Transformação do cafeeiro para resistência à herbicida através de bombardeamento

Transcrição

1 Transformação do cafeeiro para resistência à herbicida através de bombardeamento

2 Diagrama de Transformação Genética de Café Transformação via Agrobacterium ou Biobalística Explantes descontaminados são colocados em meio de cultura Regeneração de embriões ou brotos transformados Seleção de explantes/ tecidos transformados Transferência para meio seletivo ( antibióticos / herbicida) e de regeneração Análise molecular: PCR Southern, Northern e Western blot Regeneração de plantas Análise fisiológica da nova característica

3 Vetor LB CaMv35 S polya PAT (bar) CaMV35 S CaMV 35 S -glucuronidase (gus A) Nos poly-a T-DNA do plasmídio pcambia RB

4 PDS 1000/He-BioRad Antes Depois Tubo de aceleração Disco de ruptura Tecido vegetal Sistema de aceleração de partículas com alta pressão de hélio

5 Análise Histoquímica Expressão transiente do gene gus em calos embriogênicos de C. canephora 24 h após o bombardeamento de partículas.

6 Análise Histoquímica Expressão estável do gene uida em tecido embriogênico de C. canephora.

7 Regeneração de Embriões Regeneração de embriões de C. canephora em meio seletivo contendo 5 M de glufosinato de amônio

8 Plântulas Regeneradas Putativos transformantes em desenvolvimento em meio sem reguladores de crescimento

9 Análise Histoquímica Expressão estável do gene uida plântulas transformada X controle não transformada

10 Análise Molecular M C 1 2 P 450 bp Detecção do gene bar (450 bp) através da PCR. M, marcador molecular;c, controle negativo; 1-2 plântulas transgênicas; P, plasmídio pcambia 3301.

11 Análise das plantas transformadas Resistência ao glufosinato Planta transformada Controle

12 Transformação genética de laranja doce visando resistência ao cancro cítrico

13 CANCRO CÍTRICO Lesões de Folha Depreciação do fruto J.H. Graham T.R. Gottwald Infecção severa - desfolha J.H. Graham

14 Resistência Varietal (em condições de campo) Altamente suscetíveis grapefruit Lima ácida galego Moderadamente suscetíveis limão Laranja doce Moderadamente resistente Fotos: T.R. Gottwald e J.H. Graham Tangerina

15 Medidas de Controle Prevenção Fundecitrus Erradicação Fundecitrus

16 Peptídeos antibacterianos Natureza catiônica e anfipática Conformação de α-hélice quando ligada à superfície fosfolipídica de membranas

17 Capacidade de desestabilizar membranas de microrganismos reação estequiométrica e não catalítica

18 Peptídeos antibacterianos usados em transformação de plantas Magainina (Xenopus sp.) Atacina (Trichoplusia ni) Cecropina (Hyalophora cecropia) Lisozima (T4, bovina e humana)

19 SARCOTOXINA IA Efeito antibacteriano e antifúngico em quantidades nanomolares Rompimento de membranas ricas em fosfolipídios aniônicos (baixo nível em plantas e animais) Sarcophaga peregrina Peptídeos homólogos em intestino de animais Amplo espectro contra patógenos

20 National Institute of Agrobiological Resources, Tsukuba, Japão

21 Protocolos de Regeneração 1. Segmentos de epicótilo A D B C E Bespalhok et al., 2002 (Crop Breed Appl. Biotechnol.)

22 Protocolos de Regeneração 2. Segmentos de ramos maduros

23 Planta de laranja Pêra regenerada em florescimento após um ano.

24 Transformação via Biobalística Segmentos de epicótilo/pbe-gus Bespalhok et al., 2002

25 Transformação via Agrobacterium Ramos maduros/ pbe-gus

26 Construção com gene de peptídeo com ação antibacteriana (Sarco IA)

27 Obtenção de plantas transgênicas Broto adventício em meio com agente seletivo (canamicima > glufosinato) Transformantes putativos regenerados após enxertia.

28 Teste histoquímico para comprovar a transformação de plantas (pbe-gus)

29 Análise PCR e Southern de plantas in vitro Digestão com EcoRI e hibridação com sonda específica para sarcotoxin IA

30 Western blot de folhas novas expandidas Sintoma aos 25 dias após inoculação (104 CFU/ml) Controle stx-5

31 45 dias após inoculação (104 CFU/ml) Controle stx-5

32 Transformação genética de porta-enxertos para Citrus spp. visando obter maior tolerância ao estresse hídrico

33 Porta-enxertos Limão Cravo (Citrus limonia): ~80% das plantas cítricas estão enxertadas sobre este porta-enxerto; Porta-enxerto mais rústico dispensa irrigação mesmo em áreas de clima mais seco; Susceptível ao agente causador da morte súbita dos citros (MSC);

34 Porta-enxertos citrange Carrizo (Citrus sinensis x Poncirus trifoliata) Porta-enxerto obtido visando incorporar resistência ao frio dos Trifoliata em laranjas; As plantas enxertadas sobre Carrizo - alta produtividade, boa qualidade dos frutos e moderada resistência à geada.

35 Osmoprotetores Protegem a célula - desidratação e oxidação. Exemplos de osmoprotetores: Síntese de glicinabetaína - colina desidrogenase e colina oxidase Síntese de trealose - trealose-6-fosfato desidrogenase Síntese de prolina - 1- pirrolina-5-carboxilase sintetase

36 Gene P5CS Isolado de Vigna aconitifolia (Moth bean) Enzima bifuncional - catalisa a conversão: P5CS P5CR Glutamato GSA P5C Prolina CH2 CH2 COOH CH P5CS P5CDH NH2 COOH Ácido L-Glutâmico CH2 CH2 CHO CH CH2 CH CH espontâneo NH2 COOH GSA CH2 N P5C P5CR ProDH CH2 CH2 CH2 CH NH COOH L-Prolina

37 TNos P5CS-F129A EcoR I P35S PNos RB nptii TNos P35S GUS TNos LB Representação esquemática da construção usada para transformação (Kishor et al., 1995)

38 Esquema de regeneração e transformação dos porta-enxertos germinação in vitro indução de gemas alongamento semente 1-2 mm epicótilo Transformação EHA105-P5CSF129A casa vegetação Análises moleculares Seleção canamicina enraizamento aclimatação Transferência Plantmax 1/2 MS + NAA

39 Escolha dos melhores eventos baseado na concentração de prolina moles prolina g-1 peso fresco citrange Carrizo (evento 1) plantas controle citrange 1Carrizo citrumelo Swingle

40 Análise da integração do DNA ao genoma por Southern Blot Sonda fragmento p5cs de 1.6 Kb 32P d-ctp HindIII XbaI P35S XbaI P5CS Tnos DNA genômico das plantas digeridas - HindIII 23,130 bp 9,416 bp 6,557 bp 4,361 bp 2,322 bp 2,027 bp Ct-P5-20 Ct-P5-16 Ct-P5-08 Ct-P5-07 Plasm. 3C Tnos P5CS Ct-cont Cr-P5-14 Tnos P35S Cr-P5-03 GUS Cr-P5-02 Tnos P35S Cr-P5-01 nptii Cr-cont P35S HindIII Plasm.1C HindIII

41 Determinação da concentração de prolina evento 1 de citrange Carrizo u m o le s p r o lin a g -1 d e m a s s a s e c a c o n tr o le tr a n s g ê n ic a ~2x 100 ~2x 50 0 sem estresse 1 com estresse Submetidas a 20 dias de estresse hídrico

42 Ajustamento osmótico (MPa) Potencial da água (Mpa) Potencial da água, potencial osmótico e valores de ajustamento osmótico t controle t transgênica s controle s transgênica Potencial da água Transgênica Potencial osmótico Controle transgênica

43 Plantas submetidas a 20 dias sem água