ANÁLISES DE MATERIAIS BIOLÓGICOS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA AGRÍCOLA ANÁLISES DE MATERIAIS BIOLÓGICOS PROF. DR. KIL JIN PARK DRA. GRAZIELLA COLATO ANTONIO 2 semestre/2006

2 1. INTRODUÇÃO Uma das principais funções dos alimentos é fornecer energia ao organismo. Os alimentos são compostos complexos constituídos de carboidratos, proteínas, gorduras, vitaminas e sais minerais que pela digestão são divididos para serem aproveitados pelo organismo. Para se conhecer a composição química de um alimento são realizadas determinações analíticas. Essas determinações atuam em vários segmentos dentro de uma indústria, desde a caracterização da matéria-prima que irá compor um novo produto, até seu controle de qualidade e estocagem. A análise de alimentos também é utilizada para análise de alimentos processados quando deseja-se verificar a eficiência do processo ou até mesmo a comparação de processamento, como por exemplo, diferentes tipos de secagem. Através das análises químicas pode-se verificar o que ocorreu com os constituintes dos alimentos processados, isto é, se ocorreram perdas de vitaminas e/ou minerais, desnaturação das proteínas, gelatinização de amido, etc. Além de serem utilizadas para a caracterização de alimentos in natura, principalmente, alimentos novos e ainda desconhecidos como as frutas ou vegetais exóticos típicos de regiões menos exploradas. No processamento de alimentos é importante conhecer a sua composição e avaliar se as condições a matéria-prima estará sendo submetida irá produzir efeitos indesejáveis ou mesmo desejáveis ao produto final. Para a realização dessas determinações diversos métodos podem ser empregados. Esses métodos foram desenvolvidos, testados e catalogados. Alguns centros de pesquisas brasileiros desenvolveram métodos analíticos para determinar essas composições, como o Instituto Adolfo Lutz, Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Centro de Estudos de Amidos e Raízes Tropicais (CERATI), entre outros. A Association of Official Analytical Chemists (AOAC) é uma associação de cientistas e organizações dos setores público e privado, que promove a validação de métodos e medidas de qualidade nas ciências analíticas. Essa associação, a muitos anos, vem publicando coletâneas de métodos de análise e procedimentos obtidos por estudos sistemáticos inter-laboratoriais de vários países. São métodos oficiais válidos em todo o mundo e muito utilizados. Os métodos estão catalogados em dois volumes, onde são descritos, para cada tipo de produto (frutas, cereais, carnes, pós, etc.), os procedimentos recomendados para o preparo e as determinações analíticas subseqüentes. A escolha do método de análise deve ser bem avaliada para que a exatidão seja a maior possível. Em função do alto custo muitas vezes não é possível utilizar o melhor método de análise, portanto, o tipo de análise é limitado em relação ao tipo de equipamento ou até mesmo ao tipo de reagente ou pessoal especializado. 2. TIPOS DE ANÁLISES Caracterizar um alimento envolve analisar a sua constituição química, características físicas e sensoriais. A determinação da composição centesimal dos alimentos visa determinar principalmente os teores de: umidade, cinzas, proteínas, carboidratos, fibras, lipídios, vitaminas 2

3 e minerais. Outros parâmetros como a atividade de água, cor e textura, também possuem grande importância na indústria de alimentos. Novas ferramentas de análise têm sido muito empregadas na caracterização, controle de processo e controle de qualidade de produtos alimentícios, como a análise da microestrutura (microscopia ótica, eletrônica de varredura e de transmissão, confocal, etc.) Análises Químicas e Físico-químicas A análise de alimentos é aplicada para determinação de um ou vários componentes ou elementos químicos que o constituem. Com a evolução e o surgimento de novos instrumentos de medida, tem havido uma redução considerável no número de análises necessárias para se obter resultados, conclusivamente, além de se observar uma grande melhoria na precisão dessas análises Determinação de Umidade Definição A determinação de umidade é uma das medidas mais importantes e utilizadas na análise de alimentos. No processo de secagem essa determinação é fundamental. A umidade de um alimento está relacionada com sua estabilidade, qualidade e composição, e pode afetar as seguintes características do produto: Estocagem: alimentos estocados com alta umidade irão deteriorar mais rapidamente que os possuem baixa umidade. Por exemplo, grãos com umidade excessiva estão sujeitos a rápida deterioração devido ao crescimento de fungos que desenvolvem toxinas como aflatoxina. Embalagem: alguns tipos de deterioração podem ocorrer em determinadas embalagens se o alimento apresentar uma umidade excessiva. Por exemplo, a velocidade do escurecimento em vegetais e frutas desidratadas ou a absorção de oxigênio (oxidação) em ovo em pó podem aumentar com o aumento da umidade, em embalagens permeáveis à luz e ao oxigênio. Processamento: a quantidade de água é importante no processamento de vários produtos, como, por exemplo, a umidade do trigo na fabricação do pão e produtos de padaria. A umidade é o principal fator para os processos microbiológicos, como o desenvolvimento de fungos, leveduras e bactérias, e também para o desenvolvimento de insetos. No caso dos produtos perecíveis o frio é normalmente utilizado como inibidor do processo microbiológico, enquanto que para os produtos deterioráveis a secagem, para níveis de umidade até 12-13%, é o processo mais simples e eficaz. O conhecimento do teor de umidade das matérias primas é de fundamental importância na conservação e armazenamento, na manutenção da sua qualidade e no processo de comercialização. 3

4 Métodos para a determinação de umidade Existem muitos métodos para determinar a umidade em alimentos e a escolha do método vai depender: da forma a qual a água está presente na amostra, da natureza da amostra, da quantidade relativa de água, da rapidez desejada na determinação e do equipamento disponível. A água pode estar presente na amostra sob duas formas: Água livre: é a água que está simplesmente adsorvida no material, é a mais abundante. É perdida facilmente às temperaturas em torno da ebulição. Água ligada: é a água da constituição, que faz parte da estrutura do material, ligada a proteínas, açúcares e adsorvida na superfície de partículas coloidais, e necessita de níveis elevados de temperatura para sua remoção. Dependendo da natureza da amostra, requer temperaturas diferentes para a sua remoção, que frequentemente não é total e em alguns casos não é eliminada nem a temperaturas que carbonizem parcialmente a amostra. O aquecimento da amostra pode causar a caramelização ou decomposição dos açúcares, perda de voláteis ou ainda a oxidação dos lipídeos. Portanto, é importante uma avaliação criteriosa e cuidadosa para a escolha do método mais adequado e conveniente à amostra e disponibilidade do laboratório. Por isso, o resultado da medida da umidade deve vir sempre acompanhado do método utilizado e das condições empregadas, como tempo e temperatura. A conservação da matéria prima, do ponto de vista qualitativo e/ou quantitativo, vai depender do tipo de produto com que se está trabalhando e para a determinação da umidade o tipo de produto deve ser observado. Os produtos podem ser divididos em: perecível, com alto teor de água (como frutas, legumes e vegetais) e deteriorável, com teor de água de 15 a 30% na época de colheita (como os grãos). Em geral, a determinação de umidade, que parece um método simples, torna-se complicado em função da exatidão e precisão dos resultados. As dificuldades encontradas, geralmente, são: a separação incompleta da água do produto; a decomposição do produto com formação de água além do original e a perda de substâncias voláteis do alimento que serão computadas como peso em água. As determinações de umidade são classificadas em métodos diretos e indiretos. Métodos Diretos Nos métodos diretos a água é retirada do produto, geralmente por processo de aquecimento, e o teor de umidade é calculado pela diferença de peso das amostras no início e no final do processo. Devido a sua maior confiabilidade, os métodos diretos são empregados como padrão para a aferição de outros procedimentos. Por exigir um tempo relativamente longo para sua execução, às vezes representa uma desvantagem do método, por exemplo, quando se necessita de resposta imediata no controle de uma determinada operação. Como métodos diretos têm-se: estufa, infravermelho e destilação. 4

5 a) Método de Estufa O método de estufa é o método mais utilizado em alimentos e está baseado na remoção da água por aquecimento, onde o ar quente é absorvido por uma camada muito fina do alimento e é então conduzido para o interior por condução. Como a condutividade térmica dos alimentos é geralmente baixa, costuma levar muito tempo (6 18 horas a C, ou até peso constante) para o calor atingir as porções mais internas do alimento. A evaporação por um tempo determinado pode resultar numa remoção incompleta da água, se ela estiver fortemente presa por forças de hidratação, ou se o seu movimento for impedido por baixa difusividade ou formação de crosta na superfície. Por outro lado, na evaporação até peso constante, pode ocorrer uma superestimação da umidade por perda de substâncias voláteis ou por reações de decomposição. O aquecimento direto da amostra a 105ºC é o processo mais usual, entretanto, no caso de amostras de alimento, que se decompõem ou sofrem transformações a esta temperatura, deve-se utilizar estufa à vácuo para seu aquecimento, onde se reduz a pressão atmosférica e se mantém a temperatura de 70ºC. A pesagem da amostra deve ser feita somente após resfriá-la completamente no dessecador, pois a pesagem a quente levaria a um resultado falso. b) Infravermelho Neste método é utilizado um aparelho portátil que permite a obtenção de resultados rápidos de porcentagem de umidade, sendo todo o processo controlado por um gerador de funções e balança digital. A amostra é colocada em um prato de alumínio dentro de uma câmara que protege a balança do calor por meio de um colchão de ar, que garante que haja circulação de ar interna para que os vapores de água saiam da amostra sem que seja perturbada a leitura da balança. No manual do aparelho existem informações sobre as condições recomendadas de análise para cada tipo de produto (tempo, temperatura e massa inicial de produto). c) Método de Destilação c1) Tolueno Quando existem outras substâncias que poderão se volatizar com água no processo de aquecimento, a determinação da umidade deve ser feita por processo de destilação com líquidos imiscíveis. O reagente utilizado é o tolueno. A amostra é moída, pesada (5 a 20g) e colocada em um balão contendo tolueno (cerca de 75ml). Este balão é aquecido diretamente e a água da amostra vai sendo destilada para o frasco coletor. A quantidade de água contida na amostra é dada por leitura direta do volume existente no tubo coletor, onde: volume água = gramas água. Este valor é utilizado no cálculo do teor de umidade do produto. 5

6 c2) Brown Duvel É semelhante ao método de destilação que utiliza o tolueno, sendo que neste método não há necessidade de moer a amostra, e o aquecimento é produzido por um sistema termométrico que desliza automaticamente a fonte de aquecimento. É constituído por um sistema contendo uma manta aquecedora com balão acoplado a um aparelho de destilação, com receptor graduado para coleta da água condensada no processo. Para cada tipo de grão, a quantidade ou tamanho da amostra, a temperatura e o tempo, variam, devendo-se consultar o manual que acompanha o aparelho. A Tabela 1 apresenta alguns exemplos da quantidade de amostra e temperatura para cada tipo de grão. Tabela 1 Quantidade de amostra e temperatura utilizadas para diferentes grãos na determinação da umidade pelo método de Brown Duvel. Produto Amostra (g) Temperatura ( C) Milho Arroz Soja Feijão Trigo d) Método de Karl-Fisher É um processo de determinação de umidade baseado em reações que ocorrem na presença de água. O reagente Karl Fisher (RKF) é constituído por uma mistura de iodo, dióxido de enxofre e piridina em metanol, com este reagente podem ser determinadas pequenas quantidades de água. Ocorre uma reação onde o iodo é reduzido pelo dióxido de enxofre, na presença da água: I 2 + SO H 2 O 2 HI + H 2 SO 4 (reação complexa e não estequiométrica) O procedimento do método se baseia numa titulação visual ou eletrométrico. O I 2 é reduzido para o Iodo na presença de água. Quando toda água da amostra for consumida, a reação cessa. A titulação direta usualmente fornece a água total, ou seja, água livre mais a água de hidratação. O volume de RKF gasto na titulação da amostra é então utilizado nos cálculos do teor de umidade. Por ser o reagente de Karl Fischer um dessecante poderoso, a amostra e o reagente devem ser protegidos contra a umidade atmosférica em todos os procedimentos. Exemplo de aplicação: é aplicado em amostras que não dão bons resultados pelo método de secagem a vácuo. Os produtos que são analisados são geralmente produtos com baixo teor de umidade como frutas e vegetais desidratados, balas, chocolates, café torrado, óleos e gorduras. É também utilizado em produtos ricos em açúcares, como mel, e produtos ricos em ambos, açúcares redutores e proteínas, como cereais. O método pode ser aplicado 6

7 também em produtos de níveis de umidade intermediários como produtos panificados, misturas prontas para bolos ricas em gorduras e também em produtos com altos níveis de óleos voláteis. Métodos Indiretos Nestes métodos o teor de umidade é estimado em função das propriedades elétricas do produto em uma determinada condição. Os dois princípios empregados são o da resistência elétrica e o da medida da constante dielétrica (capacitância). São métodos práticos e rápidos, mas estão sujeitos a erros decorrentes da variação das propriedades físicas dos produtos, da temperatura ou da distribuição da umidade no interior do mesmo. A aferição de equipamentos para a determinação indireta da umidade é feita em relação ao método padrão de estufa, admitindo-se variação de 0,5% em relação ao método padrão para teores de umidade inferiores a 20-25%. O manual de utilização do aparelho deve sempre ser consultado, pois cada amostra exige técnica específica. Esse método é mais utilizado para o armazenamento de grãos. Cálculo do teor de umidade Existem duas maneiras de se expressar a umidade contida em um produto em base úmida ou base seca, sendo que a umidade em base úmida (U bú ) é mais utilizada em designações comerciais, armazenamento, etc. e a umidade em base seca (U bs ) é utilizada em trabalhos de pesquisa e equações de secagem. Umidade em base úmida (U bú ) (%) U bú = Pa P( t) x 100 = Pa P + P a s x 100 onde: P a = peso da água; P s = peso da matéria seca (valor constante) e P (t) = peso total. Umidade em base seca (U bs ) (%) U bs = Pa P s x 100 Mudança de base Passar de Base Úmida Base Seca % Ubú % U bs = x % U bú Passar de Base Seca Base Úmida % Ubs % U bú = x % U bs 7

8 Determinação de Lipídios Definição O termo lipídio é utilizado para gorduras e substâncias gordurosas. Os lipídios são definidos como componentes do alimento que são insolúveis em água e solúveis em solventes orgânicos, tais como éter etílico, éter de petróleo, acetona, clorofórmio, benzeno e álcoois. Estes solventes apolares extraem a fração lipídica neutra que incluem ácidos graxos livres, mono, di e triacilgliceróis, e alguns mais polares como fosfolipídios, glicolipídios e esfingolipídios. Os esteróis, as ceras, os pigmentos lipossolúveis e as vitaminas, que contribuem com energia na dieta, podem ser extraídos apenas parcialmente. Suas propriedades físicas variam muito pouco dentro de um certo limite e são consideradas constantes, são divididas em físicas (peso específico, índice de refração e ponto de fusão) e químicas (índice de iodo, índice de saponificação, resíduo insaponificável, ácidos graxos livres). Estas constantes estão relacionadas à identificação, qualidade e quantidade do óleo ou gordura analisada Métodos para a determinação de lipídeos A avaliação quantitativa do teor de lipídeos pode ser feita através da extração com solvente a frio ou a quente. Extração com solvente a frio a) Método de Bligh-Dyer Esse método utiliza a mistura de três solventes, clorofórmio-metanol-água. A amostra é misturada com o metanol e clorofórmio que estão numa proporção que formam uma só fase com a amostra. Adiciona-se mais clorofórmio e água promovendo a formação de duas fases distintas, uma de clorofórmio, contendo lipídios, e outra metanol mais água, contendo substâncias não lipídicas. A fase do clorofórmio com a gordura é isolada e, após a evaporação do clorofórmio, obtém-se a quantidade de gordura por pesagem. Extração com solvente a quente A extração com solvente a quente está baseado em três etapas: extração da gordura da amostra com solvente; eliminação do solvente por evaporação e a quantificação da gordura por pesagem. São utilizados dois tipos de equipamentos: Soxlet, que utiliza o refluxo do solvente e o processo é intermitente ou Goldfish, onde o processo de extração é contínuo e mais rápido. Geralmente o solvente utilizado é o éter de petróleo e a porcentagem de lipídeo é calculada pela equação:

9 100 x lipídeos( g) % Lipídeos = amostra( g) Extração da gordura ligada a outros compostos Em produtos como pão e leite, a gordura está ligada a proteína e carboidratos e, portanto, deve ser liberada para quantificação. Esta liberação é feita por hidrólise ácida ou alcalina. a) Hidrólise ácida a1) Processo de Gerber Utilizado somente para leite e produtos lácteos. A gordura presente no leite está em forma de emulsão de óleo e água, cercada de um filme de proteína. Este filme é rompido através do tratamento com ácido sulfúrico. Utiliza-se o álcool isoamílico para facilitar a separação da gordura e reduzir o efeito de carbonização do ácido sulfúrico sobre ela. Após a digestão, a amostra é centrifugada num tubo chamado butirômetro. Existem vários tipos de butirômetros com escalas diferentes, para medir diferentes produtos lácteos, como creme de leite e queijos, e até para alguns produtos não lácteos, como produtos processados de carne e peixe. a2) Processo de Babcock Processo semelhante ao de Gerber, diferenciando nas quantidades de leite e ácido sulfúricos adicionados, e na adição de água quente em vez álcool isoamílico. Ambos os métodos não determinam os fosfolipídios, mas não há problemas com o leite integral que tem apenas 1% de fosfolipídios na gordura total O método de Gerber é 2 a 3 vezes mais rápido que o de Babcock. b) Hidrólise alcalina b1) Método de Rose-Gottlieb e Mojonnier A amostra é tratada com hidróxido de amônia e álcool para hidrolisar a ligação proteína-gordura, e a gordura separada é então extraída com éter de petróleo e éter etílico. O álcool precipita a proteína que é dissolvida na amônia e a gordura separada pode ser extraída com éter. A extração com éter é muito eficiente em amostras com muito açúcar como, por exemplo, leite condensado. 9

10 Caracterização de Óleos e Gorduras a) Índice de iodo Método utilizado para determinar o grau de insaturação de um óleo ou gordura e para controlar alguns processamentos. Este índice é baseado no fato de que o iodo e outros halogênios se adicionam numa dupla ligação da cadeia insaturada dos ácidos graxos. b) Índice de saponificação É definido como o número de miligramas de hidróxido de potássio necessário para neutralizar os ácidos graxos resultantes da hidrolise completa de 1 g de amostra. Durante a saponificação é formado sabão Determinação de Proteína Definição Proteínas são heteropolímeros formados por unidades menores chamadas aminoácidos. Os aminoácidos (a.a.) estão ligados em seqüência formando uma cadeia polipeptídica, esta cadeia é a base da proteína e é chamada de estrutura primária. As proteínas são extremamente importantes na nutrição porque fornecem aminoácidos essenciais ao organismo. Os aminoácidos são chamados essenciais, pois o organismo não é capaz de sintelizá-los, na digestão há a quebra da cadeia de proteínas e os aminoácidos livres são absorvidos e usados na síntese de novas proteínas. São aminoácidos essenciais: valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, treonina, lisina, arginina, histidina. No processamento de alimentos as proteínas também apresentam propriedades importantes como a capacidade de gelificação (gelatina), capacidade de emulsificação (proteína da gema do ovo), capacidade de retenção de água (proteína da soja) Métodos para a determinação de proteína A determinação da proteína em uma amostra é baseada na determinação de nitrogênio. Geralmente é feita pelo processo de digestão Kjeldahl (autor do método: Johan Kjeldahl). Este método determinada o teor de nitrogênio orgânico, ou seja, o nitrogênio proveniente de outras fontes além da proteína, tais como: ácidos nucléicos, alcalóides, lipídeos e carboidratos nitrogenados. Como estes outros componentes geralmente estão presentes em quantidades menores, o método Kjeldahl é um método químico útil na determinação de proteína. 10

11 No cálculo para se obter a porcentagem de proteína na amostra é utilizado um fator empírico de correção f. Multiplica-se este fator pelo valor total de N obtido na determinação analítica. A Tabela 2 apresenta alguns exemplos de fator f. Tabela 2 Exemplos de fator f para diferentes produtos alimentícios. Tipo de amostra Fator f Geral N x 6,25 Gelatina N x 5,55 Ovos N x 6,68 Produtos lácteos N x 6,38 Soja N x 6,00 Farinha trigo N x 5,70 Arroz N x 5,95 Carnes N x 6,25 Se o resultado for expresso em % de proteína o fator usado deve ser indicado. A determinação de nitrogênio é compreendida de 3 etapas: digestão da amostra em H 2 SO 4, liberação da amônia por adição de Na0H e titulação da amônia com HCl. O procedimento experimental é lento e deve ser cuidadosamente conduzido para se evitar acidentes, ou a produção de falsos resultados Determinação de Cinzas Definição A cinza de uma amostra de alimento é o resíduo inorgânico que permanece após a queima de matéria orgânica de uma amostra. A cinza é constituida principalmente de grandes quantidades de K, Na, Ca e Mg; pequenas quantidades de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e traços de Ar, I, F e outros elementos Método para a determinação de cinzas O método de determinação de cinzas é muito simples e consiste na queima da amostra em mufla utilizando temperaturas de 550ºC a 570ºC por tempos pré-determinados. Para cada tipo de amostra existem condições recomendadas que devem ser verificadas antes de proceder a determinação. A cinza obtida não é necessariamente da mesma composição que a matéria mineral presente originalmente no alimento, pois pode haver perda por volatilização ou alguma interação entre os constituintes da amostra. Os elementos minerais se apresentam na cinza sob a forma de óxidos, sulfatos, fosfatos, silicatos e cloretos, dependendo das condições de incineração e da composição do alimento. Algumas mudanças podem ocorrer como oxalatos de 11

12 cálcio podem ser transformados em carbonatos, ou até em óxidos. A composição da cinza vai depender da natureza do alimento e do método de determinação utilizado. Amostras com alto teor de umidade devem sofrer secagem antes da incineração, e, portanto muitas vezes é vantajoso combinar a determinação direta de umidade e a determinação de cinzas. A presença de largas quantidades de cinzas em produtos como açúcar, amido, gelatina, frutas ácidas ou pectina é indesejável e, portanto cuidados especiais devem ser tomados durante seus processos produtivos Determinação de Açúcares Definição Os carboidratos são os componentes mais abundantes e amplamente distribuídos entre os alimentos. Apresentando varias funções como: nutricional (geram energia), adoçante natural (glicose, frutose, sacarose, etc.), matéria-prima para produtos fermentados, principal ingrediente dos cereais, responsável por propriedades reológicas da maioria dos alimentos de origem vegetal (polissacarídeo) e pela reação de escurecimento em muitos alimentos. Os açúcares são os carboidratos existentes nos alimentos e são divididos em: monossacarídeos (glicose, frutose), dissacarídeos (sacarose, lactose, galactose, maltose), polissacarídeos (maltodextrinas, amidos, gomas, pectinas e celuloses). Os carboidratos têm pelo menos duas funções orgânicas (C = 0 e C 0H) que dá a estes compostos várias opções de transformação, como: Reação de Maillard: açúcares redutores + aminoácidos - Reações de escurecimento e formação de voláteis, ex: pão, carne, bolo, etc. Degradação de Strecker: - Caramelização degradação de açúcares. O caramelo é um corante largamente empregado na indústria de alimentos Métodos para a determinação de açúcares Exigências na preparação de amostras: as amostras sólidas devem ser moídas em condições que causem a mínima mudança no conteúdo de umidade e que não afetem as propriedades e composição do alimento. Os lipídios e clorofila são geralmente removidos por extração com éter de petróleo, pois neste solvente os carboidratos são insolúveis. Na determinação do conteúdo de carboidratos em alimentos, deve-se obter solução aquosa dos açúcares, livres de substâncias interferentes, para posterior identificação e quantificação. Estas substâncias interferentes podem ser pigmentos solúveis, substâncias opticamente ativas (aminoácidos etc.), constituintes fenólicos, lipídios e proteínas. As substâncias interferentes 12

13 podem ser separadas por descoloração, tratamento com resina trocadora de íons, ou clarificação com vários agentes clarificantes. A função destes clarificantes é de precipitar as substâncias que irão interferir na medida física ou química do açúcar. Os métodos quantitativos utilizados para determinação de açúcares totais e açúcares redutores utilizados em alimentos são: a) Munson-Walker: método gravimétrico baseado na redução de cobre pelos grupos redutores dos açúcares. b) Lane-Eynon: método que utiliza a titulação e também está baseado na redução de cobre pelos grupos redutores dos açúcares. c) Somogyi-Nelson: método que utiliza a titulação e também está baseado na redução do cobre. Os métodos de redução são empíricos e as condições estabelecidas para cada um deles devem ser rigorosamente seguidas. Como reagente utiliza-se: Reagente de Fehling, que é composto por uma Solução A (sulfato de cobre cristalino em água) e uma Solução B (tartarato de sódio e potássio e hidróxido de sódio) em água. Os resultados são expressos em: açúcares redutores, em glicose (%, p/p), açúcares nãoredutores, em sacarose (%, p/p) Determinação de Fibra Bruta Definição As fibras alimentares não fornecem nutrientes para o organismo, entretanto são elementos essenciais na dieta. As fibras, que formam o esqueleto dos vegetais, consistem de celulose de vegetais e outros elementos na alimentação que não conseguimos digerir. As fibras são um paradoxo porque não alimentam, mas são essenciais à saúde. A fibra bruta é o resíduo orgânico obtido após sucessivas extrações e lavagens com éter, ácido sulfúrico diluído, hidróxido de sódio diluído e álcool Importância: Medir o valor nutricional de alimentação de animais: digestibilidade da fibra bruta é baixa e alimentos com alto teor de fibras brutas, têm baixo valor nutritivo; Análise de Alimentos: detectar adulterações (limites estabelecidos); Qualidade de vegetais: conteúdo de fibra bruta varia com a maturidade. 13

14 Métodos para a determinação de fibras Os métodos para a determinação das fibras variam muito de acordo com as condições de tratamento empregadas à amostra. Os métodos de análise recuperam de 60 a 80% de celulose e de 4 a 67% de lignina, em relação ao valor real existente na amostra, portanto não é uma medida segura ou específica dos grupos de substâncias existentes na amostra. Os equipamentos utilizados para a análise são: centrífuga de tubos, estufa (130ºC), dessecador, erlenmeyr, provetas, béquer, funil de Büchner, filtro de linho/algodão, cadinho e mufla. A porcentagem de fibras é calculada pela equação: 100 x n gramas de fibra % Fibra ( p / p) = n gramas de amostra Determinação de Sólidos Solúveis Definição A determinação de sólidos solúveis em materiais biológicos é uma medida muito utilizada no processamento e conservação de alimentos para avaliação de: Maturação de frutas (qualidade e estabelecimento de preços, ex.: uva, laranja). Elaboração de caldas (xaropes) para frutas em conserva. Ponto final de processos de concentração (polpas concentradas, doces em massa, geléias). Qualidade de sucos processados Método para a determinação de sólidos solúveis A medida da concentração de sólidos solúveis de uma amostra é feita através do método refratométrico, simples e rápido, com bom grau de precisão. Utiliza como princípio o índice de refração de uma substância pura, que sendo constante, para determinada condição de temperatura e pressão, pode ser utilizado para a sua identificação. Desta forma, foi estabelecido o método para a determinação da concentração de sólidos solúveis em uma amosta, onde sabe-se que o índice de refração da água a 20ºC é 1,3330. A presença de sólidos solúveis na água resulta numa alteração destes índices. Conhecendo-se o índice de refração da solução aquosa, é possível determinar a quantidade de soluto presente na mesma. Esta propriedade é utilizada para determinar então a concentração de sólidos solúveis de soluções de açúcar. Em sucos de frutas, produtos de tomate, mel e xaropes, como o açúcar é o principal componente, a porcentagem sólidos solúveis pode ser considerado uma boa aproximação da 14

15 porcentaagem de sólidos totais, sendo amplamente utilizada nos cálculos onde este valor é aplicado. O equipamento mais utilizado é denominado: de Refratômetro de Abbé. Sua utilização é simples, devendo apenas ser calibrado com água destilada antes das determinações. Existem tabelas que permitem efetuar a correção devido a influência da temperatura: A leitura é realizada da seguinte forma: a amostra líquida, sem a presença de interferentes (como sólidos de cascas, etc.) é colocada sobre o prisma do aparelho, por onde passará um feixe de luz. Oresultado é lido imediatamente por uma escala existente no aparelho. O valor obtido da leitura é expresso em % sólidos solúveis ou ºBrix Determinação de ph Definição A determinação do ph é uma determinação eletrométrica que avalia a concentração de íons hidrogênio em uma amostra Importância: Estado de conservação do produto: decomposição (hidrólise, oxidação, fermentação) altera a concentração de íons H+; Preservação e armazenamento do alimento: ácido inibe o crescimento de microorganismos e ação de enzimas. Os limites de crescimento de m.o. são estabelecidos pelos valores de ph; Determina o tratamento térmico o qual o alimento deverá ser submetido: ph=4,5 limite estabelecido para definição de tipo de tratamento térmico; ph<4,5 alimentos ácidos tratamento térmico mais brando (pasteurização); ph>4,5 alimentos de baixa acidez tratamento térmico mais drástico (esterilização). Afeta as propriedades físicas de alguns alimentos, por exemplo: textura e ponto de gelificação de geléias de frutas Método para a determinação do ph A determinação do ph é realizado em um equipamento denominado phmetro ou potenciômetro (eletrodos). É uma determinação muito simples e amplamente utilizada nas indústrias de processamento de alimentos. Uma solução tampão é utilizada para calibrar o aparelho antes das medições. Normalmente são utilizadas soluções de ph 4 e ph 9. Escala: ph água pura, 22ºC = 7 (neutro), ph HCl = 0 (ácido), ph NaOH = 14 (básico). 15

16 Tipos de amostra: Amostras líquidas - a determinação de ph é feita diretamente na amostra simplesmente pela imersão dos eletrodos na mesma. Amostras sólidas - diluir uniformemente 10g de amostra em 100ml de água a 25ºC, imergir os eletrodos na mesma e efetuar a leitura do ph Atividade de água Definição A quantidade de água presente em um alimento pode se encontrar na forma de água ligada e não-ligada. A relação entre o teor de água não-ligada ou disponível é denominada de atividade de água. Esse teor é designado como a a ou a w e é definido em termos de equilíbrio termodinâmico. É um número adimensional, resultado da pressão de vapor de água do produto pela pressão de vapor da água pura, à mesma temperatura. Varia numericamente de 0 a 1 e é proporcional à umidade relativa de equilíbrio. A quantificação do teor de água em produtos alimentícios é extremamente importante na sua preservação. A água numa matriz alimentícia pode exercer diversas funções, dependendo de sua disponibilidade e de outros componentes do alimento Transformações nos alimentos A a w tem muita influência nas reações de transformações de alimentos, que podem ser microbiológicas, físicas e químicas. Reações químicas: a a w afeta de maneira bem definida as velocidades das principais reações químicas de transformação dos alimentos; Reações físicas: uma série de transformações física ocorre nos alimentos em função da a w, como a cristalização em geléias e doces de frutas; a recristalização de açúcares em balas vítreas e lactose em leite em pó; a redução do escoamento livre de pós secos; a perda de crocância em cereais desidratados; a aglomeração e empedramento de açúcar e pós secos; a adesão à embalagem de balas, caramelos e chicletes; etc; Reações microbiológicas: o comportamento de microorganismos frente à a w é variável, dependendo da espécie, cepa microbiana, substrato, entre outros. No entanto, pode-se afirmar que as bactérias são usualmente mais exigentes quanto à disponibilidade de água livre, seguida dos bolores e leveduras. Os alimentos de baixa a w (< 0,60) são microbiologicamente estáveis. 16

17 Métodos para a determinação da atividade de água Há uma grande diversidade de métodos para se medir a a w, que vai desde procedimentos simples (laboratoriais) no qual o produto alcança o equilíbrio em uma atmosfera de umidade relativa conhecida, até o uso de higrômetros de respostas rápidas (Decagon). A Tabela 3 apresenta alguns alimentos e tipos de microorganismos capazes de se desenvolver em determinada faixas de atividade de água. Tabela 3: Atividade de água de alguns alimentos e suscetibilidade à deterioração. Faixa de a w Microorganismos capazes de se desenvolver Alimentos com a w na faixa indicada 1,00 0,95 Pseudomonas, Escherichia, Proteus, Shigella, Klebsiella Bacillus, Clostridium perfringers, Algumas leveduras Lingüiças, Salsichas, Pães cozidos, Alimentos contendo até 40% de sacarose e 7% de sal, Alimentos muito perecíveis: 0,95 0,91 Salmonella, V. parahaemolyticus C. Botulinum, Serratia, Lactobacillus, Pediococcus, Alguns fungos,rhodotorula, Pichia 0,91 0,87 Micrococus, Muitas leveduras: Cândida, Torulopsis, Hansenula Frutas frescas, vegetais, carnes e peixe. Carnes curadas (presunto), Concentrado de frutas, Alimentos contendo até 55% de sacarose ou 12% de sal, Alguns queijos: Cheddar, suíço, provolone. Embutidos fermentados (salames), Bolos confeitados, Queijos desidratados, Margarina, Alimentos contendo até 65% de sacarose ou 15% de sal. 0,87 0,80 Staphylococcus aureus, Saccharomyces spp., Debaryomyces, A maioria dos fungos Concentrados de frutas, Leite condensado, Farinha, Arroz, Granulados (contendo 15 a 17% de umidade), Bolos de frutas, Confeitos açucarados. 0,80 0,75 A maioria das bactérias halófilas Geléias, Marmeladas, Marzipã, Glacê de frutas, 0,75 0,65 Saccharomyces bisporus, Fungos xerofílicos: Aspergillus chevalieri, A. candidus, Wallemia sebi 0,65 0,60 Leveduras osmofílicas: Saccharomyces rouxii Poucos fungos: Aspergillus echinulatus, Marshmallow. Flocos de aveia (contendo 10% de umidade) Cremes para recheio, Geléias, Melaço, Caldo de cana de açúcar, Algumas frutas secas e castanhas. Frutas secas (contendo de 15 a 20% de umidade) Balas, Caramelos, Mel. Monascus, Monascus bisporus 0,50 Sem proliferação microbiana Macarrão e massa similares (contendo 12% de umidade), Temperos (com 10% de umidade). 0,40 Sem proliferação microbiana Ovo em pó (com 5% de umidade). 0,30 Sem proliferação microbiana Biscoitos e torradas (com 3-5% de umidade). 0,20 Sem proliferação microbiana Leite em pó (2 3% umidade), Vegetais desidratados (5% umidade), Flocos de milho (5% umidade), Sopas desidratadas. 17

18 2.2. Análise microscópica Definição De acordo com AGUILERA e STANLEY (1990), define-se como microestrutura de alimentos a organização dos componentes de um alimento e suas interações. Ao sofrer processamento, a microestrutura do alimento é destruída e reconstituída, o que poderia ser entendido como uma série de operações e reestruturação e reorganização Importância A estrutura do alimento é de grande importância em todos os aspectos de funcionalidade. Realmente, a organização microscópica de água e outros componentes do alimento governam as informações macroscópicas que estão sendo observadas através de instrumentação, isto é, podem ser criadas áreas muito heterogêneas no interior do alimento fazendo com que ocorram grandes modificações na estrutura e textura do produto final. Os parâmetros principais que influenciam grandemente tais propriedades são a atividade de água e a distribuição da mesma. Aumentando o conteúdo de água pode-se criar mudanças drásticas no estado físico dos alimentos. A migração de água é governada pelas diferenças de potenciais químicos de água entre duas zonas diferentes do produto. Esta migração pode ser limitada pela porosidade do material, a viscosidade da matriz sólida, e também as interações múltiplas nas quais a água é envolvida, depende também do coeficiente de difusão, temperatura, pressão, composição, fatores geométricos, etc. O reconhecimento da microestrutura de alimentos está agora sendo reconhecido como um pré-requisito necessário para entender suas propriedades. Todos aqueles que têm interesse de descrever, prever e controlar o comportamento de materiais alimentícios reconhecem a importância do verdadeiro reconhecimento da maneira como os componentes estão organizados, já que existe uma conexão causal entre estrutura e funcionalidade. Os métodos para o processamento de alimentos podem ser baseados no conceito de que mudanças na microestrutura afetam as propriedades do produto. Desse modo, técnicas de análise de microestrutura são necessárias para entender as relações estrutura-propriedades Métodos utilizados na análise estrutural A microscopia (óptica, eletrônica ou atômica, confocal, de polarização) e outras técnicas de imagens (como ressonância magnética) são técnicas apropriadas para análise de estrutura de alimentos por ser somente um método analítico que fornece resultados em forma de imagens. Estas técnicas são utilizadas para examinar alimentos que sofrem processos semelhantes, podendo ser visualizado o comportamento do alimento em termos de morfologia e composição. 18

19 Microscopia ótica Embora o advento das lentes eletrônicas tenha feito com que a microscopia óptica (MO) fosse deixada de lado em estudos estruturais, a descoberta da versatilidade desse instrumento, combinada com a facilidade de uso e preparo da amostra, fazendo dele uma ferramenta indispensável para a análise estrutural. A aplicação mais comum da microscopia ótica é a iluminação de campo brilhante em que a luz é transmitida de baixo através de um pequeno pedaço ou secção de material. A imagem é formada acima da amostra num tubo e visto por uma ocular com o tamanho ampliado e aproximadamente 10 a 100 vezes. Os espécimes são examinados a pressão atmosférica normal e não precisam ser desidratadas. Além disso, a preparação de amostras é relativamente fácil. Um dos recursos mais comuns da microscopia ótica de campo iluminado é aplicar tintura ou corante para aumentar o contraste ou diferenciar tecidos. Na microscopia ótica, a coloração é um processo útil porque tecidos biológicos são comumente incolores e não oferecem contraste Microscopia eletrônica de transmissão Simples equipamentos de microscopia eletrônica de transmissão (MET) se tornaram disponíveis no final dos anos 30, e logo ficou evidente que produziam resolução melhor que da microscopia óptica. Em sua forma mais simples, a MET parece-se com uma MO invertida. Um revólver eletrônico (filamento de tungstênio) é aquecido e emite estreitos raios de elétrons que viajam em alta velocidade. A voltagem aplicada para se obter essa aceleração é a ordem de 4 a 100kV. O raio de elétrons substitui a lâmpada da MO e age como uma fonte de iluminação. Como o olho humano não sensível a elétrons, a imagem fina, formada por elétrons que passaram pela amostra é focada numa tela fluorescente ou numa chapa fotográfica. Entretanto, a grande diferença entre microscópios ópticos e eletrônicos é que os elétrons precisam de um grande vácuo para viajar a distância usada na microscopia eletrônica. Essa necessidade de um meio sob alto vácuo combinada com a necessidade de um potente feixe de elétrons para passar através do material analisado limita severamente os tipos de amostras que podem ser examinadas, elas devem ser totalmente secas, extremamente firmes e fortes o suficiente para resistir aos danos causados pelo feixe de elétrons. Alimentos geralmente apresentam dificuldades para o microscopista por causa de sua composição heterogênea e forma física. No entanto, métodos simples foram desenvolvidos para lidar com amostras problemáticas. Amostram particularmente trabalhosas são as gorduras e alimentos que contêm gorduras, já que sua microestrutura é dependente de temperatura Microscopia eletrônica de varredura A microscopia eletrônica de varredura (MEV) é usada para examinar superfícies. A amostra é seca (MEV convencional) ou congelada abaixo de 80 C (cryo-mev). Uma camada espessa de metal (ouro), responsável pela condutividade elétrica, é pulverizada sobre a amostra 19

20 para poder ser visualizada. As imagens geradas pela técnica de MEV possuem bom foco e intensidade e são relativamente fáceis de serem entendidas. O MEV destina-se basicamente ao exame de superfície das amostras, sendo que as superfícies internas das amostras também podem ser visualizadas desde que a amostra seja fraturada e exposta. Ótimos resultados de fratura são conseguidos com o congelamento da amostra empregando-se nitrogênio líquido e posterior fratura manual. Uma ampla faixa de aumentos pode ser usada (20x x) e a MEV pode alcançar uma profundidade de campo aproximadamente 500 vezes maior que a microscopia ótica. Este tipo de microscópio é constituído de canhão eletrônico, lentes, circuito de varredura, coletor e ampliador de sinais, tubo de raios catódicos, sistema de vácuo, registro de imagens, controles. Algumas dificuldades permanecem: a amostra ainda é exposta a alto vácuo, o que significa que desidratação total é necessária, e o material é bombardeado por um raio de elétrons que pode eventualmente danificar a amostra Microscopia confocal O microscópio confocal de fluorescência por varredura laser, referido apenas como confocal, utiliza a fluorescência para a aquisição das imagens. A fluorescência é um tipo de luminescência (emissão de luz) em que um corpo absorve luz e após um curto intervalo de tempo re-emite essa luz. Esse é o princípio da microscopia de fluorescência, na qual compostos químicos chamados fluoróforos são usados para produzir a fluorescência do material em estudo. O uso dos fluoróforos em biologia, por exemplo, acontece quando se quer localizar uma área específica da amostra (como uma proteína, por exemplo) ou para responder a um estímulo específico. A técnica de microscopia de fluorescência consiste justamente em captar este fóton que é emitido e com ele gerar umaimagem. O sistema conhecido como microscopia confocal utiliza uma fonte de laser para promover a excitação dos fluoróforos. Através de um conjunto de lentes o microscópio é capaz de focar um cone de luz laser em uma profundidade predeterminada da amostra a ser estudada. Mudando-se o ponto focal (mantida a profundidade) é possível iluminar todo o plano em estudo, ponto a ponto. A obtenção de imagens sucessivas de diferentes planos da mesma amostra possibilita construir imagens tridimensionais e imagens tridimensionais em movimento. O inconveniente desta técnica é a degradação dos fluoróforos, o que leva à utilização do confocal para o estudo de fenômenos mais rápidos, no caso de espécimes vivos, ou para estudar detalhes internos das células em espécimes vivos ou fixados. 20

21 REFERÊNCIA BIBLIOGRAFICA A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists). Official Methods of Analysis. 16 th edição. Washington, DC, EUA, A.O.A.C. (Association of Official Analytical Chemists). Official Methods of Analysis. 17 th edição. Gaithersburg, Maryland, AGUILEIRA, J. M.; STANLEY, D. W. Microstructural Principles of Food & Engineering. 1. ed. Cambridge: Elsevier Applied Science, p. ANTONIO, G. C. Influência da estrutura celular e da geometria da amostra na taxa de transferência de massa do processo de desidratação osmótica de Banana Nanica (Musa cavendish) e de Mamão Formosa (Carica papaya L.) Dissertação (Mestre em Engenharia de Alimentos) Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, BOBBIO, P.A; BOBBIO, F.O. Química do processamento de alimentos. São Paulo: Varela, p INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985a. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, p INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985b. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, p INSTITUTO ADOLFO LUTZ. 1985c. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. 3 ed. São Paulo, v.1, p JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Foods Products p. JOSLYN, M.A. Methods in Food Analysis - 2 ed p. 21