Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas

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1 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Regiane Daniele Silva e Carvalho Obtenção de DNA genômico de Girardia tigrina e estabelecimento de progênie para extração de RNA total a partir de blastemas regenerantes submetidos à hipergravidade. São José dos Campos-SP 2014

2 Regiane Daniele Silva e Carvalho Obtenção de DNA genômico de Girardia tigrina e estabelecimento de progênie para extração de RNA total a partir de blastemas regenerantes submetidos à hipergravidade. Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas. Orientadora: Profª Dra. Nádia M.R. Campos Velho. Profª Dra. Flávia Villaça Morais. São José dos Campos-SP 2014

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4 Regiane Daniele Silva e Carvalho Obtenção de DNA genômico de Girardia tigrina e estabelecimento de progênie para extração de RNA total a partir de blastemas regenerantes submetidos à hipergravidade. Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, pela seguinte banca examinadora: Presidente: Profª Dra. Cristina Pacheco Soares (UNIVAP) Orientador( a) : Profª Dra Nádia MR de Campos Velho (UNIVAP) Profª Dra. Flavia Villaça Morais (UNIVAP) Membro externo: Profª Dra Cláudia Campos (UNIFESP). São José dos Campos-SP 27 de fevereiro de 2014.

5 Dedicatória Primeiramente dedico meu trabalho aos meus pais, Janir Pereira da Silva e Maria Zilda Faria e Silva, que sempre acreditaram em mim, e que foram os primeiros incentivadores em tudo na minha vida. Aos meus irmãos, Rinaldo, Renata e Rosana que mesmo não estando juntos todos os dias, sempre se preocuparam e me incentivaram à prosseguir. Ao meu querido esposo, Thiago Barbosa Carvalho, que nunca impediu de forma alguma que eu me dedicasse integralmente a este trabalho, sempre esteve ao meu lado me impulsionando e acreditando na minha vitória. Dedico este trabalho aos integrantes do Laboratório de Planárias da Universidade do Vale do Paraíba, Professora Doutora Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho, Professora Mestre Karla Andressa Ruiz Lopes, as colegas e amigas Bárbara Rosa Penha, Mônica Christine, Roberta Caricatto, Tabatha Benitz que me ajudaram em todos os momentos. À amiga Lívia Reis, por compartilhar dos meus sonhos e realizações, pelos sorrisos e lágrimas que vivenciamos juntas. À todos os professores que de alguma forma colaboraram para minha formação e aprendizado dentro desta Universidade. E dedico em especial a minha filha que presenciou de dentro de meu ventre minhas ansiedades, minhas tristezas e acima de tudo minhas alegrias.

6 Agradecimentos Aos colegas Bárbara, Lucas, Giselle, Rayssa, Rogério, Carolina, Suelen que me ajudaram no Laboratório de Biologia Celular e Molecular de Fungos, em meus experimentos. Às professoras Doutora Nádia Maria Rodrigues de Campos Velho, Doutora Flávia Villaça Morais, Me Karla Andressa Ruiz Lopes por me orientarem. Aos professores Doutor Newton Soares e Doutora Cristina Pacheco Soares, que foram os primeiros a abrirem as portas da UNIVAP para mim, e ainda por permitirem o uso de seus laboratórios. À Doutoranda Glória Gallo da UNIFESP, por me auxiliar na realização de parte de meus experimentos no Laboratório de Biologia Molecular e Celular de Fungos, no Departamento de Ciência e Tecnologia, da UNIFESP. Campus São José dos Campos. SP. À Professora Doutora Cláudia Campos por aceitar o convite para fazer parte desta banca. Enfim a todos que de alguma forma me ajudaram nesta etapa tão importante em minha vida acadêmica. Meus sinceros agradecimentos.

7 Obtenção de DNA genômico de Girardia tigrina e estabelecimento de progênie para extração de RNA total a partir de blastemas regenerantes submetidos à hipergravidade. Resumo As planárias há mais de cem anos são utilizadas em estudos para compreender o processo regenerativo dos metazoários. São tricladidos, se alimentam de pequenos invertebrados, larvas de insetos e compõem a cadeia alimentar em vários níveis. São monóicos podendo realizar reprodução sexuada e assexuada. Este trabalho visou a obtenção DNA genômico de Girardia tigrina e o estabelecimento de progênie para extração de RNA total a partir de blastemas regenerantes na presença de hipergravidade. A gravidade é um fator ao qual estamos submetidos constantemente. Entender as influências gravitacionais sobre nossas funções vitais confirma a importância deste estudo. Os espécimes de Girardia tigrina foram coletados no Rio Paraíba do Sul, município de Jacareí-SP. Encontravam - se aderidas nas raízes de Pistia stratiotes. Foram transferidas para recipientes onde permaneceram em ambiente climatizado com temperatura de 20ºC ±1º. Foram separados aleatoriamente 24 indivíduos adultos, estes com morfologia e funcionalidade perfeitas. Permaneceram aos pares em recipientes plásticos onde eram observados e contabilizados durante seis meses. Realizou-se extração de DNA genômico a partir de um espécime de G. tigrina e a integridade foi confirmada por eletroforese e espectrofotometria. 112 indivíduos tiveram a alimentação suprimida por duas semanas antes dos experimentos. Separados em dois grupos e após serem seccionados transversalmente na região pós- auricular, foram submetidos a hipergravidade ( 3.3 x G, 550 rpm) e o grupo controle (1G). O fragmento do blastema posterior de cada indivíduo foi removido, em zero, seis, 12 e 36 horas após o corte. Foram acondicionados oito blastemas em cada tubo de microcentrífuga. Os cones de regeneração foram submetidos a duas lavagens com PBS (Tampão fosfato-salino), e o material foi acondicionado a -80ºC. Para a extração de RNA dos blastemas, foi utilizado o método TRIzol. Realizou-se também amplificação por PCR, utilizando o gene PIWI baseado em banco de dados National Center for Biotechnology Information, e alinhamento. Com este trabalho obteve-se dados suficientes para concluir que a espécie Girardia tigrina apresenta bom comportamento reprodutivo em laboratório, e consegue desenvolver seu blastema em ambiente de hipergravidade. E ainda a partir de oito blastemas obtevese quantidade de RNA suficiente para realização de técnicas moleculares através do método TRIzol. Palavras-chave: Girardia tigrina, extração de RNA, PCR.

8 Obtaining genomic DNA Girardia tigrina and establishment of progeny for total RNA extraction of this species from regenerating blastema submitted to hypergravity. Abstract Planarians for over a hundred years are used in studies to understand the regenerative process of metazoans. Are triclads, feed on small invertebrates, insect larvae, and make up the food chain at various levels. Are monoiceous may make sexual and asexual reproduction. This work aimed to obtain genomic DNA Girardia tigrina and establish off spring for total RNA extraction of this species from regenerating blastema in the presence of hypergravity. Gravity is a factor which we are constantly being submitted. Understand the gravitational influences on our vital functions, confirms the importance of this study. The specimens were collected in Girardia tigrina, Paraiba do Sul River, the city of Jacarei - SP. Found if adhered roots Pistia stratiotes. Were transferred to containers where they remained in airconditioned room with a temperature of 20 º C ± 1 º. Randomized 24 adults with these perfect functionality and were separated. Remained in pairs in plastic containers which were observed and recorded for six months. We performed genomic DNA extraction from a specimen of G. trigrina and confirmed via 0.8% agarose gel integrity, and by spectrophotometric analysis confirmed these data. 112 individuals had suppressed feeding for two weeks before experiments. Separated into two groups, and after being sectioned in the post auricular region were subjected to hypergravity ( 3.3 x g, 550 rpm ) and the control group ( 1G ). The fragment of the posterior blastema of each individual was removed at zero, six, 12 and 36 hours after cutting. Eight blastemas were placed in each microcentrifuge tube. The cones regeneration were subjected to two washings with PBS ( phosphate buffered saline), which was removed to the packaging material -80 For RNA extraction blastema, TRIzol method was used. We also performed PCR amplification using the PIWI based on NCBI database gene and alignment. With this work we obtained sufficient data to conclude that Girardia tigrina species has a reproductive behavior in the laboratory, and can develop their blastema in hypergravity environment. And from eight blastemas obtained sufficient amount of RNA for performing molecular techniques through the Trizol method. Keywords : Girardia tigrina, extraction of RNA, PCR.

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representantes do reino animal com capacidade regenerativa Figura 2. Regeneração em planárias Figura 3. Capacidade regenerativa em planárias Figura 4. Reprodução assexuada Figura 5. Representação do Sistema Reprodutor Figura 6. Representação do Sistema Nervoso Figura 7. Representação das estruturas fotorreceptoras e quimiorreceptoras Figura 8. Girardia tigrina (Girard 1850) Figura 9. Local de coleta. Rio Paraíba do Sul, Município de Jacareí- SP Figura 10. Macrófitas da espécie Pistia stratiotes Figura 11. Visualização do processo de alimentação Figura 12. Limpeza dos espécimes após retirada do alimento Figura 13. Planárias G.tigrina da progênie em período reprodutivo. Presença de cápsulas Figura 14. Centrífuga utilizada para simulação de hipergravidade Figura 15. Corte do Blastema Figura 16. Planária G.tigrina, após corte transversal Figura 17. Esquema do processo de extração de RNA Figura 18. Termociclador THERMO utilizado nas amplificações Figura 19. Espécimes de G.tigrina separadas em duplas Figura 20. Média entre as duplas quanto ao número de indivíduos e de cápsulas no período de seis meses Figura 21. Média de indivíduos e cápsulas por mês observado Figura 22. DNA genômico de Girardia tigrina. Gel de agarose 0,8% impregnado com brometo de etídeo, contendo em A1 e A2 = 1 µg de DNA genômico de G. tigrina (A1 e A2, são duplicatas, seta branca). Em M, marcador de peso molecular (seta preta, fragmento de DNA). De acordo com a eletroforese realizada podemos afirmar que o DNA obtido em nossa extração está integro Figura 23. Períodos de extração do blastema no processo regenerativo Figura 24. Sequências de nucleotídeos para os genes ACTIN e PIWI disponíveis no banco de dados do NCBI Figura 25. Alinhamento realizado através de ferramenta online de bioinformática, Multalign Figura 26. Gel de agarose 1,0 % impregnado com brometo de etídeo, contendo resultado de PCR variação 1, utilizando oligonucleotídeos dos genes PIWI ( setas 1 e 2) e ACTIN (seta 3). Padrão Peso Molecular está representado pela seta 4. Presença de duas bandas em PIWI, e apenas uma em ACTIN

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Representação dos principais genes envolvidos na regeneração de planárias Tabela 2. Componentes utilizados na amplificação por PCR Tabela 3. Resultados de estudos com espécies de planárias em laboratório Tabela 4. Amostras (A1, A2) em duplicata submetidas a extração de DNA Tabela 5. Extração realizada pelo método Trizol com números diferentes de blastemas Tabela 6. Métodos utilizados para extração de RNA com dois blastemas Tabela 7. Amostras submetidas a extração de RNA Tabela 8. Oligonucleotídeos Sense e Anti-sense utilizados nas reações de PCR Tabela 9. Condições das reações de amplificação para os dois genes

11 Lista de abreviaturas e Siglas A- amostra Ago- agosto ANOVA- Análise de variância Caps- cápsulas cdna- desoxirribonucleotídeo complementar D- dupla G- gravidade G.tigrina- espécie de planária Girardia tigrina h- hora Indv- indivíduo Jan- janeiro LAPLA- Laboratório de Planárias M marcador de peso molecular med- média µg- microgramas min- minuto mm- mili molar N- número NCBI- National Center for Biotechnology information ŋg- nanograma Nm- nanômetro PBS- Tampão fosfato salino PCR- Polymerase chain reaction, reação em cadeia de polimerase RNAi- ribonucleotídeo de interferência RNP- ribonucleoproteína SP- São Paulo UNIFESP- Universidade Federal de São Paulo

12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Regeneração Planárias como modelo experimental Girardia tigrina Hipergravidade Estudos Moleculares OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Modelo experimental Manutenção em laboratório Estabelecimento da progênie Estabelecimento do método para extração de DNA genômico Exposição à hipergravidade Extração do blastema Estabelecimento da metodologia de extração de RNA Análise das sequências de genes em banco de dados NCBI Amplificação por PCR ( polymerase chain reaction ) RESULTADOS E DISCUSSÕES Estabelecimento da Progênie Extração de DNA genômico Exposição à hipergravidade Definição do número de blastemas para extração de RNA total Definição do método para extração de RNA total Análise das sequências de genes em banco de dados NCBI Amplificação por PCR ( polymerase chain reaction ) CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 56

13 13 1 INTRODUÇÃO As planárias são cada vez mais utilizadas como modelo de estudos devido sua grande capacidade regenerativa. Apresentam células-tronco totipotentes (neoblastos), ao longo de toda a sua vida, o que preserva esta sua característica regenerativa. As planárias são metazoários, bilaterais simétricos, pertencentes ao filo dos platyhelmintes. Seu corpo é recoberto por uma epiderme ciliada. Apresenta compartimento tecidual conjuntivo, seu parênquima constitui-se de células mesenquimais (DURÁN, 2012). As planárias constituem um modelo surpreendente, pois regenera seu Sistema Nervoso Central em poucos dias (GENTILE, 2011). A organização dos neurônios em cordões longitudinais e a concentração dos receptores e dos sistemas integrantes na extremidade anterior do corpo estão correlacionadas com a evolução da bilateralidade entre os platelmintos. Órgãos sensoriais, denominados estatocistos são bastante evidentes. Cada estatocisto consiste de uma cápsula que envolve uma cavidade preenchida por fluido e uma concreção central chamada estatólito (FRAGUAS, 2012). A espécie estudada, Girardia tigrina, pertence à classe Turbellaria, cujo grupo compreende em sua maioria invertebrados de vida livre. Podem ser encontrados entre rochas e vegetações nos ambientes aquáticos, e escondidas no solo nos ambientes terrestres (MUNHÕZ, 2007). Alimentam-se de animais mortos que chegam ao substrato ou de insetos, larvas de insetos e outros invertebrados, nesta situação nadam diretamente até a presa, liberando um muco para imobilizá-la e ingerí-la (MEXER; LEARNED, 1981). Apresentam várias estratégias reprodutivas, como reprodução sexuada, em espécimes diplóides, sexuada ou assexuada, em espécimes mixoplóides, e assexuada em espécimes poliplóides. Seu manejo é facilmente realizado em laboratório, com baixo custo de manutenção (GUECHEVA; HENRIQUES; ERDTMANN, 2001). A gravidade é um fator, no qual estamos sendo submetidos constantemente. Após as primeiras viagens ao espaço, estudos com alteração gravitacional foram realizados, a fim de entendermos quais são as influências da gravidade em nossa evolução. A partir das viagens ao espaço, este assunto passou a chamar atenção de

14 14 diversos pesquisadores. Estudos com animais modelos diversos, como as planárias, são realizados em ambientes de microgravidade e hipergravidade o que ajudará a desvendar os mistérios da gravidade. Estudos da medicina regenerativa, engenharia tecidual, biotecnologia e regulação celular podem informar como ocorre esse processo natural entre os metazoários, principalmente em alguns invertebrados. Assim estudos realizados com esses animais modelos podem ajudar a criar novas tecnologias e alternativas para tratamentos no mais amplo universo da medicina. Após sofrer fissão, as planárias já iniciam imediatamente o processo de formação de um blastema, tecido despigmentado, formado na superfície do corte, cujas células não são especializadas (AGATA, 2007). A partir do blastema é que se terá o início da formação de uma cabeça ou uma cauda. Conhecer em nível molecular como isso ocorre é necessário, para realização desses estudos, por isso a importância da padronização de métodos para obtenção de RNA e DNA desse animal modelo. O processo de extração de RNA é essencial para execução de diversas análises da expressão gênica, tais como o Real Time PCR, microarrays, construção de bibliotecas de cdna. Para a obtenção de resultados confiáveis, é fundamental que se trabalhe com progênie. Uma das maiores preocupações na extração de RNA é a sua degradação por ação de ribonucleases (RNAses) que são enzimas extremamente resistentes a diversos tratamentos. As técnicas de extração compreendem a utilização de agentes desnaturantes fortes, tais como os fenóis e sais de guanidina que efetuam a lise celular e inativação das RNAses. Além disso, a utilização de água DEPC (dietilpirocarbonato inibidor de RNAase) e materiais autoclavados, visam diminuir a contaminação por RNAses. Um dos produtos comerciais mais usados é o Trizol, que consiste em uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina. Genes envolvidos no processo regenerativo já são descritos em diversos estudos. O gene DJPUM de acordo com Rossi (2006); e Salvetti (2005), participa da manutenção de neoblastos. O gene PIWI foi descrito por Reddien et al. (2005) como gene expresso em células-tronco adultas. Petersen, et al. (2009), estudou o gene WNT como sendo mediador da proliferação celular, fato importante no processo regenerativo. Sabe-se atualmente que a genética é uma das fronteiras para a ciência moderna, podendo oferecer uma compreensão em todos os setores, pois os

15 15 organismos possuem um sistema genético, que por exemplo, nos ajuda a compreender a evolução e seu desenvolvimento de forma mais completa (PIERCE, 2011). A facilidade de obtermos lotes com espécimes estáveis geneticamente, nos permite utilizarmos as planárias em diversos estudos, como modelos para testes ecotoxicológicos e moleculares (ZAGATO; BERTOLETTI, 2006).

16 16 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 Regeneração Entre os metazoários podemos reconhecer a presença da capacidade regenerativa. Uma lesão natural ou provocada, pode ocasionar a perda de partes constituintes do corpo, e mecanismos ainda desconhecidos, oferecem a capacidade de reconstituição da parte perdida. Entre os invertebrados nota-se a presença da regeneração na reprodução assexuada, fenômeno importante para sua evolução. Nos vertebrados, os urodelos são os principais representantes com capacidade regenerativa, podendo reconstituir completamente olhos, tecidos cardíacos e membros. O mecanismo de regeneração natural de urodelos não promove apenas a diferenciação para células originais dos tecidos perdidos, mas também garante a restauração de relações fundamentais para a preservação funcional (SANTOS, 2006). Porém estes organismos vertebrados requerem mais de um mês para concluir sua regeneração, pois apresentam ciclos de vida longos, o que impossibilita a análise genômica, além de possuírem genoma grande, dificultando os estudos moleculares (NEWMARK; ALVARADO, 2002). Muitos avanços são realizados no estudo de regeneração em diferentes grupos animais (Figura 1) (ALVARADO, 2012).

17 17 Figura 1. Representantes do reino animal com capacidade regenerativa. Fonte: Galliot e Ghila, (2010). Os seres vivos que possuem estas habilidades conseguem regenerar um membro ou parte destes quando perdidos, já entre as planárias a habilidade regenerativa compreende a restauração do animal por completo a partir de pequenos fragmentos em poucos dias (Figura 2). Figura 2. Regeneração em planárias. Fonte: Newmark e Alvarado, 2002.

18 18 A regeneração é a capacidade de um organismo substituir fragmentos perdidos ou se desenvolver totalmente, seja através do crescimento de um blastema ou da remodelação de tecidos. Segundo Durán (2009) o blastema é definido como uma massa indiferenciada de células proliferativas que darão origem a todos os tecidos regenerantes. Apresenta-se como tecido não pigmentado, formado sob o epitélio que recobre a ferida. Duas estratégias foram identificadas na formação do blastema, primeiro seria o recrutamento de células-tronco, e a outra a desdiferenciação de células adultas localizadas próximo da ferida (GALLIOT; GHILA, 2010). A regeneração foi classificada em dois mecanismos: epimorfosis e morfalaxia (SALÓ, 2006). Epimorfosis é a restauração de uma estrutura perdida morfológica, anatômica e funcionalmente, através da formação de um blastema. Já morfalaxia implica na remodelação de tecidos existentes que darão origem a novos tecidos (DURÁN, 2009). Estudos são feitos para compreender como a regeneração acontece em alguns animais. Biólogos evolucionistas ainda discutem como espécies estreitamente relacionadas, podem não compartilhar essa capacidade regenerativa (ALVARADO, 2012). Embora o resultado da regeneração apresente semelhança entre espécies, os mecanismos utilizados para a realização podem ser bastante diferentes entre elas e até agora não foi delineado uma visão unificadora do processo celular e molecular da regeneração (GALLIOT, 2010). Wenemoser e Reddien (2010) afirmam que conhecer como ocorre a sinalização entre o local da lesão e os neoblastos é importante para melhor compreensão dos estudos de células-tronco e o seu papel na regeneração e homeostase do tecido, não só em planárias, como em outros metazoários. Os neoblastos são verdadeiras células-tronco totipotentes, como células embrionárias em vertebrados. Elas podem estar envolvidas na diferenciação de todos os tecidos das planárias (MORACZEWSKI, 2008). Os neoblastos encontram-se distribuídos de forma abundante em todo parênquima (WOODRUFF; BURNETT, 1965). As planárias apresentam uma população de células estaminais adultas, neoblastos, que participam da proliferação, crescimento, regeneração e homeostase do tecido. Uma característica dos neoblastos é a presença de corpos cromatóides, grande ribonucleoproteínas (RNP) e grânulos citoplasmáticos morfologicamente semelhantes a estruturas presentes na linha germinativa de muitos organismos

19 19 (ROUHANA, 2012). Neoblastos são mantidos no parênquima em números adequados, onde eles respondem às feridas por proliferação e migram para dar origem ao blastema. As células do cone de regeneração começam e se organizar para produzir as devidas mudanças padronizando a partir de um tecido preexistente do animal amputado, novas estruturas ou um novo animal, com as devidas proporções, morfalaxia (REDDIEN et al. 2005). Estudos moleculares sobre a regeneração vem sendo realizados a fim de mapear este fenômeno de maneira mais detalhada. Alguns genes são apontados como fundamentais neste processo. Salvetti (2000) identificou que o gene DjMCM² se expressa em células proliferativas. Alterações espaciais e temporais na expressão deste gene foram observadas durante a regeneração da espécie Dugesia japonica. Este fenômeno não foi detectado dentro da região do blastema, nem em regiões anteriores aos ocelos. Este gene está presente em neoblastos, mas não em todas as células, o que afirma a composição heterogênea deste grupo celular. Nos estudos de Rossi, (2006) e Salvetti, (2005), eles descrevem que o gene DjPUM apresenta papel importante na manutenção de neoblastos em Dugesia japonica. Durante a regeneração, neoblastos proliferam e acumulam sob o epitélio da ferida realizando a formação do cone regenerante. Com o uso de RNAi, uma redução no número de neoblastos impediu a formação do blastema que interrompeu o processo regenerativo. Tasaki et al. (2011) comenta que o gene DJMKPA está presente no processo regenerativo após um dia da amputação, tanto em fragmentos da cabeça como da cauda de D. japonica. A expressão diminui à medida que a regeneração se completa, por volta do sétimo dia após a amputação. A expressão de DJMKPA ocorre em resposta ao ferimento. Este pode ser considerado um bom gene para acompanhar o processo de formação do blastema durante a regeneração. DJMKPA se expressa em células do blastema em resposta ao aumento de atividade extracelular. Sua expressão se faz necessária para as células saírem do estado proliferativo e sofrerem diferenciação. Durante o processo regenerativo a expressão dos genes ocorre de forma diferenciada. Os genes HOMEOBOX DTH-1 e 2, se expressam de forma mais elevada na região dorsal das planárias, e são considerados genes tardios, que ajudam na determinação celular e diferenciação.

20 20 Não estão presentes no blastema e sim em áreas já diferenciadas, e que o gene HOMEOBOX se expressa no quinto dia da regeneração em G. tigrina (GARCIA- FERNANDÉZ, 1991, 1993). O gene HOX desempenha papel fundamental em ambos os processos de reconstituição dos fragmentos tanto anterior quanto posterior (SALÓ, 2001). Na região do blastema ele atua como instrumento que transforma o cone de regeneração em elementos perdidos. Em Girardia tigrina, Saló (2001) afirmou que sete genes HOX foram identificados sendo DTHOX-A a DTHOX-G. Durante a regeneração do fragmento da cauda, que irá formar a cabeça, ocorre baixa expressão do DTHOX-C e D. Já no fragmento que irá formar a cauda o gene DTHOX-D se expressa mais cedo que o DTHOX-C. Um dia após sofrer a fissão, a expressão do gene HOX é pouco notada. A partir do segundo dia, a expressão ocorre dentro do blastema que formará a cauda. Alguns testes com irradiação detectaram que ao se eliminar os neoblastos, não há sinais de expressão do gene HOX, o que sugere que este grupo celular seja a principal fonte deste gene. O autor ainda afirma que estes genes são ativados e inibidos em estágios iniciais de regeneração. Tanto vertebrados como invertebrados, apresentam a necessidade da expressão do gene PAX-6 como responsável pela morfogênese do olho e desenvolvimento do sistema nervoso central. Em G. tigrina este gene se expressa nos fotorreceptores. Em estágios iniciais de regeneração da cabeça foi confirmada a expressão do gene DTPAX-6, em um grupo de células pigmentadas perto da região epidérmica dorsal, o que constitui o primeiro sinal visível da regeneração dos fotorreceptores (CALLAERTS et al. 1999). Genes do dominío POU estão relacionados com a regeneração do sistema nervoso central. Orii, Agata e Watanabe (1993) relata que este gene desempenha papel fundamental na diferenciação celular durante este processo. A família do gene WNT compreende os altamente conservados, que participam como mediadores das vias de sinalização relacionadas à expressão de genes que atuam na proliferação celular e no desenvolvimento durante o processo regenerativo (PETERSEN et al. 2009). Reddien et al. (2005) identificaram dois genes SMEDWI 1 e 2 que estão expressos em células-tronco adultas participando ativamente do processo regenerativo.

21 21 A família do gene PIWI auxilia na geração de células que promovem a regeneração. Alguns genes dessa família, segundo Reddien, (2005), implicam na regulação de células germinativas. A manutenção de células-tronco pluripotentes, que apresentam capacidade de regenerarem tecidos perdidos ou envelhecidos, ocorre devido ao papel fundamental do gene PIWI 2 (PALAKADETI et al. 2008). Estudos realizados por Palakadeti et al. (2008), com RNAi, demonstrou que planárias submetidas a esta interferência apresentaram má formações, não obtiveram o crescimento do blastema e incapacidade regenerativa foi detectada, o que confirma a importância da expressão deste gene no processo regenerativo. Este gene apresenta em alguns organismos como: PIWI-related protein (Tetrahymena thermophila), CNIWI (Podocoryne carnea), SEAWI (Strongylocentrotus purpuratus) Cniwi (Podocoryne carnea) PIWI-LIKE 2 (Canis familiaris) PIWI-LIKE 1 (Danio rerio( ROSSI, 2006). Apesar de nossos ancestrais serem bastante distantes, os seres humanos, em suas células-tronco compartilham o gene HIWI que em planárias é chamado de PIWI. Este gene está presente em células responsáveis pela regeneração, já em humanos ele expressa em espermatozóides e óvulos, bem como em algumas células que geram novas células sanguíneas. Este fato reforça ainda mais a ideia de usarmos as planárias para entendermos melhor os mecanismos revelados em células-tronco.

22 22 Tabela 1. Representação dos principais genes envolvidos na regeneração de planárias. Para o conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares do processo regenerativo em tecidos humanos se utilizam estudos a partir de modelos animais, como, por exemplo, as planárias (ALVARADO, 2012). 2.2 Planárias como modelo experimental As planárias pertencem ao quarto maior filo que inclui mais de espécies. São triploblásticos, o que inclui os animais que possuem a terceira camada de desenvolvimento (mesoderme), são acelomados, nota-se ausência de ânus, de sistema circulatório e respiratório (RIUTORT, 2012). São animais de vida livre e podem ser encontrados em rios, mares, cavernas e ambientes terrestres. Pertence à classe Turbellaria, sendo considerados macroturbelários da ordem Tricladida, além disso compõem a fauna mundialmente menos estudada. Para que haja um trabalho de conservação desta biodiversidade, é necessário antes conhecêla, porém ainda não existe estimativa sobre a riqueza de macroturbelários no

23 23 território brasileiro (CARBAYO, 2008). Os Tricladidos são caracterizados por apresentar cavidade digestória bem definida, constituída por um único tubo anterior, que se divide produzindo dois ramos posteriores, o que caracteriza o nome do grupo (CARBAYO, 2008; RIUTORT, 2012). Alimentam-se predominantemente de insetos, larvas de insetos e outros invertebrados (REDDIEN; ALVARADO, 2004). A necessidade de se desvendar lacunas deixadas por sistemas modelos genéticos tradicionais, tornam as planárias um bom representante para estudos experimentais, pois ultrapassam as limitações de propriedades regenerativas de tecidos somáticos encontrados em Drosophila e Nematódeos, e ainda supera as dificuldades de estudar células- tronco em vertebrados adultos e in vivo, pois possuem todos os tecidos com capacidade regenerativa (Figura 3) (ALVARADO, 2012). Figura 3. Capacidade regenerativa em planárias. Fonte: Reddien e Alvarado (2004).