Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino: clínica, histopatologia e proteômica

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1 Universidade Federal de Ouro Preto UFOP Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas NUPEB Laboratório de Enzimologia e Proteômica - LEP Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino: clínica, histopatologia e proteômica Jonatan Marques Campos Ouro Preto 2012

2 Universidade Federal de Ouro Preto UFOP Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas NUPEB Laboratório de Enzimologia e Proteômica - LEP Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino: clínica, histopatologia e proteômica Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas (NUPEB) da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP), como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia, Área de concentração - Genômica e Proteômica. Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges Co-Orientador: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade Ouro Preto 2012

3 C198a Campos, Jonatan Marques. Alterações hepatoesplênicas associadas à infecção por Schistosoma mansoni no modelo murino [manuscrito] : clínica, histopatologia e proteômica / Jonatan Marques Campos xv, 95f.: il., color; grafs.; tabs.; mapas. Orientador: Prof. Dr. William de Castro Borges. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Área de concentração: Genômica e Proteômica. 1. Proteômica - Teses. 2. Biotecnologia - Teses. 3. Schistosoma mansoni - Teses. 4. Biomarcadores - Teses. 5. Esquistossomose - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. CDU: : Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

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5 Colaboradores Profa. Dra. Cláudia Martins Carneiro I Prof. Dr. Vanderlei Rodrigues II Prof. Dr. Milton Hércules guerra de Andrade III Profa. Dra. Lizandra Guidi Magalhães II M.s. Nívia Carolina Nogueira Paiva I Dra. Adriana Paes Leme VI Mestranda Renata Alves de Oliveira e Castro IV Mestranda Aline Costa Litalino I I Laboratório de Imunpatologia NUPEB/UFOP II Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos FMRP/USP III Laboratório de Enzimologia e Proteômica NUPEB/UFOP IV Laboratório de Imunoparasitologia NUPEB/UFOP VI - Setor de Espectrometria de Massas do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais ABTLuS) i

6 Este trabalho é dedicado a todos meus familiares; Meus pais, Raul Antônio e Ingrid Marques; Minha irmã, Jenifer Marques Meus avós, Clotilde Marques e Nilo Marques (in memorian), Tarcília Campos e Raimundo Campos. ii

7 Agradecimentos A Deus por me proporcionar paz, esperança e força durante toda minha caminhada. Aos meus pais, irmã e familiares por serem o alicerce do meu crescimento. Ao professor William de Castro Borges pela excelente orientação, aprendizado, confiança, incentivo e seriedade. Ao professor Milton Hércules Guerra de Andrade pela co-orientação, incentivo e desenvolvimento de recursos técnicos no LEP. Ao professor Vanderlei Rodrigues pela colaboração e oportunidade de desenvolvimento de parte deste trabalho em seu laboratório FMRP/USP. A professora Cláudia Martins Carneiro pela colaboração e conselhos nos experimentos. Aos professores Ieso de Miranda e Renata Guerra por terem disponibilizados seus laboratórios auxiliando no desenvolvimento deste trabalho. A doutoranda Nívia Carolina pela excelente colaboração na realização da análise histológica presente neste trabalho. A Profa. Dra Lizandra Guidi Magalhães pela ajuda nos experimentos realizados na FMRP/USP. A mestranda Renata Alves de Oliveira e Castro pela ajuda nos experimentos. Aos amigos do LEP pela amizade, apoio, aprendizado e momentos de diversão. Agradeço ao mestrando Leandro Xavier Neves pela ajuda nos experimentos. Ao técnico do LEP José Henrique Braga Fortes pela experiência de laboratório, por proporcionar um ambiente de trabalho organizado e pela ajuda nos recursos técnicos. Aos amigos da República 171 que me acolheram e foram meus parceiros de festas e futebol durante todo este tempo. Em especial ao Daniel Discaciate (Daniboy) e ao Paulo Renato (Marú). Ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia/NUPEB/UFOP pela oportunidade do desenvolvimento desta dissertação. A CAPES/REUNI pela bolsa de estudos fornecida durante a realização deste projeto. A FAPEMIG pelo apoio financeiro para execução deste projeto. A todos que direto ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. iii

8 Faço o melhor que sou capaz, só para viver em paz. (Marcelo Camelo Los Hermanos) iv

9 Sumário Lista de Figuras...vii Lista de Tabelas...ix Lista de Abreviaturas e Símbolos...x Resumo...xii Abstract...xiv 1 Introdução Aspectos gerais O ciclo biológico do Schistosoma mansoni Diagnóstico e Tratamento Proteômica Modelo murino de infecção por S. mansoni Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Metodologia Manutenção do ciclo do S. mansoni Delineamento Experimental Exame parasitológico de fezes Obtenção do material biológico Razão peso do órgão e peso corporal Leucograma Dosagens enzimáticas para ALT, AST e Albumina Sérica Análise histológica Extração de proteínas Eletroforese unidimensional (1D SDS-PAGE) Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE) Digestão in gel e preparo de amostras para espectrometria de massas...25 v

10 Identificação das proteínas por espectrometria de massas Resultados Exame parasitológico de fezes - acompanhamento da ovoposição nos animais infectados Avaliação de esplenomegalia e hepatomegalia nos animais dos grupos I e II Análises hematológicas e dosagens bioquímicas Análises histológicas de fígado e baço Análise proteômica comparativa de fígado e baço dos animais dos grupos I e II Perfil eletroforético unidimensional e análise densitométrica Perfil proteico em eletroforese bidimensional (SDS-PAGE) da fração solúvel de fígado Perfil proteico em eletroforese bidimensional (SDS-PAGE) da fração solúvel do baço Discussão Conclusões Referências Anexos...75 vi

11 Lista de Figuras Figura 1: Distribuição da Esquistossomose no mundo...3 Figura 2: As 10 principais causas de DALYs...3 Figura 3: Distribuição da população que requer quimioterapia preventiva...5 Figura 4: Ciclo de vida do S. mansoni...8 Figura 5: Géis de eletroforese bidimensional (2-DE)...11 Figura 6: Métodos de ionização soft para análise de peptídeos e proteínas...12 Figura 7: Representação do método de infecção pelo anel...18 Figura 8: Diagrama esquemático para obtenção de proteínas solúveis...22 Figura 9: Ilustração das etapas de produção do gel bidimensional (2-DE)...24 Figura 10: Etapas do processo de digestão in gel...26 Figura 11: Delineamento experimental ilustrando a identificação dos peptídeos obtidos por digestão in gel...28 Figura 12: Gráfico demonstrando a evolução da ovoposição nos animais infectados entre o 35º e o 50º dia de infecção...30 Figura 13: Relação peso do órgão e peso corporal dos grupos I e II...31 Figura14: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo I com 5 semanas de infecção...33 Figura15: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo II com 7 semanas de infecção...34 Figura 16: Fotomicrografias de fígado de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção...37 Figura 17: Gráfico do número de células inflamatórias na região perivascular de fígado...38 Figura 18: Fotomicrografias de baço de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção...39 Figura 19: Gráfico comparando a área do folículo nodular do baço...39 Figura 20: Perfil eletroforético representativo de proteínas solúveis de fígado e baço...41 Figura 21: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo I (5 semanas de infecção)...43 vii

12 Figura 22: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo II (7 semanas de infecção)...44 Figura 23: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de fígado de animais do grupo II (7 semanas de infecção) ph Figura 24: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de baço de animais do grupo I (5 semanas de infecção)...49 Figura 25: Géis bidimensionais representativos de proteínas solúveis de baço de animais do grupo II (7 semanas de infecção)...50 Figura Suplementar Figura Suplementar Figura Suplementar viii

13 Lista de Tabelas Tabela 1: Prevalência das Principais Doenças Tropicais Negligenciadas...4 Tabela 2: Principais metabólitos alterados em urina de camundongos infectados com S. mansoni e em hamsters infectados com S. japonicum...14 Tabela 3: Amostragem de animais...18 Tabela 4: Tabela de dosagens bioquímicas...35 Tabela 5: Dosagens de proteínas solúveis de fígado e de baço...40 Tabela 6: Proteínas de fígado identificadas por espectrometria de massas...46 Tabela 7: Proteínas de baço identificadas por espectrometria de massas...51 Tabela Suplementar 1: Proteínas de Fígado...76 Tabela Suplementar 2: Proteínas de Baço...86 ix

14 Lista de Abreviaturas e Símbolos % - Percentual C Graus Celsius µa - Microampere µg Micrograma µl - Microlitro ACN Acetonitrila ADP Adenosina difosfato ALT Alanino aminotrasferase AMBIC - Bicarbonato de Amônio AST Aspartato aminotrasferase ATP Adenosina trifosfato BCA - bicinchoninic acid BIP - Binding immunoglobulin protein CCA Centro de ciência animal CHAPS (3-[(3-Cholamidopropil) dimetilamônio]-1- propanosulfonato) cm Centímetro Da - Dalton DNA Ácido desoxirribonucleico DTT - Ditiotreitol EDTA - Ethylenediamine tetraacetic acid EF-Tu - Elongation factor thermo unstable ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay empai Exponentially modified protein abundance index FDR False discovery rate FMRP Faculdade de medicina de Ribeirão Preto g - Gramas HCL Ácido Clorídrico HE Hematoxilina e Eosina HSP Proteína de Choque Térmico IAA - Iodoacetamida IEF - Isoeletrofocalização kda Kilodálton Kg Kilograma LEP Laboratório de Enzimologia e Proteômica M Molar m/z Massa sobre carga ma - Miliampere Mb Megabase mg Miligrama min Minutos mm Milímetro mm Milimolar Mr Massa relativa N - Número NaCl Cloreto de Sódio NCBI National Center for Biotechnology Information nl Nanolitro OMS Organização Mundial de Saúde x

15 p:v Peso por volume pb Pares de bases PBS Phosphate buffered saline PCR Reação em cadeia da polimerase ph Potencial hidrogeniônico ROS - Reactive oxygen species SDS Dodecil Sulfato de Sódio SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS TCA Ácido tricloroacético TFA Ácido trifluoracético Tris - tris(hidroximetil)aminometano UFOP Universidade Federal de Ouro Preto USP Universidade de São Paulo V - Volts v:v Volume/volume WHO World Health Organization xi

16 Resumo A Esquistossomose é uma doença endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. É considerada a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública devido ao impacto socio-econômico, podendo ocasionar cerca de 200 mil mortes anualmente. A caracterização do genoma e transcriptoma do Schistosoma mansoni propiciou o emprego de técnicas na área da proteômica as quais vem permitindo maior compreensão da biologia deste parasito em todos os estágios de seu ciclo de vida. Entretanto, até o momento, poucos estudos proteômicos abordaram a relação parasito-hospedeiro. O entendimento desta relação é de fundamental importância para a proposição de novos métodos de diagnóstico, avaliação de prognóstico e tratamento da doença. O presente trabalho teve como foco a análise das alterações no proteoma solúvel de fígado e baço, utilizando o modelo murino de infecção por S. mansoni. A primeira abordagem fundamentou-se na discriminação dos estágios de fase aguda e fase crônica nos animais infectados. Após realização do exame parasitológico de fezes, avaliação das alterações hepatoesplênicas através da relação (% órgão/corpo) e histologia de fígado e baço, foi possível estabelecer que o grupo de animais com 5 semanas de infecção desenvolveu a fase aguda da esquistossomose e animais infectados por 7 semanas apresentaram a fase crônica da doença. A técnica de eletroforese bidimensional comparativa, para proteínas solúveis de fígado e baço de animais controles e infectados, demonstrou alterações nos níveis de expressão de proteínas associadas com processos e vias bioquímicas diversas, como resposta ao estresse celular, tradução, ciclo da uréia e via glicolítica. No fígado, a categoria de proteínas chaperoninas apresentou maior número de representantes com alteração de expressão dentre as quais se destacam GRP-78 (proteína reguladora de glicose 78 kda), HSP-71 (proteína de choque térmico 71 kda), Erp- 60 (calreticulina) e PDI (proteína dissulfeto isomerase). Por outro lado, proteínas como a CPSase I (carbamoil fosfato sintetase I), albumina, indoletilamina N-metiltransferase, peroxirredoxina-6 e anidrase carbônica III apresentaram expressão diminuída no fígado em decorrência da infecção. O perfil proteômico do fígado do animal infectado correlacionou-se com a análise histológica do órgão na qual se observa uma intensa resposta imune celular. No baço, as proteínas identificadas com alteração de expressão foram calreticulina, fosfoglicerato quinase I, frutose-bifosfato aldolase A, gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase, EF-Tu, (fator de elongamento) e aspartato aminotransferase. Em geral, as proteínas diferencialmente presentes no baço de animais infectados apresentaram aumento de expressão, sendo o perfil molecular xii

17 compatível com a demanda de produção de energia e síntese proteica. Estes dois processos são altamente relevantes para o custeio da intensa proliferação celular observada no órgão. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a abordagem proteômica empregada permitiu a identificação de marcadores teciduais induzidos pela infecção por S. mansoni. Abordagens futuras permitirão estabelecer se as alterações teciduais decorrentes da infecção pelo parasito alteram significativamente o proteoma plasmático a ponto de indicar novos biomarcadores da esquistossomose. xiii

18 Abstract Schistosomiasis is an endemic disease affecting 207 million people worldwide. It is considered the second most important parasitic disease in terms of public health due to its social and economic impact, leading to an estimated 200 thousand deaths annually. The characterization of the S. mansoni genome and transcriptome has allowed the use of proteomic techniques providing a deeper understanding of the parasite s biology throughout its life cycle stages. Nevertheless, a few proteomic studies have addressed the host-parasite relationship. Understanding the S. mansoni parasitism is of paramount importance for the proposal of novel diagnostic methods, evaluation of prognosis and treatment of the disease. The present work focused on the spleen and liver soluble proteome-associated alterations in the murine model of experimental schistosomiasis. The first approach involved discrimination between the acute and chronic stages of the disease. After feces examination, measurement of hepatic/spleen mass increase and tissue histology it was established that the 5 week-infected mice developed the acute phase of schistosomiasis whereas animals infected for 7 weeks exhibited the chronic disease. Comparative two dimensional gel electrophoresis, for cytosolic proteins from liver and spleen, demonstrated changes in the expression profile for molecules involved in several cellular processes such as stress response, translation, urea cycle and glycolytic pathway. In the liver, various chaperonins such as GRP-78, HSP-71, Erp-60 and PDI exhibited increased expression profile. In contrast, carbamoyl phosphate synthetase I, albumin, indoethyllamine N-methyltransferase, peroxiredoxin 6 and carbonic anhydrase III were detected at lower levels upon S. mansoni infection. The liver proteomic profile for the infected animal correlated with the histological analysis of the organ in which an intense cellular immune response was observed. In the spleen, the identified proteins displaying altered expression profile were calreticulin, phosphoglycerate kinase I, fructose-biphosphate aldolase A, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, EF-Tu (elongation fator Tu) and aspartate aminotransferase. Overall, the proteins differentially expressed in the spleen of infected animals displayed up regulation evidencing a molecular profile suitable to provide the demand in energy production and protein synthesis. These two cellular processes are of great relevance to maintain the intense cellular proliferation observed in the organ. Collectively, our results demonstrated that the employed proteomic approach allowed the identification of tissue markers induced by the S. mansoni infection. Future experiments will xiv

19 establish whether the observed tissue alterations promoted by the S. mansoni parasitism significantly alter the plasma proteome to highlight novel biomarkers of schistosomiasis. xv

20 1- Introdução

21 1 - Introdução 1.1 Aspectos gerais O gênero Schistosoma é constituído por organismos da família Schistosomatidae, classe Trematoda e filo Platelminto. Os representantes deste gênero possuem sexos separados e um ciclo de vida heteroxeno. As principais espécies de Schistosoma que parasitam os seres humanos são: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma intercalatum e Schistosoma mekongi (Mahmoud, 2004). Algumas destas espécies causam a forma intestinal da esquistossomose (S. mansoni, S. japonicum, S. intercalatum e S. mekongi); as quais, no estágio de vida adulta, localizam-se no sistema porta hepático do hospedeiro vertebrado. O S. haematobium causa a esquistossomose urogenital por localizar-se nas veias do trato urinário, durante a fase de vida adulta e por liberar ovos através da urina (Utzinger et al., 2011) A Esquistossomose também conhecida como Bilharzíase é uma doença parasitária endêmica em vários países, afligindo mais de 207 milhões de pessoas no mundo. Estima-se ainda, que 779 milhões de pessoas possuem o risco de contrair a doença, Figura 1 (World Health 2010); além de ser considerada a 4ª principal doença tropical negligenciada no mundo, Tabela 1 (Hotez et al., 2008). Depois da malária é a segunda infecção parasitária mais importante em termos de saúde pública e impacto socio-econômico, ocasionando cerca de 200 mil mortes por ano, (Wichmann et al., 2009). As doenças tropicais negligenciadas constituem a 6ª maior causa de DALYs (Disability-Adjusted Life Years), um índice métrico adotado pela organização mundial de saúde, o qual avalia o impacto da doença no indivíduo, baseando-se nos anos de vida perdidos devido à incapacidade produtiva e morte prematura, Figura 2. 2

22 Figura 1: Distribuição da Esquistossomose no mundo. Geneva, World Health Organization, ( preventive-chemotherapy/databank/en/index.html). Figura 2: As 10 principais causas de DALYs (Disability-Adjusted Life Years) no mundo. Adaptado de (Hotez et al., 2007). 3

23 Tabela 1: Prevalência das Principais Doenças Tropicais Negligenciadas. Adaptado de (Hotez et al., 2007). O S. mansoni é endêmico no nordeste do Brasil, na Venezuela, Suriname, Caribe e Egito. O S. japonicum é endêmico na China, Filipinas e Indonésia. O S. mekongi é encontrado no Camboja (Chitsulo et al., 2004). No Brasil a esquistossomose mansônica ocorre de forma endêmica nos seguintes estados: Alagoas, Maranhão, Bahia, Pernambuco, Rio Grande do Norte, Paraíba, Sergipe, Espírito Santo e Minas Gerais (predominantemente no norte e nordeste do Estado), Pará, Piauí, Ceará, Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina, Paraná, Rio Grande do Sul, Goiás e no Distrito Federal (SES/MS, 2010, World Health, 2010). Aproximadamente 25 milhões de pessoas vivendo nas zonas rurais estão expostas ao risco de contrair a doença (de Oliveira et al., 2004). O S. mansoni, é dentre as espécies causadoras da 4

24 esquistossomose, a mais estudada no mundo. Acredita-se que a doença chegou às Américas através do comércio de escravos africanos no período colonial (Campbell et al., 2000). No Brasil, a esquistossomose foi detectada pela primeira vez em 1908, pelo médico brasileiro Pirajá da Silva, através de exames de fezes e de vermes coletados a partir de necropsias (Katz, 2008). A transmissão da doença depende da existência de hospedeiros intermediários, e as três principais espécies envolvidas na transmissão para o homem são: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria straminea e Biomphalaria tenagophila. Clinicamente, a esquistossomose pode ser classificada em doença de fase aguda e fase crônica. A fase aguda corresponde à etapa de penetração das cercárias através da pele, variando desde um quadro assintomático até apresentação de um quadro clínico sintomático. Nos seres humanos, a fase crônica inicia-se a partir do sexto mês após a infecção, podendo durar vários anos. Está associada à postura de ovos, lesões no fígado e baço, hipertensão portal, varizes esofagianas e hemorragias, podendo levar à morte (SES/MS, 2010, Ferrari and Moreira, 2011, World Health, 2010). A Assembléia Mundial de Saúde, através da resolução (WHA54. 19) realizada em maio de 2001, recomendou aos países membros a desenvolverem atividades de controle sustentável, garantindo o acesso à medicação e promovendo medidas preventivas para o controle da esquistossomose. A meta mínima era a administração de quimioterapia para pelo menos 75% de todas as crianças em risco de morbidade até 2010 (Favre et al., 2009). Porém estimativas indicam que menos de 10% da população em risco de morbidade recebe quimioterapia preventiva, demonstrando que a cobertura estabelecida em 2001 está longe de ser alcançada, Figura 3. Figura 3: Distribuição da população que requer quimioterapia preventiva. AFR África / AMR Américas / EMR leste do Mediterrâneo / SEAR Sul e leste da Ásia / WPR Oeste do pacífico. Geneva, World Health Organization,

25 1.2 - O ciclo biológico do Schistosoma mansoni O S. mansoni é o agente etiológico da esquistossomose mansônica, uma doença inicialmente assintomática, podendo evoluir para formas clínicas extremamente graves e levar o paciente à morte. A fêmea do S. mansoni mede aproximadamente de 1,2 a 1,6 cm, apresenta corpo cilíndrico e encontra-se alojada em uma fenda do corpo do macho denominada de canal ginecóforo. O macho mede cerca de 1 cm, apresenta cor mais clara que a fêmea e corpo achatado (Loverde and Chen, 1991). O sexo do S. mansoni é determinado no zigoto, este possui 8 pares de cromossomos (2n=16), sendo 7 pares autossômicos e 1 par sexual. A fêmea é heterozigótica ZW e o macho é homozigoto ZZ. (Berriman et al., 2009). O genoma do Schistosoma contém mais de 380 milhões de pares de bases divididos entre os setes pares autossomais e o par sexual. A versão mais recente proposta para o genoma do S. mansoni contabiliza cerca de genes (Protasio et al., 2012). O ser humano é o principal hospedeiro definitivo do S. mansoni. Nele, o parasito apresenta a forma adulta, reproduz-se sexuadamente e, por meio da eliminação dos ovos, ocasiona a contaminação das coleções hídricas. A infecção no hospedeiro vertebrado se dá através do contato com água doce contendo cercárias, as quais são capazes de penetrar ativamente na pele do hospedeiro, orientadas por estímulos químicos e utilizando-se do conteúdo proteico das glândulas pré e pós acetabulares. (Collins et al., 2011, Curwen et al., 2006). Proteínas presentes nas secreções das glândulas cercarianas possuem funções proteolíticas e imunomoduladoras. Uma variedade de isoformas para elastase, além de outras enzimas proteolíticas (dipeptidil peptidase e invadolisinas), constitui as secreções utilizadas no processo de penetração. Outra proteína encontrada em secreções de cercárias é a SmKK7, por apresentar homologia com toxinas de escorpião, acredita-se que possua a capacidade de bloquear canais de K +, auxiliando na modulação do sistema imune (Curwen et al., 2006). O processo de penetração das cercárias pode levar em média de 4 a 6 minutos, porém algumas cercárias levam apenas 1.5 minutos para passar pela barreira física da pele (Haas and Haeberlein, 2009). Ao penetrarem na pele do hospedeiro as cercárias perdem a cauda, e após uma rápida transformação, atingem o estágio de esquistossômulo. A transformação em esquistossômulo dá origem ao tegumento heptalaminar, o qual permite a adaptação às alterações de osmolaridade, nutrientes, temperatura e ação do sistema imune (Skelly and Shoemaker, 2000). A camada mais externa do tegumento, o membranocalyx, possui a capacidade de captar 6

26 proteínas e moléculas do hospedeiro como CD44 e glicolipídeos provenientes de eritrócitos, favorecendo-o na evasão do sistema imune (Castro-Borges et al., 2011a). O tegumento também funciona como uma barreira física protegendo os componentes enzimáticos, transportadores, canais iônicos da membrana plasmática e ainda apresenta capacidade de renovação a cada 5 dias (Saunders et al., 1987, Braschi and Wilson, 2006). Os esquistossômulos permanecem neste estágio por 2 a 3 dias, antes de migrarem, através do sistema linfático e vênulas presente na derme, para o sistema circulatório. Ao atingir a corrente sanguínea, passam pelo coração e eventualmente pelos pulmões, até alcançarem o sistema porta-hepático. Após o 28 dia de infecção, os vermes presentes no sistema porta-hepático se acasalam e dão início à migração até as vênulas mesentéricas para o início da ovoposição. Através do pareamento, o macho libera os espermatozóides dentro do canal ginecóforo, estes fecundam os ovócitos dando origem ao zigoto (Dewalick et al., 2011). O desenvolvimento sexual da fêmea e, consequentemente, o início da ovoposição, são dependentes do acasalamento com o macho. Acredita-se que através de vias de sinalização envolvendo o fator de crescimento TGF-β, o macho ativa e regula a expressão gênica na fêmea (Freitas et al., 2007, Beckmann et al., 2010). A produção de aproximadamente 300 ovos por dia, e a consequente presença destes ovos no tecido hepático, promove a liberação de antígenos solúveis (SEA), induzindo o aparecimento de reações inflamatórias periovulares, originando os granulomas e, em seguida, o processo de fibrose (Manzella et al., 2008). As glicoproteínas Omega-1 e IPSE/alpha-1 juntas constituem a fração mais abundante dos antígenos solúveis de ovos (SEA). Estas proteínas são hepatotóxicas e imunogênicas, possuem a capacidade de estimular a liberação de IL-4, induzindo uma resposta inflamatória do tipo Th2 no hospedeiro (Abdulla et al., 2011, Mathieson and Wilson, 2010). Os ovos depositados no endotélio da parede das vênulas induzem uma reação inflamatória periovular, a qual provavelmente facilita a passagem dos mesmos pela musculatura até atingirem a luz intestinal (Lenzi et al., 1991). Ao serem liberados juntamente com as fezes, os ovos alcançam as coleções hídricas e, em contato com a água doce, eclodem liberando os miracídios. Os miracídios são formas larvais ciliadas, capazes de nadar em busca do hospedeiro invertebrado, moluscos do gênero Biomphalaria. No hepatopâncreas do molusco, as larvas transformam-se em esporocistos primários, os quais se desenvolvem em esporocistos secundários. Estes últimos, por meio de reprodução assexuada, dão origem às cercárias. Análises recentes de transcrição gênica por microarray sugerem que a síntese de proteínas a serem utilizadas pelas cercárias durante a infecção do 7

27 hospedeiro vertebrado, ocorre no interior do molusco durante os estágios de diferenciação em cercárias (Parker-Manuel et al., 2011), Figura 4. Figura 4: Ciclo de vida do S. mansoni. O S. mansoni possui um ciclo heteroxeno, necessitando de um hospedeiro invertebrado (Biomphalaria) e de um hospedeiro vertebrado. Cercárias liberadas pelos caramujos penetram ativamente na pele do hospedeiro vertebrado e se transformam em esquistossômulos. Estes atingem o sistema circulatório através da derme, e se alojam no sistema porta-hepático. No sistema porta-hepático os vermes, acasalam-se e, em seguida, migram para as veias mesentéricas dando início à ovoposição. Os ovos atingem as coleções hídricas, eclodem e liberam os miracídios. Os miracídios infectam o caramujo, transformam-se em esporocistos primários que por poliembrionia geram esporocistos filhos e depois cercárias. Adaptado de: Introdução à parasitologia. Wilson, R.A, pp13. 8

28 1.3 - Diagnóstico e Tratamento O diagnóstico da esquistossomose pode ser realizado por métodos diretos e indiretos. Os métodos indiretos ou sorológicos dependem de marcadores bioquímicos e imunológicos associados à infecção, dentre os quais se destacam os testes imunológicos como a imunofluorescência, ensaios imunoenzimáticos (ELISA), reação intradérmica e reação periovular. Técnicas de reação em cadeia de polimerase estão sendo descritas para o diagnóstico da doença (Pontes et al., 2002). Atualmente a técnica de Kato-Katz é o método parasitológico recomendado para o diagnóstico da esquistossomose, por ser quantitativo e prático (Katz et al., 1972). No entanto, a sensibilidade desta técnica diminui quando a prevalência e intensidade da infecção são baixas (Zhou et al., 2008, Lin et al., 2008). Os testes sorológicos para detecção de IgG e IgM no soro de pacientes, possuem uma grande sensibilidade, podendo indicar infestação atual ou passada, principalmente em áreas de baixa prevalência da doença, ou em pacientes com baixa parasitemia. O método de ELISA, por exemplo, além de proporcionar ensaios quantitativos, mostra-se mais adequado para aplicação em estudos populacionais onde se encontra baixa parasitemia, apresentando uma sensibilidade e especificidade próximas de 98% (Oliveira et al., 2005). Teste de imunofluorêscencia para a detecção de anticorpos contra S. mansoni demonstram alto grau de sensibilidade 95,6% para as fases aguda e crônica (Kanamura et al., 2002). Entretanto, este método possui especificidade em torno de 50%. Em geral os ensaios de detecção de anticorpos demonstram ser mais sensíveis que os exames parasitológicos, mas carecem de especificidade. Já a detecção de antígenos circulantes é um método altamente específico, porém não tem demonstrado ser mais sensível que os exames parasitológicos em áreas de baixa endemicidade (Attallah et al., 1999, Van Lieshout et al., 1995). Os testes de reação em cadeia da polimerase (PCR), realizados a partir de amostras de fezes e soros de pacientes, não demonstraram reações cruzadas com outros helmintos, atingindo sensibilidade de 96.7% e especificidade de 88% (Pontes et al., 2002). Contudo, testes como imunofluorêscencia e PCR não estão disponíveis na rotina do sistema público de saúde (Sorgho et al., 2005). Desta maneira, torna-se necessário o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico, especialmente para auxiliar na detecção de pacientes com baixa carga parasitária (Alan Wilson et al., 2006). Para o tratamento da esquistossomose, o praziquantel e a oxaminiquine são as drogas de escolha. Os dois medicamentos se equivalem quanto à eficácia e segurança, todavia o 9

29 praziquantel é a droga disponível atualmente, em função do menor custo. O modo de ação do praziquantel não é totalmente compreendido, a maioria dos estudos aponta para perturbações na homeostase do cálcio e comprometimento das funções normais do tegumento (Kasinathan et al., 2010). Neste sentido, o desenvolvimento de novos medicamentos para combater a infecção também se torna necessário, uma vez que existem relatos de resistência do parasito à ação deste fármaco (Kasinathan et al., 2010) Proteômica A palavra proteoma foi primeiramente introduzida por Wilkins (1996), onde foi utilizada para expressar a idéia do conjunto das proteínas de uma célula ou organismo. Assim, a proteômica foi estabelecida como ferramenta para o estudo da expressão proteica e suas alterações (Anderson and Anderson, 1998). Atualmente existe um grande interesse na aplicação da proteômica, como ferramenta para a identificação de marcadores proteicos. Alguns tecidos, órgãos e fluidos corporais, tais como plasma e saliva já estão sendo utilizados na busca de possíveis biomarcadores de infecções (Bodzon-Kulakowska et al., 2007). A proteômica também reune ferramentas que fornecem informações sobre modificações póstraducionais, abundância de proteínas e interações proteicas, possibilitando o estudo de alterações metabólicas ocorridas em um organismo (Harvie et al., 2007, Manivannan et al., 2011). Com o melhoramento de técnicas de pré-fracionamento destes proteomas e com a introdução da técnica de eletroforese bidimensional (2-DE), em 1975 por O'Farrell e Klose; tornou-se possível a análise e detecção de proteínas em amostras biológicas mais complexas (O'Farrell, 1975). Através da técnica de eletroforese bidimensional, as proteínas são inicialmente separadas de acordo com o ponto isoelétrico e, em seguida, submetidas à separação por massa molecular, com auxílio de uma matriz polimérica (acrilamida/bisacrilamida), Figura 5. Assim, tornou-se possível a detecção de alterações como: aumento ou diminuição da expressão de proteínas em um proteoma específico e modificações pós-traducionais como glicosilação e fosforilação. 10

30 A) B) Figura 5: Géis de eletroforese bidimensional. Géis ilustrativos mostrando a separação das proteínas na primeira dimensão ph 3-10, seguido de separação de acordo com a massa molecular. Adaptado de (Rusconi et al., 2010) A partir do desenvolvimento de gradientes de phs imobilizados, para separação das proteínas na 1ª dimensão, obteve-se uma melhor reprodutibilidade dos géis (Gorg et al., 2009). Em seguida, surgiu a necessidade de identificação em larga escala das proteínas detectadas em gel. O emprego da técnica de digestão in gel, a qual baseia-se na excisão da banda contendo a proteína de interesse e incorporação de enzimas proteolíticas, para a geração de peptídeos, possibilitou a identificação destas proteínas por espectrometria de massas. As recentes técnicas de sequenciamento de peptídeos / proteínas via ESI-MS ( Electrospray Ionization Mass Spectrometry ) e MALDI-MS ( Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) e o desenvolvimento de algoritmos de busca utilizando-se de dados espectrais, tornou possível a identificação de proteínas em larga escala (Cottrell, 2011, Seidler et al., 2010). No processo de ionização por ESI, os peptídeos são submetidos à cromatografia líquida e, durante a eluição, direcionados à um spray capilar. Neste capilar aplica-se uma altissíma diferença de potencial, proporcionando a formação e dispersão de gotas microscópicas carregadas. Uma vez dispersadas, as gotículas microscópicas contendo os peptídeos ionizados, são evaporadas formando-se gotas de diâmetros cada vez menores, até atingirem o estado gasoso, evento chamado de fissão de 11

31 Coulomb (Kebarle and Verkerk, 2009). Após a fissão, a relação m/z (massa/carga) pode ser obtida a partir de uma variedade de analisadores de massas e detectores disponíveis atualmente, Figura 6A. No processo de ionização por MALDI, os peptídeos são misturados à uma matriz orgânica capaz de absorver radiação ultra violeta. Após a solidificação dos peptídeos na matriz orgânica utiliza-se laser em comprimento de onda definido, para promover a sublimação e transferência de carga aos peptídeos, possibilitando a identificação via diferentes analisadores de massas Figura 6B. A - ESI B - MALDI Figura 6: Métodos de ionização soft para análise de peptídeos e proteínas. A) Técnica de ESI, ilustrando a eletropulverização de peptídeos B) Técnica de MALDI, ilustrando a ionização de peptídeos misturados a uma matriz orgânica. Adaptado de (Steen and Mann, 2004). 12

32 1.5 - Modelo murino de infecção por S. mansoni Considerado como o principal modelo utilizado para infecção experimental por S. mansoni, o modelo murino vem contribuindo para o entendimento de inúmeros aspectos ligados à esquistossomose e à biologia do parasito (Abdul-Ghani and Hassan, 2010). Dentre os aspectos que justificam sua utilização incluem o baixo custo, a facilidade de manipulação do animal e o tempo reduzido necessário para a evolução clínica da doença. No camundongo, a esquistossomose de fase aguda se estabelece durante os primeiros 30 a 35 dias de infecção, tempo necessário para a instalação dos vermes adultos no sistema porta-hepático, pareamento e início da ovoposição (Loverde and Chen, 1991, Harvie et al., 2007). A fase crônica, por sua vez, inicia-se a partir da postura dos ovos sendo as complicações teciduais ocasionadas pela deposição crescente dos mesmos nos tecidos, especialmente no hepático (Manivannan et al., 2010). Dependendo da carga parasitária, o animal dificilmente sobrevive à 8ª semana de infecção, embora tenha sido demonstrado que a infecção com 45 cercárias garante sobrevida por até 20 semanas em camundongos machos da linhagem CBA/J (Henderson et al., 1993). Mais recentemente o modelo murino tem sido empregado para a identificação de possíveis marcadores teciduais da infecção por S. mansoni, utilizando-se de abordagens na área da proteômica (Manivannan et al., 2010). Análises do proteoma total de fígado de camundongos infectados demonstraram alterações nos níveis de várias enzimas relacionadas ao metabolismo energético, resposta ao estresse, dentre outras (Manivannan et al., 2012). Espera-se que a curto prazo as inovadoras tecnologias para identificação e quantificação de proteínas forneçam um inventário molecular do impacto da doença no hospedeiro vertebrado. Tais investigações são de particular importância, especialmente quando aplicadas aos estágios da doença para os quais é possível a correlação com a doença humana (Manivannan et al., 2011, Harvie et al., 2007). Estudos de metabolômica também têm sido realizados utilizandose do modelo murino de infecção por S. mansoni. A identificação rápida e inequívoca de centenas de metabólitos diferencialmente presentes no soro e urina de animais infectados vem proporcionando a validação de métodos alternativos para a detecção dos distúrbios metabólicos associados à infecção - Tabela 2 (Wu et al., 2010a, Balog et al., 2011). Neste sentido, a detecção de níveis elevados do aminoácido hidroxiprolina em soros de animais infectados tem sido avaliada como potencial indicador de fibrose em pacientes com esquistossomose hepatoesplênica (Wang et al., 2004, Utzinger et al., 2011). 13

33 Tabela 2: Principais metabólitos alterados em urina de camundongos infectados com S. mansoni e em hamsters infectados com S. japonicum (Utzinger et al., 2011). a Camundongos fêmeas infectados com 80 cercárias de S. mansoni, amostras de urina coletadas após 46 e 56 dias de infecção e analisadas por ressonância magnética nuclear (NMR). b Camundongos fêmeas infectados com 100 cercárias de S. mansoni, amostras de urina coletadas após 56 dias de infecção e analisadas por eletroforese em capilar (CE). c Hamsters infectados com 100 cercárias de S. japonicum, amostras de urina coletada após 36 dias de infecção e analisadas por ressonância magnética nuclear (NMR). O presente trabalho pretende, a partir de uma coleção de dados clínicos, ensaios de atividade enzimática, análise histológica de fígado e baço e análise comparativa de proteínas por gel bidimensional, contribuir com o entendimento da relação parasito/hospedeiro durante o curso da infecção por S. mansoni, utilizando camundongos isogênicos da linhagem Balb/c. Espera-se que os resultados encontrados possam, no futuro, apontar candidatos potenciais para melhoria das técnicas de diagnóstico, prognóstico e tratamento da esquistossomose. 14

34 2 - Objetivos

35 2 - Objetivos Objetivo geral Identificação de proteínas solúveis diferencialmente presentes no fígado e baço de camundongos Balb/c infectados por S. mansoni, nos estágios de fase aguda e crônica da doença Objetivos específicos Discriminar os estágios de fase aguda e fase crônica da esquistossomose em camundongos Balb/c infectados com cercárias de S. mansoni através de ensaios enzimáticos, leucometria, Razão percentual (órgão/corpo) e análise histológica; Obter o proteoma solúvel de fígado e baço dos animais controles e infectados nos dois estágios distintos da infecção; Realizar eletroforese bidimensional comparativa para a detecção de proteínas diferencialmente presentes no fígado e baço de animais infectados; Identificar as proteínas selecionadas por espectrometria de massas. 15

36 3- Metodologia

37 3 - Metodologia Manutenção do ciclo do S. mansoni A manutenção do ciclo do S. mansoni é rotineiramente realizada no Laboratório de Biologia Molecular de Parasitas Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / USP. Cercárias de S. mansoni da linhagem Porto Rico são recuperadas a partir de moluscos da espécie Biomphalaria glabrata previamente infectados. Os moluscos são mantidos no escuro por 48 horas antes de serem expostos à luz artificial, pelo período mínimo de 2 horas para a liberação das cercárias. As cercárias liberadas são contadas em microscópio óptico antes de serem utilizadas para a infecção dos animais. O processo de infecção se dá através do contado percutâneo de cercárias com o abdômen dos animais, simulando uma infecção natural. 3.2 Delineamento Experimental Fêmeas de camundongos (Mus musculus, n = 32) germ free, da linhagem Balb/c com 30 dias de idade e aproximadamente 20g foram adquiridos via Biotério Central da Universidade de São Paulo, campus Ribeirão Preto. Os animais foram anestesiados, via intraperitoneal, através da administração associada de dois anestésicos cloridrato de cetamina 10% (Syntec) a 8.0 mg/kg e cloridrato de xilazina 2,3% (Vetbrands) a 4.0 mg/kg, proporcionando uma analgesia de aproximadamente 60 minutos. Com o auxílio de um aparador automático de pelos, fez-se a tricotomia da região abdominal dos animais, para facilitar a penetração das cercárias. Os animais foram colocados em decúbito dorsal, imobilizados em um suporte de acrílico, e em seguida, os anéis de aço inoxidável de dimensões, 1 cm de altura por 0,5 cm de raio, foram posicionados sobre o abdômen e fixados em acrílico com o auxílio de fita adesiva. Em seguida, cerca de 1 ml de suspensão contendo cercárias foi dispensado nos anéis para a infecção de 20 animais. Os camundongos foram mantidos em contato com a suspensão de cercárias durante 30 minutos à temperatura ambiente. Para os outros 12 animais, utilizados como controles não infectados, o processo de infecção foi simulado com a utilização de água. Decorridos 30 minutos de exposição, a suspensão remanescente de cercárias foi descartada em etanol 70%. A Figura 7 ilustra o esquema representativo do processo de infecção pelo método de anel. 17

38 Após a infecção, os 32 animais foram separados em dois grupos conforme indicado na Tabela 3: Grupo I (animais com 5 semanas de infecção) e grupo II (animais com 7 semanas de infecção). Em seguida, os animais foram mantidos em gaiolas à temperatura ambiente com ração e água ad libitum e ciclo claro/escuro com intervalos de 12 horas. Todos os procedimentos realizados com os animais foram aprovados pela Comissão de Ética em Uso Animal. 1-Biomphalaria glabrata infectados 2-Liberação das cercárias 3-Contagem das cercárias 4-Anestesia dos animais 5-Suspensão de cercárias 6-Infecção por anel Figura 7: Representação do método de infecção por anel. 1 e 2- Caramujos infectados são expostos à luz para liberação das cercárias. 3- A contagem das cercárias é realizada em microscópio óptico. 4- Camundongos são anestesiados por via intraperitoneal. 5- A suspensão de cercárias (200 cercárias/ml) é adicionada sobre o abdômen do animal, através do anel de infecção. 6- Decorrido 30 minutos de infecção, a suspensão de cercárias é retirada do anel. Tabela 3: Amostragem de animais Grupo I 5 semanas Controle (N=6) Infectado (N=10) Grupo II 7 semanas Controle (N=6) Infectado (N=10) N Número de animais. 18

39 3.3 - Exame parasitológico de fezes Cerca de 300 mg de fezes recolhidas de cada animal infectado, foram coletadas entre o 35º e o 50º dia de infecção em intervalos de 5 dias. As amostras foram conservadas em formol tamponado 10% até a realização dos exames. Análise das fezes foi realizada segundo o método de sedimentação espontânea ou método de Hoffman, (Hoffman WA, 1934). O sedimento obtido foi analisado diretamente ao microscópio óptico para a determinação do número de ovos por lâmina. As lâminas foram confeccionadas em triplicata para cada animal, utilizando-se 200 μl de sedimento Obtenção do material biológico Todos os animais dos grupos I e II foram eutanasiados respectivamente após 5 e 7 semanas de infecção, utilizando-se a administração intraperitoneal dos anestésicos cloridrato de cetamina 10% (Syntec) a 24.0 mg/kg e cloridrato de xilazina 2,3% (Vetbrands) a 12.0 mg/kg. Após verificação de analgesia profunda, os animais foram pesados e, em seguida, cerca de 700 L de sangue coletados por punção cardíaca. O sistema porta-hepático dos animais foi posteriormente perfundido com solução salina citratada (NaCl 0.85%, Citrato de sódio 0.75%). Após a perfusão foram retirados o fígado e o baço dos animais dos grupos controle e infectado. Os órgãos foram pesados, lavados em tampão fosfato de sódio (PBS 0,01 M ph 7,2) e segmentos de aproximadamente 0.5 cm de largura obtidos e armazenados em formol tamponado 10% para análises histológicas. O restante dos órgãos foi congelado em freezer - 80 C para posteriores análises proteômicas. 3.5 Razão peso do órgão e peso corporal Para todos os animais dos grupos I e II, obteve-se a razão percentual entre o peso dos órgãos, fígado e baço, em relação ao peso corporal dos animais (% órgão/corpo). Este parâmetro foi obtido para avaliação de hepatoesplenomegalia dos animais infectados em comparação com os animais controles em cada fase de infecção. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student s t-test não pareado, através do software Prism versão

40 3.6 Leucograma O sangue obtido foi dividido em duas partes, sendo cerca de 400 μl mantido na presença de EDTA a 2% para análises hematológicas e 300 μl para obtenção de soro. Para a realização das análises hematológicas foram determinados: contagem global de leucócitos e análise diferencial (número de linfócitos, neutrófilos segmentados, monócitos e eosinófilos). Os leucogramas dos animais do grupo controle serviram como valores normais de referência. Os esfregaços obtidos para a contagem diferencial foram corados utilizando-se o Kit Instant Prov (Labor & Labor Bioclin). Para a contagem global de leucócitos, diluiu-se o sangue em líquido de Turk (ácido acético 2%, violeta genciana 0,1%) na proporção de 1:10 e este foi analisado em câmara de Neubauer espelhada. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student s t-test não pareado, através do software Prism versão Dosagens enzimáticas para ALT, AST e Albumina Sérica O soro obtido foi utilizado para dosagens bioquímicas de ALT (alanino aminotransferase); AST (aspartato aminotrasferase) e Albumina sérica. As amostras de soro foram analisadas pelo Laboratório de Análises Clínicas - Claudino / Ouro Preto, onde as enzimas transaminases foram dosadas através de métodos cinéticos e submetidas à leitura no ultravioleta por espectrofotometria (Bioclin). A albumina foi dosada através do método colorimétrico verde de bromocresol (Bioclin). As dosagens enzimáticas e de albumina do grupo controle serviram como valores normais de referência. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student s t-test não pareado, através do software Prism versão Análise histológica Durante a necropsia, amostras de fígado e baço foram fixados em formol 3,7% tamponado (ph 7.2), processados rotineiramente e incluídos em parafina. Secções de aproximadamente 4 μm de espessura foram obtidas em micrótomo e submetidas à coloração com Hematoxilina & Eosina (HE) e Tricrômico de Masson. Nos cortes de baço foi avaliado o grau de organização tecidual (distribuição da polpa branca e polpa vermelha). Nos cortes de fígado, foram avaliados o processo inflamatório 20

41 perivascular e a área média dos granulomas. A coloração de Tricrômico de Masson permitiu a avaliação qualitativa do processo de fibrose no interior dos granulomas. Para avaliação do processo inflamatório foram quantificados os núcleos celulares presentes no infiltrado perivascular em toda a extensão do corte histológico. As imagens foram visualizadas pela objetiva de 40x e digitalizadas através da microcâmera Leica DFC340FX associada ao microscópio Leica DM5000B. Todas as imagens foram analisadas com o auxílio do software de análise e processamento de imagem Leica QwinV3 no Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto. O processo inflamatório foi determinado pela diferença significativa (p<0,05) entre o número de núcleos celulares presentes nos animais infectados e aquele observado nos animais controles ± desvio padrão Extração de proteínas Para a extração de proteínas solúveis, 100 mg de tecidos foram macerados em nitrogênio líquido com o auxílio de um gral e pistilo. O conteúdo macerado foi colocado em eppendorf e, em seguida, adicionou-se 500 μl de tampão de extração (Tris-HCl 25 mm ph 7,5) contendo 20 μl de PIC ( coquetel inibidor de proteases, Sigma-Aldrich). A mistura foi homogeneizada em vortex por 5 minutos, seguido de sonicação (Sonifer 250 Branson) por 5 ciclos de 20 pulsos em banho de gelo. A suspensão resultante foi centrifugada a 4 C e x g por 1 hora em centrifuga Sorvall 5C. O sobrenadante, referente à fração solúvel, foi recuperado e o sedimento contendo membranas, armazenado a -80 C. Uma alíquota de 50 μl do sobrenadante foi armazenada para dosagem de proteínas totais. Após a recuperação do sobrenadante, o mesmo foi colocado em um tubo tipo Falcon de 15 ml para a precipitação das proteínas com ácido tricloroacético (TCA) e acetona. Para cada 1 ml de sobrenadante foram adicionados 8 ml de acetona P.A gelada e 1 ml de solução de ácido tricloroacético (TCA) 100%. A mistura foi homogeneizada e deixada durante a noite em freezer a -20 C para precipitação das proteínas. Após a precipitação, a mistura foi centrifugada a x g por 30 minutos a 4 C em centrifuga Sorvall 5C. O precipitado foi ressuspendido e lavado por 2 vezes com 500 μl de acetona gelada e novamente centrifugado a 4 C e x g por 30 minutos. O precipitado de proteínas foi deixado à temperatura ambiente para evaporação total da acetona. Finalmente, o precipitado foi ressuspendido em 21

42 200 μl de tampão de reidratação (uréia 7 M; tiouréia 2 M; CHAPS (3-[(3-Cholamidopropil) dimetilamônio]-1- propanosulfonato) 4%; azul de bromofenol 0.002%), Figura 8. Figura 8: Diagrama esquemático para obtenção de proteínas solúveis Eletroforese unidimensional (1D SDS-PAGE) Anteriormente à confecção dos géis unidimensionais, fez-se a dosagem de proteínas solúveis, obtidas conforme o item 3.9. pra esta dosagem foi utilizando o kit BCA protein assay (Thermo scientific). O extrato proteico da fração citosólica de cada órgão, foi analisado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (10% SDS-PAGE) conforme descrito por Laemmli, UK Para o preparo da amostra a ser analisada, cerca de 30 μg de proteínas foram desnaturados em 10 μl de tampão da amostra (Tris-HCl M 22

43 ph 6.8; SDS 4%; glicerol 20%; azul de bromofenol 0,002%). As amostras foram fervidas em banho-maria por 5 minutos, e, em seguida, aplicadas no gel. A eletroforese ocorreu a 200 V e 20 ma durante aproximadamente 1,5 horas. Utilizou-se solução de Coomassie Brilliant Blue G 250 (Coomassie Brilliant Blue G 250 2%; etanol 40%; ácido acético 7%) para coloração do gel durante 2 horas. O gel foi descorado em solução A (etanol 40%, ácido acético 7%) por 30 minutos e, em seguida, em solução B (etanol 10%, ácido acético 7%) durante a noite. As imagens dos géis foram obtidas através do scanner ImageScanner III (GE healthcare). A análise densitométrica, utilizando-se de canaletas referências contendo 30 g de proteínas citossólicas, foi realizada com o auxílio do software Quantity One, versão Bio Rad. Esta análise foi utilizada para se igualar a quantidade total de proteínas obtidas dos animais controles e infectados e posterior confecção das réplicas técnicas nos géis bidimensionais Eletroforese bidimensional (2-D SDS-PAGE) Para a confecção de géis bidimensionais 300 μg de proteínas citosólicas foram solubilizadas em tampão de reidratação contendo DTT a 1% e anfólitos ph 3-10 ou 4-7 0,8%. As amostras foram acondicionadas em sarcófagos (Strip Holder 7 cm, GE Healthcare) para a incorporação das proteínas no gel de primeira dimensão (Immobiline DryStrip Gels 7cm; ph 3-10 ou ph 4-7, Linear,GE Healthcare). A etapa de isoeletrofocalização (IEF) ocorreu à temperatura de 20 C a 50 μa/gel no equipamento Ettan IPGphor III (GE Healthcare) de acordo com o seguinte protocolo: reidratação por 12 horas; 300V durante 30 minutos; 1000V por 30 minutos e 8000V por 3 horas. Após a focalização isoelétrica, as proteínas presentes nos géis de primeira dimensão foram submetidas à redução com 1% de DTT em solução de equilíbrio (uréia 6M; Tris-HCl ph M; glicerol 30%; SDS 2%; azul de bromofenol 1%) e, em seguida, alquiladas com iodoacetamida (IAA) a 4% em solução de equilíbrio. Para a separação das proteínas por massa molecular (segunda dimensão) utilizou-se gel de acrilamida/bisacrilamida a 10%. O gel de primeira dimensão foi posicionado e posteriormente fixado no gel de segunda dimensão com solução de agarose 1% a quente em tampão de eletroforese. A eletroforese ocorreu nas seguintes condições: 200 V e 20 ma/gel durante aproximadamente 1,5 horas. Para corar o gel foi utilizado solução de Coomassie Blue G 250. Após 2 horas de coloração o gel foi descorado em solução A (etanol 40%, ácido acético 7%) por 30 minutos e, em seguida, em solução B (etanol 10%, ácido acético 7%) durante a noite. As imagens dos géis foram obtidas através do scanner ImageScanner III (GE 23

44 healthcare) e sobrepostas através do software 2-D Evolution v.2005, (GE healthcare). A Figura 9 mostra uma representação das etapas de confecção dos géis bidimensionais. Figura 9: Ilustração das etapas de produção do gel bidimensional (2-DE). Extratos citosólicos, obtidos de fígado e baço de animais controle e infectados, foram adsorvidos em géis de primeira dimensão 7cm (ph3-10/4-7) por 12 horas. Os géis reidratados foram isoeletrofocalizados no aparelho Ettan IPGphor III e as proteínas posteriormente reduzidas e alquiladas com DTT 1% e IAA 4%, respectivamente. A segunda dimensão ocorreu em géis de poliacrilamida 10%. Após coloração dos géis a análise de expressão diferencial foi realizada com auxílio do software 2-D Evolution v.2005 Non Linear Dynamics. 24

45 3.12 Digestão in gel e preparo de amostras para espectrometria de massas Após a obtenção dos géis bidimensionais, os spots de interesse (proteínas diferencialmente presentes nos grupos controle e infectados) foram excisados e transferidos para eppendorfs de 1,5 ml contendo 300 μl de solução descorante (etanol 40%; ácido acético 7%) e mantidas a 37 C até a completa descoloração. A solução descorante foi retirada e os spots lavados com 500 μl de água milli-q para remover o excesso de solução descorante. Em seguida, os spots foram novamente lavados e desidratados por 3 vezes durante 5 min em 300 μl de solução 20 mm NH 4 HCO 3 / Acetonitrila (ACN) 50%. A desidratação completa dos spots ocorreu em speed vaccum durante 30 minutos. Os spots foram reidratados com cerca de 15 μl de solução de tripsina a 0,1 μg/ μl em solução 20 mm NH 4 HCO 3. Após 20 minutos, o excesso de solução de tripsina foi retirado e os spots recobertos com cerca de 40 μl de solução NH 4 HCO 3 a 20mM. A tripsinólise ocorreu a 37 C por 24 horas. O sobrenadante de reação contendo os peptídeos trípticos foi recuperado e transferido para um novo tubo. Para a extração dos peptídeos presentes no interior dos spots adicionou-se ao tubo cerca de 30 μl de ácido trifluoracético (TFA) 2% / ACN 50% e o sobrenadante recuperado após 30 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes contendo os peptídeos de cada spot foram combinados e secos em speed vaccum. As amostras foram mantidas a 4 C para posterior análise por espectrometria de massas. A Figura 10 ilustra as principais etapas associadas ao processo de digestão in gel. 25

46 Figura 10: Etapas do processo de digestão in gel. Bandas de interesse dos géis controle e infectados são excisadas e colocadas em solução descorante até total descoloração. Em seguida são lavadas com tampão AMBIC, 3.13 Identificação desidratadas em das speed proteínas vaccum e por novamente espectrometria hidratadas em de massas tampão AMBIC contendo tripsina. A digestão com tripsina ocorreu por 24 horas a 37 C. Posteriormente os peptídeos trípticos são recuperados e secados em speed vaccum Identificação por espectrometria de massas Os peptídeos provenientes de cada digestão in gel descrita no item 3.12, foram analisados no Setor de Espectrometria de Massas do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais ABTLuS), Campinas SP. Inicialmente, os peptídeos foram resusspensos em 12 L de ácido fórmico 0.1% e cerca de 4 L submetidos à pré-coluna nanoacqutiy Symmetry C18, 5 µm (180 µm x 20 mm, Waters) acoplada ao sistema nanoacquity UPLC (Waters) utilizando ácido fórmico a 0.1% (v/v) a um fluxo de 10 L/min. A pré-coluna foi lavada durante 5 min e, em seguida, o fluxo foi direcionado para a coluna capilar nanoacquity BEH µm C18 (75 m x 250 mm, Waters). A separação dos peptídeos nesta coluna ocorreu a partir da utilização de dois solventes, solvente A 0.1% ácido fórmico e solvente B 100% ACN/0.1% ácido fórmico. O fluxo para a coluna capilar foi de 300 nl/min, a temperatura da coluna ajustada para 60 C e o perfil do gradiente estabelecido segundo as condições: 5% solvente B por 2 min, seguido por um gradiente 26

47 linear até 35% solvente B durante 20 min. Finalmente, lavou-se a coluna utilizando 95% solvente B por 2.5 min. O sistema de nanocromatografia citado acima interfaceado com o espectrômetro Q-Tof Ultima (Micromass Waters) contendo uma fonte de nano-electrospray, constituíram o equipamento utilizado para a detecção e fragmentação dos peptídeos. Espectros MS e MS/MS foram adquiridos utilizando o modo AutoMSMS. Os parâmetros de espectrometria de massas para o modo MS incluíram: voltagem do íon spray 1500 V, gás de secagem a 6L/min, temperatura do gás de secagem 160 C, faixa de aquisição m/z No modo AutoMSMS as condições foram as seguintes: dissociação induzida por colisão com gás N 2, faixa de aquisição m/z , carga dos íons selecionados para fragmentação +2, +3 e +4 e exclusão de íons com carga +1. Dados obtidos a partir dos espectros MS/MS foram submetidos à busca de identidade utilizando uma cópia local do programa Mascot (Matrix Science Ltd., version 2.1). Os bancos de dados utilizados foram o NCBInr ( sequencias; resíduos) e o NCBI_Mus musculus ( sequencias). As buscas levaram em consideração os seguintes critérios: enzima Tripsina; modificação fixa carbamidometilação (C); modificação variável oxidação (M); tolerância para íon precursor - 10 ppm; tolerância para íons provenientes de fragmentação Da. Considerou-se uma taxa de falsos positivos (FDR) de 2% e os peptídeos que apresentaram expect value 0.05 foram considerados identificações significativas. Figura

48 Figura 11: Delineamento experimental ilustrando a identificação dos peptídeos obtidos por digestão in gel. Após a obtenção dos peptídeos por digestão in gel, estes foram ressuspendidos em ácido fórmico 0.1% e posteriormente separados por nano- UPLC, interfaceado ao espectrômetro de massas Q-Tof Ultima (Micromass). Os dados de MS/MS foram submetidos à busca de identidade nos bancos NCBInr e Mus Musculus. 28

49 4-Resultados

50 Número de ovos por lâmina 4 Resultados 4.1 Exame parasitológico de fezes - acompanhamento da ovoposição nos animais infectados O gráfico representado na Figura 12 mostra o número médio de ovos de S. mansoni presentes no sedimento de fezes após 35º, 40º, 45º e 50º dias de infecção. Os resultados dos exames demonstraram que entre o 35º e 40º dia após a infecção o número de ovos presentes nas fezes é significativamente menor em comparação com a ovoposição observada no período entre o 45º e o 50º dia. Este resultado, embora não exatamente quantitativo, serviu para a definição de dois grupos experimentais distintos para a posterior análise de biomarcadores teciduais associados com a infecção. A partir do 45º dia o número médio de ovos depositados nos tecidos aumenta consideravelmente caracterizando a fase crônica da doença no modelo murino ** 20 * dias 40 dias 45 dias 50 dias Figura 12: Gráfico demonstrando a evolução da ovoposição nos animais infectados entre o 35º e o 50º dia de infecção. Para as análises estatísticas utilizou-se o número médio de ovos presentes em 300 mg de fezes de 5 animais. As triplicatas das lâminas foram analisadas no software Prism versão 5.0 utilizando Student s t-test pareado. 30

51 4.2 Avaliação de esplenomegalia e hepatomegalia nos animais dos grupos I e II A Figura 13 demonstra as alterações indicativas de hepatoesplenomegalia nos animais infectados em comparação com os animais controles para os dois grupos avaliados. No gráfico (A) podemos observar um significativo aumento do baço nos animais com 5 semanas de infecção, período no qual o peso do órgão aumenta 100% em relação ao baço de animais controles. No gráfico (B) observa-se um aumento discreto do fígado para estes animais. Para os animais com 7 semanas de infecção foram observados aumentos significativos de baço e fígado, gráficos (C) e (D). Nestes animais observou-se aumento de até quatro vezes para o baço e de até duas vezes para o fígado em relação ao peso dos órgãos nos animais controles. Neste período a hepatoesplenomegalia característica da esquistossomose está bem definida o que contribuiu para a definição de fase crônica da doença nos animais infectados. As análises estatísticas foram realizadas utilizando Student s t-test não pareado, através do software Prism versão 5.0. *** * *** *** Figura 13: Relação peso do órgão e peso corporal dos grupos I e II. (A) % Baço/Corpo grupo I (B) % Fígado/Corpo grupo I (C) % Baço/Corpo grupo II (D) % Fígado/Corpo grupo II. As análises estatísticas foram realizadas através do software Prism versão 5.0, utilizando-se Student s t-test não pareado. * p 0.05 *** p

52 4.3 Análises hematológicas e dosagens bioquímicas Amostras de sangue, dos animais do grupo I e do grupo II, foram coletadas através de punção cardíaca e avaliadas quanto às alterações do número de células sanguíneas, através de contagem global e diferencial de leucócitos. Os dados representados na Figura 14 mostram que não houve alterações significativas na contagem global de leucócitos dos animais com 5 semanas de infecção, no entanto, a avaliação da leucometria diferencial deste grupo demonstrou eosinofilia nos animais infectados, Figura 14E. No grupo de animais com 7 semanas de infecção, não foram observadas diferenças estatísticas nas análises de leucócitos globais, porém a contagem diferencial revelou uma diminuição significativa de eosinófilos, caracterizando eosinopenia associada à infecção crônica, Figura 15E. 32

53 * Figura 14: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo I com 5 semanas de infecção. (A) Leucócitos globais (B) % de Monócitos (C) % de Linfócitos (D) % de Segmentados (E) % de Eosinófilos. As análises estatísticas foram realizadas através do software Prism versão 5.0, utilizando-se Student s t-test não pareado. * p

54 * Figura 15: Análise global e diferencial de leucócitos do grupo II com 7 semanas de infecção. (A) Leucócitos globais (B) % de Monócitos (C) % de Linfócitos (D) % de Segmentados (E) % de Eosinófilos. As análises estatísticas foram realizadas através do software Prism versão 5.0, utilizandose Student s t-test não pareado. * p

55 As amostras de sangue recolhidas dos animais dos grupos I e II, também foram utilizadas para avaliação de marcadores clássicos de dano tecidual, especificamente dosagem de atividade de ALT e AST e concentração de albumina sérica. Na Tabela 4 podemos observar as alterações das enzimas transaminases e alterações no nível de albumina sérica ao longo da infecção. Os resultados das avaliações bioquímicas demonstraram diminuição nos níveis das enzimas transaminases ALT e AST, entre os animais infectados e controles do grupo I e do grupo II. A razão ALT/AST teve um aumento em torno de 50% comparando os animais infectados dos dois grupos. A princípio esta razão poderia indicar aumento dos níveis de ALT a partir da 5 semana de infecção, demonstrando a severidade do dano hepático. No entanto, os valores absolutos de atividade enzimática demonstraram que os níveis de ALT permaneceram sem grandes alterações enquanto os níveis de AST diminuíram o que contribuiu para o aumento da razão ALT/AST. Por outro lado, os níveis séricos de albumina diminuíram em relação ao controle nos animais com 5 semanas de infecção e, significativamente, nos animais com 7 semanas de infecção, demonstrando o comprometimento da função hepática associado à fase crônica da esquistossomose. Tabela 4: Tabela de dosagens bioquímicas Grupo I a (5 semanas de infecção) Grupo II b (7 semanas de infecção) Controle Infectado Controle Infectado ALT (U/L) 392,9 203,5 202,5±72,0 150,1±2,4 AST (U/L) 757,9 653,1 511,2±139,6 260,7±17,4 ALT/AST 0,52 0,31 0,40 0,58 ALB (g/dl) 3,76 3,56 3,86±0,11 2,93±0,11 ** a - Para os animais do grupo I, os dados mostrados correspondem a dosagens de apenas um pool proveniente de 3 animais. b - para o grupo II foram feitas analises estatísticas utilizando triplicatas de pools provenientes de 3 animais, Student s t-test. ** p

56 4.4 Análises histológicas de fígado e baço As secções de fígado e baço provenientes dos animais dos grupos I e II foram mantidas em formol, posteriormente incluídas em parafina e processadas para histologia conforme descrito no item 3.8. A tríade portal (ramo da veia porta; ramo da artéria hepática e ducto biliar) e a veia centro-lobular, de animais controles dos grupos I e II, estão mostradas nas Figuras 16A/16B, respectivamente. Observou-se aspecto histológico hepático normal nestes animais. As Figuras 16C/16D demonstraram respectivamente, inflamação moderada perivascular presente nos animais infectados do grupo I e acentuado processo inflamatório perivascular nos animais infectados do grupo II. A seção demonstrada na Figura 16E ilustra a presença de vermes pareados em corte transversal nos animais com 5 semanas de infecção. Observa-se nítido aumento de diâmetro no ramo da veia porta nestes animais e inflamação moderada perivascular. A Figura 16F indica a presença de ovos imaturos no parênquima hepático dos animais com 5 semanas de infecção, no entanto, observa-se discreta inflamação granulomatosa ao redor dos ovos. Por outro lado, após 7 semanas de infecção os ovos presentes no parênquima hepático, aparentam desenvolvimento completo, e estão circundados por intensa inflamação granulomatosa, Figura 16G. Utilizando-se do método de coloração Tricômico de Masson foi possível visualizar deposição de colágeno associada ao processo de fibrose instalado para a resolução dos granulomas, Figura 16H. Avaliações quantitativas do número de células inflamatórias da região perivascular dos animais infectados mostraram que entre 5 e 7 semanas de infecção houve um aumento de 100% no número de células inflamatórias, Figura

57 Figura 16: Fotomicrografias de fígado de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção. (A) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo I, evidenciando os componentes da tríade portal (asterisco) e veia centro-lobular (seta); (B) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo II, evidenciando os componentes da tríade portal (asterisco) e veia centro-lobular (setas); (C) camundongos infectados do grupo I necropsiados após 5 semanas de infecção, apresentando discreto infiltrado inflamatório perivascular (asterisco); (D) camundongos infectados do grupo II necropsiados após 7 semanas de infecção, evidenciando acentuado infiltrado inflamatório perivascular (asterisco); (E) presença de helmintos na veia da tríade portal (seta); (F) ovos no parênquima hepático de um animal infectado do grupo I, necropsiados após 5 semanas de infecção (cabeça da seta); (G) ovos isolados por inflamação granulomatosa, presente em um animal infectado do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção (seta); (H) presença de granulomas fibrosados no parênquima hepático de um animal infectado do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção (cabeça de seta). Coloração por Hematoxilina-Eosina (A-G); Coloração Tricrômico de Masson (H). Barra=100µm. 37

58 *** Figura 17: Gráfico comparativo do número de células inflamatórias na região perivascular do fígado entre os animais infectados do grupo I e grupo II. O aspecto histológico normal do baço de animais controles dos grupos I e II está demonstrado, respectivamente nas Figuras 18A/18C. Observa-se a polpa branca organizada em folículos nodulares não estimulados e a distribuição celular da polpa vermelha apresenta aspecto histológico normal. Nos animais do grupo I, com 5 semanas de infecção, os nódulos foliculares apresentaram-se hipertróficos, com aparecimento de centros germinativos constituídos de macrófagos e linfócitos, Figura 18B. Os animais do grupo II, com 7 semanas de infecção, apresentaram hiperplasia de polpa branca e aumento acentuado de linfócitos e de células fagocitárias na região de polpa vermelha, Figura 18D. A medida da área nodular do baço, revelou aumento de 100% nos animais com 5 semanas de infecção, Figura 19. Para os animais com 7 semanas de infecção, não foi obtida a área nodular, devido à intensa hiperplasia do órgão, a qual dificultou a delimitação exata do nódulo. 38

59 Figura 18: Fotomicrografias de baço de camundongos infectados com Schistosoma mansoni e necropsiados com 5 e 7 semanas após a infecção. (A) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo I, evidenciando a organização nodular da polpa branca (circulado), distribuída entre as células da polpa vermelha (asterisco); (B) hipertrofia nodular com hiperplasia das células da polpa branca restrita à região folicular em camundongos infectados do grupo I, necropsiados após 5 semanas de infecção. (C) aspecto histológico normal de camundongos controles do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção, evidenciando a organização nodular da polpa branca (circulado) distribuída entre as células da polpa vermelha (asterisco); (D) hiperplasia das células da polpa branca extrapolando a região nodular, com perda de arquitetura esplênica, em camundongos do grupo II, necropsiados após 7 semanas de infecção. (A-D) Hematoxilina-Eosina. Barra=100µm * Controle Infectado Figura 19: Gráfico comparando a área nodular no baço entre os animais controles e infectados do grupo I. 39