames, implementar o uso de sistema computadorizado de análise das imagens 64. Na confirmação diagnóstica das lesões papilares o uso de imunomarcadores auxilia tanto nas biópsias percutâneas (BAAF e biópsia por agulha grossa) como no estudo anatomopatológico das peças cirúrgicas 65. Nos estudos que utilizaram a IHQ como critérios diagnósticos e na distinção entre benignidade ou malignidade das lesões papilares, sejam no diagnóstico préoperatório como no anatomopatológico da peça cirúrgica, podem ser utilizados diferentes marcadores celulares de superfície. Os mais usados foram CD44, CD10, p63, actina de músculo liso, citoqueratinas CK5 e CK6, sempre buscando a identificação da presença de células mioepiteliais 7,9,13,19-20,24,28,37. Para definir fatores prognósticos, Bozzetti et al utilzaram exclusivamente ICQ nas BAAF realizadas nas lesões mamárias. Foram realizados dois marcadores, qual sejam o Ki67 com ponto de corte 8,4% e p53 com ponto de corte 1% das células analisadas. Os resultados foram satisfatórios, mas a sua aplicabilidade no diagnóstico pré-operatório não foi avaliada 43. Leal et al, em estudo sobre carcinoma ductal intracístico (CDI), analisaram a determinação de Ki67 em BAAF e também no material incluído em parafina, avaliaram a positividade deste marcador no CDI isolado que foi de 8,8% (3,7 a 22,1%), no CDI associado a carcinoma ductal in situ de 9,8% (3,6 a 16,7%) e CDI associado a carcinoma invasor de 11,2% (3,0 a 18%). Não observaram diferença significativa na análise dos dados 66. Para melhorar o diagnóstico citológico nas BAAFs das lesões papilares, considerada por muitos como zona cinzenta, Midulla et al realizaram estudo retrospectivo de 37 casos com resultados citológicos incertos e com diagnóstico firmado com a histologia. Utilizaram estudo ICQ com Ki67 e bcl-2, encontraram resultados altamente significativos (p<0,001) para positividade nos casos malignos com o Ki67. Com bcl-2 não foi observada nenhuma associação 67. Ao revisar biópsias percutâneas com diagnóstico de lesões papilares em três centros de patologia e submeter o material a avaliação com estudo IHQ (painel utilizando p63, calponina e citoqueratina 5-6 (CK 5-6)), Douglas-Jones et al observaram uma melhora altamente significativa na acurácia do diagnóstico préoperatório, de 44% na avaliação convencional corada pela hematoxilina-eosina, para

22 22 91% no exame com IHQ, ao se comparar com o diagnóstico definitivo do material removido cirurgicamente 65. Em estudo IHQ de material de biópsias percutânea com agulha grossa, Shah et al utilizaram CK 5-6, calponina e p63. Embora não tenham definido os critérios adotados para a positividade destes imunomarcadores, a análise dos dados demonstrou que a associação da microscopia ótica convencional e a IHQ foi capaz de aumentar o valor preditivo positivo, o valor preditivo negativo, a especificidade, a sensibilidade e acuracidade do diagnóstico. Embora não houvesse no estudo análise estatística que avaliasse a significância do método empregado, os autores concluíram que lesões papilares mamárias com biópsia percutânea sem sinais de atipias histológicas (associadas ao painel de IHQ) e sem sinais suspeitos ao estudo radiológico não requerem excisão cirúrgica, apenas controle 68. Ao avaliarem material submetido a processamento em parafina cujo diagnóstico era de lesão papilar, Troxell et al reafirmaram a dificuldade na diferenciação das lesões papilares benignas e malignas, mesmo no exame da peça cirúrgica, e propuseram teste com IHQ utilizando actina de músculo liso (que identifica presença de actina nas células e, portanto não exclusiva de células mioepiteliais), painel de marcadores de células mioepiteliais (caponina, p63 e P- cadherina) e CD44 (marca componentes epiteliais e mioepiteliais das lesões papilares). Consideraram positivos os exames com expressão 1+. Concluíram que a associação de caponina com p63 são mais efetivos para auxiliar nos casos onde encontra-se dificuldade no distinguir a presença de malignidade nas lesões papilares 69. Hill et al avaliaram, em estudo, a presença de células mioepiteliais em biópsias por agulha grossa em lesões papilares com IHQ, utilizando o p63, calponina e miosina de músculo liso, no diagnóstico diferencial entre lesões benignas e malignas. Observaram alta sensibilidade e especificidade na determinação das células mioepiteliais com a marcação pelo p63, sem reação cruzada com miofibroblastos ou músculo liso da parede vascular. Apesar desta capacidade de determinação da célula mioepitelial, os autores não recomendaram a sua utilização na forma isolada devido a apresentar uma coloração nuclear muito descontínua, sugeriram a sua associação com calponina ou miosina de músculo liso. A diferenciação entre carcinoma in situ e invasor não foi recomendada pelos autores

23 23 em material de punção biópsia, devido à amostragem do material não conter adequadamente as margens da lesão 26. Propondo um novo painel de IHQ, Moritani et al associaram três grupos de imunomarcadores para diferenciar carcinoma intraductal papilífero de papiloma intraductal com hiperplasia ductal, em material fixado em parafina. Na composição do painel foram utilizados marcadores de células mioepiteliais (p63, calponina e CD10), marcadores neuroendócrinos (cromogranina A e sinaptofisina) e citoqueratinas de alto peso molecular (CK 34βE-12). Concluíram os autores que apresentam alta probabilidade de malignidade quando dois dos seguintes critérios estiverem presentes: ausência de células mioepiteliais (<10% de positividade), citoqueratina de alto peso molecular negativa (<10%), marcadores neuroendócrinos positivos (>10%) 27. Em revisão realizada por Moriya et al, sobre avanços em IHQ, os autores reafirmaram que a utilização dos marcadores de células mioepiteliais (p63, calponina, miosina, CD10, actina de músculo liso) não são suficientes quando utilizados de maneira isolada na diferenciação das lesões papilares benignas e malignas 70, afirmação corroborada por Schenka et al 71. A utilização de citoqueratinas (CK 5-6 e CK 34βE12) foi bastante seletiva na avaliação das lesões papilares e na hiperplasia ductal atípica 70. Quando avaliaram lesões papilares com diagnóstico pré-operatório realizado com biopsia de agulha grossa e compararam com resultado de exame anatomopatológico, Tse et al utilizaram três marcadores IHQs (receptores de estrógeno, citoqueratina 14 e p63) conseguindo reduzir de 79% para 30% a discordância entre os exames. Observaram, entretanto que os falsos positivos e os falsos negativos não foram totalmente eliminados 72. Estudo prospectivo realizado por Harton et al com obtenção de BAAF de lesões papilares no que foi avaliada a expressão do p63 e comparada com o estudo do material ressecado e fixado em parafina. Analisaram a imunorreação citoquímica separadamente nas células agrupadas (clusters) e nas células isoladas obtendo os mesmos resultados dentro do mesmo material. Concluíram no artigo que as lesões malignas e benignas apresentam uma significativa diferença na coloração do p63 nas lâminas de BAAF. Também afirmaram que o uso da ICQ com p63 quando aplicada nas BAAFs, nas quais o diagnóstico não pode ser conclusivo quando

24 24 baseado apenas na morfologia, aumenta a especificidade e os valores preditivos positivos e negativos 43. No futuro, o desenvolvimento de novos marcadores específicos para descarga ou lavado mamilar, podem aumentar a detecção das lesões papilares mamárias malignas antes da cirurgia 54.

25 25 3 MÉTODO Projeto de pesquisa avaliado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, protocolo CEP 5372 e aprovado através do parecer número /09 de 04 de novembro de Estudo retrospectivo com análise de casos de BAAF, coletados entre janeiro de 2003 e setembro de 2009 no banco de citopatologia mamária do laboratório de Patologia Médica em Ponta Grossa (PR), com levantamento de 32 casos de lesões papilares da mama com diagnóstico através de Biópsia aspirativa por agulha fina (BAAF). Material e diagnósticos revisados no mesmo laboratório, validados 14 casos como amostra da pesquisa. Dados e história clínica, exame físico e exames complementares levantados dos prontuários dos pacientes. Para a análise e classificação dos exames de mamografia e ultrassonografia mamária foram utilizados os critérios do sistema Breast Image Reporting and Data System (BI-RADS) do Colégio Americano de Radiologia, versão Realizado estudo imunocitoquímico (ICQ) do material contido nas lâminas de BAAF utilizando o marcador para célula mioepitelial p63 43 (marca DAKO Clone 4A4) e o índice proliferativo Ki67 11 (marca DAKO Clone MIB-1). Exame (coloração) realizado no laboratório referência de Anatomia Patológica do Hospital A. C. Camargo, São Paulo - SP. Interpretação das lâminas e emissão do diagnóstico ICQ realizados no laboratório Patologia Médica, Ponta Grossa - PR. Foram revisadas as lâminas dos exames anatomopatológicos dos casos removidos cirurgicamente referentes às BAAF (com recorte dos blocos quando necessário), estudadas em microscópio óptico Olympus modelo BX41 no laboratório Patologia Médica em Ponta Grossa - PR. Foram critérios de inclusão, BAAF com diagnóstico pré-operatório de lesão papilar, realizadas entre janeiro de 2003 e setembro de 2009, e cujas pacientes tenham sido submetidas à ressecção cirúrgica com análise histológica do material. Foram critérios de exclusão pacientes cujas lâminas de BAAF tenham sido coradas apenas pelo método de Giemsa 60, os casos que todas as lâminas de BAAF

26 26 tenham sido consideradas insatisfatórias na revisão pelo patologista do laboratório de anatomia patológica e os casos em que houve descolamento do material fixado da lâmina no processo de coloração da ICQ. Realizou-se a coleta do material da BAAF à mão livre nos casos de nódulos palpáveis ou guiada por ultrassonografia nas lesões nodulares impalpáveis. Utilizouse agulha hipodérmica descartável 25 x 7 mm (22 gauge) ou 40 x 8 mm (21 gauge) acoplada a seringa descartável de 20 ml e como dispositivo auxiliar para realização da aspiração usou-se a pistola de Cameco 42,74. O esfregaço do material aspirado foi realizado em número variável de lâminas, com mínimo de seis, e o material fixado em álcool 70-90% ou secos ao ar 42,74. Para a análise ICQ foram utilizadas apenas os materiais fixados no álcool, sendo os secas ao ar (coradas pelo método de Giemsa) excluídos do estudo 59. Descrição da técnica de coloração por imunocitoquímica empregada 75 : a) hidratação das lâminas em água corrente; b) bloqueio da peroxidase endógena: banho por cinco minutos em Peróxido de hidrogênio/metanol (50% Peróxido de Hidrogênio 10 volumes, 50% metanol); c) lavagem em solução salina tamponada (PBS); d) bloqueio de proteínas: 20 minutos com Bloqueador de Proteínas (DAKO); e) incubação do anticorpo primário por duas horas à temperatura ambiente (Ta) em câmara úmida; f) lavagem em PBS; g) incubação com anticorpo secundário (Advance HRP Link -DAKO) por 30 minutos (Ta); h) lavagem em PBS; i) incubação com polímero ( Advance HRP enzyme- DAKO) por 30 minutos(ta); j) lavagem em PBS; k) revelação da reação com cromógeno diaminobenzidine (DAB) por cinco minutos (Kit Liquid DAB+ Substrate Chromogen System; DakoCytomation, Carpinteria, California); l) lavagem em água corrente;