Considerações das Aulas Laboratoriais de Bacteriologia Alimentar

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1 Considerações das Aulas Laboratoriais de Bacteriologia Alimentar Nestas aulas foram praticados métodos de detecção de microrganismos em alimentos. Os trabalhos baseiam-se na realização de uma amostragem correcta, consequentes diluições apropriadas, de sementeiras em meios de cultura adequadamente preparados, contagem apropriada dos microrganismos e fornecimento dos resultados segundo as Normas Portuguesas. Para começar, temos aqui o esquema do trabalho inicial. Os grupos partiram de diferentes amostras : Contagem Soro fisiológico Soro Triptonado Ringer Bolores e Leveduras Cooke Rose Bengal agar Cloranfenicol agar 0,2 ml /placa Sementeira à superfície 22-25ºC/5 dias Adição de diluente Suspensão 1:10 Diluições 10-2, 10-3, LEITURA Amostra Pesar Totais 30º Plate Count agar (PCA) Gelose de Contagem (45ºC) 1 ml /placa Sementeira por incorporação 30ºC/72 horas fiambre, bolo, tomates, milho. No que se refere às amostras: no milho vai usar-se a lavagem do grão para proceder aos ensaios; no caso do bolo, para termos uma amostra representativa deveremos tirar um pouco do exterior da massa, do interior e do creme; como são sólidos, o procedimento manda preparar uma suspensão 1:10 com a ajuda de um diluente adequado. O diluente que vamos utilizar mais frequuentemente será o soro fisiológico, que é aquoso, isotónico e estará esterilizado. Assim em termos de procedimento será o seguinte: a partir da nossa amostra vamos pesar, e de forma a fazer a amostragem representativa, cerca de 10 g de amostra; depois à nossa massa de amostra juntamos 9 x o seu peso em diluente, de forma a criar de imediato uma suspensão 1:10, ou seja, a agitação aqui é essencial para não gerar falsos negativos. (Exemplo: pesamos 9,4 g de bolo, tivemos de juntar 9,4 x 9 = 84,6 g (ml) de soro fisiológico de forma a fazer a diluição correcta e agitamos bem!). O passo seguinte é proceder a diluições seriadas de modo a conseguir obter numa delas a quantidade de microrganismos adequada para fazer as contagens. O esquema abaixo dá uma ideia de como se faz: de uma diluição retira-se 1 ml e adicionam-se 9 de diluente; dessa última retira-se 1ml de diluição e colocam-se em mais 9 de diluente e assim sucessivamente; agora, se retiramos 1 ml de uma dilução 1:10 estamos a retirar 0,1 g de amostra; na seguinte retiramos 0,01 g e por aí em diante. Posto isto relatamos casos concretos. As diluições efectuadas para cada amostra usada na aula foi a seguinte: Amostra Totais a 30ºC Bolores e Leveduras Fiambre Bolo

2 Tomate Milho No nosso caso, como era o do bolo, preparamos diluições até Agora abordaremos os dois tipos de contagem separadamente. Contagem de bolores e Leveduras (ler Norma Portuguesa /1987) Para a realização destas contagens, usam-se meios de cultura que favoreçam o crescimento dos fungos em detrimento das bactérias. Assim temos dois tipos de meios: O Cooke Rose Bengal agar ( que é um meio selectivo, tem um ph inferior a 7, poderá conter clortetraciclina que inibe o crescimento das bactérias, tem peptona e contém uma grande quantidade de açucar, necessária aos fungos e pouco favorável às bactérias; além disso o meio limita o crescimento dos fungos filamentosos para não gerarem micélios muito grandes) e o Cloramfenicol agar (que tem o antibiótico, fonte de nutrientes de um extracto de levedura, alta quantidade de dextrose e um ph também inferior a 7); existem mais meios selectivos mas estes serão os usados nas aulas. Assim, após termos as nossas diluições disponíveis, para cada diluição seriam inoculadas 5 placas com 0,2 ml cada; as placas têm de ter um grau de humidade adequado: nem muito seco para não absorver abruptamente o inóculo, nem muito molhado o que dá cabo do inóculo. O inóculo é feito à superfície colocando 0,2 ml com uma micropipeta e depois com um espalhador esterilizado (uma pipeta de pasteur de vidro dobrada ao calor) espalha-se o inóculo sem tocar nos bordos. Devem-se fazer pelo menos 5 placas para cada diluição e fazer este procedimento pelo menos para duas diluições sucessivas (ou seja, 5 placas para 10-4 e 5 placas para 10-5 por exemplo). Na aula, para economizar placas fizemos o inóculo de 5 placas com a diluição de 10-1 ; a esta placa juntou-se uma placa testemunha (sem inóculo) que se colocou a incubar nas mesmas condições. Para avaliação dos resultados deste método a norma diz o seguinte: 9.4. Contagem de Colónias A contagem pode ser efectuada com auxílio de um contador de colónias, nas 5 placas da solução-mãe ou da mais baixa diluição cujo número de colónias, por placa, seja inferior a 150. As colónias de bolores e leveduras são contadas separadamente de acordo com a sua morfologia. É aconselhável proceder também à identificação e contagem das colónias de bolores dentro de cada género Resultados Cálculo Sendo: n a soma do número de colónias de bolores contadas nas 5 placas da suspensão-mãe ou da diluição considerada; n a soma do número de colónias de leveduras contadas nas 5 placas da suspensâo-mãe ou da diluição considerada; ni n 2, n 3... as somas do número de colónias de cada género ou espécie de bolor, quando identificados, que perfazem na totalidade a soma n; d o denominador da diluição em relação à qual se efectuou a contagem. O teor total de fungos (bolores e leveduras) por grama ou cm 3 de produto é: (n + n') x d o teor total de bolores por grama ou cm 3 do produto é: n x d o teor total de leveduras por grama ou cm 3 do produto é: n' x d o número de colónias de cada género ou espécie de bolor, quando identificados, por grama ou cm 3 de produto, é, respectivamente: n i x d n 2 x d n 3 x d Apresentação 2

3 O teor micológico exprime-se em número de colónias de fungos, por grama ou centímetro cúbico do produto, e é representado por um número compreendido entre 1,0 e 9,9, multiplicado por 10n, sendo n o expoente apropriado da potência de 10. O resultado da análise micológica deverá ser expresso do seguinte modo: no total de colónias de bolores por grama ou cm 3 dd produto; no total de colónias de leveduras por grama ou cm 3 do produto; no de colónias de cada género ou espécie de bolores por grama ou cm 3 do produto. a) No caso de não se haver registado qualquer valor por ausência de colónias, os resultados exprimem-se por: inferior a 1 x d colónias por grama ou centímetro cúbico, sendo d o denominador da mais baixa diluição efectuada; b) no caso de não se ter registado qualquer valor, por excesso de colónias que impossibilite a contagem nas diluições efectuadas, os resultados exprimem-se por: superior a 7,5 x 10 2 x d i por grama ou por centímetro cúbico, sendo d i o denominador da mais alta diluição realizada. Então será assim: temos as nossas 5 placas de tal modo que procedemos à contagem se, por cada placa tiver menos de 150 colónias; depois de ler a norma e como na aula tivemos as placas cheias o nosso resultado foi : Contagem de Bolores e Leveduras: superior a 7,5 x 10 3 CFU por grama (de bolo) há aqui um detalhe: segundo a norma há que diferenciar entre bolores e leveduras e dar o resultado separadamente; o que temos aqui é bolores+leveduras = teor micológico total! Duas considerações: porquê 7,5 x 10 2 x dil.? Porque é o limite máximo de colónias nas 5 placas, ou seja 5 x 150. E porquê CFU? são colony-forming-units, ou seja, são as unidades (1 ou mais bactérias) que estando em placa geram 1 colónia como está aqui esquematizado. Outro pormenor: se não tívéssemos nenhuma colónia nas 5 placas poderíamos falar em 0 CFU?Não! porque a partir do momento em que não temos CFU no meio quer dizer que temos menos de 10 colónias por grama de amostra. Isto explica-se do seguinte modo: se pesamos teoricamente dez gramas e colocamos numa suspensão 1:10, significa que haveria na prática pelo menos 1 microrganismo por cada ml de suspensão; ora, se tivermos por exemplo 5 microrganismos na suspensão toda, ao retirarmos e semearmos 1 ml poderíamos não levar microrganismo nenhum (porção de volume rosa no desenho não contendo microrganismos, apesar de no resto do tubo os ter) ; conclusão: o facto de não aparecer colónias não quer dizer que não haja microrganismo na amostra; são é em nº. inferior ao mínimo estabelecido para contagem na Norma! Contagem dos Microrganismos Totais a 30 º C (ler NP 1995/1982) Neste teste vamos proceder à contagem de tudo o que seja microrganismo que apareça na placa (bactérias, leveduras, bolores). Para esta técnica temos de usar um meio que permita que tudo cresça sem excepção: Plate Count Agar é um meio simples nutritivo com ph neutro e que proporciona o crescimento de tudo; o facto de ter 1g/L açucar pode desfavorecer um pouco os fungos. Aqui a técnica é um pouco diferente: vamos pegar em tantas placas de petri quantas diluições tivermos; assim cada placa levará 1 ml de uma determinada suspensão; em banho maria fervente encontra-se o meio fundido que vamos retirar e numa temperatura de mais ou menos 45/50º vamos adicionar às placas até cobrir bem o fundo da placa(+-15 ml); fecha-se e homogeneiza-se com movimentos 3

4 em 8. Deixa-se solidificar e vai a incubar; uma placa testemunha deve acompanhar as restantes. As boas práticas indicam que se devem fazer duas placas para cada diluição mas na aula fizemos apenas uma para cada. Os resultados e contagens estão definidos na norma: LEITURA Procede-se à contagem das colónias após o período de incubação determinado. Não sendo possível fazê-la de imediato, as placas são conservadas à temperatura de 0 a 5º C durante 24 h, no máximo. Faz-se a contagem de colónias em cada placa de Petri da mesma diluição que contenha entre 30 e 300 colónias. RESULTADOS CÁLCULO E APRESENTAÇÃO - No caso de existirem uma ou duas placas de uma mesma diluição contendo entre 30 e 300 colónias: - Calcula-se a média aritmética do número de colónias contadas nas 2 placas. - Considera-se somente dois algarismos significativos. Para um número de três algarismos, arredonda-se ao zero mais próximo. Se o 3.º algarismo for 5, arredondase ao zero inferior. - Multiplica-se este valor pelo inverso do factor de diluição correspondente, para se obter o número de microrganismos por grama ou cm 3 da amostra. - Expressa-se este resultado por um número compreendido entre 1,0 e 9,9, multiplicado por 10 n, sendo a a potência de 10 apropriada No caso de todas as placas semeadas não conterem colónias, o resultado aprcsenta-se da seguinte forma: Produtos líquidos... menos de 1 microrganismo por cm 3. Outros produtos (com suspensão-mãe)... menos de l X s microrganismos por grama, sendo s o inverso do factor da diluição da suspensão-mãe No caso das placas semeadas com a amostra em análise (produtos líquidos) ou com a suspensão-mãe (outros produtos) conterem menos de 30 colónias, o resultado apresenta-se da seguinte forma: Produtos líquidos... menos de 30 microrganismos por cm 3. Outros produtos... menos de 30 X s microrganismos por g, sendo s o inverso do factor da diluição da suspensão-mãe Se em todas as placas das diferentes diluições semeadas se encontrar um número de colónias maior que 300, o resultado apresenta-se da seguinte forma: - mais de 300 x 10 z sendo z o inverso do factor da diluição mais elevada em que se verifique mais de 300 colónias. Nota Se tivermos em duas diluições consecutivas idênticas condições de contagem, é de prever que ocorreu erro de manipulação, pelo que os resultados devem ser eliminados. Em último caso pode aceitar-se como indicativo o resultado obtido na diluição mais baixa. Como se pode ver pela norma, cada diluição tem uma placa em duplicado. Para proceder à contagem, colocamos as placas por ordem de diluição, da maior diluição para a menor diluição e vamos averiguar a diluição que tem um nº. compreendido entre 30 e 300 colónias; no nosso caso, no bolo a diluição foi a 10-4, que apresentou 112 colónias. Ora, o nosso resultado seria 112 x 10 4 = 1,1x Logo seria de escrever: Contagem dos microorganismos totais a 30ºC...1,1x 10 6 CFU/grama (de bolo) Como é evidenciado na figura da página seguinte, a análise bacteriológica alimentar assenta em várias partes; acabamos de ver a parte da flora total que inclui a contagem de bolores e leveduras e a contagem dos microrganismos totais a 30 º C (que no boletim são as aerobias mesófilas, ou seja, é o mesmo parâmetro adaptado à realidade actual). Após as contagens relativas à flora total passamos agora para os bioindicadores de contaminação 4

5 fecal: coliformes (entre eles os fecais e nestes a E.coli), streptococos fecais (enterococos actualmente) e clostridium (incluindo os sulfito redutores). No que refere a uma pesquisa traduzse por um teste em que apenas se relata se há ausência ou presença (ou cede um nº. estimativo de microrganismos presentes, embora istu faça mais sentido na contagem...) ; hoje em dia praticamente todos os parâmetros são avaliados por contagens (lá está acho mais que o NMP se encaixa nesta parte e não na pesquisa). Uma das técnicas de contagem é a do NMP (nº. mais provável) que se baseia numa estimativa estatística e cujos pormenores estão na norma 2079/1989, pág 13. Sumariamente, o fundamento do teste está em semear vários inóculos em 3 concentrações diferentes x 5, ou seja, 5 tubos de x inóculo + 5 tubos de y inóculo + 5 tubos de z inóculo; todos eles são sujeitos a uma incubação nas mesmas condições e após esta, são verificados os que tiveram reacção positiva; ao sabermos os positivos de cada série de um inóculo poderemos ir a uma tabela que matematicamente nos indica com determinado intervalo de confiança, o nº. mais provável de microrganismos por determinada quantidade de amostra. As contagens em placa, visam proceder a uma contagem mais apurada e não estatística e determinam os microrganismos viáveis cultiváveis presentes. Mas vamos tornar isto mais claro com os exemplos realizados nas aulas. Começamos na parte dos bioindicadores de contaminação fecal por realizar a pesquisa de coliformes em água; os coliformes são bactérias Gram (representantes dos bacilos gram -) e que tentam representar as bactérias do intestino deste tipo; são fermentadores da lactose a 30ºC gerando ácidos VB 10 ml AMOSTRA água + LAC e gás; têm a habilidade de crescer em sais biliares; dentro dos coliformes há os fecais que crescem a uma temperatura de 44,5 ºC e geralmente a grande maioria destes são E. Coli. A técnica de pesquisa baseia-se em inocular 10 ml da nossa amostra de água (bem agitada) em dois tipos de meio: caldo lactosado (meio de enriquecimento, visto que este meio propicia condições para as bactérias crescerem porque lhes damos papinha) e meio de Verde Brilhante ( meio selectivo com verde brilhante e sias biliares que inibem Gram + e outras bactérias que cresçam geralmente não produzem nenhum gás). O aparecimento de gás no tubo de Durham 5

6 é considerado um positivo após incubação durante 48h a 30-35ºC ; só que há várias hipóteses: - Não cresce nos dois tubos e aí temos um negativo não há coliformes na amostra; - Cresce apenas no caldo lactosado significa que a bactéria ainda não estava preparada para crescer bem num meio selectivo e por isso este caldo de enriquecimento fortaleceu a bactéria e requer então que se faça repicagem e sementeira para o meio selectivo (VB); - Cresce em ambos; podemos então dizer que há coliformes na nossa amostra. Mas depois de termos confirmado que há crescimento num ou em ambos os tubos procedemos consoante o caso: - Se só cresceu no meio de enriquecimento, vamos repicar e inocular dois meios VB e um meio de água peptona; um meio VB vai a incubar a 30ºC e os outros dois a ; - Se cresceu nos dois tubos iniciais, repica-se e inocula-se um VB e uma Água peptona que vão ambos a incubar a. Para quê isto? Se já sabemos que temos coliformes temos se saber se são fecais (crescem em VB a ) e se houverem fecais se são E. Coli (em Água Peptona há produção de indol, ou seja, com reagente de Erlich forma uma coloração vermelha).esquematicamente estão aqui os possíveis resultados: Nota: para manter a Amostra temperatura 30ºC direitinho a LAC- VB- LAC+ VB- LAC+ usa-se um banho de água pois este consegue ter uma mior capacidade de manter a Coliforme Negativo Coliforme Positivo Mas não FECAIS 30ºC VB- 30ºC AP- Coliforme Positivo FECAIS (mas não E.coli) 30ºC AP+ AP- AP+ Coliforme Positivo FECAIS E. coli temperatura, para não gerar erros pela sua variação como pode acontecer numa estufa. Vista a pesquisa vamos também determinar o NMP. Esta técnica visa fazer uma estimativa da quantidade de microrganismos. Para coliformes usamos o meio de MacConkey líquido (um meio contendo peptona, sais biliares, lactose e púrpura de bromocresol) que é selectivo para Gram negativos e diferencial pois o púrpura de bromocresol muda para amarelo com a produção de ácidos que baixam o ph. Para a técnica usamos 15 tubos segundo o esquema da página seguinte; o inóculo é a nossa amostra de água (agitar bem); ao usar 10 ml de inóculo, o meio é duplo o que evita que tenhamos de trabalhar com volumes muito elevados e por isso ao adicionarmos inóculo o meio fica na concentração certa. Depois de preparados os tubos, vão a incubar a 30ºC durante 48 horas (acho eu). O resultado é visível pelo aparecimento de uma coloração amarela derivada da fermentação da glucose do meio. Por cada tubo duvidoso ou positivo 6

7 10 ml meio + 0,1 ml de inóculo 10 ml meio + 1 ml de inóculo 10 ml meio DUPLO + 10 ml de inóculo deveremos fazer 1 VB 30ºC; 1 VB 1 AP (água peptona) para confirmar os resultados: se o Verde brilhante a 30ºC for positivo confirmamos o resultado (produção de gás); se ambos os verdes brilhantes forem postivos então temos coliformes fecais; se for E. Coli a AP vai dar positivo! Portanto, se um tubo duvidoso não gerar gás num VB a 30ºC será um resultado negativo as coliformes! Após termos as nossas confirmações feitas tomamos os resultados do seguinte modo: Inóculo (ml) Positivos 0, Vamos agora consultar uma tabela que tem para cada caso os resultados do NMP por 100 ml ; neste caso seria: O NMP/ 100 ml = 11, como temos pela tabela; a imagem pode ilustrar o aspecto de 3 positivos numa das séries de 5 tubos (no nosso exemplo na série dos 10 ml) em bora as cores não sejam bem estas como sabemos... O que vimos até aqui de coliformes foi: a sua pesquisa e a determinação do NMP, ambos em água. Vamos agora ver como se processa em amostras sólidas. No que respeita à execução da técnica, ela é parecida com a dos totais a 30ºC. As diferenças essenciais são: - O meio é o VRBL Violet Red Bile Agar que é selectivo para os Gram negativos: tem cristal violeta (violet) que inibe Gram + assim como sais biliares (bile); o indicador é o vermelho neutro (Red) que gera coloração vermelha com a produção de ácidos acompanhada pela precipitação de sais biliares; contem depois cloreto de sódio e nutrientes essenciais assim como o suporte (agar); - Cada diluição (efectuadas do modo já exposto), tal como nos totais a 30ºC, é colocada na placa (1ml) e é adicionado o meio preparado recentemente e que está no banho (sementeira por incorporação); há aqui o pormenor que é preciso fazer uma OVERLAY para criar um ambiente anaeróbio e propício à fermentação e boa multiplicação dos coliformes - colocamos depois do meio solidificar uma segunda 7

8 camada de meio; depois de solidificar invertemos e colocamos na estufa durante 24h mais ou menos 2 h, a 30ºC; No que respeita a contagens e resultados, a norma 3788/1990 diz o seguinte: 10. Resultados Cálculo Escolhem-se as placas que contenham no máximo 150 colónias características e/ou não características em duas diluições sucessivas; pelo menos uma das placas deve conter 15 colónias características. Calcula-se o número N de coliformes por centímetro cúbico ou por grama de procuro, sob a forma de média ponderada a partir de duas diluições sucessivas, segundo a fórmula seguinte: onde: Σc é a soma das colónias características contadas em todas as placas em 9.4 ni é o número das placas contadas na primeira diluição; n 2 é o numere das placas contadas na segunda diluição; d é a diluição a partir da qual se obtiveram as primeiras contagens. Arredonda-se os resultados calculados a dois algarismos significativos. O resultado, do número de bactérias coliformes por centímetro cúbico ou por grama de produto, é expresso por um número compreendido entre 1,0 e 9,9 multiplicado pela potência de 10 apropriada. Exemplo: Uma contagem de coliformes deu os seguintes resultados (com a sementeira efectuada em duplicado): diluição 10-2 : 83 e 97 colónias diluição 10-3 : 13 e 8 colónias Arredonda-se a dois algarismos significativos, seja 9100 ou 9,1 x 10 3 coliformes por centímetro cúbico ou grama de produto Se nenhuma das placas contiver mais de 15 colónias características, calcula-se c número estimado Ne de coliformes aplicando a equação dada em Se as duas placas correspondentes à amostra para análise (produtos líquidos) ou à diluição-mãe (outros produtos), contiverem menos que 15 colónias características, apresenta-se o resultado sob a forma: - menos de 15 coliformes por centímetro cúbico (produto líquido) ou menos de 15 x d coliformes por grama (outros produtos), sendo 1/d o factor da diluição da suspensão-mãe Se não existe nenhuna colónia característica nas placas correspondentes à amostra para análise (produtos líquidos) ou à suspensão-mãe (outros produtos), dar o resultado sob a forma: - menos de 1 coliforme por centímetro cúbico (produtos líquidos) ou - menos de 1 x d coliformes por grama (outros produtos) sendo 1/d o factor de diluição da suspensão mãe Fidelidade do método Placas contendo entre 15 e 150 colónias características (veja-se ) Por razões de ordem estatística, os limites de confiança variam de ± 16% a ± 52%. Na prática, podem verificar-se variações maiores sobretudo entre os resultados obtidos por diferentes analistas Casos particulares (veja-se ) 8

9 Veja-se o quadro anexo. Para obter os limites de confiança, multiplicam-se os limites inferiores por d. sendo 1/d o factor de diluição Cálculo de pequeno número de colónias (veja-se ) Os limites de confiança dos pequenos números são dados no quadro anexo. Na aula só fizemos uma placa para cada diluição e usamos uma amostra de queijo fresco; as únicas diluições que usamos foi 10-3, 10-4 e A única placa contável era a Então neste caso, contadas 66 colónias, e como só temos uma placa há apenas que multiplicar pelo factor de diluição, ou seja, 66 x 10 5 = 6,6 x 10 5 ; Resultado: Número de Coliformes...6,6x10 5 CFU/g (de queijo) Estamos falados de coliformes: pesquisa, NMP e Contagem em VRBL. Outro grupo de bioindicadores de contaminação fecal são os enterococos: bactérias Gram positivas adaptadas à vida intestinal; pertencem ao grupo D de lancefield logo hidrolisam esculina ; crescem com sais biliares, sais de tetrazólio e azida sódica; nº. reduzido em humanos mas significativo em fezes de animais. Para este grupo pode-se fazer pesquisa e determinação do NMP com meios contendo azida sódica como o caldo de Azida ou o meio SF; para realizar a confirmação fazemos uma sementeira em meio de Slanetz-Bartley ou Kanamicina Esculina Agar por exemplo. Na aula fizemos a determinação do NMP. A técnica é em tudo semelhante à dos coliformes apenas mudando o meio inoculado que é o SF (é um meio que contém púrpura de bromocresol, azida sódica (o que o torna selectivo para enterococos), cloreto de sódio que também tem o seu efeito de selectividade; contém depois outras fontes de nutrientes - + essenciais; o meio vai tornar-se amarelo com a produção de ácidos devido à viragem do indicador mas não se faz de forma evidente, ou seja, fica mais para o alaranjado (imagem esq.). Os positivos e duvidosos de cada série de 5 tubos (para as diferentes quantidades inoculadas 0,1 ml; 1 ml ou 10 ml) serão posteriormente confirmados em meio mais selectivo que põe em evidência uma característica típica do grupo: Meio de Slanetz Bartley (imagem dir.), contendo cloreto de Tetrazólio que é reduzido pelas bactérias produzindo uma cor violácea típica (cada tudo ocupará uma fatia do meio, de modo que o meio possa ser semeado por estria com inóculos dos vários tubos ); Kanamicina Esculina agar ou Bilis esculina - que produzem coloração escura devido à hidrólise da esculina e formação de complexos com compostos contendo ferro; podem ser usados outros meios mas que não são de tanta importância salientar. Depois de termos confirmados os positivos e duvidosos, vamos então a uma tabela de NMP e vemos a que valor corresponde; se para a séries ,1 tivéssemos respectivamente positivos estaria na tabela: 2 NMP/100 ml de amostra (água).portanto a técnica é igual aos coliformes mas muda o meio apenas; aliás, a técnica do NMP é geral e vem descrita na generalidade na norma 2079/1989, pág. 13; para cada classe de bioindicadores adapta-se ao meio e ao método de confirmação típicos dessa classe porque no resto é tudo um processo matemático. Na aula não determinamos mais nada neste grupo. Falta tratarmos de ver um grupo que tem como uma das principais diferenças poder estar esporulado na amostra: os Clostridiuns Sulfito-redutores. O grupo dos clostridios trata de bactérias tipicamente anaeróbias Gram +, esporuladas e que têm a capacidade de 9

10 reduzir o sulfito. Juntamente com os outros grupos forma o trio dos bioindicadores de contaminação fecal. Aqui vai-se realizar a contagem de esporos de clostridiuns usam-do a técnica que se descreva na norma 2262/1986. A técnica é um pouco diferente das que estamos habituados mas consiste basicamente no seguinte: vamos pegar na nossa amostra (água/suspensão ) e vamos aquecê-la de forma a eliminar as possíveis formas vegetativas presentes (garantindo assim que se der resultados advém de um esporo); a seguir vamos juntar um meio adequado fundido mas em tubo estreito de modo a fazer-se uma sementeira em profundidade em que o O 2 tenha dificuldade em penetrar e assim criamos as condições anaeróbias necessárias; vai a incubar a cerca de 37ºC entre 1 a 5 dias, conforme os resultados. O meio usado é o meio Viande-Foie sulfito (Meat liver sulfite) que é um meio que contém extracto de fígado (porque contem aa sulfurados contribuindo para favorável potencial redóx (?) o que é bom para anaeróbios), glucose, amido, sulfito de sódio (que vai ser alvo de redução) e sais de ferro. Na aula o que fizemos foi: - para a amostra de água, pegamos em 20 ml e fomos aquecer a 75-80ºC durante 10 para nos livrarmos das formas vegetativas ( ter o cuidado de só começar a contar os 10 a partir do momento em que o tubo no banho já está a 80ºC); a seguir juntamos com o meio (que neste caso são 20 ml de meio duplo) num tubo estreito e não agitamos; deixamos solidificar e foi a incubar; a ausência de agitação é para evitar incorporação de O 2 ; - para a suspensão de alimento a testar, vamos utilizar 10 ml de suspensão 10-1 (porque assim já damos o resultado por grama) e vamos também aquecer a 75-80ºC durante 10 para ficarem só os potenciais esporos; depois adiciona-se no tubo mais estreito a 10 ml de meio duplo; arrefece sem agitar e é sujeito a incubação. Assim o meio em coluna é uma forma de criar anaerobiose. Após se realizar a incubação vamos verificar os resultados. A norma 2262 diz algo parecido com isto: Após a incubação indicada em 9.4, consideram-se positivos os tubos que apresentam colónias negras características isoladas ou não, uma vez que as colónias resultantes do desenvolvimento dos esporos das bactérias sulfito-redutoras têm tendência para alastrar e enegrecer todo o meio; considera-se positivo nas diluições que tiverem um resultado positivo; RESULTADOS: sendo d1 e d2 respectivamente os expoentes da mais alta diluição decimal positiva e mais baixa diluição decimal negativa, a pesquisa refere-se como: positiva em 10 d1 e negativa em 10 d2 G ou cm 3 ; pode apresentar-se na forma de potência ou decimal. Disto antes de mais nada nota-se que: depois de incubar é bom irmos ver ao fim de 1 dia, 2, 3, consoante as colónias vão aparecendo pois ao fim dos 5 dias pode já o meio estar todo negro e impossibilitar a visualização das colónias. Na aula fizemos apenas uma amostra de água e uma suspensão de um alimento; obtivemos colónias escuras num dos meios (suspensão) e um tubo todo escuro (no da água); relativamente à pesquisa na água dizemos que temos positivo por 20 ml de água, logo a água está imprópria segundo a legislação portuguesa; no que refere à suspensão usamos a diluição 10-1 e obtivemos 13 colónias (exemplo); dizemos que é positivo em 1 g; e nº. de esporos de clostridiuns sulfitoredutores = 13 esporos/g de alimento. Acho que está a bem dizer tudo de mais importante salientado do que fizemos. Para se fazer isto com uma pernas às costas seria bom: - ler as normas por alto; - rever os procedimentos que fizemos; - atender à forma de dar os resultados; - ir com calma! Boa sorte! Zé tolas,