Erliquiose Monocítica Canina: Revisão sobre a doença e o diagnóstico

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS Erliquiose Monocítica Canina: Revisão sobre a doença e o diagnóstico Herika Xavier da Costa Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares Goiânia 2011

2 ii HERIKA XAVIER DA COSTA Erliquiose Monocítica Canina: Revisão sobre a doença e o diagnóstico Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. Nível: Doutorado Área de concentração: Sanidade animal, Higiene e tecnologia de alimentos Linha de pesquisa: Parasitos e doenças parasitárias dos animais Orientador: Prof. Dr. Guido Fontgalland Coelho Linhares UFG Comitê de orientação: Prof. Dra. Valéria de Sá Jayme UFG Dr. Sabrina Castilho Duarte Goiânia 2011

3 iii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Erliquiose Monocítica Canina (EMC) Agente etiológico, histórico e distribuição geográfica Transmissão Patogenia e Manifestação Clínica Achados laboratoriais Diagnóstico A) Exame parasitológico direto B) Testes sorológicos C) Isolamento D) Biologia Molecular CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 27

4 iv LISTA DE FIGURAS Figura 1.Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x Figura 2.Vista dorsal de exemplares de carrapatos adultos, machos e fêmeas, vetores da Erliquiose Monocítica Canina. (A) Rhipicephalus sanguineus (B) Dermacentor variabilis Figura 3. Cão com epistaxe severa devido a infecção por E. canis Figura 4. Fotomicrografia de células DH82 infectadas com E. canis com reação fluorescente positiva (setas). Notar a fluorescência positiva de forma difusa, caracterizando aparentemente antígenos solúveis (A) no citoplasma celular, corpúsculos elementares e iniciais (B), bem como a presença de mórulas (C). Imunofluorescência indireta; Figura 5. Fotomicrografias de células DH82 provenientes de monocamada inoculada com o isolado de Jaboticabal, SP, apresentando mórulas de E. canis (setas) aos 28 dias pós-inoculação. Panótico rápido (Laborclin ); 100X Figura 6. Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT-Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: Não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos Figura 7. Molécula de SYBR Green entre a fita dupla de DNA Figura 8. Ilustração de uma sonda TaqMan. F- Fluoróforo e Q- Quencher Figura 9. PCR em Tempo Real com sonda TaqMan... 24

5 1 1. INTRODUÇÃO A Erliquiose Monocítica Canina (EMC) é uma doença causada por bactérias estritamente intracelulares, Gram-negativas, pertencentes à ordem Rickettsiales, família Anaplasmataceae, gênero Ehrlichia e espécie Ehrlichia canis (DUMLER et al., 2001). A EMC foi descrita inicialmente por DONATIEN & LESTOQUARD em um cão Pastor Alemão no Instituto Pasteur na Algéria em Desde então, a EMC tem sido reconhecida mundialmente e é considerada uma das doenças mais importantes que acometem os cães, podendo causar infecções graves e fatais (NAKAGHI et al., 2008; DA SILVA et al., 2010). No Brasil, a EMC foi diagnosticada pela primeira vez em Belo Horizonte, Minas Gerais (COSTA et al., 1973). A transmissão de E. canis ocorre durante o repasto sanguíneo do carrapato Rhipicephalus sanguineus infectado, o qual mantém a bactéria por transmissão transestadial (BREMER et al., 2005). No Brasil, as frequências de carrapatos R. sanguineus encontrados naturalmente infectados por E. canis têm variado de 2,3 a 6,2% (AGUIAR et al., 2007a). Este carrapato encontra-se preferencialmente em regiões urbanas do país, porém também ocorre em menores densidades nas áreas rurais e provavelmente, em todo o território nacional. É uma espécie de difícil controle, o que contribui para a manutenção da E. canis em regiões tropicais e subtropicais (LABRUNA et al., 2001). No Brasil, a EMC já foi relatada em cães de praticamente todos os estados brasileiros. Estudos epidemiológicos no país têm revelado prevalências de EMC que variam de 4,8 a 65% em cães de ambiente urbano ou rural (COSTA Jr. et al., 2007; SAITO et al., 2008). A estimativa da prevalência da EMC é muito variada e está intimamente relacionada com a população animal estudada, região, época e técnica de diagnóstico empregada. Para cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários, a frequência de animais positivos aos testes sorológicos ou moleculares tem oscilado entre 20 a 30% (DAGNONE et al., 2003; LABARTHE et al., 2003; BULLA et al., 2004; TRAPP et al., 2006).

6 2 A patogênese da EMC envolve três fases clínicas consecutivas: aguda, subclínica e crônica. Na fase aguda, os sinais clínicos podem variar de leves a graves e incluem sinais inespecíficos como anorexia, depressão e febre, e ocasionalmente, petéquias, equimoses e epistaxe podem aparecem. Anormalidades hematológicas nesta fase podem incluir trombocitopenia, anemia e leucopenia leve (BORIN et al., 2009). O tratamento adequado na fase aguda resulta em recuperação completa, porém, com tratamento inadequado ou a falta dele, a doença pode progredir para a fase subclínica, que pode durar anos. O diagnóstico da EMC comumente ocorre durante a fase crônica da doença, a qual é caracterizada por supressão medular, sangramentos por mucosas e alta letalidade (HARRUS et al., 1997). O tratamento nesta fase comumente é trabalhoso e de custo elevado, muitas vezes necessitando de hospitalização prolongada e transfusões de sangue. E apesar do intenso cuidado, o resultado geralmente é pouco gratificante (MYLONAKIS et al., 2004). O Diagnóstico da EMC frequentemente é desafiador para o clínico veterinário de pequenos animais devido a característica multissistêmica da doença (HARRUS & WANER, 2011). A presença do carrapato e a ocorrência de outros casos da doença na região, são importantes para se confirmar a suspeita clínica. O diagnóstico pode ser feito através do exame parasitológico direto, cultura, testes sorológicos e técnicas de biologia molecular (DAGNONE et al., 2003). Em virtude da gravidade da EMC e do seu caráter endêmico em regiões tropicais e subtropicais, a detecção precoce da infecção é extremamente importante. Dessa forma, há grande preocupação com o desenvolvimento e uso cada vez maior de novas técnicas para o diagnóstico da infecção por E. canis (HARRUS & WANER, 2011). As tradicionais técnicas de diagnóstico (exame parasitológico direto e sorologia) são valiosas ferramentas de diagnóstico para EMC, no entanto, o diagnóstico definitivo de infecção por E. canis de forma mais eficaz e rápida requer o uso de técnicas moleculares. Assim, buscou-se com esta revisão de literatura ressaltar a importância da EMC e do estabelecimento de um diagnóstico precoce em cães a fim de contribuir com o prognóstico da doença em cães.

7 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Erliquiose Monocítica Canina (EMC) Agente etiológico, histórico e distribuição geográfica As espécies do gênero Ehrlichia são pequenos organismos cocóides ou elipsoidais, frequentemente pleomórficos, Gram-negativos e parasitas intracelulares obrigatórios de leucócitos. O gênero Ehrlichia inclui as espécies Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. muris, E. ruminantium e E. ewingii (DUMLER et al., 2001). As espécies de Ehrlichia são transmitidas aos hospedeiros principalmente através da picada de um carrapato infectado. O que explica a maior prevalência da erliquiose em regiões tropicais e subtropicais devido à distribuição geográfica dos vetores (ANDEREG & PASSOS, 1999). E. canis é transmitida aos cães principalmente pelo Rhipicephalus sanguineus (BREMER et al., 2005), E. ruminantium (ruminantes) por carrapatos do gênero Amblyomma, E. chaffeensis (humanos e veados) e E. ewingii (humanos e cães), por Amblyomma americanum e Dermacentor variabilis (DUMLER et al., 2001) e E. muris (roedores) por Haemaphysalis flava e Ixodes persulcatus (INOKUMA et al., 2007). Espécies de carrapatos, tais como A. cajennense, foram suspeitos para atuar como vetores de E. canis em áreas rurais (COSTA JR et al., 2007). A EMC ganhou importância mundial durante a Guerra do Vietnã, devido as perdas de um grande número de cães militares dos Estados Unidos (HUXSOLL et al., 1970). A EMC é amplamente detectada em todo o Brasil. Três espécies foram descritas até o momento no Brasil: E. canis (COSTA et al. 1973; LABRUNA et al, 2007; UENO et al,.2009) e E. ewingii acometendo cães (OLIVEIRA et al., 2009) e E. chaffeensis acometendo um veado pantaneiro (MACHADO et al., 2006). O DNA de E. muris e E. ruminantium ainda não foram identificadas no Brasil, este agentes etiológicos frequentemente acometem

8 4 roedores e ruminantes, respectivamente (VIEIRA et al., 2011). Ehrlichia canis é a principal espécie acometendo cães no Brasil. No entanto, existe um relato recente comprovando a infecção por E. ewingii em cinco cães de Viçosa, Minas Gerais (OLIVEIRA et al., 2009). A Ehrlichia canis foi descrita inicialmente por DONATIEN & LESTOQUARD em um cão Pastor Alemão no Instituto Pasteur na Algéria em 1935, os quais observaram no esfregaço sanguíneo de cães infestados por R. sanguineus a presença de pequenos organismos semelhantes a rickettsia no interior de monócitos, que foram nomeados Rickettsia canis. No ano de 1945, MOSHKOVSHI renomeou a Rickettsia canis para Ehrlichia canis, em homenagem ao famoso bacteriologista alemão, Paul Ehrlich (McDADE, 1990). Existem três cepas de E. canis, isoladas e caracterizadas geneticamente como: Flórida (M73226), Oklahoma (M73221) e Israeli (U26740). Apesar das cepas terem origens geográficas distintas, existe uma grande similaridade genética entre elas, de acordo com a sequência do RNA ribossomal 16S (DAGNONE et al., 2001). No cão, E. canis invade predominantemente os leucócitos mononucleares (linfócitos e monócitos), onde se replicam por divisão binária. O microrganismo se localiza no citoplasma celular e se reproduz no interior de fagossomos na forma de corpúsculos iniciais. Os corpúsculos iniciais são unidades do microrganismo que se unem para formar a mórula (ALMOSNY & MASSARD, 2002). À microscopia ótica, E. canis pode ser visualizada no citoplasma de células sanguíneas mononucleares caninas como colônias de corpos cocóides, denominadas mórulas intracitoplasmáticas (Figura 1).

9 5 Figura 1.Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x. Fonte: /2010/06/what-is-ehrlichiosis.html O destino das mórulas são as células do sistema fagocitário mononuclear (SFM), que são normalmente distribuídas pelo baço, fígado, sangue e linfonodos). Por meio de estudos com microscopia eletrônica constatou-se que a mórula é formada por um conjunto de microrganismos pleomórficos, firmemente envoltos por uma dupla membrana, densamente compactados dentro de um vacúolo. As mórulas medem cerca de 1.0 a 6.0 µm de largura e contém de 1 a 40 organismos firmemente envoltos por uma membrana (MENDONÇA et al., 2005; GREENE, 2006). A infecção por E. canis é relatada mundialmente sendo mais comumente encontrada nas regiões tropicais e subtropicais do mundo (GREENE, 2006). A EMC é frequentemente diagnosticada acometendo cães na América do Norte (TZIPORY et al., 2010), América do Sul (BULLA et al., 2004), Europa (COCCO et al., 2003), Ásia (SUTO et al., 2001) e África (GHORBEL et al., 2001). No Brasil, a primeira descrição da doença causada por E. canis foi feita em Belo Horizonte, Estado de Minas Gerais por COSTA et al. (1973). Desde então, a E. canis foi diagnosticada em praticamente todos os Estados brasileitos. Apesar da existência de relatos da EMC acometendo cães em todo o país, dados precisos sobre a prevalência da doença nas diferentes áreas do Brasil ainda são muito escassos (VIEIRA et al., 2011).

10 6 De acordo com Labarthe et al. (2003), aproximadamente 20% dos cães atendidos em clínicas e hospitais veterinários nas regiões sul, sudeste, centro-oeste e nordeste do Brasil são sorologicamente positivos para E. canis. O risco de infecção por E. canis é maior em cães que vivem em casas do que aqueles que vivem em apartamentos. Provavelmente em virtude da maior exposição dos cães que vivem em casas com quintais aos carrapatos do que aqueles que vivem em apartamentos (COSTA Jr et al., 2007). De acordo com Solano-Gallego et al. (2006), a variação na prevalência da infecção por E. canis relaciona-se com o tipo de população estudada, a região geográfica, o número total de cães avaliados em cada estudo e o método de diagnóstico empregado. A frequência de animais reagentes a E. canis obtida por dot-elisa é de 15,5% (104/671) para o Estado de São Paulo, 29,6% (125/422) no Rio de Janeiro e 20,9% (93/446) em Minas Gerais (LABARTHE et al., 2003). Já a frequência de E. canis obtida pela técnica de PCR, é de 21% no Paraná (DAGNONE et al, 2003), 15% no Rio de Janeiro (MACIEIRA et al., 2005) e 7,8% em Ilhéus e Itabuna (Bahia) (CARVALHO et al., 2008). A frequência de sororreagentes entre cães sintomáticos comumente é elevada, sendo observada em 92,3% (48/52) dos cães avaliados por dot- ELISA, na cidade de Jaboticabal/ SP (OLIVEIRA et al., 2000) e 88% dos cães testados por nested-pcr do gene 16S rrna, em Jaboticabal, SP (DAGNONE et al., 2009) Transmissão O principal vetor da espécie E. canis em todo o mundo é o carrapato Rhipicephalus sanguineus (Figura 2A), o qual é conhecido como carrapato marrom do cão, uma espécie cosmopolita amplamente encontrada no Brasil, assim como em outras áreas de clima tropical e subtropical (SHAW et al., 2001; BREMER et al., 2005). Embora o Rhipicephalus sanguineus seja reconhecido como o principal vetor da EMC, acredita-se que este não seja o único vetor da doença. Johnson et al. (1998) demonstraram experimentalmente que o Dermacentor variabilis (Figura 2B), também é capaz de transmitir E. canis aos

11 7 cães. Porém, não se tem relatos sobre o papel de outras espécies de carrapatos na transmissão natural de E. canis em cães. Figura 2.Vista dorsal de exemplares de carrapatos adultos, machos e fêmeas, vetores da Erliquiose Monocítica Canina. (A) Rhipicephalus sanguineus (B) Dermacentor variabilis. Fonte: LITTLE, O R. sanguineus é encontrado principalmente em áreas urbanas, onde atua ao longo do ano. Embora não muito comum, populações de R. sanguineus também são encontradas em áreas rurais (Labruna et al., 2001). No carrapato, as erliquias se disseminam a partir do intestino para os hemócitos e para a glândula salivar. Durante a alimentação, os carrapatos inoculam a secreção salivar contaminada com erlíquias no interior do sítio de alimentação no hospedeiro. Os carrapatos sobrevivem como adultos sem se alimentar, por 155 a 568 dias, e podem transmitir a infecção por até 155 dias após se tornarem infectados (DAGNONE et al., 2001). A contaminação de carrapatos por E. canis comumente ocorre quando os carrapatos se alimentam nos estágios larval ou ninfal em cães durante a fase aguda da infecção. Tentativas de transmissão de E. canis para carrapatos que se alimentaram como ninfas em cães durante as fases subclínica e crônica da infecção não foram bem sucedidas (LEWIS et al., 1977). A transmissão da EMC aos cães ocorre durante o parasitismo por ninfas e/ ou adultos do carrapato R. sanguineus parasitados com E. canis, o qual mantém a bactéria por transmissão transestadial. Como não ocorre transmissão transovariana de E. canis em carrapatos, as larvas de R. sanguineus não são importantes na transmissão, porém podem se infectar pelo

12 8 agente, e esta infecção se mantém nos estágios de ninfa e adultos (BREMER et al., 2005). Embora a infecção natural nos cães ocorre principalmente durante o repasto sanguíneo de carrapatos infectados com E. canis, transmissão de E. canis aos cães também pode ocorrer por meio de transfusões sanguineas de um cão infectado para outro suscetível (BORIN et al., 2009). O vetor da EMC, R. sanguineus, é capaz de transmitir inúmeros outras hemoparasitoses caninas, fato este que torna relativamente comum a coinfecção de E. canis com outros hemoparasitos, como o Anaplasma sp. (MOREIRA et al, 2003; DAGNONE et al, 2009), Babesia sp. (TRAPP et al., 2006; BORIN et al., 2009), Hepatozoon sp. (MUNDIM et al., 2008) e Mycoplasma sp. (MOREIRA et al., 2005). Os hospedeiros vertebrados mais importantes e comuns da EMC são os membros da família Canidae (cães, coiotes, raposa e chacal). Porém, já foi relatado ocorrência na Venezuela de pelo menos seis casos clínicos descritos de erliquiose humana causada por E. canis, indicando que este agente pode causar infecções no homem (PEREZ et al., 2006) Patogenia e Manifestação Clínica Uma grande variedade de fatores, incluindo o tamanho do inóculo de E. canis, podem influenciar o curso e o resultado da infecção nos cães. A manifestação da doença pode ser afetada pela patogenicidade das diferentes cepas de E. canis e por co-infecções com outros patógenos, como Babesia canis vogeli e Hepatozoon canis transmitida pelo mesmo vetor (GREENE, 2006; HARRUS & WANER, 2011). Durante o período de incubação de 8 a 20 dias, a E. canis se multiplica em macrófagos do sistema mononuclear fagocitário, por fissão binária, disseminando por todo o corpo. O curso subsequente da EMC tem sido dividido em três fases, aguda, subclínica e crônica, baseada nos sinais clínicos e anormalidades clínico-patológicas demonstradas em estudos por infecção experimental. Porém a diferenciação precisa das fases da EMC na ocorrência natural da infecção é difícil (GREENE, 2006). A EMC é caracterizada por manifestações clínicas multissistêmicas, que variam na intensidade de acordo com as fases da doença. Não existe

13 9 predileção de idade ou sexo para EMC, sendo relatada em cães com dois meses a 13 anos de idade (SOUZA et al., 2010). Entretanto, cães pastor alemão parecem ser mais suscetíveis do que outras raças (BORIN et al., 2009; UENO et al., 2009). A fase aguda da EMC dura de duas a quatro semanas. Durante esse período, o microrganismo replica-se nas células mononucleares da circulação sanguínea, e o parasita dissemina-se para órgãos como baço, fígado e linfonodos, infectando as células mononucleares. Nesta fase ocorre trombocitopenia entre 10 e 20 dias pós infecção e um aumento no número de plaquetas imaturas circulantes, que persiste por toda a doença na maioria dos animais (GREENE, 2006). As principais alterações clínicas observadas na fase aguda são apatia, anorexia, vômito, secreção oculonasal, esplenomegalia, mucosas pálidas, petequias, epistaxe (Figura 3) e uveíte (NAKAGHI et al., 2008; BORIN et al., 2009; HARRUS & WANER, 2011). Estes sinais clínicos geralmente diminuem espontaneamente dentro de uma a quatro semanas, porém os cães podem entrar numa fase assintomática ou subclínica, podendo permanecer infectados por longos períodos (ORIÁ et al., 2004; GREENE, 2006). Figura 3. Cão com epistaxe severa devido a infecção por E. canis. Fonte: LITTLE, 2010.

14 10 Os sinais oculares podem estar presentes em todas as fases da doença e envolvem a maioria das estruturas oculares. A prevalência de lesões oculares em casos de infecção natural varia de 10% a 15% e a severidade do comprometimento ocular muda de paciente para paciente (ORIÁ et al.,2004). As lesões oftalmológicas incluem uveíte anterior, coriorretinite, hemorragia da retina. A cegueira pode ocorrer como resultado da hiperviscosidade sanguínea levando à hemorragia sub-retiniana e descolamento de retina (HARRUS & WANER, 2011). A fase subclínica da infecção ocorre após seis a nove semanas da inoculação, mas pode durar meses ou ano. Nesta fase os cães imunocompetentes podem eliminar o parasito e cessarem a doença, não entrando na fase crônica (BREITSCHWERDT, 2004). Durante a fase subclínica da EMC, o peso dos animais normaliza e a febre cessa (UENO et al., 2009). Cães na fase subclínica apresentam-se clinicalmente saudáveis e permanecem potenciais portadores persistentes por anos. Resultados de infecções experimentais indicam que durante a fasesubclínica da EMC, a E. canis encontra-se em maior quantidade no baço, sendo este o último órgão a acomodar o parasita antes da sua eliminação (GREENE, 2006). A fase crônica desenvolve-se em alguns animais após a fase subclínica, e caracteriza-se por supressão medular, sangramentos por mucosas e conjuntivas e alta letalidade, sendo comumente mais grave que as outras fases da EMC. Nesta fase ocorre grave comprometimento da medula óssea, a produção de elementos sanguíneos fica prejudicada, resultando em pancitopenia (DAGNONE et al., 2001). Os sinais clínicos desta fase são semelhantes aos observados na fase aguda, porém com maior intensidade e gravidade. Frequentemente observa-se palidez das mucosas, fraqueza, sangramento e perda de peso significativa (HARRUS & WANER, 2011). Cães nesta fase podem eventualmente morrer por infecções secundárias ou sangramentos incontroláveis. Portanto, a identificação da doença antes de entrarem na fase crônica da EMC é muito importante para o prognóstico (GREENE, 2006).

15 Achados laboratoriais As anormalidades laboratorias tipicas na fase aguda inclui tromboctipenia, leucopenia e anemia leve. De acordo com Nelson & Couto (2006), a anemia nesta fase é do tipo normocítica normocrômica regenerativa, devido à perda de sangue. A trombocitopenia nesta fase pode ocorrer por aumento no consumo de plaquetas, aumento no sequestro esplênico e destruição imunomediada ou por diminuição da meia vida das plaquetas. A própria infecção por E. canis causa lise de plaquetas, porém, casos sem trombocitopenia podem ocorrer. Ocorre também alteração na função das plaquetas, com muitos animais apresentando sangramento superficial, mesmo com o número de plaquetas e perfil de coagulação normais (ALMOSNY & MASSARD, 2002; ACCETTA, 2008). A fase sub-clínica da EMC é caracterizada por persistência variável de trombocitopenia, leucopenia e anemia na ausência de sinais clínicos (BREITSCHWERDT, 2004). Dentre as alterações hematológicas relatadas com maior frequência na fase crônica da EMC, destaca-se a anemia arregenerativa. Das alterações presentes no leucograma, destacam-se o desvio nuclear de neutrófilos para a esquerda, trombocitopenia e a eosinopenia. Outros achados como leucopenia e monocitopenia são considerados menos frequentes (BORIN et al., 2009). Após o exame clínico de rotina de animais suspeitos, e na ausência de qualquer sinal clínico de outras doenças, o achado de trombocitopenia frequentemente é usado como método de triagem ou mesmo para diagnosticar EMC, seguido pelo tratamento com antibióticos. O problema é que os sinais clínicos da EMC são comuns a outras enfermidades e a trombocitopenia não ocorre apenas em cães com EMC (BULLA et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005; SANTOS et al., 2009). A plaquetometria pode ser considerado um teste sensível, embora pouco específico na triagem de cães clinicamente suspeitos de erliquiose (BULLA et al., 2004; MACIEIRA et al., 2005). A magnitude da trombocitopenia pode aumentar a fidedignidade do diagnóstico (BULLA et al., 2004).

16 12 A ocorrência de trombocitopenia em cães com EMC é muito comum. De acordo com Bulla et al. (2004), 98,5% (66/67) dos cães de Botucatu/SP com EMC apresentaram trombocitopenia no hemograma. Macieira et al. (2005) no Rio de Janeiro/SP e Santos et al. (2009) em Ribeirão Preto/SP, encontraram dados semelhantes relatando uma frequência de trombocitopenia em cães com EMC de 88,23% (30/34) e 66,27% (57/86), respectivamente. Em virtude da alta incidência de E. canis e de outros hemoparasitos em cães no Brasil, a identificação correta do agente etiológico (ou de outras doenças como a causa da trombocitopenia, especialmente quando E. canis é descartada) continua a ser um problema para o veterinário clínico Diagnóstico O diagnóstico da EMC é difícil e complexo, geralmente começa com a avaliação clínica de um paciente com sinais clínicos, histórico da presença de carrapatos e achados de trombocitopenia. A confirmação laboratorial do diagnóstico pode ser realizada por meio do exame parasitológico direto, cultivo, sorologia e técnicas de biologia molecular (DAGNONE et al., 2003). Para maximizar a probabilidade de se chegar a um diagnóstico, ensaios sorológicos e testes de biologia molecular devem ser realizados em conjunto com uma avaliação cuidadosa de esfregaços de sangue em qualquer paciente com suspeita de EMC. A cultura de células geralmente é reservado para laboratórios de pesquisa especializados (LITTLE, 2010). A) Exame parasitológico direto O exame parasitológico direto é um método de diagnóstico rotineiramente utilizado em clínicas e hospitais veterinários para pesquisa de hemoparasitos por ser de rápida execução e possuir um baixo custo (ALVES et al., 2005). A suspeita clínica de EMC pode ser confirmada por meio de achados de mórulas (inclusões) de E. canis em leucócitos de esfregaços sanguíneos (Figura 1) ou creme leucocitário (WOODY & HOSKINS, 1991). No entanto, é

17 13 importante ressaltar que a ausência de parasitos em esfregaços de sangue ou creme leucocitário não exclui a possibilidade de infecção (BORIN et al., 2009). Figura 1. Mórula de E. canis infectando leucócito de cão. Objetiva 100x. Fonte: /2010/06/what-is-ehrlichiosis.html O exame parasitológico direto do esfregaço sanguíneo é específico porém pouco sensível. E de acordo com Harrus & Waner (2011) esta técnica é mais indicada para o diagnóstico na fase aguda da infecção, pois a detecção de mórulas de E. canis ocorre por um curto período de tempo nos leucócitos (monócitos e macrófagos), e a visualização durante as fases subclínicas e crônicas é extremamente rara, conduzindo a resultados falsos negativos. Todavia, a busca por mórulas em monócitos circulantes é o método de diagnóstico mais rotineiro para a EMC, mas em muitos casos ineficaz, pois a detecção direta de E. canis é dificil e incomum (NAKAGHI et al., 2008). Na EMC, a identificação de mórulas no esfregaço sanguíneo ocorre apenas nas duas primeiras semanas da infecção e em pequenas quantidades, devido à baixa parasitemia e a porcentagem de células infectadas raramente ultrapassarem 1%. A visualização de mórulas de E. canis nos monócitos é observada em apenas 4% dos casos de erliquiose (HARRUS & WANER, 2011). Oliveira et al. (2000) ao analisarem através do exame parasitológico direto, 48 amostras de sangue de cães de Jaboticabal-SP, positivas no dot-

18 14 ELISA, verificaram a presença de mórulas de E. canis em apenas uma das amostras avaliadas, obtendo uma frequência de apenas 2% (1/48). Resultados semelhantes foram observados por Faria et al. (2010), os quais verificaram pelo exame parasitológico direto uma frequência de E. canis de 5,7% (2/35) em cães sintomáticos de Jaboticabal-SP. O exame parasitológico direto embora seja um exame altamente conclusivo para o diagnóstico das hemoparasitoses, apresenta pouca sensibilidade devido ao nível de parasitemia flutuante do agente etiológico, mesmo em casos de doença clínica, principalmente nas fases crônicas (GREENE, 2006). B) Testes sorológicos As bactérias do gênero Ehrlichia induzem resposta humoral específica, base para o diagnóstico sorológico, ocorrendo soroconversão nos animais algumas semanas após a infecção (OTRANTO et al., 2009). Vários métodos sorológicos têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da EMC e são considerados valiosas ferramentas de triagem. Dentre os testes sorológicos, a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) é utilizada no diagnóstico da erliquiose, sendo aplicável tanto para estudos de infecções experimentais quanto naturais. A propagação de E. canis em cultura celular tem sido a base para produção de antígenos a serem aplicados em testes sorológicos, havendo detecção de anticorpos precoces em até sete dias pós-infecção, embora a maioria dos cães se tornam soropositivos somente após 28 dias da infecção (HARRUS et al., 1997). Pela RIFI, a soropositividade começa entre 7 a 21 dias após a infecção, chega a níveis máximos após 80 dias e persiste, a menos que se efetue o tratamento (ALMOSNY & MASSARD, 2002). A RIFI é um teste para a pesquisa de anticorpos anti- E. canis. Porém, embora ocorra o emprego de testes sorológicos para o diagnóstico da erliquiose, sabe-se que as várias espécies de erlíquias dividem antígenos em comum, gerando reações cruzadas entre espécies do mesmo gênero. Além disso, os testes sorológicos não são capazes de distinguir uma infecção

19 15 corrente de uma exposição prévia sem estabelecimento ou persistência de infecção (AGUIAR et al., 2007b). Títulos de IgG 1:40 são considerados positivos para a exposição por E. canis (Figura 4). Para infecções agudas, são recomendados dois testes consecutivos, com intervalo de 7-14 dias, um aumento de 4 vezes em títulos de anticorpos é sugestivo de uma infecção ativa. Anticorpos IgG anti- Ehrlichia persistem por vários meses após o tratamento e eliminação da bactéria (WANER & HARRUS, 2011). Figura 4. Fotomicrografia de células DH82 infectadas com E. canis com reação fluorescente positiva (setas). Notar a fluorescência positiva de forma difusa, caracterizando aparentemente antígenos solúveis (A) no citoplasma celular, corpúsculos elementares e iniciais (B), bem como a presença de mórulas (C). Imunofluorescência indireta; 40. Fonte: AGUIAR et al., 2007b. Além do RIFI, testes imuno enzimáticos (ELISA) têm sido desenvolvidos e utilizados no diagnóstico da doença. Kits ImmunoComb Dot- ELISA para a detecção de anticorpos IgG contra E. canis estão disponíveis comercialmente (HARRUS et al., 2002). Oliveira et al., 2000 ao utilizarem o Kit Dot-Elisa em 52 cães com sintomatologia compatível com EMC, relataram uma frequência de animais sororeagentes em 92,32% dos cães estudados, apenas quatro cães, foram negativos através do emprego do Kit ImmunoComb, demonstrando uma boa sensibilidade do teste. Os resultados do dot-elisa são de fácil leitura por pessoal não treinado.

20 16 O kit Immunocomb (BIOGAL), é capaz de determinar anticorpos do tipo IgG específicos para o parasito. O teste pode ser realizado com sangue total ou soro, é de fácil execução, rápido, e a leitura é direta, observando-se a coloração final da reação (ANDEREG & PASSOS, 1999). Este teste é muito útil no monitoramento dos níveis de anticorpos, principalmente nas fases subclínica e crônica, onde é muito difícil o encontro da E. canis em esfregaço sanguíneo. Também é útil no monitoramento dos níveis de anticorpos pós tratamento (VIGINARD-ROSEZ et al., 2001). Após o tratamento, os títulos de anticorpos tendem a diminuir de forma lenta e gradual e o animal torna-se comumente negativo após 15 a 30 meses. Em áreas endêmicas, cães podem apresentar um alto título de IgG para E. canis, sem demonstrar a doença clinicamente, causando um aumento no número de falsos-positivos nessas regiões (BULLA et al., 2004). A principal desvantagem dos métodos sorológicos é a dificuldade de distinguir uma infecção atual de uma exposição prévia. Além disso, pode ocorrer reação cruzada com outras espécies de Ehrlichia (DAGNONE et al., 2001; WANER et al., 2001). A interpretação dos resultados de exames sorológicos deve considerar o curso da doença, a reatividade cruzada com outras espécies de Ehrlichia, infecções múltiplas com outros agentes transmitidos por carrapatos e, também, títulos de anticorpos persistentes após o tratamento. C) Isolamento O cultivo in vitro de E. canis vem sendo realizado em diversas partes do mundo (KEYSARY et al., 1996; UNVER et al., 2001). A E. canis pode ser cultivada in vitro em células DH82 (células histiocitárias de cães), linhagem originária de monócitos caninos, que foi adaptada em cultivo celular a partir de células obtidas de um caso de histiocitoma (WELLMAN et al., 1988). Até o momento, são vários os isolados de E. canis cultivados in vitro e geneticamente caracterizados na América do Norte e no Velho Mundo. No caso da América Latina, o isolamento in vitro de E. canis cães tem sido reportado apenas na Venezuela (UNVER et al., 2001) e no Estado do Rio de Janeiro (TORRES et al., 2002) e São Paulo (Figura 5) (AGUIAR et al., 2007b), no Brasil. Outras

21 17 linhagens celulares têm se mostrado útil para o isolamento in vitro de E. canis, como macrófago peritoneal canino (STEPHENSON & OSTERMAN, 1977), monócito primário canino (HEMELT et al., 1980), célula endotelial humana (DAWSON et al., 1993) e células macrofágicas de camundongos BALB/C (KEYSARY et al., 2001). Figura 5. Fotomicrografias de células DH82 provenientes de monocamada inoculada com o isolado de Jaboticabal, SP, apresentando mórulas de E. canis (setas) aos 28 dias pós-inoculação. Panótico rápido (Laborclin ); 100X. Fonte: AGUIAR et al., 2007b. No entanto, esta é uma técnica demorada não disponíveis na maioria dos laboratórios. Culturas também exigem instalações especializadas de laboratório e pessoal altamente treinado. D) Biologia Molecular O surgimento e desenvolvimento da biologia molecular foi um dos maiores passos das ciências biológicas durante o século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trouxe inúmeros benefícios para o desenvolvimento científico, destacando-se o sequenciamento de genomas, a expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de deonças infecciosas (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004). A técnica de amplificação de DNA de E. canis pela reação em cadeia da polimerase (PCR) têm promovido maior sensibilidade, especificidade e diagnóstico direto de confiança, podendo ser empregado com eficácia nas diferentes fases clínicas da infecção (NAKAGHI et al., 2008; HARRUS & WANER, 2011).

22 18 A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction) é uma metodologia que pode ser executada inteiramente In vitro sem o uso de células. A técnica da PCR foi desenvolvida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004). A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA-polimerase, a mesma que participa da replicação do material genético nas células. Esta enzima sintetiza uma sequência complementar de DNA, desde que um pequeno framento (o iniciador, oligonucleotídeo, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese. Os iniciadores definem a sequência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma determinada sequência DNA com bilhões de cópias (MULLIS, 1990). A técnica de PCR comumente é realizada em uma única etapa e é capaz de diferenciar as espécies de Ehrlichia, pela detecção de sequências específicas no DNA da bactéria. O desenvolvimento de ensaios moleculares para a detecção rápida e eficaz da EMC vem se mostrado eficaz. Um número limitado de genes alvos estão disponíveis para a detecção espécie específica de E. canis. Ensaios de PCR para E. canis tem como alvo mais comum o gene 16S RNA (ALVES et al., 2005; PINYOOWONG et al., 2008), mas outros alvos, incluindo P28 (NAKAGHI et al., 2010) e a protéina dsb (DOYLE et al., 2005) têm sido utilizados para a detecção de E. canis. Uma das variações da técnica de PCR é a nested-pcr, em que o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e utilizando-se este primeiro produto, segue-se à amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR. Alguns trabalhos ressaltam que a utilização da nested-pcr aumenta a sensibilidade da técnica (WEN et al., 1997; MURPHY et al., 1998). A nested-pcr é muito sensível e específica para a detecção de E. canis, sendo útil para o diagnóstico laboratorial (MURPHY et al., 1998) e para verificação da eficácia in vivo de antibióticos contra essa infecção (WEN et al.,

23 ; BRANGER et al., 2004). A nested-pcr em virtude da sua sensibilidade elevada, tem sido usado com frequência para a detecção de E. canis, (WEN et al., 1997; MURPHY et al., 1998; VINASCO et al., 2007; MACIEIRA et al., 2005; MYLONAKIS et al., 2009), porém como é realizado em duas etapas envolve custo e trabalho adicional e pode ser mais suscetível a falsos positivos como resultado de contaminação da primeira etapa. Uma análise comparativa entre a PCR (gene dsd) e a nested-pcr (16S rrna), realizada em 24 amostras de sangue de cães naturalmente infectados por E. canis, demonstrou que as duas técnicas são adequadas ao diagnóstico da EMC (MACHADO, 2004). As vantagens adicionais da PCR em etapa única são a redução de falsos-positivos devido à contaminação por amplicons da primeira etapa e a diminuição no tempo de execução da técnica, sendo também muito utilizada no diagnóstico da EMC (ALVES et al., 2005; SIARKOU et al., 2007; PINYOOWONG et al., 2008). A infecção concomitante de E. canis com outros hemoparasitos comumente é frequente em regiões endêmicas. Dessa forma, buscando facilitar o diagnóstico das principais hemoparasitoses caninas, protocolos que detectam mais de um agente etiológico em uma mesma reação têm sido desenvolvidos. KLEDMANEE et al. (2009) desenvolveram um Multiplex de PCR convencional capaz de realizar a detecção simultânea de E. canis, Babesia sp. e Hepatozoon canis, em uma mesma amostra de sangue canino. A técnica de amplificação do DNA a partir de amostras clínicas é importante para a detecção e diferenciação das espécies de Ehrlichia porque esses organismos crescem lentamente e em limitadas linhagens celulares e, ainda, há vários níveis de reação cruzada limitando a diferenciação sorológica entre várias espécies. A PCR possui a vantagem de detectar o DNA erliquial nos primeiros dias pós-infecção e é bastante específica, desde que usados oligonucleotideos que amplifiquem o DNA da espécie investigada (SUMMER et al., 1997). Utilizando PCR, é possível isolar DNA e identificar E. canis a partir de amostras de sangue, baço, linfonodos, rins, fígado, médula óssea (GAL et al., 2008) e soro (MYLONAKIS et al., 2009). A PCR convencional é um método que possui alta especificidade e sensibilidade, mas possui algumas limitações, como a possibilidade de

24 20 contaminação com o brometo de etídio no processamento pós amplificação, os resultados não são expressos em números (não é quantitativa) e a discriminação é baseada apenas no tamanho do fragmento. Além da possibilidade de ocorrer resultados falso-positivos ocasionados por contaminação do ambiente de trabalho por DNA amplificado em virtude da alta sensibilidade do método de PCR. E estas restrições podem ser minimizadas ou até mesmo evitadas com o uso da PCR em Tempo Real (DO CARMO & FIORINI, 2007). A inovação tecnológica resultante da PCR, denominada de PCR em Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clínicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em relação à PCR que apresenta somente resultados qualitativos (NOVAIS & PIRES- ALVES, 2004). A PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que contém um termociclador acoplado a um sistema ótico para a excitação da fluorescência e captura da emissão, além de um computador para aquisição de resultados e análise final da reação. Durante a PCR em Tempo Real, o acúmulo de amplicons é detectado em "tempo real", para cada ciclo da reação, por meio da excitação de fluorocromos que marcam sondas seqüênciaespecíficas ou primers usados na reação (HEID et al., 1996; NOVAIS & PIRES- ALVES, 2004). O PCR em tempo real é mais sensível do que PCR convencional, além de permitir a quantificação da carga bacteriana. Esta técnica de diagnóstico tem sido utilizada para quantificar a carga de Ehrlichia em cães infectados naturalmente e experimentalmente (BANETH et al., 2009). A probabilidade de contaminação na PCR em tempo real é menor do que a PCR convencional. Dessa forma, a PCR em tempo real vem se tornando rapidamente o método preferencial para o diagnóstico de E. canis (HARRUS & WANER, 2011). A detecção de E. canis pelo PCR em tempo real torna-se interessante uma vez que esta técnica permite a quantificação e rapidez de

25 21 resultado, pois não requer a detecção em gel de eletroforese, necessário na análise da PCR convencinal. A PCR em tempo real realiza a quantificação dos ácido nucléicos de maneira precisa e com maior reprodutibilidade, porque determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Threshold (CT) (Figura 6). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência. A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que aumenta na proporção direta da quantidade de produto da PCR. Os compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR Green e o TaqMan (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004). Figura 6. Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT-Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: Não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos. Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, O desenvolvimento de protocolos Multiplex de PCR em tempo real é possível e pode ser utilizado na detecção simultânea e quantificação

26 22 de diversos patógenos na mesma amostra, diminuindo assim o tempo de trabalho e o custo da reação. No entanto, comumente ocorre uma redução da sensibilidade e precisão (FERRIE et al., 1992). Existem duas principais abordagens para a detecção quantitativa de patógenos usando PCR em tempo real: uma com compostos fluorescentes inespecíficos tais como SYBR Green e outra com sondas específicas, tais como sondas TaqMan (LIVAK et al., 1995). O composto florescente SYBR Green se liga entre a fita dupla de DNA (Figura 7) e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescência verde. No começo da amplificação, a mistura da reação contém o DNA desnaturado, os iniciadores e o SYBR Green (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004). Figura 7. Molécula de SYBR Green entre a fita dupla de DNA. Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004 As vantagens da utilização do SYBR Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilidade. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante a reação, incluindo produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo (NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004). O composto fluorescente TaqMan é uma sonda (fragmento de DNA marcado usado para hibridizar outra molécula de DNA) utilizada para detectar sequências específicas nos fragmentos de DNA amplificados na PCR. Por ser mais específica que o SYBR Green, a sonda TaqMan é a mais utilizada no desenvolvimento de protocolos de PCR em tempo real para o diagnóstico da EMC (DOYLE et al., 2005; BANETH et al., 2009; PELEG et al., 2010).

27 23 A sonda TaqMan apresenta em uma extremidade um floróforo, e na outra extremidade um quencher (molécula que aceita energia do floróforo na forma de luz e a dissipa na forma de luz ou calor) como mostrado na Figura 8. Figura 8. Ilustração de uma sonda TaqMan. F- Fluoróforo e Q- Quencher. Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, Os podutos da reação são detectados pela fluorescência gerada após a atividade exonuclease 5 3 da Taq DNA polimerase. Durante a PCR em tempo real a sonda TaqMan hibridiza com a sequência da fita simples de DNA complementar alvo para amplificação. No processo de amplificação a sonda TaqMan é degradada devido à atividade exonuclease 5 3 da Taq DNA polimerase, separando o quencher da molécula fluorescente durante a extensão. A separação do fluoróforo do quencher resulta em um aumento da intensidade de fluorescência (Figura 9). Assim, durante o processo de amplificação a emissão de luz é aumentada de forma exponencial. Esse aumento da fluorescência ocorre apenas quando a sonda hibridiza e quando a amplificação da sequência alvo é estabelecida (HEID et al., 1996; NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004).

28 24 Figura 9. PCR em Tempo Real com sonda TaqMan Fonte: NOVAIS & PIRES-ALVES, 2004 A reação com TaqMan é considerada um método sensível para determinar a presença ou ausência de sequência específicas. Vários protocolos de multiplex de PCR em tempo real já estão disponíveis para a detecção simultânea de diversos patógenos. Porém, protocolos de PCR em tempo real e Multiplex PCR para a detecção de E. canis e detecção específica de espécies do gênero Ehrlichia ainda são muito escassos. O primeiro multiplex de PCR em tempo real capaz de detectar e discriminar três espécies de Ehrlichia clinicamente importantes em uma única reação de amplificação do gene da proteína (dsb) foi descrito por Doyle et al. (2005). O multiplex desenvolvido possui uma satisfatória sensibilidade analítica e é capaz de distinguir especificamente amplicons de E. chaffeensis, E.ewingii e E. canis, detectando também coinfecções em uma mesma amostra. Este protocolo inovador, é útil para o diagnóstico e tratamento tanto de animais de companhia como de pacientes humanos infectados, podendo também ser utilizado em estudos epidemiológicos.

29 25 Baneth et al., em 2009, desenvolveram um protocolo de PCR em tempo real usando a região 16S rrna de E. canis. As sondas e primers desenhados foram espécie específica para E. canis e apresentou sensibilidade satisfatória. Peleg et al., em 2010 ao analisarem a importância da detecção simultânea de mais de um hemoparasito em uma mesma amostra devido a redução dos custos e tempo de execução da técnica descreveram um protocolo de PCR em tempo real capaz de detectar simultaneamente E. canis e B. canis vogeli, os quais são dois importantes patógenos de cães transmitidos pelo mesmo vetor, R. sanguineus. É inegável a contribuição dos ensaios de biologia molecular, tais como PCR em tempo real para o diagnóstico precoce da EMC, bem como para o desenvolvimento de estudos epidemiológicos na identificação de agentes infecciosos potencialmente letais e de difícil cultivo. A necessidade de desenvolvimento de métodos de diagnóstico altamente sensíveis é cada vez maior em decorrência da importância de um diagnóstico precoce. E o emprego de testes de diagnóstico rápido e altamente sensível e específico capaz de detectar E. canis, incluindo co-infecções de E. canis com outros hemoparasitos em uma mesma amostra é extremamente valioso para o diagnóstico eficaz, o qual servirá para sustentar o emprego da terapêutica adequada e contribuirá para o prognóstico da doença.

30 26 CONSIDERAÇÕES FINAIS A Erliquiose Monocítica canina é uma doença multissistêmica potencialmente fatal para os cães, sendo frequente nas regiões tropicais e subtropicais. É transmitida pelo carrapato R. sanguineus, o qual é abundante no Brasil e ocorre durante todo o ano, contribuindo dessa forma para a manutenção da E. canis no país. O controle da infestação por carrapatos em cães é muito difícil e representa um grande desafio para os proprietários e clínicos veterinários. A EMC é endêmica no Brasil e por apresentar alta letalidade quando não tratada, necessita de um diagnóstico rápido e preciso para que o tratamento específico seja instituído. Porém, o diagnóstico da EMC é extremamente complicado e trabalho e requer o uso em conjunto de várias técnicas de diagnóstico. Avaliação das manifestações clínicas, testes sorológicos e moleculares são todos importantes e necessários para o diagnóstico preciso dessa doença. Os sinais clínicos da doença são inespecíficos e comuns a inúmeras outras doenças transmitidas por carrapatos e a sorologia não é capaz de diferenciar uma infecção atual de uma exposição prévia, além de apresentar reação cruzada entre as espécies do mesmo gênero. Avanços na área de biologia molecular têm proporcionado métodos altamente específicos e sensíveis, para identificação direta do agente etiológico da EMC. Entre estas técnicas, destaca-se a reação em cadeia da polimerase (PCR), que possibilita um diagnóstico preciso e seguro. Vários protocolos de PCR têm sido desenvolvidos para o diagnóstico da infecção por E. canis em cães, sendo capazes de indicar uma infecção ativa e identificar a espécie infectante, constituindo importantes ferramentes de diagnóstico da doença. Dessa forma, as técnicas moleculares surgem como metodologia alternativa que sobrepõem as limitações das técnicas convencionais de diagnóstico, identificação e diferenciação de microrganismos.

31 27 REFERÊNCIAS 1. ACCETTA, E.M.T. Ehrlichia canis e Anaplasma platys em cães (canis familiaris, linnaeus, 1758) trombocitopênicos da região dos lagos do Rio de Janeiro f. Dissertação (Mestrado em medicina veterinária), Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica. 2. AGUIAR, D. M.; GUACYARA T. CAVALCANTE, G.T.; ADRIANO PINTER, A.; SOLANGE M. GENNARI,S.M.; CAMARGO, L.M.A.;LABRUNA, M.B. Prevalence of Ehrlichia canis (Rickettsiales: Anaplasmataceae) in dogs and Rhipicephalus sanguineus (Acari: Ixodidae) ticks from Brazil. Journal of Medical Entomology, v. 44, n. 1, p , 2007a. 3. AGUIAR, D.M.; SAITO, T.B.; HAGIWARA, M.K.; MACHADO, R.Z.; LABRUNA, M.B. Diagnóstico sorológico de erliquiose canina com antígeno brasileiro de Ehrlichia canis. Ciênc. Rural., v. 37, p , 2007b. 4. ALMOSNY, N.R.P; MASSARD, C.L. Erliquiose em pequenos animais e como zoonose. In: ALMOSNY, N.R.P. Hemoparasitoses em Pequenos Animais Domésticos e como Zoonoses. 1 ed. Rio de Janeiro: L.F. Livros Ltda., p ALMEIDA, P.S.R.; SADDI, V.A. Monitoramento de doença residual mínima em leucemia mielóide crônica por PCR em tempo real. Rev. bras. hematol. hemoter., v.29, n.4, p , ALVES, L. M.; LINHARES, G. F. C.; CHAVES, N. S. T.; MONTEIRO, L. C.; LINHARES, D. C. L. Avaliação de iniciadores e protocolo para o diagnóstico da pancitopenia tropical canina por PCR. Ciên Animal Bras. Goiânia, v. 6, n. 1, p , ANDEREG, P. I.; PASSOS, L. M. F. Erliquiose canina Revisão. Clinica Veterinária, v. 4, n. 19, p , BANETH, G.; HARRUS, S.; OHNONA, F.S.; SCHLESINGER, Y. Longitudinal quantification of Ehrlichia canis in experimental infection with comparison to natural infection. Veterinary Microbiology, V.136, p , BORIN, S.; CRIVELENTI, L.Z; FERREIRA, F.A. Aspectos epidemiológicos, clínicos e hematológicos de 251 cães portadores de mórula de Ehrlichia spp. naturalmente infectados. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.61, n.3, p , BRANGER, S.; ROLAIN, J. M.; RAOULT, D. Evaluation of Antibiotic Susceptibilities of Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, and Anaplasma phagocytophilum by Real-Time PCR. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v.48, n.12, p , DOI: /AAC