O Acaso na Natureza. Guia do Aluno. Simulação de uma Análise Genética

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1 O Acaso na Natureza Guia do Aluno imulação de uma Análise Genética 1

2 De uma árvore genealógica ao ADN e voltar I N T R O D U Ç Ã O Nesta simulação prática, irás investigar a hereditariedade de um único gene envolvido numa característica genética em particular. A história base da investigação é a seguinte: Amostras individuais de ADN foram doadas por membros de uma grande família (em baixo). De cada amostra, parte do gene em estudo foi amplificado usando a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Isto proporciona milhões de cópias do ADN para que se consiga uma detecção mais fácil. O gene em questão tem dois alelos diferentes (variantes do gene). Receberás uma ou mais amostras de ADN amplificado. A tua tarefa é detectar quais os alelos presentes em cada amostra cortando o ADN com uma enzima de restrição e examinando os fragmentos de ADN resultantes usando electroforese em gel. Estes dados genéticos podem ser combinados com a árvore genealógica para que possas determinar como é herdada a característica genética. O processo está resumido ao lado. ample Amostra; Restriction Enzyme Treatment Tratamento com Enzima de Restrição; Autosomal Autossómica; ex-linked Ligada ao sexo; Dominant allele Alelo dominante; Recessive Allele Alelo recessivo; DNA cut by enzima ADN cortado pela enzima; base pairs (bp) pares de bases (pb); Gel electrophoresis Electroforese em gel; Trait Característica; No trait em característica; Carrier Portador; Movement of DNA fragments Movimento dos fragmentos de ADN. Neste exercício, a característica pode ter sido herdada numa de duas maneiras: como um característica autossómica recessiva ou como uma característica ligada ao sexo. 2

3 Características Autossómicas Recessivas Um membro da família que é homozigótico para o alelo dominante (genótipo DD) terá apenas ADN do tipo D. Ele não terá a característica. No entanto, alguém que seja homozigótico para o alelo associado à característica (genótipo dd) só terá ADN do tipo d. Manifestará, assim, a característica. Indivíduos heterozigóticos (genótipo Dd) têm ADN dos dois tipos, mas o alelo recessivo (d) estará ocultado pelo alelo dominante (D) e a característica não se manifestará. A diferença na sequência do ADN dos alelos D e d é tal que, no alelo d, há uma sequência de pares de bases que pode ser reconhecida e cortada por uma enzima de restrição. No entanto, o alelo dominante (D) não tem zona de restrição e, por isso, não será cortado pela enzima. Indivíduos que são homozigóticos para o alelo dominante (DD) apenas têm ADN do tipo D, que não é afectado pelo tratamento com a enzima de restrição. A electroforese em gel separa fragmentos de ADN pelo tamanho, assim, nestas amostras, todos os fragmentos de ADN por cortar mover-se-ão em conjunto para formar uma banda única no gel. Indivíduos que são homozigóticos para o alelo recessivo (dd) têm apenas ADN do tipo d, por isso, todo o seu ADN será cortado pela enzima. Isto cria fragmentos de dois tamanhos diferentes que irão produzir duas bandas no gel depois da electroforese. Indivíduos heterozigóticostos (Dd) terão ADN dos dois tipos. Metade dos fragmentos de ADN (do tipo D) permanecerão por cortar e metade dos fragmentos serão cortados em dois. Assim, depois da incubação com a enzima de restrição, amostras de ADN de uma pessoa que é heterozigótica conterão fragmentos de três tipos diferentes, o que produzirá três diferentes tipos de bandas na electroforese em gel. Árvore genealógica demonstrativa das relações entre os sujeitos deste exercício Male exo Masculino Female exo Feminino 3

4 Características ligadas ao sexo O padrão de hereditariedade que detectas ao analisares as amostras de ADN poderá mostrar que a característica que estás a estudar é transportada nos cromossomas sexuais (X e Y). Essas características dizem-se ligadas ao sexo. Numa fêmea existem dois cromossomas X, por isso, um único alelo recessivo (a) pode ser mascarado por um alelo dominante (A) no outro cromossoma. Isto é semelhante à expressão de características nos cromossomas autossómicos descritos acima. No entanto, muito poucos genes do cromossoma X, que é maior, têm um gene correspondente no cromossoma Y, mais pequeno. Assim, num macho com um cromossoma X e um Y, é improvável que um alelo recessivo no cromossoma X seja mascarado por um no Y. Assim, características ligadas ao sexo recessivas são extremamente raras em fêmeas, mas são mais facilmente encontradas em machos. Enzimas de restrição: cortando o ADN Enzimas que cortam sequências específicas de ADN chamam-se endonucleases ou enzimas de restrição. Têm este nome porque são feitas por bactérias para restringir a proliferação de vírus invasores. Diferentes tipos de enzimas de restrição cortam diferentes sequências de bases no ADN. Estas enzimas podem ser usadas para ajudar a detectar a presença de diferentes formas de determinados genes (alelos). Imagem 1: A enzima de restrição (uma proteína) BamHI ligada a uma porção de ADN, vista ao longo do eixo do ADN. A representação esquemática da enzima é feita a amarelo, magenta e cinzento. O ADN, no centro, é representado como um modelo de linhas. Imagem 2: A BamHI ligada a uma pequena porção de ADN. A proteína está representada por uma fita com diferentes tons de azuis para as duas cadeias que a constituem. Desta vez, o ADN está representado por um modelo cheio. Estes modelos em computador foram produzidos utilizando RAMOL. A informação de ambos os modelos provém do Banco de Dados de Proteínas (Protein Data Bank Para procurar esta informação, introduza o código de identificação: 1BHM Electroforese em gel do ADN A electroforese em gel é usada para separar fragmentos de ADN de diferentes tamanhos. Primeiro, obtém-se um gel a partir de agarose uma forma muito pura de 4

5 agar, obtida de algas marinhas. Numa das extremidades do tanque onde é colocado o gel, há vários pequenos orifícios (poços) feitos pelos dentes de um pente que foi introduzido no gel antes de ele ter solidificado. Uma solução tampão é vertida sobre o gel, para que encha os orifícios e entre em contacto com os eléctrodos em cada extremidade do gel. ão os Iões presentes na solução tampão que vão conduzir a electricidade. Esta solução também impede o gel de secar. Os fragmentos invisíveis de ADN são misturados com um pequeno volume tampão de amostra que contém uma solução densa de açúcar, de modo que, quando é adicionada aos pequenos orifícios, afunda-se, levando o ADN consigo. Uma corrente eléctrica é aplicada aos eléctrodos, criando um campo eléctrico ao longo do gel. Os grupos fosfato conferem carga eléctrica negativa aos fragmentos de ADN, de modo que o ADN migra através do gel em direcção ao eléctrodo positivo. Os fragmentos mais pequenos movimentam-se rapidamente através do gel poroso fragmentos maiores viajam mais lentamente. Deste modo, os pedaços de ADN são separados pelo tamanho. O tampão de amostra também se move através do gel, para que se possa acompanhar a progressão da electroforese. Depois da electroforese, o gel é corado de modo a revelar a presença do ADN. Cada banda individual no gel é constituída por milhões de fragmentos de ADN do mesmo tamanho. Buffer solution (over gel) olução tampão (sobre o gel); Loading Dye Tinta contrastante; DNA fragments are in this area Os fragmentos de ADN estão nesta área; Wells Orifícios; Electrode Eléctrodo; Direction of DNA movement entido do movimento do ADN 5

6 1 I N T R U Ç Õ E P R Á T I C A Utilização das microsseringas As microsseringas deste kit estão desenhadas de modo a serem usadas com pontas descartáveis. Cada ponta deve ser usada uma única vez e a seguir ser colocada no lixo. As pontas estão marcadas com 2 e 10 microlitros (µl), permitindo que pequenos volumes de líquido sejam medidos com precisão. Obterás melhores resultados se adoptares as respectivas precauções: Nunca puxes o êmbolo para fora da seringa quando o re-inserires, o selo pode ficar danificado; Antes de encheres a microsseringa, puxa o êmbolo um pouco para fora (1-2mm). Isto dar-te-á algum ar extra para no fim conseguires expulsar a última gota de líquido da ponta da microsseringa; Ao administrares líquidos, segura a microsseringa o mais próximo possível da posição vertical e ao nível dos teus olhos, para que possas ver aquilo que estás a fazer; Remove a gota de líquido da ponta da microsseringa tocando na parede interior do microtubo; Não toques na ponta da microsseringa com os teus dedos. Existem proteases e DNAses no teu suor que podem contaminar e degradar os reagentes que estás a pipetar. Microsyringe Microsseringa; Important hold here don t touch the tip! Importante segura aqui. Não toques na ponta!; Calibrated tip Ponta calibrada Unidades de volume Um microlitro corresponde à milionésima parte do litro 1 litro (L) = mililitros 1 mililitro (ml) = microlitros (µl) 6

7 2 Distribuição da amostra de ADN a. Coloca uma ponta limpa na microsseringa. Coloca 20µL da solução de ADN que recebeste num tubo contendo uma enzima de restrição liofilizada. Mistura o líquido e a enzima liofilizada com cuidado, arrastando o líquido para cima e para baixo, na ponta, algumas vezes. O líquido no tubo da enzima deverá apresentar uma distinta tonalidade azul, mas não deverá haver uma concentração de corante no fundo do tubo. b. Fecha bem o tubo com uma tampa. c. Escreve o número da amostra no tubo usando uma caneta com tinta à prova de água. Escreve perto da borda do tubo, onde é mais improvável que a tinta se apague. d. Coloca o teu tubo num suporte flutuante junto das outras amostras de ADN (provavelmente de outros estudantes). Notas A enzima liofilizada foi conservada com uma solução tampão apropriada e um corante azul. É essencial acrescentar o volume correcto de líquido no tubo e garantir que os seus componentes se misturam bem. Isto porque as enzimas de restrição podem ser menos eficazes se forem usadas em excesso ou com uma concentração errada de solução tampão. Por exemplo, numa concentração inapropriada de solução tampão, a enzima EcoRI pode cortar moléculas de ADN na sequência AATT em vez de cortar a longa e mais específica sequência GAATTC. As enzimas de restrição providenciadas no kit trabalham melhor a 37ºC. A maior parte das enzimas de restrição estão acabadas de desnaturar e, uma vez rehidratadas, devem ser utilizadas imediatamente. Important Mix well after dispensing Importante Mexer bem depois de colocar o ADN; Numbered DNA sample Amostra de ADN numerada; Label here Identifica o tubo aqui; Dried restriction enzyme Enzima de restrição liofilizada 7

8 3 Incubação a. Confirma que os tubos contendo o ADN estão bem tapados e, de seguida, incuba-os num banho de água ou numa incubadora a 37ºC, durante 30 a 45 minutos. Durante a incubação, a enzima de restrição cortará as moléculas de ADN numa zona específica, se essa zona estiver presente. Isto produzirá, dos fragmentos originais de 6500 pares de bases que te foram fornecidos, fragmentos de 2500 e 4000 pares de bases. e não existir uma zona apropriada para a restrição, os fragmentos de ADN permanecerão inteiros. Depois de algumas horas, a acção enzimática acabará. Foam block that floats uportes de espuma que flutuam; Incubate for minutes Incubar durante minutos 4 Preparação do gel a. e ainda não foi feito, usa um forno microondas ou um banho de água a ferver para derreter algum gel de agarose gel (0.8% p/v feito na solução tampão TBE). Agita o líquido e certifica-te que não há aglomerados ou fibras de agarose que permaneçam por dissolver. Guarda a agarose derretida num banho de água ou numa incubadora a 55-60ºC até ser necessária. b. Corta dois pedaços do tecido de fibra de carbono, cada um com aproximadamente 42mm x 22mm. Estes serão os eléctrodos de cada lado do tanque do gel. Verifica se os eléctrodos encaixam correctamente em cada extremidade do tanque, depois retira-os e coloca-os de lado. c. Coloca um pente de 4 ou 6 dentes na ranhura de uma das extremidades do tanque do gel e depois coloca-o numa superfície direita. Isto é necessário porque, se o gel solidifica num determinado ângulo, os fragmentos de ADN não se moverão uniformemente pelo gel. 8

9 d. Tendo cuidado para não te queimares, agita a garrafa de novo e verte cerca de 10mL de agarose derretida no tanque do gel de modo a que encha a cavidade central e flua por debaixo e entre os dentes do pente. Tenta não adicionar agarose em demasia precisarás de um gel liso e não com curvas. e derramares solução de agarose nas áreas perto das extremidades do tanque, deixa-a repousar poderás retirá-la mais tarde quando estiver repousada. e. Deixa o tanque em repouso por minutos, até o gel ficar duro (o gel ficará opaco assim que estiver sólido). Molten agarose can scald Agarose derretida pode queimar; Flat side of the comb Lado liso do pente; Molten agarose Agarose derretida; Carbon fibre tissue Tecido de fibra de carbono; Cut two electrodes Corta dois eléctrodos 5 Carregamento do gel a. Verte ligeiramente cerca de 10mL da solução tampão TBE no tanque de gel. O líquido deverá cobrir a superfície do gel e escorrer para as áreas de cada extremidade. b. Com extremo cuidado, remove o pente do gel, permitindo que a solução tampão encha os orifícios deixados pelo pente. Tem cuidado para não rasgares os orifícios ao puxares o pente. c. Coloca o tanque do gel num local onde possa permanecer em repouso enquanto decorre a electroforese. 9

10 Verás mais facilmente aquilo que vais fazer a seguir se colocares o tanque do gel numa superfície escura, por exemplo, um pedaço de papel preto. Como alternativa, podes colar uma fita preta no fundo do tanque, debaixo dos orifícios. d. Coloca uma ponta nova na microsseringa. Acrescenta 2µL de tampão de amotra ao tubo contendo o ADN que queres carregar. Mistura a tinta e a amostra de ADN agitando vigorosamente a mistura para cima e para baixo na ponta da microsseringa. e. Pipeta a mistura de tampão de amostra e ADN para dentro de um dos poços, segurando a ponta acima do orifício mas debaixo da solução tampão (vê a ilustração). Tem muito cuidado para não perfurares o fundo do orifício com a ponta da microsseringa. f. Anota qual o ADN que colocaste dentro de cada orifício (escreve no lado de fora do tanque de gel com um marcador, se necessário). g. Repete os passos d-f com as outras amostras de ADN digerido (talvez de outros estudantes da tua turma). Para evitar contaminação cruzada, usa sempre uma ponta nova para cada amostra. h. e estás a utilizar um pente de quatro dentes TBE buffer over gel olução tampão TBE sobre o gel; Loading dye Corante de ADN; DNA sample Amostra de ADN; Black card under gel tank reveals the wells Um papel escuro debaixo do tanque permite que se vejam os orifícios; Electrodes Eléctrodos. para fazer os orifícios, acrescenta 2µL de ADN marcador num dos orifícios no gel. e utilizaste um pente de 6 dentes, acrescenta apenas 1µL ADN marcador a um dos orifícios. 10

11 6 Correr o gel a. Coloca um eléctrodo em cada extremidade do tanque, como mostra a ilustração. Junta os eléctrodos a pilhas usando fios com molas de crocodilo. Deverão ser utilizadas pilhas suficientes (em série) para fornecer uma voltagem total de não mais de 36 volts. Certifica-te que o terminal positivo da bateria está ligado ao eléctrodo mais afastado dos orifícios. Electrodes Eléctodos b. Certifica-te que há contacto entre a solução tampão e os eléctrodos (acrescenta um pouco mais de tampão TBE se for necessário). e a corrente estiver a passar, deverás ver bolhas vindo de ambos os eléctrodos. c. Deixa o gel a correr em repouso durante algumas horas. Numa sala mais quente, talvez seja necessário colocar o tanque de gel num saco de plástico para reduzir a evaporação da solução tampão. Como alternativa, poderás usar um pente com seis dentes para tapar o tanque. d. Desliga as pilhas assim que o corante azul alcançar o fim do gel. e deixares as baterias ligadas, o ADN ultrapassará o fim do gel. e. Limpa as molas de crocodilo com água da torneira e seca-os bem para prevenir a corrosão. Perigo de choques eléctricos sérios se o equipamento for ligado directamente a uma tomada Notas Os iões na solução tampão TBE usada no gel conduzem a electricidade. Esta solução tampão é alcalina. Em condições alcalinas, os grupos fosfato do ADN têm carga negativa e, assim, o ADN movese na direcção do eléctrodo positivo (ânodo) quando em presença de corrente eléctrica. O EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) presente na solução tampão aniquila iões divalentes (tal como o Mg 2+ ). Isto ajuda a prevenir danos no ADN, uma vez que esses iões são necessários (como co-factores) às enzimas (DNases) que degradam o ADN. Warning! Use no more than 36 volts Aviso! Não usar mais de 36 volts; Place the comb over the tank to reduce evaporation Colocar um pente sobre o tanque para reduzir a evaporação 11

12 O tampão de amostra não afecta o ADN mas desloca-se através do gel ligeiramente à sua frente (como se fosse um fragmento de ADN de, aproximadamente, 300 pares de bases). 7 Coloração do ADN a. Retira e coloca de parte os eléctrodos. Verte a solução tampão para fora do tanque (esta pode ser guardada e reutilizada várias vezes, mas não indefinidamente). b. Calça umas luvas de protecção para prevenir que o corante manche a tua pele. c. Deixa o gel no tanque. Verte aproximadamente 10mL de corante de ADN (Azure A) na superfície do gel. d. Deixa-o durante exactamente 4 minutos e, de seguida, coloca a tinta numa frasco para reutilização. (Assim como a solução tampão, o corante de ADN pode ser reutilizado diversas vezes antes de precisares de o substituir. No entanto, poderás reparar que a tinta velha pode precisar de ficar no gel durante um pouco mais de 4 minutos). e. Limpa a superfície do gel com água destilada ou água deionizada com extrema precaução. Verte a água e deita-a fora. Azure A moves down through the gel staining the DNA O azure A desloca-se através do gel corando o DNA; 1 kb ruler régua de 1 kb; Millimetre graph beneath the gel is a convenient way to measure distances Colocar papel milimétrico debaixo do gel é uma boa maneira de medir as distâncias; Wells Orifícios; DNA bands: the patterns you see will match those shown here Bandas de ADN: os padrões que vais observar coincidem com os aqui ilustrados; Loading dye Corante de DNA f. Coloca o tanque de gel num saco de plástico para prevenir que o gel seque e, de seguida, deixa o gel revelar durante a noite. g. No símbolo (quadrado ou círculo) de cada pessoa na árvore genealógica, grava o número de bandas visíveis no gel que contém o ADN dessa pessoa. Os resultados de todas as amostras ajudar-te-ão a determinar o padrão de hereditariedade do gene em estudo. 12

13 Notas Géis manchados podem ser guardados indefinidamente num saco de plástico selado e guardado num frigorífico. Não os exponhas a luz solar forte nem uses água com cloro, uma vez que a cor desaparecerá. O ADN marcador presente neste kit contém fragmentos dos seguintes tamanhos (em kb): ; ; ; 9 162; 8 144; 7 126; 6 108; 5 090; 4 072; 3 054; 2 036; 1 636; 1 018; 506; 517. Os fragmentos mais pequenos do marcador desaparecerão no fim do gel. N O R M A d e E G U R A N Ç A ADN e enzimas de restrição O ADN e as enzimas de restrição contidas nesta simulação são seguras para manuseamento nas escolas. Não provêm de humanos e o seu uso não apresenta quaisquer tipos de preocupações éticas ou de segurança. Não foram utilizados nenhuns seres vivos. No entanto, a limpeza é importante para prevenir a contaminação cruzada e assegurar o sucesso da experiência. alpicos de enzimas ou de solução de ADN devem ser limpos com prontidão. Os tubos de plástico (polipropileno) usados e as pontas das microsseringas podem ser colocadas no lixo normal ou recicladas sem qualquer tipo de precaução especial. Gel de agarose e for usado um forno de microondas para derreter o gel de agarose, certifica-te de que o gel é colocado num recipiente que não esteja selado. e não estiver disponível um forno de microondas, em substituição do mesmo, podem ser usados um banho de água a ferver ou uma placa de aquecimento. Deves mexer o gel enquanto este aquece para evitar que queime. Não se recomenda o uso do bico de Bunsen para derreter o gel de agarose. Cuidado! Agarose quente e derretida pode escaldar e, por isso, deve ser manuseada com extrema precaução Tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) Quando usado conforme as indicações, este tampão não necessita de normas de segurança especiais. O tampão usado pode ser eliminado directamente pelo cano. 13

14 Tecido do Eléctrodo O eléctrodo de fibra de carbono poderá libertar pequenas fibras, o que poderá causar uma ligeira irritação da pele se manuseares o tecido durante muito tempo. erá uma precaução sensata usares luvas se achares que o tecido é desagradável de manusear. As fibras libertadas são, no entanto, demasiado grandes para entrarem nos pulmões, por isso, não será necessário usares uma máscara. As fibras são solúveis em fluídos corporais e são completamente biodegradáveis. Energia eléctrica Aviso! O equipamento para a electroforese em gel foi concebido para funcionar a baixas voltagens (não excedendo os 36 volts) com pilhas secas. Esta voltagem jamais deverá ser ultrapassada, uma vez que os componentes eléctricos em uso não estão isolados do utilizador. Aviso! e se ligar este equipamento a uma fonte de electricidade podem ocorrer choques eléctricos fatais Corante de ADN (Azure A em etanol) A solução concentrada de corante de ADN concentrado é inflamável e deve ser mantida longe de chamas. O corante é Azure A que, quando diluída como indicado, forma uma solução de 0.04% em 20% de etanol. Nesta concentração, não apresenta nenhum risco para a tua segurança, embora seja necessário o devido cuidado para evitar derrames do líquido na pele ou nos olhos, como por exemplo, usar luvas e óculos de protecção. O corante utilizado pode ser diluído em água e deitado fora pelos canos. Corante do tampão da amostra (Azul de bromofenol/ucrose) Quando usado segundo as indicações, este corante contrastante não apresenta quaisquer riscos. O corante usado pode ser deitado fora pelos canos. 14

15 Mais informações de segurança Mais informações sobre segurança envolvendo trabalho prático com ADN poderá ser encontrada no seguinte artigo: Delpech, R. And Madden, D. (2001): Working with DNA in Topic in afety (Third Edition) Association for cience Education. IBN: Este artigo e mais informação pode ser encontrada no sítio do NCBE: R E C U R O A D I C I O N A I DNA cience: A first course in recombinant DNA technology by D.A. Micklos and G.A. Freyer (1990) Cold pring Harbor Laboratory Press / Carolina Biological upply Company. IBN: Brown, N. (1995) Electrophoresis for the visually impaired: the modification of the Lambda protocol and its use with visually impaired A-level students. Journal of Biological Education 29 (3) Illuminating DNA by Dean Madden (2000) National Centre for Biotechnology Education. IBN: Recombinant DNA and biotechnology: A guide for students by Helen Kreuzer and Adrianne Massey (2001) econd edition. American ociety for Microbiology Press. IBN: ABC of clinical genetics by Helen M. King (1997) BMJ Publishing Group. IBN: Genome. The autobiography of a species in 23 chapters by Matt Ridley (2000) Fourth Estate. IBN: X. The Human Genome The Wellcome Trust Web site: Exploring our molecular selves U National Institutes of Health Web site: The molecular modelling software RAMOL (mencionado na página 3) is available free-of-charge from: 15