Magnetoeletroquímica de Partículas de Magnetita Modificadas com Quitosana e Ferroceno para Aplicação em Bioeletrocatálise

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1 Magnetoeletroquímica de Partículas de Magnetita Modificadas com Quitosana e Ferroceno para Aplicação em Bioeletrocatálise Antonio Francisco Arcanjo de Araújo Melo Dissertação apresentada como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Nanociências e Materiais Avançados. Orientador: Prof. Dr. Frank Nelson Crespilho Santo André Março de

2 Antonio Francisco Arcanjo de Araújo Melo Magnetoeletroquímica de Partículas de Magnetita Modificadas com Quitosana e Ferroceno para Aplicação em Bioeletrocatálise Santo André Março de

3 DEDICATÓRIA Este trabalho de Mestrado é dedicado a toda minha família, em especial aos meus pais Antonio Arcanjo de Araújo e Maria do Carmo Melo da Silva; e ao meu irmão Antonio Arcanjo de Araújo Junior. 3

4 AGRADECIMENTOS A Deus, pelo dom da vida concedido; Aos meus pais Antonio Arcanjo de Araújo e Maria do Carmo Melo da Silva, pelos ensinamentos de vida que me foram passados, prezando sempre pela honestidade, humildade e respeito para com todos; Aos professores Dr. Welter Canthanhêde da Silva e Dr. Jose Milton Elias de Matos, pela confiança depositada; Ao meu orientador Prof. Dr. Frank Nelson Crespilho, pela paciência e incentivo durante a realização deste trabalho; A todos os alunos do Grupo de Materiais e Métodos Avançados (GM 2 Av), em especial os amigos Vitor Alexandre Nunes de Carvalho, Roberto Alves de Sousa Luz, Kamila Cássia Pagnoncelli e Rodrigo Michelin Iost, pelo apoio nos momentos difíceis e por todas as alegrias compartilhadas; A todos os amigos e professores da Universidade Federal do ABC que de maneira direta e indireta participaram da minha formação acadêmica. À Universidade Federal do ABC, pela bolsa de mestrado e infraestrutura concedida, fundamentais no desenvolvimento deste trabalho. 4

5 Se a educação sozinha não pode transformar a sociedade, tampouco sem ela a sociedade muda. Paulo Freire 5

6 SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT 1. INTRODUÇÃO Magnetoeletroquímica Magnetoeletroquímica Aplicada em Sistemas Enzimáticos Partículas de Magnetita (Fe 3 O 4 ) Quitosana Ferroceno Glicose Oxidase OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Materiais e Reagentes Síntese e Modificação de Fe 3 O Obtenção do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx Caracterização das Partículas de Fe 3 O 4 e Fe 3 O 4 -Modificadas Estudos de Magnetoeletroquímica RESULTADOS E DISCUSSÃO Sintese e Caracterização de Partículas de Fe 3 O Caracterização das Particulas de Fe 3 O 4 Modificada com Quitosana Caracterização do Compósito Fe 3 O 4 -Quit Modificado com Ferroceno Magnetoeletroquímica para Fe 3 O 4 -Quit-Fc Parâmetros Cinéticos e Termodinâmicos Estabilidade Eletroquímica Estudos Iniciais de Magnetoeletroquímica para o sistema Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO

7 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura cristalina de Fe 3 O 4 : Espinélio inverso Figura 2. Estruturas químicas da quitina e quitosana Figura 3. Estrutura química do ferroceno com seus dois anéis Cp conformados eclipsadamente Figura 4. Esquema da transferência de elétron para o sistema ferroceno / cátion ferrocino Figura 5. Representação estrutural da enzima GOx Figura 6. a) Esquema de síntese das partículas de Fe 3 O 4 pelo método de coprecipitação. b) Modificação das partículas de Fe 3 O 4 com quitosana. c) Modificação de Fe 3 O 4 -Quit com moléculas do medidor redox ferroceno Figura 7. Esquema ilustrativo da obtenção do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx Figura 8. Fotografias do equipamento MagnetoElectron constituído por ímãs de neodímio-ferro-boro localizados em um carrinho que se desloca sobre a superfície de um trilho posicionado atrás do eletrodo de trabalho em uma cela eletroquímica convencional Figura 9. a) Esquema ilustrativo do MagnetoElectron que consiste em um modulador de campo magnético comutável acoplado a uma cela eletroquímica convencional de 3 eletrodos (ET = eletrodo de trabalho, RE = eletrodo de referência e CE = contra eletrodo) ligado a um potenciostato. b) MagnetoElectron empregado nas configuração I e II

8 Figura 10. a) Fotografias das soluções precursoras de FeCl 2.4H 2 O 0,05 mol L -1, FeCl 3 0,1 mol L -1 e da suspensão de Fe 3 O 4. b) Resposta magnética da suspensão Fe 3 O 4 ao campo magnético externo aplicado Figura 11. Espectros de UV-Vis da solução de FeCl 3 3 mmol L -1 (a) e da suspensão de Fe 3 O 4 (b). Em destaque, tem-se o aumento da linha de base referente ao espalhamento de luz das partículas de Fe 3 O 4 em suspensão Figura 12. Difratograma para o pó obtido de Fe 3 O 4 (a) e a ficha cristalográfica ICSD para o padrão de magnetita (b) Figura 13. Imagens FEG-SEM das partículas de Fe 3 O 4 depositadas em substrato de silício. Em destaque, tem-se um zoom de uma partícula de Fe 3 O Figura 14. Espectros de FTIR para Fe 3 O 4 (a), quitosana (b) e Fe 3 O 4 -Quit (c) Figura 15. Difratogramas para os pós de Fe 3 O 4 (a), Fe 3 O 4 -Quit (b) e Fe 3 O 4 -Quit-Fc (c) Figura 16. Comparação do ganho de corrente entre os modos desligado (a) e ligado (b) para o suspensão de Fe 3 O 4 -Quit-Fc (10 mg ml -1 ) - configuração I do MagnetoElectron. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1 ph 7,0. Dados: ʋ = 100 mv s Figura 17. Voltamogramas cíclicos em diferentes velocidades de varredura ( mv s -1 ) para a suspensão de Fe 3 O 4 -Quit-Fc (10 mg ml -1 ) nos modos desligado (a) e ligado (b) - configuração I do MagnetoElectron. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1 ph 7,0. Dados: ʋ = mv s

9 Figura 18. Controle magnético dos processos redox de Fe 3 O 4 -Quit-Fc utilizando os modos ligado e desligado do MagnetoElectron (configuração II). Potencial aplicado: 0,34 V. Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1 ph 7, Figura 19. Estudo da estabilidade eletroquímica de Fe 3 O 4 -Quit-Fc (configuração II do MagnetoElectron) em vários intervalos de tempo: (a) 1 hora; (b) 5 horas; (c) 12 horas e (d) 24 horas. Potencial aplicado: 0,34 V. Dados: Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1, ph 7, Figura 20. Resposta magnética da suspensão de Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx ao campo magnético externo aplicado Figura 21. Voltamogramas cíclicos para Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx na ausência de glicose (a), na presença de 20 mmol L -1 de glicose utilizando o modulador magnético (configuração I) nos modos desligado (b) e ligado (c). Eletrólito suporte: tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1 ph 7,0. Dados: ʋ = 10 mv s

10 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS GOx - glicose oxidase FAD - flavina adenina dinucleotídio Fe 3 O 4 - partículas de magnetita LDH - lactato desidrogenase PQQ - pirroloquinolina quinona NADH - nicotinamida adenina dinucleotídeo PDDA - poli(cloreto de dialildimetilamônio) Quit - quitosana C 60 - fulereno Fc - ferroceno IL - líquido iônico Cp - η 5 -ciclopentadienil UV-Vis - Espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta-visível FTIR - Espectroscopia vibracional na região do Infravermelho com transformada de Fourier DRX - Difração de raios X VC - Voltametria cíclica PBS - (phosphate buffer solution) - solução tampão fosfato ATR - (attenuated total reflection) - reflectância total atenuada ITO - vidro recoberto com óxido de estanho dopado com índio GM 2 Av - Grupo de Materiais e Métodos Avançados da Universidade Federal do ABC FEG-SEM - (field emission gun scanning electron microscopy) - microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo 10

11 LISTA DE SIMBOLOS - comprimento de onda (nm) α ext - coeficiente de extinção α abs - coeficiente de absorção α sca - coeficiente de espalhamento θ - teta (graus) J - densidade de corrente (µa cm -2 ) A - Ampere E - potencial elétrico (V) V - Volts Ag/AgCl - prata / cloreto de prata ʋ - velocidade de varredura (mv s -1 ) Epa potencial de pico anódico (V) Epc- potencial de pico catódico (V) 11

12 RESUMO Magnetoeletroquímica é área da ciência que estuda os fenômenos eletroquímicos na presença de um campo magnético externo. Recentemente, suspensões coloidais contendo partículas de magnetita (Fe 3 O 4 ) modificadas têm sido aplicadas no controle magnético de reações bioeletrocatalíticas. Neste contexto, esta dissertação apresenta a síntese de um novo material (Fe 3 O 4 -Quit-Fc) proveniente da adsorção entre o mediador redox ferroceno (Fc) e a superfície das partículas de Fe 3 O 4 (~1 µm) modificadas com quitosana (Quit). A suspensão de Fe 3 O 4 -Quit-Fc (10 mg ml -1 ) foi submetida aos estudos voltamétricos na ausência e na presença de um campo magnético externo (0,24 T) perpendicular ao plano de um eletrodo de ITO, área de 1 cm 2. Na presença do campo, foi observado um aumento de 1,63 e 3,64 µa cm -2 nas correntes de pico catódicas e anódicas, respectivamente, referentes ao par redox ferroceno/ferrocino. Os resultados mostraram que as partículas de Fe 3 O 4 -Quit-Fc são atraídas no sentido das linhas de campo, onde são estabelecidas condições de fluxo por convecção forçada aumentando o transporte de massa em direção a superfície do eletrodo de trabalho. Isso faz com que maior quantidade de Fc presente nas partículas Fe 3 O 4 -Quit-Fc participe dos processos eletroquímicos, resultando no aumento dos valores de densidade de corrente. Por cronoamperometria, observaram-se que as partículas de Fe 3 O 4 -Quit-Fc são estáveis e podem atuar de forma reversível em estados campo comutável. Por fim, imobilizou-se a enzima glicose oxidase (GOx) na superfície das partículas Fe 3 O 4 -Quit-Fc por meio da ligação cruzada entre a GOx e quitosana utilizando moléculas de glutaraldeído. Por voltametria cíclica, investigou-se a atividade catalítica do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx em suspensão na presença de 20 mmol L -1 de glicose. Quando na presença de campo, observa-se um aumento de 3,2 µa cm -2 na corrente eletrocatalítica de oxidação de peróxido de hidrogênio, um subproduto da oxidação de glicose. Com base nesses resultados, acredita-se que seja possível alcançar um controle fino de reações biocatalíticas sob a influência do campo magnético externo. 12

13 ABSTRACT Magnetoelectrochemistry is the area of science that studies the electrochemical phenomena in the presence of an external magnetic field. Recently, colloidal suspensions containing particles of modified magnetite (Fe 3 O 4 ) have been applied in the magnetic control of bioelectrocatalytic reactions. In this context, this dissertation mentions the synthesis of a new material (Fe 3 O 4 -Chit-Fc) from the adsorption between the ferrocene redox mediator (Fc) on the surface of Fe 3 O 4 particles (~1 μm) modified with chitosan (Chit). The Fe 3 O 4 -Chit-Fc suspension (10 mg ml -1 ) was subjected to voltammetric studies in the absence and presence of an external magnetic field (0.24 T) applied perpendicularity to the plane of an ITO electrode (glass coated with tin oxide doped with indium, area of 1 cm 2 ). In the presence of the magnetic field, it was observed increases of 1.63 and 3.64 μa cm -2 in the cathodic and anodic and peaks currents, respectively. The latter is related to the redox couple ferrocene/ferrocino. It is suggests that Fe 3 O 4 -Chit-Fc particles are attracted towards the field lines, where flow conditions are established by forced convection and increasing the mass transport towards the surface of the electrode. Consequently, a more quantity of Fc on Fe 3 O 4 -Chit-Fc increase the current density. From chronoamperometry, it was observed that the Fe 3 O 4 -Chit-Fc particles are stable and can act reversibly at the switchable field states. Finally, it is immobilized the glucose oxidase enzyme (GOx) on the surface of Fe 3 O 4 -Chit-Fc particles by cross-linking between GOx and chitosan using glutaraldehyde. By cyclic voltammetric, it was investigated the catalytic activity of the Fe 3 O 4 -Chit-Fc/GOx suspension in the presence of 20 mmol L -1 glucose. In the presence of the field, there is an increase of 3.2 μa cm -2 in the electrocatalytic current of hydrogen peroxide oxidation, a product of the glucose oxidation. Based on these results, it is believed that it is possible to achieve high control of biocatalytic reactions under the influence of external magnetic field. 13

14 1. INTRODUÇÃO 1.1 Magnetoeletroquímica A magnetoeletroquímica é área da ciência que estuda os fenômenos eletroquímicos na presença de um campo magnético externo. Faraday foi o pioneiro na realização de estudos dessa natureza há mais de um século atrás [1]. No entanto, somente nos últimos 30 anos houve um significativo avanço nessa área. Até 1983, os primeiros trabalhos se dedicavam a estudar a eletrodeposição controlada de cobre na presença de campos magnéticos [2,3]. Nesses estudos, evidenciaram-se uma modificação estrutural do cobre eletrodepositado e o aumento das correntes faradaicas devido ao aumento no transporte de massa em solução, sendo essas, consequências diretas da atuação da força de Lorentz. Em 1990, utilizando eletrodos horizontais paralelos as linhas de indução magnéticas, Aaboubi e colaboradores observaram que o ganho de corrente referente ao par redox ferro/ferricianeto de potássio era semelhante ao observado quando eletrodos de disco rotatórios eram empregados [4]. Essa constatação possibilitou a criação de uma relação semi-empírica baseada em relações clássicas de magnetohidrodinâmica, que explica o aumento de corrente obtido em um processo faradaico em função de um campo magneto aplicado. No final da década de 90, em um estudo sobre o efeito do campo magnético nos processos redox de moléculas aromáticas, Leventes e colaboradores apresentaram uma nova relação semi-empírica que incluía a viscosidade cinemática do eletrólito como um novo parâmetro a ser considerado. Os autores observaram uma dependência não linear do aumento das correntes em função do número de elétrons envolvidos no processo redox [5]. Em magnetoeletroquímica, as variáveis que resultam no aumento do transporte de massa já estão bem estabelecidas, em contraste com a dinâmica dos processos de transferência heterogênea de elétrons, que ainda é bastante controversa. Assim, diversas relações semi-empíricas têm sido propostas, o que leva a não existir um modelo teórico completo que explique todos os fenômenos que ocorrem em experimentos de magnetoeletroquímica. Dessa maneira, todas as relações semi-empíricas propostas até hoje não podem ser generalizadas, tornando-se específicas para cada condição experimental. 14

15 Apesar das dificuldades encontradas na modelagem de experimentos eletroquímicos na presença de um campo magnético externo, estudos de magnetoeletroquímica podem se estender a outras aplicações, como o controle magnético de reações bioeletrocatalíticas, conforme descrito a seguir. 1.2 Magnetoeletroquímica Aplicada em Sistemas Enzimáticos No começo do século XXI, Willner e colaboradores seguiram uma abordagem em magnetoeletroquímica diferente à descrita no tópico anterior. Eles demonstraram pela primeira vez o controle magnético da reação catalisada pela enzima glicose oxidase (GOx), no qual partículas de magnetita (Fe 3 O 4 ) modificadas com ácido aminohexanóico N-metiloferrocenil (derivado do ferroceno insolúvel) foram utilizadas com o intuito de mediar o contato elétrico entre o eletrodo de trabalho e a enzima GOx que se encontrava dispersa em solução [6]. Para isso, propuseram dois estados de comutação, os modos ligado e desligado. No modo ligado, um imã foi posicionado abaixo do eletrodo de trabalho e, em seguida, as partículas modificadas de Fe 3 O 4 foram atraídas para a superfície eletródica, permitindo a oxidação da glicose. Já no modo desligado, quando o imã foi posicionado acima do eletrodo, as partículas de Fe 3 O 4 modificadas foram removidas de sua superfície evitando a oxidação da glicose. Da mesma forma, Katz e colaboradores reportaram o funcionamento de um sistema integrado com duas enzimas, GOx e lactato desidrogenase (LDH), onde um imã foi utilizado para modular a análise seletiva de seus respectivos substratos, glicose e lactato (a análise seletiva de glicose e lactato só foi possível com o bloqueio de uma das reações bioeletrocatalíticas). Nesse experimento, ao posicionar o imã acima do eletrodo de ouro funcionalizado com uma monocamada de ácido aminohexanóico N-(metiloferrocenil), observou-se a oxidação da glicose. Entretanto, quando o mesmo foi posicionado abaixo do eletrodo, as partículas de Fe 3 O 4 modificadas com pirroloquinolina quinona (PQQ) foram atraídas para a sua superfície, ocorrendo assim à oxidação de lactato e o bloqueio da reação catalisada pela GOx [7]. Em outro estudo, Katz em colaboração com Willner demonstrou o deslocamento lateral das partículas de Fe 3 O 4 modificadas com PQQ sobre a superfície de um eletrodo de vidro recoberto com ouro, permitindo a oxidação da 15

16 nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) em locais pré-determinados [8]. Zhai e colaboradores reportaram a construção de um biocompósito (Fe 3 O 4 -PDDA-GOx) formado por partículas de Fe 3 O 4 modificadas com poli(cloreto de dialildimetilamônio) (PDDA) e GOx. Ao contrário de Willner, o sinal eletrocatalítico do biocompósito foi modulado sem a necessidade de removê-lo da superfície do eletrodo de trabalho (lamina de microscopia revestida com uma camada de ouro de 20 nm de espessura) [9]. Ao ser aplicado um campo magnético externo, Fe 3 O 4 -PDDA-GOx orientou-se ao sentido das linhas de campo na forma de um fio, onde a variação no ângulo de incidência promoveu uma permuta entre a posição vertical e horizontal do mesmo. Na posição horizontal, uma maior corrente anódica referente ao processo bioeletrocatalico da GOx foi observada quando comparada com a posição vertical. Isso ocorreu devido a uma maior área de contato entre Fe 3 O 4 -PDDA-GOx e o eletrodo. Como observado nos trabalhos supracitados, à versatilidade no uso das partículas de Fe 3 O 4 em reações bioeletrocatalíticas advém principalmente do fato de possuírem um momento magnético permanente. Na presença de um campo magnético, as partículas de Fe 3 O 4 são atraídas no sentido das linhas de campo e agrupadas em uma região de interesse na superfície eletródica. Mais detalhes sobre a estrutura cristalina e as propriedades das partículas de Fe 3 O 4 estão descritos a seguir. 1.3 Partículas de Magnetita (Fe 3 O 4 ) As partículas de Fe 3 O 4 são óxidos de ferro pertencente à família das ferritas, representadas pela fórmula química M 2+ Fe 3+ 2 O 4, onde M é geralmente um íon referente a um metal no estado de oxidação (II) do mesmo período do ferro na tabela periódica (Mn 2+, Fe 2+, Co 2+, Ni 2+, Cu 2+ e Zn 2+ ). Sua estrutura cristalina é conhecida como espinélio inverso (figura 1) caracterizada pelo empacotamento de íons de oxigênio em uma estrutura cúbica de face centrada, com a presença de íons de ferro nos estados de oxidação (II) e (III). Nessa estrutura, metade dos íons Fe 3+ se coordena ao oxigênio em uma simetria tetraédrica (sítios A) e, a outra metade, juntamente com íons Fe 2+, coordena-se ao oxigênio em uma simetria octaédrica (sítios B) [10,11]. 16

17 Figura 1. Estrutura cristalina de Fe 3 O 4 : Espinélio inverso [12]. Na estrutura de espinélio inverso, a presença de íons de ferro nos estados de oxidação (II) e (III) faz com que a Fe 3 O 4 apresente interessantes propriedades, uma delas é o ferrimagnetismo. Diferentemente dos materiais antiferromagnéticos, Fe 3 O 4 possui um momento magnético não nulo, pois os momentos de spin dos íons de ferro dos sítios A antiparalelos em relação aos momentos de spins dos íons de ferro nos sítios B possuem magnitudes diferentes [13]. Além da presença dos íons metálicos em dois estados de oxidação, as propriedades magnéticas encontradas em um óxido de ferro da família das ferritas estão associadas as suas características morfológicas e estruturais. Essas, por sua vez, são determinadas pelas condições experimentais durante uma rota sintética. Portanto, a escolha do método de síntese interfere diretamente na estrutura e morfologia das partículas de Fe 3 O 4. Na literatura, são reportados diversos caminhos para a síntese de Fe 3 O 4, entre eles se destacam o método de coprecipitação [14], microemulsão [15] e decomposição térmica de precursores organometálicos [16]. De todas as rotas citadas anteriormente, o método de coprecipitação, além de ser o mais simples, permite a obtenção de partículas de Fe 3 O 4 a temperatura ambiente. O mesmo também pode ser aplicado em escala industrial, já que há a possibilidade da obtenção de uma grande quantidade de partículas com um baixo custo e em um tempo síntese relativamente pequeno [17,18]. Atualmente, inúmeras aplicações das Fe 3 O 4 têm sido reportadas em vários trabalhos. Ferrofluidos [19], dispositivos de 17

18 armazenamento de dados [20] e catálise [21] são algumas delas. Aplicações biomédicas também têm sido mostradas como, por exemplo, magneto-hipertemia [22], liberação controlada de fármacos [23], contraste em imagens de ressonância magnética [24] e controle magnético de reações bioeletrocatalíticas na presença de enzimas [6]. Para que partículas de Fe 3 O 4 possam ser aplicadas com biomoléculas (enzimas, por exemplo), é necessário que sua superfície seja modificada quimicamente. Tais modificações podem ocorrer via adsorção eletrostática ou ligação covalente, com grupos funcionais oriundos de polímeros ou surfactantes. Trabalhos recentes reportam o uso de nanopartículas de Fe 3 O 4 modificadas em matriz polimérica de quitosana (Quit), onde grupamentos hidroxilas e amino presentes em sua estrutura são responsáveis pela adsorção e remoção de metais pesados como Pb(II), Ni(II) e Cu(II) em águas residuais [25,26]. A quitosana apresenta diversas características químicas que favorecem o seu uso na modificação das partículas de magnetita, como apresentado a seguir. 1.4 Quitosana Quitosana é um biopolímero natural obtido da desacetilação da quitina (segundo polímero mais abundante na natureza depois da celulose) encontrada na carapaça de insetos, camarões, caranguejos, e outros crustáceos [27]. Quitina é um homopolímero de cadeia heterogênea que apresenta apenas uma unidade de repetição, N-acetil-D-glicosamina. Já na quitosana, em sua cadeia principal são observadas duas unidades de repetições, N-acetil-D-glicosamina e D-glicosamina [28]. Na quitosana, a unidade de repetição relacionada à D-glicosamina é encontrada em uma maior porcentagem quando comparada com a N-acetil-Dglicosamina. Essa relação depende do grau de desacetilação empregado durante sua obtenção, que geralmente varia entre 66 e 95%. Comercialmente, a quitosana pode ser encontrada na forma de flocos, pó ou em solução, com massa molar média entre e g mol -1 [28]. A figura 2 ilustra as estruturas químicas da quitina e da quitosana. 18

19 H 3 C HO CH 2 OH NHCOCH 3 O O HO CH 2 OH O NHCOCH 3 O n HO CH 2 OH NHCOCH 3 O O CH 3 Quitina O CH 3 HO HO OH O NH 2 O n HO OH NH O O m OH Quitosana Figura 2. Estruturas químicas da quitina e quitosana. Na estrutura química da quitosana, em cada repetição de D-glicosamina são observados um grupo amino e dois grupos hidroxilas. A presença do grupo amino permite a sua existência em estado sólido ou aquoso, dependendo do valor do ph do meio [29]. Por exemplo, quando a quitosana é dispersa em uma solução aquosa de ácido acético ph 4,2 (Eq ), o grupo amino livre (-NH 2 ) é protonado a (-NH + 3 ), enquanto que em ph entre 6.0 e 6,5 é observada sua precipitação (Eq ). Quit-NH 2 (s) + CH 3 COOH Quit-NH 3 + (aq) + CH 3 COO - (aq) (ph 4,2) Quit-NH 3 + (aq) + OH - (aq) Quit-NH 2 (s) + H 2 O (l) (ph 6,0) A grande quantidade de grupos reativos presentes em sua cadeia principal associados a propriedades de adsorção, biodegradabilidade, baixa toxicidade e uma boa biocompatibilidade [30] fazem da quitosana uma importante ferramenta na construção de biodispositivos que são comumente utilizados na remoção de metais pesados e corantes presentes em águas residuais [31], aplicações biomédicas e farmacêuticas [32,33]. Devido a essas propriedades, a quitosana também é considerada como um tipo de suporte ideal para a imobilização de enzimas [30]. Em um trabalho desenvolvido por Zhilei e colaboradores, a fabricação de um biodispositivo promissor para o sensoriamento de glicose (GOx/C 60 -Fc-Quit-IL) foi demonstrado. A atividade eletrocatalítica da GOx foi notavelmente melhorada pela 19

20 presença de fulereno (C 60 ) e do mediador redox ferroceno (Fc). A quitosana, juntamente com o líquido iônico (IL), criaram um ambiente que manteve a bioatividade da GOx por aproximadamente 30 semanas. Esse biossensor de glicose apresentou boa estabilidade, alta sensibilidade e baixo limite de detecção, com um tempo de resposta rápido [34]. É importante salientar que o Fc utilizado na estrutura GOx/C 60 -Fc-Quit-IL é o mediador redox responsável pela transferência de carga entre o cofator enzimático da enzima GOx e a superfície eletródica. Algumas das principais propriedades do Fc estão descritas no próximo tópico. 1.5 Ferroceno O di(η 5 -ciclopentadienil) de ferro (II), mais conhecido como ferroceno (Fc), é um metaloceno de cárater diamagnético que apresenta uma estrutura sanduíche, onde um átomo de ferro (II) encontra-se posicionado entre dois aneis η 5 - ciclopentadienil (Cp) conformados de forma ecplisada (os orbitais dos anéis Cp e os orbitas d do ferro (II) são responsáveis por sua coordenação). A figura 3 ilustra a estrutura química do Fc, onde o plano de cada anel é perpendicular a ligação metalligante e todos os seus cinco átomos de carbono encontram-se equidistante ao centro metalico (a distância entre os planos de cada anel é de aproximadamente 3,32 Å) [35]. Figura 3. Estrutura química do Fc insolúvel com seus dois anéis Cp conformados eclipsadamente [36]. Desde a sua descoberta em 1951, o Fc e seus derivados têm sido amplamente utilizado em catálise [37], fotoquímica [38], aditivos anti-detonantes para combustíveis [39] e, mais recentemente, na construção de biossensores 20

21 amperométricos [40], no qual desempenha um papel fundamental na transferência mediada de elétrons em uma reação bioeletrocatalítica. Durante essa reação, a transferência eletrônica ocorre no átomo metálico, onde o ferro (II) é oxidado a ferro (III) originando o cátion ferrocino (nessa transferência, os anéis Cp do ferroceno apresentam pouca contribuição, pois são considerados ligantes de campo fraco), como mostra a figura 4. O sistema ferroceno/cátion ferrocino possui características fundamentais para o bom funcionamento de um biossensor, pois tanto a forma oxidada quanto a reduzida possui boa estabilidade química, alta taxa de transferência de elétrons, baixo potencial redox independente do ph do meio e alta reversibilidade (química e eletroquímica) [41]. ferroceno cátion ferrocino Figura 4. Esquema da transferência de elétron para o sistema ferroceno/cátion ferrocino [36]. A transferência de elétron para o sistema ferroceno/cátion ferrocino é muito atrativa do ponto vista de aplicação, como por exemplo, em biossensores. Biossensor é um dispositivo capaz de fornecer informações quantitativas ou semiquantitativas utilizando um elemento de reconhecimento de origem biológica como, por exemplo, enzimas, antígenos, anticorpos, DNA, organelas, tecidos e entre outros. Atualmente, entre todos os biossensores comercializados em larga escala, o sensor de glicose tem sido empregado em uma maior proporção devido ao grande problema de saúde pública relacionado à diabetes, enfermidade que vem atingindo grande parte da população mundial. Para isso, a enzima glicose oxidase é a principal ferramenta utilizada na construção de um biossensor de glicose devido a 21

22 sua alta sensibilidade e seletividade na determinação do substrato β-d-glicose, como apresentado a seguir. 1.6 Glicose Oxidase A glicose oxidase (GOx) é uma flavoproteína que catalisa a oxidação de β-d-glicose em D-glucono-δ-lactona, utilizando oxigênio molecular como receptor de elétrons - o sítio catalítico responsável por tal reação é denominado FAD (flavina adenina dinucleotídio), também chamado de cofator enzimático [42]. A figura 5 ilustra uma unidade monomérica de GOx com seu respectivo cofator enzimático. Figura 5. Representação estrutural da enzima GOx [43]. A reação catalisada pela enzima GOx pode estar divida em duas outras semireações, uma redutora (Eq ) e outra oxidativa (Eq ). Na meia reação redutora, a GOx catalisa a oxidação do β-d-glicose em D-glucono-δ-lactona e esse é hidrolisado a ácido glucônico. Em seguida, o cofator enzimático da enzima, é reduzido a FADH 2. Já meia reação oxidativa, o FADH 2 é reoxidado à FAD pelo oxigênio molecular produzindo peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) como subproduto da reação [44]. 22

23 β-d-glicose + GOx-FAD D-glucono-δ-lactone + GOx-FADH GOx-FADH 2 +O 2 GOx-FAD + H 2 O Atualmente, vários estudos têm reportado o uso da GOx na fabricação de biodispositivos [45,46]. Entretanto, para um funcionamento ideal de um biossensor, é necessário que haja uma efetiva imobilização enzimática. Ao retirar uma enzima de seu meio natural e imobilizá-la em um substrato sólido, propriedades relacionadas aos sítios catalíticos, estrutura molecular e atividade enzimática podem ser comprometidas. Dessa maneira, alguns métodos de imobilização têm sido reportados [47,48], no qual plataformas modificadas têm sido utilizadas visando um aumento da estabilidade e conseqüentemente da vida útil da enzima. É importante frisar que a vida útil de uma enzima livre em solução é de apenas algumas horas ou até mesmo alguns dias, entretanto quando imobilizadas, essa pode se estender por vários meses. 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Objetivo geral deste trabalho está dividido em duas etapas. A primeira visa avaliar o desempenho eletroquímico do composto Fe 3 O 4 -Quit-Fc por meio de estudos de magnetoeletroquímica. Na segunda etapa, pretende-se imobilizar a enzima GOx na superfície de Fe 3 O 4 -Quit-Fc e, em seguida, verificar a atividade catalítica do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx na presença e na ausência de um campo magnético externo aplicado. 2.1 Objetivos Específicos Sintetizar partículas de Fe 3 O 4. Modificar as partículas de Fe 3 O 4 em matriz polimérica de quitosana. 23

24 Adsorver moléculas do mediador redox Fc na superfície do compósito Fe 3 O 4 -Quit. Caracterizar as partículas de Fe 3 O 4 e Fe 3 O 4 -Modificadas (Fe 3 O 4 -Quit e Fe 3 O 4 -Quit-Fc) por meio das técnicas de espectroscopia eletrônica na região do ultravioleta e do visível (UV-Vis), microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo (FEG-SEM), espectroscopia vibracional na região do infravermelho (FTIR) e difração de raios X de policristais (DRX). Verificar por voltametria cíclica (VC) e cronoamperometria a estabilidade eletroquímica de Fe 3 O 4 -Quit-Fc por meio das alternâncias entre os estados de comutação ligado e desligado do modulador magnético MagnetoElectron (configuração I e II, respectivamente). Imobilizar a enzima GOx na superfície do compósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc por meio de ligações cruzadas. Verificar a atividade catalítica do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx na presença do modulador magnético MagnetoElectron (configuração I). 3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 3.1 Materiais e Reagentes Todas as soluções foram preparadas a partir de reagentes de alta pureza e água ultra pura (Milli-Q, 18,2 MΩ cm -1 ). Os reagentes cloreto férrico 98% (FeCl 3 anidro), cloreto ferroso tetraidratado 98% (FeCl 2.4H 2 O) e hidróxido de amônio 98% (NH 4 OH) foram adquiridos da Vetec. Quitosana, com grau de desacetilação de 85% foi adquirida da empresa Polymar Ciência e Nutrição S/A. O mediador redox ferroceno 98% (Fc), hexano 95%, ácido acético (glacial) 100%, glutaraldeído 25% (GA), glicose oxidase (GOx) [de Aspergillus niger], albumina de soro bovino (BSA) e β-d-glicose (99%) foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Diidrogeno fosfato de sódio (NaH 2 PO 4 ), monoidrogenofosfato de sódio (Na 2 HPO 4 ) empregados na preparação 24

25 do tampão fosfato de sódio 0,1 mol L -1 (PBS, ph 7,0) também foram adquiridos da Vetec. 3.2 Síntese e Modificação das partículas de Fe 3 O 4 Sintetizou-se as partículas de Fe 3 O 4 pelo método de coprecipitação [49]. Primeiramente, misturou-se as soluções aquosas de cloreto férrico (0,1 mol L -1 ) e cloreto ferroso tetraidrado (0,05 mol L -1 ) na proporção de 2:1, respectivamente. Em seguida, adicionou-se um excesso de NH 4 OH até que o meio apresentasse ph 9,0 e um precipitado negro fosse formado. Durante a adição dos reagentes, o sistema fora mantido em atmosfera de nitrogênio sob forte agitação. As partículas de Fe 3 O 4 presentes em suspensão foram separadas magneticamente e, em seguida, lavadas com água destilada até que o sobrenadante apresentasse um ph 6,5. Por fim, essas partículas foram secas a uma temperatura de 60º C e maceradas, obtendo-se um pó fino e homogêneo (figura 6a). Respeitando uma razão estequiométrica de 1:10 (Fe 3 O 4 / Quit), uma massa do pó das partículas de Fe 3 O 4 foi pesada e redispersa em solução ácida (2% de ácido acético) de quitosana 1,0 g L -1 [50], obtendo-se o composto Fe 3 O 4 -Quit. Depois de 24 horas, todas as partículas de Fe 3 O 4 modificadas com quitosana em suspensão foram decantadas por separação magnética, e em seguida, secas a vácuo (figura 6b). Depois de secas, as mesmas foram modificadas com moléculas do mediador redox ferroceno por meio de adsorção física, onde uma massa de Fe 3 O 4 -Quit (4 mg) foi redispersa em um excesso de Fc 0,1 mol L -1 solubilizado em hexano. Em seguida, esperou-se o solvente evaporar totalmente, obtendo-se o composto Fe 3 O 4 -Quit-Fc. Por fim, o novo material obtido foi lavado com água destilada e seco a vácuo (figura 6c). Nesse caso, a etapa de lavagem se deu com o intuito de retirar todos os cristais de Fc adsorvidos fracamente à superfície de Fe 3 O 4 -Quit. 25

26 a) b) c) Figura 6. a) Esquema de síntese das partículas de Fe 3 O 4 pelo método de coprecipitação. b) Modificação das partículas de Fe 3 O 4 com quitosana. c) Modificação de Fe 3 O 4 -Quit com moléculas do medidor redox ferroceno. 26

27 3.3 Obtenção do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx A imobilização da GOx sobre a superfície de Fe 3 O 4 -Quit-Fc foi realizada por meio da ligação cruzada com glutaraldeído na presença de albumina de soro bovino (BSA) [51], obtendo-se o biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx. Para isso, 10 mg de Fe 3 O 4 -Quit-Fc foram dispersas em 2 ml de uma solução PBS 0,1 mol L -1 (ph 7,0) contendo 15 mg ml -1 de BSA e 5 mg ml -1 de GOx. Em seguida, a essa solução foram adicionados 110 µl de GA 25%. Antes da realização dos estudos de magnetoeletroquímica, o biocompósito foi estocado por um período de 24 horas a uma temperatura de 4º C com o intuito que toda a enzima se ligasse a superfície de Fe 3 O 4 -Quit-Fc. A figura 7 mostra um esquema ilustrativo da obtenção do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx. Figura 7. Esquema ilustrativo da obtenção do biocompósito Fe 3 O 4 -Quit-Fc/GOx 3.4 Caracterização das Partículas de Fe 3 O 4 e Fe 3 O 4 -Modificadas A formação das partículas de Fe 3 O 4 em suspensão foi monitorada por UV-Vis utilizando um espectrofotômetro Varian Cary 50 (as medidas foram realizadas em uma cubeta de quartzo com 1 cm de caminho ótico). A estrutura cristalina, o tamanho médio dos cristalitos de Fe 3 O 4 e a modificação de Fe 3 O 4 -Quit com moléculas de Fc foram caracterizados por DRX de policristais, em um difratômetro Bruker D8 Focus, com radiação de cobre ( = 0,15406 nm), voltagem de 40 kv e 27

28 amperagem de 40 ma. A varredura angular foi compreendida em um intervalo de 10 2θ 70 com passos de 0,05, medidos a cada 5 segundos. As imagens de FEG-SEM das partículas de Fe 3 O 4 depositadas em substrato de silício, foram obtidas utilizando um microscópio eletrônico de varredura JEOL, modelo JSM-6701F. Os espectros de FTIR para os pós de Fe 3 O 4, quitosana e Fe 3 O 4 -Quit foram obtidos no modo reflectância total atenuada (ATR) utilizando cristal de ZnSe em um espectrômetro Varian-600 FTIR. 3.5 Estudos de Magnetoeletroquímica Os experimentos de VC e cronoamperometria foram conduzidos em um potenciostato conjugado à um sistema de geração de campo magnético comutável ( ligado e desligado ), denominado MagnetoElectron (figura 8) - equipamento desenvolvido pelo nosso Grupo. Esse equipamento é constituído basicamente por ímãs de neodímio-ferro-boro que se encontram localizados em um carrinho que se desloca sobre a superfície de um trilho posicionado atrás do eletrodo de trabalho de uma cela eletroquímica (tanto o carrinho quanto o trilho foram usinados de uma peça de tarugo composta de poliamida). Todos os ímãs encontram-se agrupados e posicionados dentro do carrinho, oferecendo um campo máximo de 0,24 Teslas a 0,5 cm do centro da cela eletroquímica. Esse valor de campo foi determinado por meio de um gaussímetro e posteriormente empregado em todos os experimentos eletroquímicos. Para esses experimentos, utilizou-se uma cela eletroquímica convencional de 3 cm 3 composta por três eletrodos conectados a um Potenciostato/Galvanostato μautolab III. Eletrodo de ITO (vidro recoberto óxido de estanho dopado com índio) foi eletrodo de trabalho (1 cm 2 ), platina como contra eletrodo e prata/cloreto de prata saturado (Ag/AgCl sat ) como eletrodo de referência. É importante salientar que durante a realização dos experimentos eletroquímicos, os dois estados de comutação do modulador de campo magnético (modos ligado e desligado ) foram empregados em duas configurações. Na configuração I (figura 9a), o modo desligado corresponde apenas à eletroquímica de solução do material estudado, ou seja, nenhum campo magnético foi aplicado, enquanto que no modo ligado, os imãs encontram-se posicionados atrás do eletrodo de trabalho. Diferentemente do que foi proposto na configuração I, o estado 28

29 de comutação desligado empregado na configuração II, corresponde quando todos os imãs encontram-se posicionados a frente do eletrodo de trabalho (figura 9b). Dessa maneira, os dois estados comutáveis (modos ligado e desligado ) utilizados nesta configuração correspondem a um campo magnético de mesma intensidade (0,24 Teslas). Figura 8. Fotografias do equipamento MagnetoElectron constituído por ímãs de neodímio-ferro-boro localizados em um carrinho que se desloca sobre a superfície de um trilho posicionado atrás do eletrodo de trabalho em uma cela eletroquímica convencional. 29

30 a) b) Figura 9. a) Esquema ilustrativo do MagnetoElectron que consiste em um modulador de campo magnético comutável acoplado a uma cela eletroquímica convencional de 3 eletrodos (ET = eletrodo de trabalho, RE = eletrodo de referência e CE = contra eletrodo) ligado a um potenciostato. b) MagnetoElectron empregado nas configuração I e II. 30

31 4. Resultados e Discussão 4.1 Sintese e Caracterização de Partículas de Fe 3 O 4 As partículas de Fe 3 O 4 foram sintetizadas pelo método de coprecipitação, que consiste em uma reação de alcalinização controlada em atmosfera inerte (equação 4.1.1), onde uma base forte é adicionada a uma solução aquosa contendo sais de ferro (II) e (III) até que o meio apresente um ph entre 9,0 e 10,0 [52]. Fe 2+ (aq) + 2 Fe 3+ (aq) + 8 OH - (aq) Fe 3 O 4 (s) + 4 H 2 0 (l) A fim de evitar a formação de outras fases de óxido de ferro durante a síntese, além do controle estequiométrico dos precursores, todo o sistema foi mantido sob atmosfera de nitrogênio [53,54]. A figura 10 ilustra a imagem das soluções precursoras juntamente com a suspensão de Fe 3 O 4 (a), e a resposta da suspensão de Fe 3 O 4 ao campo magnético externo aplicado evidenciando a presença de propriedades magnéticas (b). a) b) Figura 10. a) Imagem das soluções precursoras de FeCl 2.4H 2 O 0,05 mol L -1, FeCl 3 0,1 mol L -1 e da suspensão de Fe 3 O 4. b) Resposta magnética da suspensão de Fe 3 O 4 ao campo magnético externo aplicado. 31