RENATA CAMPOS NOGUEIRA

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1 1 RENATA CAMPOS NOGUEIRA ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E ANÁLISE DA ESTABILIDADE CITOGENÉTICA APÓS EXPANSÃO IN VITRO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO HUMANO. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia. Orientador: Dra. Milena Botelho Pereira Soares Feira de Santana, BA 2009

2 2 Dedico este trabalho: Aos meus queridos pais, José Eduardo e Ana Beatriz, pelo apoio incondicional para que eu seguisse o meu caminho e ao meu amado marido, Emerson F. Queiroz, por tornar os momentos difíceis mais amenos e as pequenas vitórias tão especiais.

3 3 AGRADECIMENTOS NINGUÉM É MAIS FORTE QUE TODOS NÓS JUNTOS! Esse trabalho, realizado ao longo de dois anos e meio, só foi possível devido ao empenho e suporte de diversas pessoas. Foi um momento de aprendizado, convivência e renúncia. Aprendizado na área de pesquisa, convivência com os novos colegas e com a riquíssima cultura baiana e renúncia de uma zona de conforto ilusória que impede tantas pessoas de perseguirem seus sonhos. Minha conquista, intangível, vai muito além das páginas seguintes. Nunca me esquecerei desse período. Portanto, meus sinceros agradecimentos: À minha orientadora, Dra. Milena B. P. Soares, que se tornou uma grande amiga e companheira de projetos pessoais e profissionais. Difícil expressar em palavras o agradecimento por ter viabilizado o meu sonho orientando tanto o meu trabalho de mestrado como minha carreira científica e, principalmente, meu eterno reconhecimento por ter aberto sua família e amigos ao meu convívio. Finalizo esta etapa com a certeza de que alguns projetos aqui iniciados são para a vida inteira. Ao Dr. Ricardo Ribeiro do Santos, chefe do laboratório, por ter me acolhido no grupo com tanto carinho. Formador de recursos humanos me ensinou que a ciência pouco significaria se não fosse compartilhada. Meu eterno respeito. Ao querido colega Ricardo Santana de Lima pelo suporte nos primeiros dias no laboratório, um terreno completamente desconhecido, pela paciência com que me ensinou a trabalhar com cultura de células e principalmente pelo sentimento de amor ao grupo que hoje guardo comigo. À minha companheira de pesquisa Elisalva Guimarães (querida Liu). Pelo empenho incansável na citometria de fluxo, nas diferenciações, na cultura de células. Estabelecemos uma parceria de sucesso e amizade verdadeira! À Gisele Carvalho e Adriana de Oliveira pela colaboração no PCR. Sem a paciência e determinação de vocês eu não teria conseguido. À Carine Azevedo e Marcos Leal que tiveram participação efetiva na realização dos experimentos de imunofluorescência, demonstrando sempre muita consideração por mim. À Dra. Acácia de Carvalho e Dr. Spencer Payão pela fundamental contribuição na etapa de citogenética. Aos colegas de mestrado, Luís Flávio Maia e Cristina Menezes, por partilharem momentos alegres nesse período. A estrada Bahia-Feira não será mais a mesma! Aos colegas da penúltima salinha do corredor : Flávia Maciel, Denis Zubieta (que me ajudou na confecção das figuras), Dra. Mara Pires, Fernanda de Borba e mais recentemente

4 4 Dra. Zaquer Costa (que revisou profissionalmente meu manuscrito). Obrigada pela amistosa convivência. Às Dras. Fabiana Nonato e Cristiane Flora pela sincera amizade. Com vocês aprendi que é possível conciliar a responsabilidade de mãe, esposa, pesquisadora e continuar sendo, antes de tudo, você mesma. O tempo não pára! À Dra. Simone Macambira pelo amor ao ensino e formação de profissionais. Sua dedicação nos faz acreditar em sonhos e resistir aos percalços. À Roberta Couto e Lucyvera Imbroinise, em especial, pelo trabalho na administração do laboratório. Ao curso de Pós-graduação em Biotecnologia. Em especial ao Helton Ricardo, secretário, e Prof. Dr. Aristóteles Góes Neto pela dedicação aos alunos. À FAPESB pelo apoio financeiro. Aos colegas do LETI por compartilharem os momentos nesta caminhada. Ao Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz da Fundação Oswaldo Cruz por disponibilizar a excelente estrutura física. Agradecimentos especiais... À minha amada família baiana: tia Eliane, tio Marcelo e Daniel que me receberam em Salvador onde eu me senti em casa desde o primeiro dia. Hoje, a sensação é de que vocês sempre fizeram parte da minha vida. Só precisava encontrá-los! Às tias Andréia e Vera que me empurraram para fora da zona de conforto numa tarde no Rio de Janeiro durante um dos muitos períodos de angústia. As palavras de apoio foram decisivas. À minha Iazinha, longe, porém não distante. Você tem o meu amor incondicional. Ao amor dos meus irmãos, Cecília e Duda. Por causa desse sentimento de família tenho certeza de que nunca estou sozinha. À minha avó Landa que, sabiamente, diz: Dá liberdade ao Pai para que Ele conduza a trama dos teus dias... Aos meus sogros e cunhados que me receberam com tanto amor na família. Aos meus amigos, em especial minhas amigas de longa data: Alessandra Lima, Larissa Lima e Patrícia Achtschin, por entenderem meus períodos de ausência em prol da pesquisa. A Deus e aos Orixás por colocarem todas estas pessoas no meu caminho. Não existe acaso!

5 5 "Morre lentamente quem não viaja, quem não lê, quem não ouve música, quem não encontra graça em si mesmo. Morre lentamente quem destrói o seu amor-próprio, quem não se deixa ajudar. Morre lentamente quem se transforma em escravo do hábito, repetindo todos os dias os mesmos trajetos, quem não muda de marca, não se arrisca a vestir uma nova cor ou não conversa com quem não conhece. Morre lentamente quem faz da televisão o seu guru. Morre lentamente quem evita uma paixão, quem prefere o negro sobre o branco e os pontos sobre os "is" em detrimento de um redemoinho de emoções, justamente as que resgatam o brilho dos olhos, sorrisos dos bocejos, corações aos tropeços e sentimentos. Morre lentamente quem não vira a mesa quando está infeliz com seu trabalho, quem não arrisca o certo pelo incerto para ir atrás de um sonho, quem não se permite pelo menos uma vez na vida fugir dos conselhos sensatos. Morre lentamente, quem passa os dias queixando-se da sua má sorte ou da chuva incessante. Morre lentamente, quem abandona um projeto antes de iniciá-lo, não pergunta sobre um assunto que desconhece ou não responde quando lhe indagam sobre algo que sabe. Evitemos a morte em doses suaves, recordando sempre que estar vivo exige um esforço muito maior que o simples fato de respirar. Somente a perseverança fará com que conquistemos um estágio esplêndido de felicidade." Pablo Neruda

6 6 RESUMO Encontrar a fonte de célula-tronco mais apropriada para uso terapêutico depende da investigação de diversos fatores, como a sua capacidade de proliferação e estabilidade citogenética quando expandidas in vitro, assim como suas características fenotípicas e potencial de diferenciação. Neste estudo nós comparamos características de células-tronco mesenquimais isoladas do epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa de dente decíduo em momentos diferentes após expansão in vitro. Células-tronco mesenquimais (CTM) obtidas do epitélio amniótico foram facilmente isoladas, mas, expandidas in vitro com dificuldade. A expressão de Oct-4, um fator de transcrição relacionado ao fenótipo de célula-tronco indiferenciado, foi observado em culturas de CTM do tecido adiposo e polpa dentária em diferentes passagens. Estas células também apresentaram capacidade de diferenciação osteogênica e adipogênica in vitro. A análise de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo foi realizada, confirmando a presença de células expressando fenótipo característico de CTM, com identificação de diferenças entre tecido adiposo e polpa dentária. Esta fração correspondeu a uma pequena porcentagem de células (em torno de 2%). Após expansão in vitro, foram analisadas preparações cromossômicas por técnica de bandeamento G. Cariótipos normais foram encontrados em metáfases de células do tecido adiposo e polpa dentária em diferentes passagens in vitro, exceto na passagem mais avançada (20 ) da CTM derivada do tecido adiposo. Os resultados indicam que células-tronco humanas derivadas do tecido adiposo e polpa de dente decíduo possuem muitas características similares, mas não são iguais e ambas podem ser expandidas em cultura por pelo menos dez passagens sem apresentarem sinais de anormalidades cromossômicas. Apesar de muitos avanços terem sido realizados nesse campo, a correlação entre a informação experimental gerada e a aplicação clínica adequada permanece um desafio para pesquisas futuras. Palavras- chave: Tecido adiposo polpa de dente decíduo epitélio amniótico células-tronco mesenquimais expansão in vitro estabilidade citogenética

7 7 ABSTRACT Finding the most appropriate source of stem cells for therapeutic use depends on investigation of many factors, such as their capacity to proliferate and cytogenetic stability when in vitro expanded, as well as their phenotypic characteristics and differentiation potential. In this study we compared features of mesenchymal stem cells (MSC) isolated from human amniotic epithelium, adipose tissue and deciduous dental pulp different times after in vitro expansion. Mesenchymal stem cells from human amniotic epithelium were easily isolated, but difficult to expand in vitro. The other two sources of cells were easy to expand and used in a series of analyses. The expression of Oct-4, a transcription factor related to undifferentiated stem cell phenotype, was observed in cultures of MSC from adipose tissue and dental pulp in different passages. These cells had also osteogenic and adipogenic differentiation capacity in vitro. Analysis of cell surface markers by flow cytometry was performed, confirming the presence of cells expressing phenotype characteristic of MSC, although differences between adipose tissue and dental pulp. These corresponded to a small percentage of the cells (about 2%). After in vitro expansion, chromosome preparations were analyzed by G-banding techniques. Normal kariotypes were found in metaphases of cells from adipose tissue and dental pulp in different in vitro passages, except for a late passage (20 th ) of adipose tissue derived MSC. The results indicate that human adipose tissue and deciduous dental pulp derived stem cells posses many similarities regarding their characteristics but they are not equal and both cultures can be expanded for at least ten passages without signs of chromosomal abnormalities. Although many advances have been made in this field, connection between the experimental information generated and the suitable clinical application remains a challenge for future research. Keywords Adipose tissue deciduous dental pulp amniotic epithelium mesenchymal stem cells in vitro expansion cytogenetic stability

8 8 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular. 18 Figura 2 Método de obtenção de CTM de diferentes fontes pela seleção de 23 células aderentes. Figura 3 Isolamento de células-tronco mononucleares humanas pela técnica 25 de Boyum utilizando sucessivas centrifugações. Figura 4 Esquema de diferenciação de CTM em linhagem osteogênica, 28 adipogência e condrogênica quando expostas aos diferentes meios indutores de diferenciação. Figura 5 Delineamento experimental do processo de extração, análise e 30 diferenciação osteogênica e adipogênica das CTM. Figura 6 Isolamento de CTM da membrana placentária. 31 Figura 7 Isolamento de CTM do tecido adiposo. 32 Figura 8 Isolamento de CTM da polpa de dente decíduo. 33 Figura 9 Cultura de CTM aderentes provenientes do tecido adiposo. 40 Figura 10 Cultura de CTM aderentes provenientes da polpa de dente decíduo. 40 Figura 11 Cultura de CTM aderentes provenientes do epitélio amniótico. 40 Figura 12 Micrografias de culturas de CTM 41 Figura 13 Análise de CTM do epitélio amniótico na 10 a passagem de cultura 42 in vitro. Figura 14 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo 44 na 4 passagem. Figura 15 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas do tecido adiposo 45 na 10 passagem. Figura 16 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície 46 característicos de CTM. Figura 17 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente 47 decíduo na 4 passagem. Figura 18 Análise por citometria de fluxo de CTM obtidas da polpa de dente 48 decíduo na 10 passagem. Figura 19 Comparação do percentual de expressão de antígenos de superfície característicos de CTM. 49

9 9 Figura 20 RT-PCR de culturas de CTM provenientes do tecido adiposo e polpa 49 de dente decíduo. Figura 21 Diferenciação adipogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51 Figura 22 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas do tecido adiposo. 51 Figura 23 Diferenciação osteogênica de CTM derivadas da polpa de dente 51 decíduo. Figura 24 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo 53 in vitro na 2 a passagem. Figura 25 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo 53 in vitro na 10 a passagem. Figura 26 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM 54 derivada do tecido adiposo. Figura 27 Cariótipo de cromossomo pela técnica de bandeamento G de CTM 54 derivada da polpa de dente decíduo. Figura 28 Metáfases de CTM derivadas de tecido adiposo humano após cultivo 55 in vitro na 20 a passagem. Figura 29 Características das culturas de CTM derivada de epitélio amniótico, tecido adiposo e polpa do dente decíduo.

10 10 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Anticorpos e seus fornecedores utilizados na citometria de fluxo. 35 Tabela 2 Condições empregadas na reação de PCR. 37 Tabela 3 Análise por citometria de fluxo de CTM do epitélio amniótico na 10 passagem de cultura in vitro. 43

11 11 LISTA DE ABREVIATURAS CTE CTM MO CTDA LIF TGF-β IBMX CD PCR HBSS SBF MEM Célula-tronco embrionária Célula-tronco mesenquimal Medula óssea Célula-tronco derivada do tecido adiposo Leukemia inhibitory factor Transforming growth factor-β Isobutil metil xantina Grupo de diferenciação Reação da cadeia em polimerase Hank s balanced salt solution Soro bovino fetal Minimum essential medium

12 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 14 2 OBJETIVOS 17 3 REVISÃO DA LITERATURA CÉLULAS TRONCO Células-tronco adultas CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS Obtenção Caracterização Marcadores de superfície Expressão de fatores de transcrição Potencial de diferenciação 27 4 MATERIAL E MÉTODOS DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ISOLAMENTO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Epitélio amniótico Tecido adiposo Polpa de dente decíduo SELEÇÃO E EXPANSÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS CARACTERIZAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Coloração por Giemsa Citometria de fluxo Análise da expressão do Oct-4 por RT-PCR semi-quantitativo Diferenciação osteogênica 38

13 Diferenciação adipogênica ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 39 5 RESULTADOS ANÁLISE QUALITATIVA DAS CTM DERIVADAS DO EPITÉLIO AMNIÓTICO, TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO SELEÇÃO DE CTM ADERENTES MORFOLOGIA DE CTM DERIVADA DO TECIDO ADIPOSO E POLPA DE DENTE DECÍDUO MARCADORES DE SUPERFÍCIE CITOMETRIA DE FLUXO ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAÇÃO INDUZIDA ESTABILIDADE CITOGENÉTICA 53 6 DISCUSSÃO 57 7 CONCLUSÕES 62 8 REFERÊNCIAS 63 9 ANEXOS ARTIGO 1 - EARLY TOXICITY SCREENING AND SELECTION OF LEAD COMPOUNDS FOR PARASITIC DISEASES. 9.2 ARTIGO 2 - CURRENT STATUS OF STEM CELL THERAPY FOR LIVER DISEASES 71 80

14 14 1 INTRODUÇÃO As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As célulastronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). As células-tronco adultas estão presentes no organismo após o nascimento. Dentre os principais tipos de células-tronco adultas identificadas temos as células-tronco mesenquimais (CTM), que atuam no reparo e homeostase em vários tecidos do corpo. São células precursoras capazes de se diferenciar em vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo (DAN et al., 2008). Atualmente, as células-tronco têm sido objeto de crescente estudo pela suas potenciais aplicações na área biomédica. Na literatura existem relatos da segurança clínica da utilização de terapia com célulastronco, como, por exemplo, a transfusão autóloga de células mononucleares da medula óssea na artéria hepática em pacientes com doenças crônicas do fígado (LYRA et al., 2007), nas coronárias em pacientes com cardiopatia chagásica crônica (VILAS-BOAS et al 2006) assim como em pacientes com infarto crônico do miocárdio (YAO et al 2008) e na via intramuscular e intra-arterial de membros inferiores isquêmicos de pacientes diabéticos (GU et al 2008), dentre outros. O fato das células serem autólogas, eliminando assim o risco de rejeição imune, e representarem uma fonte acessível e isenta de complicações éticas também contribui para o crescente interesse da comunidade científica em terapia celular. Casos de sucessos de transplantes alogênicos, como na estimulação do crescimento em crianças com osteogenesis imperfecta (HORWITZ et al., 2002) pelo tratamento com CTM isoladas da medula óssea e expandidas in vitro, reforçam o cenário de um futuro promissor para a terapia celular. A identificação de novas fontes de CTM é imprescindível para o sucesso da terapia celular. As células devem possuir boa capacidade proliferativa, manutenção das características imunofenotípicas quando cultivadas in vitro e estabilidade citogenética. O futuro aponta para a existência de uma fonte preferencial para uma dada terapia, estabelecendo assim uma correlação entre marcadores imunofenotípicos e reparação tecidual. Estudos recentes sinalizam o potencial de CTM proveniente da polpa dentária na regeneração óssea pela sua expressão de marcadores ósseos (GRONTHOS et al., 2002) e habilidade em regenerar o complexo de polpa da dentina composto de matriz mineralizada (GRONTHOS et al., 2000).

15 15 A medula óssea (MO) é a principal fonte de CTM utilizadas até o momento. Porém, o procedimento de obtenção dessas células é invasivo, e o número e o potencial de diferenciação e proliferação diminuem com a idade (STENDERUP et al., 2003). O método padrão de isolamento de CTM baseia-se na sua capacidade de aderência ao plástico (FRIEDENSTEIN et al., 1970). Relatos na literatura demonstram o isolamento de CTM provenientes de outras fontes facilmente accessíveis, tais como a membrana placentária (MIKI et al., 2005), tecido adiposo (ZUK et al., 2001) e polpa dentária (GRONTHOS et al., 2002). O potencial proliferativo de uma célula é inversamente proporcional ao nível de especialização da mesma (DAN et al., 2008). Espera-se, portanto, que células com fenótipo indiferenciado possuam alta capacidade de expansão. A estabilidade cromossômica em culturas de CTM após sucessivas passagens também deve ser avaliada, uma vez que, in vivo, mudanças cromossômicas geralmente resultam em carcinogênese (CATALINA et al., 2007). As CTM devem possuir capacidade de diferenciação nas linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica, de acordo com critérios propostos pelo Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al., 2006). A caracterização das CTM através da análise da expressão de antígenos de superfície por citometria de fluxo, foi proposta pelo Comitê de Célula Tronco Tecidual e Mesenquimal da Sociedade Internacional para Terapia Celular (DOMINICI et al., 2006). Esse comitê estabeleceu critérios para caracterizar CTM humana baseado nos estudos com CTM proveniente de medula óssea. Até o momento não foi identificado nenhum marcador específico para as CTM e na literatura encontram-se proposições para isolar uma população pura de CTM de um tecido (PITTENGER et al., 1999; ALSALAMEH et al., 2004), mas, ainda não existe um consenso. Já foi demonstrado que a expressão de antígenos pode mudar com o cultivo in vitro (FIBBE, 2003) e que pode haver variação na expressão de acordo com o tipo de tecido em que foi extraída a célula (GRONTHOS et al., 2001). A presença de reguladores centrais, como Oct-4, Nanog e Sox-2 responsáveis pela manutenção do estado pluripotente e de autorenovação de CTE humanas (NIWA et al 2000) também pode ser investigada nas culturas de CTM. Já foi demonstrado na literatura a expressão dos marcadores de células-tronco embrionárias em CTM proveniente da polpa dentária (KERKIS et al., 2006) e da membrana placentária (MIKI et al., 2005). Portanto, nesse estudo investigamos as características das CTM provenientes de três fontes: membrana placentária, tecido adiposo e polpa de dente decíduo. Foram avaliados a

16 16 expressão gênica e de marcadores de superfície, o potencial proliferativo e de diferenciação e a manutenção da estabilidade citogenética quando expandidas in vitro.

17 17 2 OBJETIVOS GERAL Caracterizar comparativamente fontes de células-tronco mesenquimais para utilização em terapia celular. ESPECÍFICOS Extrair células-tronco do epitélio amniótico, da polpa do dente decíduo e do tecido adiposo humanos; Caracterizar fenotipicamente as células-tronco adultas provenientes desses tecidos, de acordo com sua morfologia e expressão de antígenos característicos; Identificar a expressão de fatores de transcrição responsáveis pela manutenção do estado indiferenciado das células; Investigar o potencial de diferenciação destas células nas linhagens osteogênicas e adipogênicas. Analisar a manutenção numérica e estrutural do cariótipo normal das células após sucessivas passagens.

18 18 3 REVISÃO DA LITERATURA 3.1. CÉLULAS-TRONCO As células-tronco têm sido objeto de interesse científico crescente pela sua utilidade em inúmeras aplicações biomédicas. São definidas por duas características essenciais: 1º - são capazes de gerar cópias idênticas de si mesmas, se autorenovando; 2º - originam diferentes tipos celulares mais especializados do corpo humano, tais como cardiomiócitos, hepatócitos, ilhotas pancreáticas e células nervosas (GROVE et al., 2004). Diferenciação é o processo através do qual uma célula adquire nova morfologia e característica funcional (THEISE & KRAUSE, 2002). A diferenciação in vivo leva ao estabelecimento de linhagens celulares somáticas da camada precursora germinativa durante o desenvolvimento dos mamíferos. De qualquer modo, o processo é também prevalente no reparo e manutenção de tecidos durante a vida pós-natal e adulta, assim como na diferenciação de células-tronco da medula óssea em células sanguíneas eritróides e mielóides funcionais (GROVE et al, 2004). As células-tronco podem ser classificadas em duas grandes categorias, de acordo com seu estágio de desenvolvimento: embrionárias e não embrionárias, ou adultas. As célulastronco embrionárias (CTE) são isoladas da massa celular interna do embrião no estágio de blastocisto (MARTIN, 1981; NAGY et al., 1990). São células capazes de originar todos os tecidos do organismo, incluindo o tecido extraembrionário durante o desenvolvimento. Thomson e colaboradores (1998) isolaram células-tronco embrionárias humanas pela primeira vez, e posteriormente foi demonstrado que estas células possuem a mesma plasticidade encontrada nas células-tronco embrionárias de camundongos, ou seja, a habilidade de se diferenciar em vários tipos de células somáticas com características funcionais, tais como neurônios, hepatócitos e cardiomiócitos (MULLER et al.,2002; XU et al., 2002). As células-tronco podem, ainda, ser classificadas quanto ao seu potencial de diferenciação e plasticidade, ou seja, o potencial de formação de diferentes tipos de células maduras (figura 1). Por exemplo, uma célula multipotente possui a capacidade de se diferenciar em múltiplos tipos celulares não restritos a uma única camada germinativa. Tem sido demonstrada a diferenciação de células-tronco residentes de um determinado tecido em células características de outro tecido (SNYKERS et al., 2007; TALÉNS-VISCONTI et al., 2006). Uma célula é dita pluripotente quando se diferencia em todos os tipos celulares

19 19 encontrados no organismo. Uma célula totipotente pode dar origem a um organismo inteiro, incluindo membranas extra-embrionárias e placenta. As CTE são classificadas como pluripotentes (SOLTER, 2006), pois mesmo sendo possível obter um embrião e camundongos adultos das CTE, estas não podem derivar as membranas extra-embrionárias e placenta (NAGY et al, 1993). Essa classificação está em constante mudança com os avanços das pesquisas na área. Outros autores já classificam as CTE como totipotentes (DAN et al.2008). PLASTICIDADE DE ACORDO COM O GRAU DE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR PLASTICIDADE Figura 1. Plasticidade de acordo com o grau de especialização celular Células-tronco adultas A célula-tronco adulta é uma célula indiferenciada encontrada em um tecido diferenciado do organismo. Elas são responsáveis pela auto-renovação e homeostase do seu tecido de origem ao longo da vida (MINGUELL et al., 2001). As células-tronco adultas mais estudadas são as células-tronco da medula óssea. A medula óssea humana, derivada do mesoderma embrionário, é um tecido complexo formado por uma população de células-tronco hematopoiéticas, tendo como suporte o estroma mesenquimal. O estroma da medula óssea possui uma composição heterogênea, sendo reservatório de várias populações de células-tronco, entre elas as CTM e as células-tronco progenitoras multipotentes adultas (JIANG et al., 2002). A medula óssea foi a primeira fonte de CTM relatada na literatura. Hoje existem referências de propagação de CTM a partir de

20 20 inúmeros tecidos e órgãos, tais como o cérebro (CLARKE et al., 2000), o fígado (YANG et al., 2002), a pele (TOMA et al., 2001), o tecido adiposo (ZUK et al., 2001), o músculo esquelético (JACKSON et al., 1999), e o sangue (ZHAO et al., 2003). Jiang e colaboradores (2002) descreveram que as CTM mantêm sua morfologia, o comprimento de telômero (27 kb), e a habilidade de se diferenciar mesmo depois de 60 divisões celulares. Já foi demonstrada in vitro a diferenciação dessas células em uma enorme variedade de tipos celulares, tais como osteoblastos, adipócitos, condrócitos, células endoteliais, miócitos esqueléticos, glia, neurônios e cardiomiócitos (ALVAREZ-DOLADO et al., 2003) CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS As células-tronco mesenquimais (CTM) são células especializadas que atuam no reparo e homeostase de vários tecidos do corpo. São células precursoras, capazes de se diferenciar em vários tipos celulares diferentes, mas não em todas as células do organismo. As CTM podem ser extraídas de diversos órgãos, expandidas em cultura como uma população aderente de células com formato fusiforme semelhante ao de fibroblastos, e induzidas a se diferenciar em múltiplos tipos celulares (BAKSH et al. 2004; DOCHEVA et al., 2007). A utilização das CTM na medicina regenerativa para indução de reparo tecidual tem sido objeto de estudo em diversos grupos de pesquisa no mundo. Uma série de trabalhos experimentais envolvendo o uso terapêutico destas células tem demonstrado sua eficiência, por exemplo, em doenças cardíacas (DAI et al., 2005), hepáticas (KUO et al., 2008) neurológicas (CHOPP & LI, 2002) e renais (MORIGI et al. 2008). Esse procedimento tem sido promissor também na esfera clínica, onde se observa um crescimento exponencial de trabalhos publicados nos últimos anos (HORWITZ et al., 2002; KHARAZIHA et al., 2009). Em conjunto, os estudos experimentais e clínicos parecem indicar um efeito protetor das CTM decorrente de fatores por elas secretados. Existem algumas barreiras técnicas importantes a serem superadas na implantação desta terapia, tais como o alto custo de expansão das células, presença reduzida nos tecidos e dificuldades na caracterização das mesmas. No entanto, espera-se que a terapia celular com CTM seja uma opção terapêutica em um médio a longo prazo. A geração de linhagens celulares humanas para teste de drogas é outro campo onde se espera grande emprego das CTM (DAVILA et al, 2004). O estabelecimento de testes toxicológicos in vitro com células humanas especializadas, ao invés de células animais, pode

21 21 representar um enorme avanço na predição de efeitos colaterais em humanos. Por exemplo, hepatócitos e cardiomiócitos provenientes de células-tronco in vitro podem ser utilizados rotineiramente para excluir novas entidades químicas que estejam no processo de screening baseado na hepatotoxicidade e cardiotoxicidade observada, duas maiores causas de falha do desenvolvimento pré-clínico de novas drogas terapêuticas. Portanto, uma triagem in vitro baseada em células hepáticas humanas, visando à identificação de hepatotoxicidade nos estágios iniciais de desenvolvimento de um medicamento, pode representar uma economia de tempo e recursos (NOGUEIRA et al., 2009). A diferenciação de CTM em hepatócitos tem sido largamente investigada (SNYKERS et al 2009) tendo sido objeto de inúmeras revisões, inclusive pelo nosso grupo (SOUZA et al 2009 aguardando impressão), e já se observam depósitos de patentes de testes in vitro utilizando estas células (PCT/EP2004/012134). O método tradicional de obtenção de células a partir da medula óssea por punção da crista ilíaca é invasivo e sabe-se que o número de células obtidas por procedimento é influenciado pela idade do paciente (STENDERUP et al., 2003). Assim como a medula óssea, o tecido adiposo é um órgão derivado do mesoderma e contém uma população estromal de células endoteliais microvasculares, células do músculo liso e células-tronco (ZUK et al., 2001). Essas células podem ser dissociadas enzimaticamente do tecido adiposo (comumente obtido por lipoaspiração) e separada dos adipócitos por centrifugação. Uma população celular é obtida quando submetida a condições de crescimento seletivas para CTM. Essa população chamada célula-tronco derivada de tecido adiposo (CTDA), possui muitas características em comum com as células derivadas da medula óssea, tais como um extenso potencial proliferativo e capacidade de diferenciação em tipos celulares característicos de outros tecidos (DE UGARTE et al., 2003). A descoberta das CTDA pode ser de grande importância para a terapia celular. Enquanto a idade do paciente limita a quantidade de medula que pode ser obtida e aumenta o tempo em cultura necessário para se atingir a dose celular terapêutica, a obtenção de CTM derivadas do tecido adiposo representa uma fonte alternativa de células que podem ser obtidas em grande quantidade com anestesia local e desconforto mínimo (STREM et al., 2005). Dentre as fontes de células-tronco mesenquimais está o epitélio amniótico placentário. A placenta contém três camadas, o âmnion, o córion e a decídua. Cada camada é derivada de várias fontes diferentes. Apesar de a decídua ser de derivação materna, o âmnion e o córion se derivam do embrião. Enquanto o córion é derivado do trofoblasto, o âmnion é derivado do epiblasto oito dias após a fertilização. Portanto, o epiblasto origina o âmnion, assim como todas as camadas germinativas do embrião. A gastrulação ocorre aproximadamente três