Instruções de uso. Dengue Vírus IgM Capture DxSelect EL1500M. Somente para diagnóstico in vitro

Transcrição

1 Instruções de uso Somente para diagnóstico in vitro Dengue Vírus IgM Capture DxSelect EL1500M 96 / 480 testes UTILIZAÇÃO O Dengue Vírus IgM CaptureDxSelect da Focus Diagnostics é um teste qualitativo para a detecção de anticorpos IgM anti-vírus da dengue (DV) no soro humano e pode ser utilizado no apoio ao diagnóstico da infecção aguda da dengue em humanos. RESUMO E EXPLICAÇÃO DO TESTE A dengue (DF) é uma doença viral auto-limitada aguda que se caracteriza por febre, cefaléia, dores no corpo, erupção cutânea, linfoadenopatia e prostração. Na sua forma mais grave, a febre hemorrágica da dengue, os pacientes infectados apresentam febre grave e insuficiência renal, levando à síndrome do choque da dengue, muitas vezes fatal (DSS). 1 Estima-se que cerca de 2 bilhões de pessoas ao redor do mundo correm o risco de contrair dengue DF, e que mais de 1 milhão de pessoas por ano são infectadas. 2 Adicionalmente, centenas de milhares de casos de DSS, fazem da dengue a doença por arbovírus mais importante no mundo. 2 O vírus da dengue (DV) é um flavivírus e está estreitamente relacionado ao vírus da febre amarela, encefalite japonesa e outras Arboviroses do grupo B. Os membros deste grupo possuem RNA de fita simples cercado por um nucleocapsídeo icosaédrico coberto por um envelope lipídico de 10 nm de profundidade. 3 Existem 4 sorotipos de dengue sorologicamente distintos. A infecção por uma cepa não protege o hospedeiro contra a infecção pelas outras. De fato, um estudo sugere que a dengue hemorrágica e DSS ocorrem mais comumente em indivíduos que tenham sido infectados anteriormente por outra cepa. 4 A presença de anticorpos circulantes anti o vírus da dengue, não neutralizantes, de reação cruzada pode atuar como um fator de reforço imunológico contra a infecção. No entanto, os anticorpos de reação cruzada não neutralizantes, contra outros flavivírus, que não sejam o da dengue, não estão associados a um reforço imunológico contra a infecção. 4 Epidemias de dengue vem ocorrendo regularmente em todo o mundo. As maiores epidemias ocorreram no sul dos Estados Unidos (1922 afetando mais de 1 milhão de pessoas), Austrália (1925 e 1942), Grécia (1927) e Japão ( ) 2 CDC oficiais e peruanos relataram um surto importante de dengue que ocorreu entre março e julho de Essa epidemia ocorreu em torno de Iquitos, envolvendo vírus da dengue dos tipos 1 4 e foi a primeira confirmação por laboratório da transmissão de dengue em indígenas no Peru. 5 O vírus da dengue pode ser transmitido onde forem encontrados os vetores: os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. O A. aegypti está localizado principalmente nas Américas tropical e subtropical e é originário da parte sul dos Estados Unidos. 2 O principal vetor para a dengue na Ásia é A. albopictus. Este mosquito recentemente estabeleceu-se nos Estados Unidos, tanto ao Norte como na região central de Illinois. No entanto, a transmissão não tem sido associada a este fato até o presente. 2 Na maioria dos pacientes, casos suspeitos de DF são mais rapidamente diagnosticados por métodos sorológicos. Tradicionalmente foram utilizadas inibição por hemoaglutinação e neutralização de redução de placa. 3 No entanto testes de captura de IgM ELISA tornaram-se o método de escolha. Na maioria dos indivíduos a resposta de IgM para dengue é específica, e persiste por 90 dias. 6 Anticorpos IgG para o vírus da dengue foram detectados em pacientes 60 anos após a infecção. 7 Portanto, uma única determinação de anticorpos não deve ser considerada conclusiva. O teste IgG ELISA é útil como uma ferramenta epidemiológica quando utilizada para estabelecer a soroprevalência. Esta informação também pode ser útil em estudos destinados a determinar o desempenho do reforço imunológico no choque da dengue. Como para a maioria dos flavivírus, IgG apresenta alta reatividade cruzada entre os demais membros do grupo flavivírus. O Dengue Vírus IgM CaptureDxSelect da Focus Diagnostics é um teste destinado à detecção de anticorpos IgM anti-dengue dos tipos 1-4 no soro humano. Este teste é específico para IgM e usa um conjugado peroxidase/monoclonal flavivírus e TMB como substrato. Cada cavidade é revestida com IgM de captura anti-humana. A solução de antígeno contém proporções iguais de vírus da dengue do tipo 1 a 4 inativados. Foram utilizadas as seguintes cepas de vírus: Tipo 1: TH-Sman; Tipo 2: TH-36, Tipo 3: H87 e Tipo 4: H241. PRINCÍPIO DO TESTE As microcavidades de poliestireno do Dengue Virus IgM CaptureDxSelect são revestidas com anticorpo específico anti-igm humana(cadeia pt). As amostras diluídas de soro e controles são incubadas nas cavidades e IgM presente na amostra liga-se ao anticorpo específico anti-igm humana. Reagentes inespecíficos são removidos por lavagem. Adiciona-se o antígeno do vírus da dengue (DV) às cavidades, que são incubadas, e, se IgM anti-dv estiver presente na amostra, ocorre a ligação antígeno DV com IgM anti-dv. O antígeno não ligado DV é removido por lavagem; adiciona-se o conjugado/peroxidase anti-dv e incuba-se. Se o antígeno DV for retido pelo anti-dv na amostra, o conjugado se liga ao antígeno DV nas cavidades. O excesso de conjugado é removido por lavagem. Enzima e substrato cromógeno são adicionados e a cor se desenvolve. Depois de adicionar o reagente de bloqueio, a mudança de cor resultante é quantificada pela leitura espectrofotométrica das densidades ópticas das amostras, que é diretamente proporcional à quantidade de antígeno/igm específica presente na amostra. As DOs são comparadas com as leituras do cut off para determinar os resultados PROCEDIMENTO DE FUNDO DO SUBSTRATO O kit Dengue IgM Capture DxSelect Focus emprega cavidades de captura revestidas com anti- IgM humana. IgM capturada com o anticorpo heterófilo ativo pode se ligar diretamente ao reagente. Uma forma de atenuar essas falsas reações é através da utilização de um procedimento de subtração do fundo. Publicação de dados demostraram que amostras com baixo nível de reatividade podem beneficiar a aplicação da subtração de fundo, no entanto, cada laboratório deve definir o seu próprio algoritmo de teste para medir analitos por ELISA µ de captura. MATERIAIS FORNECIDOS O kit ELISA contém material suficiente para realizar 96 ou 480 determinações. Permitir que os reagentes fornecidos estejam a temperatura ambiente antes de usar. Todos os materiais não abertos são estáveis entre 2 e 8 C até a data de vencimento indicada no rótulo do reagente Antígeno liofilizado 2 frascos (no caso de 96 testes) ou 10 frascos (no caso de 480 testes) contendo antígeno do vírus da dengue inativado liofilizado (porções iguais dos 4 tipos). Cada 6 ml de antígeno pode realizar aproximadamente 60 testes. Para reconstituir o antígeno, adicionar exatamente 6 ml da solução de reconstituição. Não use água destilada ou outro reagente que não seja o reagente de reconstituição fornecido. Os resultados serão inválidos se qualquer outro reagente for utilizado para reconstituir o antígeno. Permitir que o antígeno reidrate em temperatura ambiente por 1 hora antes do uso: o antígeno deve ser dissolvido antes do uso. Armazenar o antígeno a 2-8 C por até 30 dias após a reconstituição. Se o antígeno restante não for utilizado dentro de 30 dias, alíquotar e congelar a -70 C ou mais. Descongelar somente uma vez. Solução de reconstituição de antígeno Solução de cultura celular, sufactante e azida sódica 0,1% 96 testes:1x 13 ml 480 testes: 5 x 13 ml 12x8 Microcavidades de poliestireno em uma moldura revestidas com anti-igm humano Cada tira pode ser dividida em cavidades individuais de uso rentável. Para evitar a condensação, deixe o antígeno à temperatura ambiente antes de abrir os pacotes fechados. 96 testes: 1 placa com 12 x testes: 5 placas com 12 x 8 PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 1

2 Solução de Tampão Concentrada 10x Solução tampão salina com sufactante. Prepare 1000 ml de uma solução de tampão de lavagem 1X antes de usar. Para preparar uma solução de tampão 1X, misturar 100 ml de Tampão 10X com 900 ml de água destilada (ou deionizada) e dissolver todos os cristais. Usar apenas a água purificada de grau mais alto para a reconstituição do tampão de lavagem. Foi observado que algumas fontes de água deionizada contém materiais que podem interferir no ensaio. Agitar até ficar bem misturado e todos os cristais ficarem dissolvidos 96 testes: 1 x 100mL 480 testes: 5 x 100 ml Controle Positivo IgM - 0,30 ml Soro humano. Contém conservante azida sódica 0,1%. Requer diluição antes do uso. 96 testes: 1 x 0,30 ml 480 testes: 5 x 0,30 ml Controle negativo - 0,30 ml Soro humano. Contém 0,1% de azida sódica como conservante. Requer diluição antes do uso. 96 testes: 1 x 0,30 ml 480 testes: 5 x 0,30 ml Calibrador Cut-Off IgM - 0,30 ml Soro humano. Contém 0,1% de azida sódica como conservante. Requer diluição antes do uso. 96 testes: 1 x 0,30 ml 480 testes: 5 x 0,30 ml Diluente de amostras PBS com proteína, surfactante e preservativo. Pronto para uso. 96 testes: 1 x 100 ml 480 testes: 5 x 100 ml Conjugado HRP Conjugado peroxidase/ Anti-flavivirus.Contêm proteína, tampão e preservativos. 96 testes: 1 x 16 ml 480 testes: 5 x 16 ml Substrato TMB Pronto para uso. Uma mistura de 3,3 5,5 tetrametilbenzidina e peróxido de hidrogênio em tampão salina fosfato 96 testes: 1 x 16 ml 480 testes: 5 x 16 ml Solução de Bloqueio Pronto para uso. Ácido sulfúrico 1M. 96 testes: 1 x 16 ml 480 testes: 5 x 16 ml 3 fitas de vedação MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS 1. Água destilada 2. Frasco de lavagem de 250 ou 500 ml 3. Proveta graduada de 1 L 4. Tubos teste 5. Pipetas com pontas descartáveis de 10 μl 6. Pipetas com pontas descartáveis de 100 μl (pipetador de 8 canais recomendado para corrida de mais de 48 cavidades) 7. Uma pipeta ou dispensador de 1 ml 8 Pipeta de 5 ml. 9. Cronômetro 10. Toalhas de papel ou papel absorvente 11. Pia 12. Vórtex ou equivalente 13. Espectrofotômetro de placas ELISA, 450 nm VALIDADE E MANUSEIO 1. Kits e reagentes são estáveis até o final do mês indicado pela data de validade do rótulo, quando armazenado entre 2 e 8 C. 2. Não utilizar o kit de reagentes após as datas de vencimento. 3. Não exponha o reagente à luz forte durante o armazenamento ou incubação. 4. Permitir que os reagentes atinjam a temperatura ambiente antes de usar. AVISOS E AS PRECAUÇÕES 1. Este kit é somente para uso em diagnóstico in vitro. 2. Todos os produtos derivados de sangue devem ser tratados como potencialmente infecciosos. Os materiais usados neste produto (incluindo controles) foram avaliados para o antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos da hepatite C e anticorpos HIV-1 / 2 (AIDS) por métodos aprovados pelo FDA e considerados negativos. No entanto, como nenhum método de teste conhecido pode oferecer 100% de garantia de que os produtos derivados do sangue humano não transmitem esses ou outros agentes infecciosos, todos os controles, amostras de soro e equipamentos que entram em contacto com amostras devem ser considerados potencialmente infecciosos e descontaminados ou eliminados, tomando as precauções adequadas de risco biológico. 3. O antígeno liofilizado contém 4 cepas de DV inativado. Entretanto o reagente deve ser considerado potencialmente infeccioso e tratado em conformidade. 4. Azida de sódio na concentração de 0,1% foi adicionada a alguns reagentes como um agente anti-bacteriano. Para evitar o acúmulo de azidas metálicas explosivas em encanamento de chumbo e cobre, os reagentes (ver materiais fornecidos, acima) deverão ser descartados no esgoto apenas se diluídos e lavados com grandes volumes de água. Use sistemas de esgotos sem cobre e chumbo, quando possível. Ocasionalmente, descontaminar o sistema de drenagem com hidróxido de sódio 10% (ATENÇÃO: cáustico), deixar repousar durante 10 minutos, em seguida, lavar com grandes volumes de água. 5. Não substituir ou misturar reagentes de lotes diferentes ou de outros fabricantes. 6. Utilize apenas os protocolos descritos neste folheto. Tempos de incubação ou temperaturas diferentes dos especificados podem dar resultados errados. 7. A contaminação cruzada de amostras de pacientes pode provocar resultados errados. Adicionar amostras de pacientes e manusear as tiras com cuidado para evitar a mistura de soros de cavidades adjacentes na bandeja de incubação. Decantar cuidadosamente. 8. A contaminação bacteriana das amostras de soro ou reagentes pode produzir resultados errados. Use uma técnica asséptica para evitar contaminação microbiana. 9. Realizar o ensaio à temperatura ambiente (intervalo de aproximadamente C). 10. Usar técnicas adequadas de pipetagem, mantendo o padrão de pipetagem durante todo o procedimento, para assegurar valores ideais e reprodutíveis 11. O reagente de bloqueio contém ácido sulfúrico. Não permita contato com a pele ou olhos. Se exposto, lavar abundantemente com água. COLETA E PREPARAÇÃO O soro é a fonte da amostra. Não foi realizado nenhum ensaio para avaliação da compatibilidade do ensaio com outras amostras. Soros contaminados hiperlipêmicos, inativados pelo calor ou hemolisados podem provocar resultados errados e, portanto, seu uso deve ser evitado. COLETA E TRATAMENTO Coletar amostras de sangue assepticamente utilizando técnicas aprovadas por profissional qualificado. Permitir que as amostras de sangue coagulem à temperatura ambiente antes da centrifugação. Transferir assepticamente o soro para um recipiente estéril bem fechado para armazenamento a 2-8 C. Se o ensaio não for concluído dentro de 5 dias, congelar a -20 C. Descongelar as amostras e misturar bem antes de usar. PREPARAÇÃO DO CALIBRADOR CONTROLES E AMOSTRAS Diluir cada amostra, controle e calibrador 1:101, como a seguir: etiquetar os tubos e dispensar 1000 μl de Diluente de amostra em cada tubo rotulado. Adicionar 10 μl de amostra, controle e calibrador. Misturar vigorosamente. TÉCNICA O teste Dengue Virus IgM Capture DxSelect TM da Focus Diagnostics pode ser utilizado de duas formas. O protocolo clássico de CDC utiliza a incubação do antígeno de captura overnight. A alternativa é realizar a incubação do antígeno de captura em 1 hora a temperatura ambiente. 1. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente antes de usar. Remover as cavidades do pacote de armazenamento. Para evitar a condensação, deixar atingir a temperatura ambiente antes de abrir o pacote de papel alumínio. Se menos de uma placa for utilizada, as não utilizadas devem ser seladas completamente na embalagem de papel alumínio com dessecante. Guardar de 2 a 8 C. (Nota: No final do ensaio, manter o quadro para o uso com as tiras restantes). 2. Preparar solução de Antígeno (certificar-se que o reagente está à temperatura ambiente). Se o kit está sendo usado pela primeira vez, PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 2

3 reconstituir antígeno suficiente (ver MATERIAIS FORNECIDOS acima). 3.Preencher as cavidades com tampão de lavagem 1X e deixar repousar por 5 minutos. Decantar (ou aspirar) e bater vigorosamente para remover o tampão de lavagem1x. Colocar para baixo sobre papeltoalha limpo ou papel absorvente para retirar o tampão de lavagem residual. 4.Adicionar 100 μl de Diluente de Amostra para o "branco" e 100 μl de cada amostra diluída, controle ou calibrador nas cavidades apropriadas. (Nota: Para corridas com mais de 48 cavidades recomenda-se que 250 μl de cada amostra diluída seja adicionada a uma microplaca em branco no local correspondente a das cavidades ELISA. As amostras podem ser eficientemente transferida para as cavidades de antígeno com pipetador). Procedimento de subtração do background OPCIONAL Adicionar 100 μl de cada amostra diluída em 2 poços. Na etapa de colocação do antígeno, colocar o antígeno em uma cavidade e na outra cavidade colocar 100 μl do diluente. Importante nota: A subtração do background é uma forma de checar a presença de anticorpos heterofilos em amostras positivas. Portanto, a subtração do background não deve ser realizada a menos que a amostra do paciente seja inicialmente positiva. 5. Cobrir as placas com fita adesiva, e incubar durante 60 ± 1 minutos à temperatura ambiente (20-25 C). 6. Remover a fita de vedação, e esvaziar o conteúdo das cavidades em uma pia ou uma bacia de descarte. 7. Encher cada cavidade com solução de tampão de lavagem 1X e em seguida esvaziar o conteúdo em uma pia ou uma bacia de descarte. 8. Repetir a lavagem mais 2 vezes, permitir que a última lavagem descanse por 5 minutos antes da aspiração. 9. Bater vigorosamente para remover o tampão de lavagem. Colocar para baixo sobre papel-toalha limpo ou papel absorvente para retirar o tampão de lavagem residual 10. Adicionar 100 μl da solução de antígeno em todas as cavidades com um pippetador. 11. Cobrir as placas com fita adesiva e incubar durante 60 minutos em temperatura ambiente (20-25 C). 12. Lavar. Repetir os passos 6 a Adicionar 100 μl do Conjugado em todas as cavidades. 14. Cobrir as placas com fita adesiva e incubar durante 30 ± 1 minutos em temperatura ambiente (20-25 C). 15. Lavar. Repetir os passos 6 a Pipetar 100 μl do Substrato em todas as cavidades, Inicie o tempo de incubação com a adição do Substrato no primeiro poço. (Nota: Nunca coloque o substrato no mesmo recipiente em que foi usado o conjugado). 17. Incubar durante 10 ± 1 minuto em temperatura ambiente (20-25 C). 18. Adicionar 100 μl de solução de bloqueio em todas as cavidades na mesma sequência e no mesmo ritmo que o substrato foi adicionado. Em cavidades de anticorpos positivos, a cor deve mudar de azul para amarelo. 19. Secar levemente o fundo fora das cavidades com uma toalha de papel para remover gotículas que interfiram com a leitura do espectrofotômetro. Não esfregar com a toalha de papel, pois pode arranhar a superfície óptica da cavidade. (Nota: bolhas grandes na superfície do líquido podem afetar as leituras da DO). 20. Medir a absorbância dentro de 1 hora: comprimento de onda de 450 nm. Zerar o instrumento nas cavidades do branco. CONTROLE DE QUALIDADE Cada corrida deve incluir o Cut-off Calibrador e todos os 2 controles. Se múltiplas placas são executadas, incluir o Cut-off Calibrador e os dois controles em cada placa. Recomenda-se que, até o usuário se familiarize com o desempenho, todas as amostras, controles e Cut-off sejam executados em duplicata, com o calibrador Cut-off correndo duas vezes, num total de quatro cavidades. Se forem usadas cavidades individuais, o calibrador deve ser executado em triplicata. Incluir no mínimo 1 cavidade de branco (contendo apenas o diluente da amostra) para efeitos de calibração do instrumento. O calibrador Cut-off foi formulado para fornecer melhor diferenciação entre soros positivos e negativos. Depois de subtrair o branco, a DOalvo do calibrador é de aproximadamente 0,250 unidades. Devido às diferentes condições laboratoriais, os valores de absorbância podem diferir significativamente. A faixa de DO variando de a unidades é típica. Todas as Dos das replicatas do calibrador Cut-off devem variar da média dentro de 0,100 unidades de absorbância. O desempenho do Kit e a integridade dos resultados são uma função dos valores dos índices para os controles, e não da DO absoluta isolada do calibrador Cut-off. Registrar os resultados como o índice de valores relativos ao calibrador Cut-off. Para calcular os valores de índice, dividir valores da densidade óptica da amostra pela média dos valores de absorbância do calibrador. 1. O valor do índice do controle positivo deve estar entre 1.5 e O valor do índice do controle negativo deve ser inferior a 0,8. Se o calibrador ou controle não estiver dentro destes parâmetros, os resultados dos testes do paciente devem ser considerados inválidos e o ensaio repetido. CÁLCULO PARA SUBTRAÇÃO DOS RESULTADOS DO FUNDO Etapa 1. Calcular o índice para os controles, dividindo DO do controle pela DO do Cut-off. Índice para os controles (Cut-off e índice de controle) = "Ag" DO / CO DO Etapa 2. Calcular o índice das amostras dos pacientes. Em primeiro lugar, fazer o cálculo do Paciente subtraindo-se a "SD" DO da "Ag " DO e, em seguida dividindo o resultado pela DO do Cut-off. Índice do paciente = Ag DO SD DO / CO DO Etapa 3. Interpretar usando os intervalos na seção de Interpretação (por exemplo, negativo <1,00, e positivo> 1,00). INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS DOS TESTES Registrar todos os resultados como o índice de valores relativos ao calibrador Cut-off Para calcular os valores de índice, dividir valores da densidade óptica da amostra pela média dos valores de absorbância do calibrador Cut-off. > 1,00 <1,00 Positivo: Um valor de índice> 1,00 é presuntivo para a presença de anticorpos IgM antidengue. Negativo: Um valor do índice < 1,00 indica quee anticorpos IgM anti-dengue não foram detectados. LIMITAÇÕES 1. O vírus da dengue é um flavivírus. Outros membros deste grupo incluem vírus Banzi, vírus Bussuquara, vírus Iiheus, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite de St. Louis, vírus da encefalite Murray Valley, vírus Rocio, o vírus Kunjin, vírus Spondweni, vírus Sepik, vírus Ocidental do Nilo, vírus da febre amarela, vírus Zika, vírus Wesselsbron, vírus Rio Bravo, vírus da Encefalite da Europa Central, o vírus da primavera-verão russa, vírus da Doença da Floresta de Kyasanur, vírus loupinf ill, vírus Negishi, vírus da febre hemorrágica de Omsk e vírus Powassan. Embora a maioria destes vírus raramente causem doença no homem, ou são restritas a estreitas regiões geográficas, são comuns reações cruzadas entre os membros da família Flaviviridae. Portanto, deve ser tomado cuidado na interpretação dos resultados antes que um diagnóstico definitivo da dengue seja feito. Estas análises não servem como um substituto para análise clínica de um médico. 2. Todos os resultados desta e de outras sorologias devem ser correlacionados com o histórico clínico, dados epidemiológicos e outros dados disponíveis para o médico ao fazer o diagnóstico da infecção pelo vírus da dengue. 3. Se um resultado negativo do teste for relatado para um paciente com suspeita forte de dengue, por motivos clínicos ou epidemiológicos, uma segunda amostra de soro deve ser colhida de 7 a 10 dias após o início da doença e retestadas para anticorpos da classe IgM. VALORES ESPERADOS Em um estudo inédito, foi observado que em 7 dias após o início mais de 90% dos casos confirmados de dengue tiveram IgM detectáveis por ELISA, e em 10 dias após o início, 93% tinham IgM detectáveis por ELISA. 9 soro de pacientes sem sinais, sintomas ou antecedentes de dengue devem resultar negativos com este procedimento. DADOS DE DESEMPENHO Incubação durante a NOITE x de 2 horas Um investigador interno comparou o desempenho do ensaio realizando o procedimento com incubação de 2 horas contra o processo de incubação durante a noite. Cento e doze (112) soros foram avaliados. A concordância geral foi de 97,3% (109/112). Realizando o ensaio com incubação durante a noite, dos 112 soros, 55 foram positivos e 57 negativos. Dos 55 positivos durante a noite, o ensaio de 2 horas foi positivo com 98,2% dos soros (54/55). A única amostra que foi positiva no teste durante a noite e negativa na de 2 horas, foi executada em duplicata: um índice foi de 0,97 e o outro foi de 1,08, com uma média de 1,03. Dos 57 negativos durante a noite, 96,5% foram negativos com o teste de 2 horas (55/57). Das duas amostras que foram negativas no teste durante a noite e positivas para o ensaio de 2 horas, uma apresentava índice de 1,1 e a segunda um índice de 1,4. Durante a noite PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 3

4 2 horas Positivo Negativo Total Positivo 98,2% (54/55) 3,5% (2/57) 95%IC = 90,3-100% 95%IC = 0,4-12,1% 56 Negativo 1,8%(1/55) 96,5% (55-57) 95%IC = 00-9,7% 95%IC = 87,9-99,6% 56 Total SENSIBILIDADE Estudo 1 Sensibilidade com amostras de pacientes agudos Foi avaliada a sensibilidade com soros caracterizados como positivos para o vírus da dengue usando o método de incubação durante toda a noite para a realização dos testes. 1. As amostras foram colhidas de pacientes com sintomas de dengue hemorrágica ou dengue (DF). 2. Coleta inicial primária. 3. As amostras foram colhidas entre 1 e 16 dias após o aparecimento dos sintomas. 4. Os soros foram previamente analisados e caracterizados como positivos para o vírus da dengue com método de referência ELISA, HI e/ou PCR. Estudo 2 : Sensibilidade com amostras pareadas de casos agudos Foi avaliada a sensibilidade com soros pareados de 17 pacientes com suspeita de infecção pelo vírus da dengue. (n = 34) O teste foi realizado exatamente como descrito nas instruções de uso incluindo os controles. Os soros foram colhidos de 7 a 10 dias após o inicio da infecção e testado usando o método de incubação durante a noite. O método de referência utilizado pelo investigador para comparação foi um ELISA IgM. Sensibilidade com amostras pareadas de casos agudos Teste - tempo Sensibilidade 95% CI Focus 0 dias 35% (6/17) % Focus 7-10 dias 82% (14/17) % ELISA ref. 0 dias 29% (5/17) % ELISA ref dias 71% (12/17) % Estudo 3: Foi avaliada a sensibilidade do Focus IgM ELISA analisando-se um painel de soros de vírus da dengue montado pelas autoridades americanas. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. O painel de soros incluia amostras de infecção primária recente, infecção primária e infecções secundárias. Sensibilidade com infecção primária e secundária Infecção primária recente 86% (32/37) % Infecção primária 92% (47/51) % Infecção secundária 100% (15/15) % Total 91% (94/103) % Estudo 4 Foi avaliada a sensibilidade do Focus IgM ELISA analisando dois painéis de soro montados pelas autoridades americanas. Os painéis de soros incluiu um painel de densidades óticas baixas e um painel de soroconversão primário. O painel de densidades óticas baixas incluídos também exibiram densidades óticas baixas com o teste IgM ELISA usado pelo investigador. O painel de soroconversão primário incluiu amostras de dengue de especificidade conhecida. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. DO baixa 92% (12/13) % Soroconversão tipo1 100% (2/2) % Soroconversão tipo2 100% (2/2) % Soroconversão tipo4 100% (2/2) % Total 95% (18/19) % Foi avaliada a sensibilidade com 15 soros de pacientes identificados com dengue recente através de cultura positiva para vírus e também por teste de hemoaglutinação HI positivo. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. Estudo 7 Foi avaliada a sensibilidade do Focus IgM ELISA analisando-se quatro painéis de soro montados pelas autoridades americanas. Os painéis de soros incluiram um painel de baixo IgM, um painel de infecção primária, um painel de infecção secundária, e um painel de infecção antiga. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. Sensibilidade com infecção primária, secundária e antiga Condição Sensibilidade 95%CI IgM baixa 97%(29/30) % Infecção primária recente 100%(10/10) % Infeccção secundária 90%(9/10) % Infecção antiga 7%(1/14) % Total excluindo Infecção antiga 96%(48/50) % Total 77%(49/64) % Estudo 8 A investigação avaliou a sensibilidade com soros pareados de pacientes de dengue e 3 soros do mesmo paciente (total = 30, total de amostras = 61). Os soros foram selecionados da seguinte forma: 1. Cada paciente tinha suspeita de estar infectado com o vírus da dengue, 2. os pares mostraram a soroconversão por IH ou pelo menos um aumento de duas vezes nos títulos de anticorpos para as amostras pareadas por IH. O método de incubação durante a noite foi utilizado neste ensaio. Focus IgM HI ref. IgM ELISA ref. Cultura positive tipo1 75% (6/8) % Cultura positive tipo2 100% (1/1) N/A Cultura positive tipo3 100% (5/5) % Cultura positive tipo4 100% (1/1) N/A IH positiva 92% (22/24) % Total 90% (35/39) % DF 96% (48/50) % DHF 96% (25/26) % Total 96% (73/76) % Primeira coleta 37% (11/30) % 13% (4/30) % 20% (6/30) % Segunda coleta 100% (30/30) % 100% (30/30) % 100% (30/30) % Terceira coleta 100% (1/1) NA 100% (1/1) NA 100% (1/1) NA ESPECIFICIDADE Durante os estudos de investigação 3, 4, 5, 7 e 8 também foi avaliada a especificidade analisando-se soros de pessoas assintomáticas. No estudo 5, o painel de soro assintomático era também positivo para o virus da dengue e/ou encefalite japonesa pelo método HI. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. Estudo 5: Sensibilidade relativa a Cultura ou IH Positivas PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 4

5 Focus IgM ELISA Especificidade com soro Normal Condição Especificidade IC 95% Normal endêmicas (estudo 3) 95% (53/56) 85,1-98,9% Normal endêmicas (estudo 4) 100% (6/6) 54,1-100% Endêmicas HI positivo (estudo 5) 94% (31/33) 79,8-99,3% Crianças Endêmicas (estudo 8) 100% (43/43) 91,8-100% Adultos Endêmicas(estudo 8) 94% (64/68) 85,6-98,4% total endêmicas 96% (197/206) 91,9-98% Não endêmicas (7) 99% (99/100) 94,6-100% Geral Endêmica e Não endêmicas 97% (296/306) 94,1-98,4% consenso, tanto para Febre Amarela, Dengue, infecções anteriores Dengue. O método de incubação 2 horas foi utilizado para realizar o ensaio. Sem o fundo do substrato O Focus IgM foi positivo em 100% (87/87) das amostras diagnosticados com o vírus da dengue. Das 27 amostras sem diagnóstico do vírus da dengue, o ensaio IgM Focus foi negativo com 7,7% (1/13) das amostras não Malária, e negativa com 0% (0 / 14) das amostras Malária. REATIVIDADE CRUZADA Estudo 2 Foi avaliada a reatividade cruzada em pacientes vacinados contra o vírus da febre amarela, com infecções influenza e pacientes com infecção por Epstein-Barr virus. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. Estudo 6 Com o fundo do substrato O Focus IgM foi positivo em 98,9% (86/87) das amostras diagnosticados com o vírus da dengue. Das 27 amostras sem diagnóstico do vírus da dengue, o ensaio IgM Focus foi negativo com 46,2% (6/13) das amostras não malária e negativo com 0% (0 / 14) das amostras de Malária. Foi avaliada a reatividade cruzada testando-se soros de pacientes de uma área endêmica que exibiam quadro de febre aguda com suspeita inicial de dengue, e depois avaliados como soronegativos para dengue. O método de incubação durante a noite foi utilizado para realizar o ensaio. Condição Especificidade IC 95% * Vacinas Vírus da Febre Amarela 100% (06/06) * 54,1-100% Infecções por Influenza * 100% (15/15) ** 78,2-100% Epstein Baar virus 88%(7/8) 47,3-99,7% Febre aguda 100%(8/8) 63,1-100% Especificidade Geral 97%(36/37) % * Foi também constatado que os soros com vacinação contra o vírus da febre amarela e influenza foram negativos com outro teste ELISA IgM. Os soros EBV não foram pareados com o outro teste Elisa. Estudo 8 Foi avaliada a reatividade cruzada com soros de pacientes infectados com outros flavivírus, e soros de pacientes infectados com outros vírus. Ambos os painéis de soro foram testados usando o Focus IgM e o método de incubação durante a noite, IgM ELISA e HI. O painel de soros de flavivirus era composto de 33 soros de pacientes infectados com outros flavivírus: Vírus de febre amarela, vírus Ocidental do Nilo, o vírus Chinkunyungunya, vírus da encefalite japonesa, virus da febre por flebotomíneos, vírus Langat, vírus Bunya, e vírus Wassalbron. ESTABILIDADE No estudo 7 avaliaram a estabilidade. Os componentes foram acelerados para o equivalente a 2 anos a 2-8 C, incubando a 37 C. Os componentes acelerados foram testados de acordo com a bula em paralelo com os componentes não acelerados por meio da incubação durante a noite. Os componentes são considerados estáveis com os critérios especificados na bula. O dispositivo passou por cada um dos critérios. REPRODUTIBILIDADE INTRA ENSAIO No estudo 7, foi avaliada a reprodutibilidade intra-ensaio. Duas tiras que (8 poços por tira) foram retiradas de seis placas diferentes, foram removidas e re-montadas em uma placa nova (12 tiras total, 96 poços total). A nova placa foi usada para executar um ensaio de acordo com as instruções e incubação durante a noite, com Calibrador Cut-off como amostra. O dispositivo demonstrou a seguinte variação intra-ensaio: Reatividade cruzada com Infecções por Flavivirus Teste Reatividade Cruzada 95%CI Dengue tipo 2HI ref. 39%(13/33) % Dengue IgM Elisa ref. 12%(4/32) % Focus dengue IgM Elisa 27%(9/33) % Focus IgM ELISA reatividade cruzada com infecções virais nãoflavivírus Estudo 9 Foi avaliado o procedimento de fundo do substrato testando 114 amostras consensuais de dengue a partir de um painel de soros montado pela WHO. O painel incluiu 87 amostras clinicamente diagnosticadas como positivas para dengue e 27 amostras com diagnóstico de dengue negativos. Quatorze das amostras negativas foram determinadas como positivas para a malária por testes sorológicos consensuais e as 13 demais amostras foram testadas por REPRODUTIBILIDADE INTER-ENSAIO No Estudo 7, foi avaliada a reprodutibilidade inter-ensaio. Os controles e oito amostras diferentes (quatro positivos e quatro negativos) foram executados em três dias não consecutivos. Cada ensaio foi executado conforme descrito na bula. Os testes demonstraram 100% de concordância nos três dias separados. PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 5

6 REPRODUTIBILIDADE INTER-LOTE No estudo 7, foi avaliada a reprodutibilidade entre lotes. Os controles e as diferentes amostras (três soros positivos e dois soros negativos) foram executados com 3 lotes diferentes. O dispositivo demonstrou a seguinte reprodutibilidade: COMPARAÇÃO DE MÉTODOS Em uma validação interna, foi comparado o método de incubação durante a noite do protocolo da CDC e o método de incubação de antígeno por 1 hora. O estudo mostrou que a performance dos dois eram equivalentes. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Halstead, SB Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York. 2. Gubler, DJ Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990 s: top down or bottom up. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40: Henchal, EA and JR Putnak The Dengue Viruses. Clin. Micro. Rev. #: Halstead, SB Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev. of Inf. Dis. 11:S830-S MMWR :v9: Gubler, DJ Dengue, p In T.P. Monath (ed.) The arboviruses: epidemiology and ecology. Vol.2 CRC Press, Inc., Boca Raton, Fl. 7. Halstead, SB and G Papaevangelou Transmission of dengue 1 and 2 viruses in Greece in Am. J. Trop. Med. Hyg. 29: Robinson, N., Y Teramoto, M Wagner, R Moore, Evaluation of clinical sensitivity and specificity for the MRL Dengue Fever Virus IgM ELISA:Comparison of the overnight and 2 hour incubation times. 9. Kuno, G. and I Gomez and DJ Gubler An ELISA procedure for the diagnosis of dengue infections. Journal of Virol. Meth. 33: NCCLS. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline (NCCLS H18-A2). 2nd ed. (1999). 11. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). 12. Prince, Harry E., et al Development of a more Efficient Algorithm for Identifying False-Positive Reactivity Results in a Dengue Virus Immunoglobulin M Screening Assay. Clinical and Vaccine Immunology. 15:v8: Data de vencimento, N de Lote, N de Registro do Ministério da Saúde e Responsável Técnico: VIDE EMBALAGEM Produzido por: Focus Diagnostics Importado e Distribuído por: Medivax Indústria e Comércio Ltda. Av. Venezuela n 3, sala 303 Rio de Janeiro/RJ CNPJ: Atendimento ao consumidor - Tel.: (0xx21) PI.EL1500M.OUS-PT-T Página 6