VARIABILIDADE GENÉTICA DO LOBO GUARÁ

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1 VARIABILIDADE GENÉTICA DO LOBO GUARÁ (Chrysocyon brachyurus) NA ESTAÇÃO ECOLÓGICA DO JATAÍ (MUNICIPIO DE LUIS ANTÔNIO, ESTADO DE SÃO PAULO BRASIL) E EM ÁREAS VIZINHAS. GENETIC VARIABILITY OF THE MANED WOLF (Chrysocyon brachyurus) IN JATAI ECOLOGICAL STATION (MUNICÍPIO OF LUÍS ANTÔNIO, SÃO PAULO STATE BRAZIL) AND SURROUDINGS. PAULO SERGIO RIBEIRO DE MATTOS 1 ARNO RUDI SCHWANTES 2 MARCO ANTÔNIO DEL LAMA 2 ROGÉRIO HARTUNG TOPPA 3 RESUMO Foram estudados 12 marcadores genéticos protéicos (16 locos) de 29 lobos guarás da estação Ecológica do Jataí (EEJ) e entorno. O grau de polimorfismo e o nível de heterozigosidade (intraloco e média) estimados foram semelhantes aos observados por outros autores para lobos guarás e outras espécies de canídeos de vida livre. Esta área foi dividida em 3 sub-áreas considerando os rios Mogi Guaçu e Pardo como barreiras ao fluxo gênico entre as amostras coletadas. O teste para verificação de equilíbrio genético para cada uma das amostras de cada sub-área e para a amostra total demonstrou que as freqüências fenotípicas observadas estão em equilíbrio de Hardy-Weimberg. Os valores da estatística-f evidenciaram ausência de endocruzamento e estruturação populacional. Como esperado, as distâncias genéticas entre as áreas mostraram-se baixas. ABSTRACT Twelve proteic genetic markers (16 loci) in 29 maned wolves of Jatai Ecological Station and surroundings were studied. The percentage of polymorphic loci and the level of estimate heterozygosity (intralocus and average) was similar to others authors data for maned wolves and others species of wild canids. The area was divided in 3 subareas considering Mogi guaçu and Pardo river as barriers for gene flow among 3 subareas samples. The Genetic equilibrium test within each sub-area and for the whole sample indicate that the observed phenotypic frequencies were according to.hardy- Weimberg equilibrium. The F-statistics values suggests lack of imbreeding and populational structure. As expected, the genetic distances among the areas were low. 1 Médico Veterinário, MSc, doutorando pelo Programa de Pós Graduação em Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Federal de São Carlos UFSCar. 2 Biólogo, Dr, Docente do Departamento de Genética e Evolução da Universidade Federal de São Carlos UFSCar. 3 Biólogo, MSc, doutorando pelo Programa de Pós Graduação em Ecologia e Recursos Naturais da Universidade Federal de São Carlos UFSCar.

2 INTRODUÇÃO A Estação Ecológica do Jataí (EEJ), com uma área de 4532,18 ha está situada no município de Luís Antônio, nordeste do Estado de São Paulo, entre os paralelos 21 o 33 e 21 o 37 de latitude sul e 47 o 45 e 47 o 51 de longitude oeste. Esta Unidade de Conservação apresenta uma grande diversidade de habitats, distribuídos desde os ambientes verdadeiramente aquáticos como rios, córregos e lagoas, passando por banhados e formações periodicamente alagáveis, até as florestas e morros permanentemente livres de inundações (Santos et al., 2000). Os ecossistemas terrestres são representados, principalmente, por fitofisionomias do Cerrado (Cerradão e Cerrado Stricto Sensu) além de trechos de Floresta Mesófila Semidecídua (Toppa, 2001). A principal atividade econômica da região está associada ao setor primário, com indústrias de transformação baseadas no cultivo de cana de açúcar, citros e eucalipto. Outros usos da terra incluem pastagens, café, milho, soja e amendoim. A descrição da estrutura espacial da paisagem do município de Luís Antônio realizada por Pires (1995) pode ser considerada também como tendência para toda a região de estudo. A área de ocorrência do lobo guará compreende a região do Brasil Central, Paraguai, e pequenas áreas da Argentina, Bolívia e Peru (Dietz, 1984). Moreira et al. (1998) consideraram que a influência deletéria do homem no habitat do lobo guará é mais intensa nos estados do sudeste do que do centro-oeste do Brasil, em razão do alto grau de fragmentação florestal resultante da intensa exploração agropecuária e urbanização verificada na região sudeste. Do mesmo modo, a tecnificação no campo é bastante alta, com a queima da cana de açúcar antes da colheita, causando a morte de muitos animais e provocando incêndios em áreas de vegetação nativa (Pires, 1995). Desta forma, é imprescindível a avaliação da genética das populações do lobo guará em função da sua importância para a manutenção da biodiversidade e estabilidade do cerrado. Embora o lobo guará seja considerado um forte atrativo para a prática do ecoturismo (Moreira, 1998), desde 1970 esta espécie está incluída na lista de animais em extinção (Coimbra-Filho, 1972). Os estudos de características genéticas de populações específicas podem ajudar no diagnóstico do grau de "depressão endogâmica" que tende a ocorrer em populações com pequeno número de indivíduos (Woodroffe e Ginsberg, 1998). A análise eletroforética de marcadores protéicos tem contribuído bastante para o conhecimento da genética de populações do lobo guará (Moreira et al., 1998) e de outros canídeos silvestres (Ferrel et al, 1980; Kennedy et al., 1991) e podem ser uma ferramenta útil no diagnóstico da saúde genética das populações. MATERIAL E MÉTODOS A área de estudo compreende, além da EEJ, os municípios do entorno de Luiz Antônio, conforme apresentado na figura 1. As pessoas residentes na área de estudo foram entrevistadas com o intuito de buscar informações sobre a ocorrência e localização do lobo guará. As áreas que apresentaram indícios da ocorrência da espécie foram submetidas a observações indiretas (pegadas e fezes) e diretas (observação do animal), de acordo com a metodologia descrita em Pontes Filho et al. (1997).

3 Após a detecção das trilhas de passagem do lobo guará, foram dispostas armadilhas de captura descritas por Dietz (1984), modificadas por nossa equipe. Com esta metodologia, foi possível obter amostras de 22 animais. Foram amostrados também 5 animais disponibilizados pela polícia Florestal e 2 provenientes de cativeiro que viviam na natureza com localização na área de estudo. Desta forma, amostras de 29 animais da região de estudo foram coletadas. Com o acesso ao animal, foi realizada a contenção química e a coleta de sangue em tubos heparinizados. Estes tubos foram mantidos sob refrigeranção à temperatura de 2-8 o C, durante o transporte até o laboratório. Os animais foram liberados para retorno ao ambiente natural após marcação e recuperação da exposição anestésica (com exceção dos animais de cativeiro). Todas as ocorrências deste trabalho foram georreferenciadas por GPS e digitalizadas em cartas elaboradas com o emprego do programa MapInfo (versão 4.1). As amostras de sangue heparinizado foram centrifugadas para a obtenção do plasma e o precipitado (hemácias) foi lavado 3 vezes em solução de NaCl 0,9% antes do congelamento a 20 o C. Estas amostras foram então submetidas à técnica de eletroforese e coloração específica para o estudo dos zimogramas. Foram estudados os seguintes sistemas protéicos: fosfoglicose isomerase (Pgi), peptidase B (PepB), lactato desidrogenase (locos A e B - LdhA e LdhB), 6- fosfogluconato desidrogenase (Pgd), hemoglobina (Hb), haptoglobina (Hp), malato desidrogenase (Mdh), superóxido dismutase (Sod), albumina (Alb), proteínas séricas (Prt1, Prt2, Prt3 e Prt4), fosfatase ácida (AcP), e anidrase carbônica II (CA II). Como fatores limitantes ao fluxo gênico, consideramos que os rios Mogi-Guaçu e Pardo apresentam um papel estratégico no contexto deste trabalho (figura 1) pois apresentam uma largura média de 40 metros e um grande fluxo de água. Desta forma, consideramos 3 áreas de estudo: Área 1 - entre os rios Mogi Guaçu e o rio Pardo; Área 2 abaixo (ao sul) do rio Mogi Guaçu; Área 3 - acima (ao norte) do rio Pardo. Foram amostrados desta forma 8 animais para a área 1, 13 para a área 2 e 8 para a área 3. Foram realizados testes para verificação de equilíbrio de Hardy- Weinberg tanto para as amostras das três áreas e para a amostra total. Análises de desequilíbrio de ligação foram realizadas através do programa computacional LD 79 (de Weir & Cockerham, 1984), para testar a hipótese de associações preferenciais de alelos de locos distintos. A variância padronizada das frequências alélicas (teste F de Wright, 1965) foi realizada para o estudo da sub-estruturação populacional e endogamia. O calculo de distância genética foi realizado através de método de Nei corrigido para amostras pequenas (1978). Estes dois testes foram realizados através do programa Biosys-1 (Swofford e Selander, 1981) bem como o dendrograma (segundo o método do UPGMA) para representar as relações entre as amostras analisadas. RESULTADOS/AVALIAÇÃO Três locos enzimáticos - Pgi, Pep-B e Pt-4 - exibiram polimorfismo; os demais mostraram-se monomórficos, num total de 16 locos amostrados. A distribuição destes alelos na paisagem está representada na figura 1. O grau de polimorfismo em toda a área de estudo foi de 17,6% e o número de alelos por loco foi de 1,17. Moreira et al. (1998) detectaram um grau de polimorfismo de 21,4% em região de baixa pressão antrópica (Brasilia e Goiânia) e de 14,3% em região de alta pressão antrópica (São Paulo e Minas

4 Gerais). A pressão antrópica foi considerada com base na densidade populacional. Kennedy et al.(1991) encontraram 13,5% de locos polimórficos em lobos cinzentos de vida livre, Waine et al. (1991) encontraram 20% nesta mesma espécie no continente e 8% em uma ilha. A heterozigosidade intraloco dos sistemas Pgi, Pep-B e Pt-4 foram de 0.276, e 0.207, respectivamente e a heterozigosidade média foi de Moreira et al. (1998) observaram níveis de heterozigosidade média entre 1,4% e 8,3% para amostras de lobos guarás provenientes de seis regiões do Brasil. Achamos pertinente considerar os rios como importantes fatores limitantes de fluxo gênico entre os lobos guarás. Mantovani (2001) estudou a área de vida da espécie na EEJ e entorno, através de radiotelemetria, durante 29 meses e nenhum ponto de triangulação estava do outro lado do rio Mogi Guaçu, apesar da área de vida destes animais se estender por toda a margem norte do rio. Moreira et al. (1998) detectaram na sua análise de variância de frequências alélicas uma heterogeneidade significativa entre as amostragens de lobos guarás do triângulo mineiro e de São Paulo, caracterizando diferentes populações as quais são divididas pelo Rio Grande. Johnson et al (1999), conclui em seu trabalho que o Rio Amazonas aparece como a mais significante barreira geográfica de fluxo gênico para quatro espécies de felídeos silvestres. Os estudos do equilíbrio de Hardy Weinberg nas 3 áreas amostradas neste trabalho mostraram valores não significativos, indicando que a amostragem total, assim como as amostras das áreas um e dois, encontram-se em equilíbrio genético. Para a amostra da área três o qui-quadrado foi significativo (p < 0,05) para os locos Pgi e Pep-B. Esta amostra, quando re-analisada fazendo-se a correção de Yates, apresentou um valor de qui-quadrado não significativo, indicando que esta amostragem também estava em equilíbrio. As análises de desequilíbrio de ligação mostraram ausência de associação preferencial nos gametas entre alelos de locos distintos. Os valores da estatística-f (Wright, 1965) revelaram um coeficiente de endogamia (F IS = 0,067; χ 2 = 1.24, GL = 6) e um coeficiente de diferenciação interpopulacional não significativos (F ST = 0.087; χ 2 = 5.45, GL = 6). Estes valores indicam ausência de redução significativa da heterozigosidade em função da endogamia e da estruturação populacional na área amostrada. Esta ausência de estruturação populacional na área amostrada pode ser decorrente da grande mobilidade do lobo guará e da não ocorrência de filopatria na espécie. Os valores de distância genética corrigida para pequenas amostras (Nei, 1978) foram muito baixas. A distância genética entre amostras provenientes das áreas 1 (onde se localiza a EEJ) e 2 foi zero, enquanto que as distâncias genéticas entre as amostras das áreas 1-3 e 2-3 foram e 0.037, respectivamente. Moreira et al. (1998) estimaram distâncias genéticas entre 0 a 0,008 (média = 0.006) entre amostras de 6 localidades de ocorrência do lobo guará no Brasil (proximidades de Brasília, Goiânia, Belo Horizonte, a oeste e a sul do estado de Minas Gerais, e Estado de São Paulo). CONCLUSÕES Neste trabalho foram realizados estudos de marcadores genéticos protéicos de 29 lobos guarás da estação Ecológica do Jataí (EEJ) e entorno. Esta área foi dividida em 3

5 sub-áreas considerando os rios Mogi Guaçu e Pardo como divisores por serem possíveis barreiras de fluxo gênico entre os indivíduos amostrados. Dezesseis locos protéicos foram amostrados, dos quais três exibiram polimorfismo (Gpi, PepB e Prt4), resultando em grau de polimorfismo e heterozigosidade média iguais a 17.6% e 5.2%, respectivamente. Estes valores são similares ao descritos por outros autores para espécies de canídeos geneticamente próximas ao lobo guará. A composição genotípica das amostras correspondentes às três áreas, bem como à amostra total, está de acordo com o modelo de equilíbrio genético segundo Hardy-Weimberg. A análise da significância dos parâmetros da estatística-f indicou que não há redução significativa da heterozigosidade em decorrência do endocruzamento (F IS = 0,067; χ 2 = 1.24, GL = 6) e da subdivisão da população (F ST = 0.087; χ 2 = 5.45, GL = 6). A distância genética entre as amostras analisadas foi baixa (amplitude: de zero a 0.058); entretanto, o dendrograma obtido sugere maior similaridade entre as amostras de Jataí e São Carlos em comparação com a amostra procedente de Altinópolis. Não foi observada uma associação preferencial entre alelos dos três locos polimórficos analisados, indicando, portanto, ausência de desequilíbrio de ligação. Os resultados do presente trabalho indicam que a população de lobo guará analisada não apresenta indícios de redução de variação genética (menor heterozigosidade), ocorrência de endogamia, e estruturação populacional (ausência de barreiras ao fluxo gênico), o que nos permite concluir que a espécie não está depauperada geneticamente.

6 Figura 1 -

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS COIMBRA-FILHO, A. F. Mamíferos ameaçados de extinção no Brasil. In: ACADEMIA BRASILEIRA DE CIÊNCIAS. Espécies da fauna brasileira em extinção. Rio de Janeiro: DIETZ, J. M. Ecology and social organization of the maned wolf (Chrysocyon brachyurus). Smith. Contr. Ecol., v. 392, p. 1-24, FERREL, R. E. et al. Biochemical markers in a species endangered by introgression: the red wolf. Biochem. Gen., v. 18, n. 1-2, p , KENNEDY, P. K. et al. Genetic variability in natural populations of the gray wolf, Canis lupus. Can. J. Zool., v. 69, p , MANTOVANI, J. E. Telemetria convencional e via satélite na determinação da área de vida de três espécies de carnívoros da região nordeste do estado de São Paulo f. Tese (Doutorado em Ecologia) Programa de Pós Graduação em Ecologia e Recursos Naturais, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. MOREIRA, J. R. et al. Estudo preliminar da variabilidade genética do lobo guará (Chrysocyon brachyurus). Brasília: EMBRAPA, CENARGEN, P (Comunicado técnico, n. 30). NEI, M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics., v. 89, p , PIRES, J. S. R. Análise ambiental voltada ao planejamento e gerenciamento do ambiente rural: abordagem metodológica aplicada ao município de Luis Antônio SP f. Tese (Doutorado em Ecologia) Programa de Pós Graduação em Ecologia e Recursos Naturais, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. PONTES FILHO, A. et al. Projeto lobo guará. Contribuição à conservação ambiental dos campos gerais do Paraná-Brasil. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE UNIDADES DE CONSERVAÇÃO, 1., 1997, Curitiba. Anais... Curitiba: IAP: UNILIVRE: Rede Nacional Pro Unidade de Conservação, 1997, v.2. p SANTOS, J. E. et al. Funções ambientais e valores dos ecossistemas naturais. Estudo de caso: Estação Ecológica de Jataí (Luís Antônio, SP). In: SEMINÁRIO REGIONAL DE ECOLOGIA, 7., 1998, São Carlos. Anais... São Carlos: UFSCar, P SANTOS, J. E.; PIRES, A. M. Z. C. R.; PIRES, J. S. R. Caracterização ambiental de uma unidade de conservação: Estação Ecológica do Jataí, Luís Antônio, SP. São Carlos: UFSCar, p. Folheto. SWOFFORD, D. L.; SELANDER, R. B. Byosys-1: A Fortran program for the comprehensive analysis of electrophoretic data in population genetics and systematics. J. Hered. V. 72, p , 1981.

8 TOPPA, R. H.; PIRES, J. S. R. Estrutura e diversidade florística do componente arbóreo-arbustivo na diferentes fisionomias de cerrado e suas correlações com as características edáficas na Estação Ecológica de Jataí, SP. São Carlos: UFSCar, p. Relatório Científico. FAPESP. Processo 00/ WAYNE, R. K., Conservation genetics of endangered Isle Royale gray wolf. Conserv. Biol., v. 5, n. 1, p , WEIR, B. S.; COCKERHAM, C. C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure. Evolution. v. 38, p , WRIGHT, S. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating. Evolution, v. 19, p , WOODROFFE, R.; GINSBERG, J. R. Edge effects and the extinction of populations inside protected areas. Science, v. 280, p , 1988.