INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO AMAZONAS

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1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO AMAZONAS RENATA DA SILVA GALVÃO MANAUS 2013

2 II RENATA DA SILVA GALVÃO INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO AMAZONAS Dissertação apresentado ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção de Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientadora: Profª Cíntia Mara Costa de Oliveira Co-Orientador: Profª Wornei Silva Miranda Braga MANAUS 2013

3 Ficha Catalográfica Galvão, Renata da Silva. G182i Investigação de mutações de resistência associadas aos antivirais em isolados de pacientes portadores dos vírus da hepatite B no Estado do Amazonas / Renata da Silva Galvão. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, f. : il. Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical UEA/FMT e Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), Orientador: Profa. Dra. Cintia Mara Costa de Oliveira. Co-orientador: Prof. Dro. Wornei Silva Miranda Braga. Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária da Escola Superior de Ciências da Saúde UEA Sheyla Lobo Mota. 1. Hepatite B Mutação 2. Resistência Virus Hepatite B I. Título.

4 III FOLHA DE JULGAMENTO INVESTIGAÇÃO DE MUTAÇÕES DE RESISTÊNCIA ASSOCIADAS AOS ANTIVIRAIS EM ISOLADOS DE PACIENTES PORTADORES DO VÍRUS DA HEPATITE B NO ESTADO DO AMAZONAS RENATA DA SILVA GALVÃO Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Prof. Cintia Mara Costa de Oliveira, Dra Presidente Prof. Cristovão Alves da Costa, Dr. Membro Prof. Wornei Silva Miranda Braga, Dr. Membro

5 IV DEDICATÓRIA Ao Senhor Jesus, por que Dele, pra Ele e por Ele são todas as coisas.

6 V AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela oportunidade de realizar mais um sonho, por colocar na minha vida pessoas maravilhosas para mi ajudar, e por estar comigo a todo instante, me dando força, sabedoria e inteligência. A minha família querida que é minha base. Agradeço a minha mãe Rosa Meire, pelas constantes orações e pelo seu amor incondicional, compreensão e apoio. Aos meus irmãos Renato, Leonardo e Paulo César, pelo apoio e incentivo. Ao meu padrasto Gotardo Barbosa, pela dedicação e amizade. Agradeço ao meu pai Julio César, in memorian, a quem prometi que chegaria até o fim deste trabalho. As minhas tias e meus pastores pelas orações e carinho. A minha querida Orientadora Cíntia Mara, pelo incentivo, ensinamentos, amizade e dedicação. Ao meu co - orientador Dr.Wornei Braga, pelo apoio, orientações e contribuições neste trabalho. As minhas colaboradoras Márcia Castilho, Heline Lira, Joelma Martins e Suellen Silva, pela ajuda no laboratório, pela amizade e incentivo. As minhas amigas da Gerência de Virologia Liane Calado, Elizabeth Galusso, Karol Matos pela amizade, incentivo para conclusão deste trabalho. As meus amigos da Gerência de Patologia, Carlos, Sandra Caranhas, Sandra Heline, Cristiana, Lilian, pelo apoio, incentivo e amizade. Ao Dr.Araújo pelo seu apoio, pela oportunidade, pelas orientações e amizade. A minha amiga Carolina Marinho que me ajudou e incentivou desde o principio. Aos Pesquisadores Dr. Felipe Naveca e George do Instituto Leônidas Maria Deane Fiocruz/AM; A Universidade do Estado do Amazonas em proporcionar o Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical. A Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela infra estrutura para realização desde trabalho. A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CAPES, pela bolsa de estudo.

7 VI EPÍGRAFE E disse ao homem: Eis que o temor do Senhor é a Sabedoria e o aparta-se do mal é a Inteligência. (Jó 28:28)

8 VII RESUMO A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) representa um importante problema de Saúde Pública mundial, um dos maiores desafios enfrentados durante o tratamento da infecção crônica pelo VHB é o surgimento de vírus resistentes às drogas usadas. O surgimento de mutações em regiões especificas do gene da DNA polimerase têm sido extensivamente correlacionadas à resistência aos anti-virais, uma vez que possibilita o reaparecimento do DNA do vírus no soro, principalmente em indivíduos submetidos a terapia prolongada. Objetivo Geral: Neste estudo, nos propomos investigar mutações de resistência no gene da transcripatase reversa (RT) do VHB e caracterizar os genótipos em amostras de pacientes tratados e não tratados com antivirais, atendidos em uma Unidade Terciária de Saúde referência da região norte do Brasil. Uma região de 600pb da RT foi amplificada pela PCR e diretamente sequenciada. Resultados: Foram sequenciadas 113 amostras, destas quatro (3,54%) apresentaram a mutação rtm204i tanto na região YMDD como no gene S ((1 (rta80v/rtm204i), 2 (rts202l/rtm204i), 4 (rts202q/rtm204i) e 13 (rts202i/rtm204l)). Os genótipos identificados foram A 71,68% (81/113), D 15,04% (17/1130) e F 13,28% (15/113). Dos 26 pacientes que apresentaram mutações de resistência na região rt do VHB, 88,46% eram pacientes não tratados. Verificou-se também que 8,8% das sequencias virais analisadas apresentavam mutações de escape de vacina. Conclusão: Esses resultados mostram que embora as estratégias de prevenção e controle sejam eficazes há necessidade de investigação constante e exaustiva sobre epidemiologia molecular do VHB na região. Palavras Chaves: Resistência, Hepatite B, Mutação, Genótipo.

9 VIII ABSTRACT Infections by Hepatitis B virus (HBV) continue to be a public health burden worldwide. One of the biggest challenges occurring during the treatment of chronic HBV infections is the emerging of resistant viruses to the drugs prescribed. The mutations that emerged in specific regions of the gene coding for DNA polymerase were extensively correlated to resistance to the antiviral drugs, since it enables the reappearance of viral DNA in serum, especially in patients undergoing prolonged therapy. Objective: The aim of this study was to search for mutations conferring for resistance to anti-viral drugs in the gene coding for reverse transcriptase (RT) of the HBV and to denote the HBV genotypes in samples of patients with HBV undergoing either treatment or not from the reference tertiary health unit of the North Region of Brazil. A fragment of 600 base pairs of the gene RT was amplified and directly sequenced. Results: A total of 113 samples was nucleotide sequenced. In four of these samples, the mutation rtm204i (3,54%) was detected in the overlapping region known as the YMDD of the gene S ((1 (rta80v/rtm204i), 2 (rts202l/rtm204i), 4 (rts202q/rtm204i) and 13 (rts202i/rtm204l)). The HBV genotypes identified were the following: A 71,68% (81/113), D 15,04% (17/1130) and F 13,28% (15/113). Of the 26 patients presenting resistant mutations in the RT region of the HBV, 88,46% are patients naïve of treatment. Of note, 8,8% of the sequences analyzed showed escaped mutations to vaccine. Conclusion: This study highlights that to have an efficient prevention and controls strategy, it is necessary to continuously perform molecular epidemiology of the HBV in the region. Key words: Resistence, Hepatitis B, Mutation, Genotype

10 IX LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura do VHB (Partícula de Dane)... 2 Figura 2: Genoma do Vírus da Hepatite B... 3 Figura 3: Países ou áreas de risco para Hepatite B... 4 Figura 4: Diagrama esquemático da estrutura de leitura aberta de polimerase do VHB ilustrando os quatro domínios funcionais e os subdomínios 7 catalíticos A-G Figura 5: Mutações de resistência aos medicamentos utilizados para o tratamento da hepatite B crônica Figura 6: Fluxograma do processamento das amostras no estudo Figura 7: Quadro de mutações analisadas no Genafor Figura 1: (Artigo) Sequencias parciais de aminoácidos do gene S, região que codifica antígeno HBsAg, amostras identificadas de 001 a Figura 2: (Artigo) Reconstrução filogenética de sequencias nucleotidicas correspondente a 600 pb do gene de superfície do VHB... 35

11 X LISTA DE TABELAS Tabela 1: (Artigo) Tabela 2: (Artigo) Tabela 3: (Artigo) Características da população do estudo Caracterização de Mutações da Região da Polimerase(rt) e gene S Mutações na polimerase, região do YMDD e gene S do VHB... 33

12 XI LISTA DE ABREVIATURAS HBcAg - antígeno do core do vírus da hepatite B HBeAg - antígeno e do vírus da hepatite B HBsAg - antígeno de superfície do vírus da hepatite B HBxAg - antígeno X do vírus da hepatite B ALT(TGP) - alanina amino transferase Anti- HBc - anticorpo contra o antígeno do core do vírus da hepatite B Anti-HBe - anticorpo contra o antígeno e do vírus da hepatite B Anti-HBs - anticorpo contra o antígeno de superfície do vírus da hepatite B AST/TGO - aspartato amino transferase dntps - trifosfato de desoxinucleotídeos DNA - Ácido desoxirribonucleico EcoRI - Enzima endonuclease FMT-HVD - Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado gag - Proteína presente no genoma do vírus HIV HCC - Hepatocarcinoma HIV - Vírus da imunodeficiência humana IgG - Imunoglobulina da classe G IgM - Imunoglobulina da classe M Kg - (= kbp) = kilo (quilo) pares de bases = bp LPDE - Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas Mg - Miligrama MgCl2 - Cloreto de magnésio mm - Milimolar ml - Unidade de medida eme-ele NB3 - Laboratório Nível de segurança 3

13 XII ng - Nanograma pmol - Picomol PCR - Reação em cadeia da polimerase RNA - Ácido ribonucleico U - Unidade UI/L - Unidade internacional por litro VHB - Vírus da Hepatite B µl - Microlitro

14 XIII SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO O Vírus da Hepatite B Epidemiologia Genótipos, subgenótipos e subtipos do vírus da hepatite B Diagnóstico laboratorial da infecção do vírus da hepatite B Tratamento para Hepatite B Mutação do genoma do vírus da hepatite B Mutação na região da polimerase Resistência Moleculares aos Análogos e Nucleó(t)deos Mecanismos moleculares de resistência a antivirais OBJETIVOS Geral Específicos MATERIAL E MÉTODOS Modelo de Estudo Local de Estudo Aspectos Éticos População de Estudo Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão Procedimento para seleção de pacientes Processamento da Amostra no Estudo Procedimentos de laboratório Obtenção do DNA e Carga viral do VHB Reação da polimerização em cadeia Seqüenciamento Análise das seqüencias Genotipagem Análises de mutações de resistência antiviral HepSeq... 22

15 XIV Genafor Análises Estatística RESULTADOS CONCLUSÃO REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS ANEXO -1 Parecer aprovação Comitê de Ética 52 ANEXO -2 Termo de Consentimento Livre E Esclarecido 53 ANEXO -3 Questionário 55 ANEXO -4 Instruções ao Autor (Normas da Revista) 57

16 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 O Vírus da Hepatite B O vírus da hepatite B é classificado como membro da família Hepadnaviridae e gênero Orthohepadnavirus. Todos os membros da família são hepatotrópicos e compartilham características estruturais e funcionais. Os demais membros do gênero Orthohepadnavirus infectam mamíferos inferiores como marmotas, esquilos e macacos. Todos os hepadnavírus apresentam uma gama de possíveis hospedeiros restrita, além do homem, o VHB somente é transmissível aos chimpanzés. Os hepadnavírus podem incorporar seu genoma ao núcleo da célula hospedeira, mas diferentemente dos retrovírus, tal permanência não constitui etapa essencial da sua replicação. 23,29,55 As demais características comuns aos hepadnavírus são 29,51 a) Possuem os menores genomas virais de DNA conhecidos; b) Genoma constituído de DNA de fita dupla (3 a 3,3kb) contendo região de fita simples de extensão variável e polaridade fixa; c) Replicação com envolvimento de transcrição reversa; d) Partículas virais esféricas (40 a 47nm) e envelopadas, com nucleocapsídeo de simetria icosaédrica; e) Produção excessiva do antígeno de superfície; f) Elevada concentração de partículas virais completas e incompletas no sangue e, em menor concentração, em outros fluidos corpóreos; g) Atividade DNA polimerásica associada ao vírion; h) Ocorrência freqüente de infecção persistente; i) Associação de infecção crônica com desenvolvimento de Carcinoma Hepatocelular -HCC. O VHB diferencia-se de outros vírus humanos por encontrar-se em vasto título de partículas subvirais viral no soro dos indivíduos infectados. Estas partículas consistem somente das proteínas superficiais do vírus e pequenas quantidades de lipídios, apresentamse esféricas (20 nm de diâmetro) ou filamentosas (20 nm de diâmetro e comprimento variável) e podem ser encontradas em quantidades que podem atingir partículas/ml (1 mg/ml). O vírion apresenta-se esférico (partículas com 42 47nm) e possui uma bicamada superficial, sendo a mais externa constituída pelo envelope viral e a mais interna pelo nucleocapsídeo (Core), contendo uma DNA polimerase RNA dependente (ou seja, uma transcriptase reversa) 23,26 (Figura 1)

17 2 Figura 1: Estrutura do VHB (Partícula de Dane). (adaptado de 2002 James A. Perkins apud Almeida, 2007). A microscopia eletrônica forneceu a visão inicial da estrutura do genoma do VHB. Nos vírions, o genoma apresenta-se circular, constituído por uma fita circular parcialmente dupla de DNA e associado a DNA polimerase. O VHB apresenta um dos menores genomas dentre os vírus conhecidos (aproximadamente 3200 nucleotídeos) e a numeração da seqüência nucleotídica baseia-se no sítio de clivagem da enzima de restrição EcoRI ou em sítios homólogos, caso o sítio da EcoRI esteja ausente. Outros métodos de numeração também são empregados, baseados no códon inicial da proteína Core ou na primeira base do RNA prégenômico 22,26 O genoma, como encontrado nos vírions, é constituído de uma fita negativa ( antisense ) longa apresentando extremidades 5 e 3 definidas e redundância terminal de 7 a 9 bases, e uma fita positiva ( sense ) mais curta, com extensão variável. Em virtude do modo de maturação do genoma, a porção N-terminal da polimerase viral é encontrada ligada à extremidade 5 da fita negativa. Portanto, a fita negativa não é covalentemente fechada. A estrutura circular é mantido pelo pareamento de bases entre as fitas negativas e positivas. A extremidade 5 da fita positiva contém um trecho de RNA (18 nucleotídeos) derivado do RNA pré-genômico e que representa o sítio de início de síntese da segunda fita de DNA. In vivo, as

18 3 partículas do VHB são secretadas das células infectadas antes que a fita dupla esteja completa, restando uma região com 600 a 2100 nucleotídeos de DNA de fita simples nos capsídeos maduros. 22,26 Figura 2: Genoma do Vírus da Hepatite B. 23 No genoma VHB são identificadas quatro fases de leitura aberta (ORF s) definidas e sobrepostas parcialmente, que resultam na transcrição e tradução de sete diferentes proteínas, através da utilização de códons iniciais variáveis: S, C, P e X. O gene S, inclui a região pré-s1, pré-s2 e S. Todos os pares de bases no genoma do VHB estão envolvidos na codificação de, no mínimo, uma proteína viral: a região S codifica proteínas do antígeno de superfície encontradas no envelope viral. O Gene C, constituído pela região pré-c e C, é responsável por codificar os polipeptídios que constituem o nucleocapsídeo viral, antígenos HBcAg e HBeAg. O Gene P codifica a DNA polimerase viral e o gene X codifica a proteína X (HBx), que é um potente ativador de transcrição. 28 A proteína X é imprescindível para replicação e disseminação in vivo do VHB, ela atua como um transativador transcricional dos genes virais e uma variedade de genes do hospedeiro. A modulação pela HBx de transcrição gênica afeta a replicação viral e a função dos pontos de verificação do ciclo celular do hepatócito. A HBx está relacionada com a patogenia do hepatocarcinoma em pacientes infectados com VHB. 26,30

19 4 1.2 Epidemiologia A infecção pelo VHB tem uma distribuição mundial. Estima-se que, atualmente, mais de 2 bilhões da população mundial tenha sido infectada. Destes, aproximadamente 360 milhões são cronicamente infectadas e em risco de doença grave e morte por cirrose e carcinoma hepatocelular, doenças que são estimados em causar mortes a cada ano no mundo. Os seres humanos são os únicos reservatórios do VHB. O vírus é altamente contagioso e é transmitido por exposição percutânea e permucosa, exposição a sangue infectado e outros fluidos corporais (isto é, fluido seminal e vaginal). Modos comuns de transmissão incluem-mãe para o bebê, de criança para criança, práticas inseguras, transfusões de sangue e contato sexual. 64 Figura 3: Países ou áreas de risco para Hepatite B (World Health Organization 2012). O período de incubação é de 75 dias, em média, mas podem variar de cerca de 30 a 180 dias. VHB pode ser detectado no soro dias após a infecção e persistem por período variável de tempo. Em áreas com alta prevalência de hepatite B (> 8% da população HBsAg positivo), até 20% podem ser cronicamente infectadas. Com base nos critérios sorológicos, alta prevalência de infecção crônica por VHB é encontrada em áreas sub-saariana, sudeste da Ásia, no Mediterrâneo Oriental, sul e oeste da ilhas do Pacífico, Amazonia Ocidental e em partes do Caribe. 65,36

20 5 Hepatite crônica é moderadamente prevalente >2% a <8% da população HBsAgpositivo no centro-sul e ao sul-oeste da Ásia, leste e sul da Europa, Federação Russa e maior parte da América Central e América do Sul. Na Austrália, Nova Zelândia, Europa setentrional e ocidental, e América do Norte, a prevalência de infecção crônica por VHB é baixa (<2% da população HBsAg-positivo). Em áreas de alta endemicidade, VHB é mais comumente transmitido de mãe para filho no momento do nascimento, ou de pessoa para pessoa no início da infância. Em países com baixa endemicidade do VHB, forma sexual e do uso de agulhas contaminadas, especialmente entre usuários de drogas injetáveis, são as principais vias de infecção. No entanto, a transmissão perinatal pode ser responsável por 15% das mortes relacionadas com o VHB, mesmo em áreas de baixa endêmicidade. 64,14,58, Genótipos, subgenótipos e subtipos do vírus da hepatite B O desenvolvimento de vacinação, terapia antiviral e técnicas de biologia molecular levaram ao surgimento e descoberta de variantes do VHB, as quais vêm demonstrando importância clínica crescente. A variabilidade genética do VHB é observada tanto como uma expressão da evolução dos genótipos virais, ou seja, o reflexo da divergência do genoma viral na população portadora, quanto por meio do surgimento de mutações em cada indivíduo isoladamente analisado. 63,35 O antigéno de superfície da hepatite B (HBsAg) é uma lipoproteína do envelope viral que é produzido em excesso visível e circula no sangue com forma esférica e de partículas tubular de 22 nm de tamanho. O antigeno HBsAg inclui um epítopo neutralizante, chamado determinante. Outros dois HBsAg determinantes, d/y e W/R, têm sido descritos, definindo outros quatro subtipos: adw, adr, ayw e ayr. Certas substituições de aminoácidos dentro deste epítopo, particularmente na região dos aminoácidos , pode tornar um determinante irreconhecível pelos testes de triagem comuns bem como por anticorpos induzidos pela vacina. 64 Apesar do genoma do VHB, ser constituído de DNA de fita dupla, é replicado através de um RNA intermediário, tornando suscetível a elevada taxa de mutações. As polimerases dos hepadnavírus não possuem a capacidade de verificação e excisão de bases incorporadas erroneamente e apresentam taxas de mutação da ordem de 10-4 a 10-5 substituições de bases/sítio/ano, ou seja, similares à taxa do gene retroviral gag. 24,32

21 6 Em 1988, Okamoto e colaboradores sugeriram que a variabilidade genética do VHB poderia ser utilizada na geração de um sistema de classificação que substituísse ou complementasse a classificação sorológica vigente. No presente, são reconhecidos dez grupos genômicos (ou genótipos) do VHB, designados A-J, definidos arbitrariamente como portadores de divergência nucleotídica completa superior a 8%. 5,37,46,48,59,70,71 Diversos estudos têm indicado padrões característicos quanto à distribuição geográfica dos genótipos do VHB, os quais somente são conhecidos parcialmente devido ao número não representativo de amostras de algumas partes do globo. O genótipo A, além de pandêmico, é mais prevalente na América do Norte, Europa (excetuando região Mediterrânea) e África Central e Meridional. Os genótipos B e C são característicos dos países asiáticos. O genótipo D, apesar de mundialmente distribuído, é mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio e o genótipo E predomina entre portadores africanos. 1,28,37,47 O genótipo F é considerado próprio dos residentes nas Américas, verificando-se uma associação forte entre este genótipo e populações nativas das Américas Central e do Sul. O genótipo F apresenta a mais elevada divergência entre todos os genótipos 21,47 Os genótipos descritos mais recentemente G, H, I e J, 70,71 foram encontrados na América do Norte e França 59 e América Central e México 5 respectivamente. No Brasil, os estudos de levantamento da distribuição regional dos genótipos do VHB têm sido raros e com número reduzido de amostras. Os genótipos A, D e F foram descritos entre portadores crônicos acompanhados ambulatorialmente no Rio de Janeiro e entre pacientes submetidos à hemodiálise em Goiânia e Santa Catarina. 43,44,61,62 Entre pacientes paulistas, os genótipos A, D e F são encontrados, majoritariamente, em indivíduos de ascendência ocidental, enquanto os portadores dos genótipos B ou C têm sido descritos entre aqueles de origem asiática 56 Entre indígenas da região Amazônica, apenas o genótipo F foi encontrado nas tribos que não mantinham contato com não-índios, enquanto que o genótipo A foi encontrado nas tribos com intenso contato com estes. 12 Outros estudos conduzidos em portadores do HBsAg, naturais da Amazônia brasileira, revelou maior prevalência do genótipo A, seguido do genótipo F e, em menor freqüência o genótipo D e C. 49,50,72

22 7 1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção do vírus da hepatite B Os testes de função hepática, especialmente os níveis séricos da ALT/TGP e AST/TGO apesar de serem indicadores sensíveis do dano do parênquima hepático, não são específicos para hepatite. Os exames específicos para o diagnóstico do tipo de infecção são os sorológicos e os de biologia molecular. 39 Para hepatite B aguda: o marcador sorológico HBsAg, é o primeiro que aparece no curso da infecção e declina a níveis indetectáveis em até 24 semanas. O Anti-HBc IgM é marcador de infecção recente, encontrado no soro até 32 semanas após a infecção. O Anti- HBc Total é marcador presente nas infecções agudas pela presença de IgM e crônicas pela presença de IgG, que indica contato prévio com vírus. O HBeAg é marcador de replicação viral, sua positividade indica alta infecciosidade. O Anti-HBe surge após desaparecimento do HBeAg, indica o fim da fase replicativa. Anti-HBs é o único anticorpo que confere imunidade ao VHB, está presente no soro após o desaparecimento do HBsAg, sendo indicador de cura e imunidade, está presente isoladamente em pessoas vacinadas. 39 Na Hepatite B crônica a interpretação dos marcadores sorológicos são: HBsAg, presente por mais de 24 semanas, o HBeAg enquanto ocorrer alta replicação viral e o anticopo Anti-HBe positivo, sua presença sugere redução ou ausência de replicação viral exceto nas cepas com mutação pré-core (não produtoras de proteína e ). 39,8 O DNA do VHB pode ser detectado precocemente na fase aguda da hepatite viral B, persistindo no soro em altos níveis nas hepatites crônicas acompanhado do HBsAg, e em casos de hepatites fulminantes, quando o HBsAg estiver ausente (Silva e Carrilho, 2005). Os testes de carga viral para o VHB podem ter o resultado relatado em números absolutos ou log10. Sendo que o resultado do exame também pode ser relatado em cópias por ml de amostra ou em unidades internacionais por ml (UI) de amostra. As UI surgiram a partir da necessidade de padronização da quantificação, já que uma amostra apresentava resultados consistentemente diferentes quando se usavam metodologias diferentes. Foram então introduzidos padrões de DNA-VHB da Organização Mundial de Saúde. Desta forma são produzidos pelo National Institute for Biological Standards

23 8 and Control (NIBSC) controles feitos a partir de amostras positivas para o DNA-VHB com títulos altos de vírus Tratamento para Hepatite B Até recentemente, as opções farmacológicas para o tratamento da hepatite B crônica (HBC), preconizadas nos Protocolos Clínicos e Diretrizes Terapêuticas para Medicamentos de Alto Custo do Ministério da Saúde, eram restritas ao interferon e à lamivudina. Atualmente, três medicamentos antivirais (tenofovir, entecavir e adefovir) ampliam as alternativas de tratamento para o controle da ação do VHB. 40,41 No tratamento o principal objetivo é reduzir o risco de progressão da doença hepática e de seus desfechos primários, especificamente cirrose, hepatocarcinoma e, conseqüentemente, o óbito. Desfechos substitutivos ou intermediários, tais como nível de VHB-DNA, de enzimas hepáticas e marcadores sorológicos, estão validados e têm sido utilizados como parâmetros para inferir a probabilidade de benefícios da terapêutica em longo prazo, haja vista que a supressão da replicação viral de maneira sustentada e a redução da atividade histológica diminuem o risco de cirrose e de hepatocarcinoma. 41 O intérferon α (IFN α) foi à primeira droga aprovada para tratamento da infecção crônica pelo VHB. O IFNα possui atividade antiviral e imunomoduladora e ambas as ações mostram-se importantes no tratamento dessa virose. Realizou-se a maioria dos estudos clínicos com essa medicação, embora o IFNβ, que possui efeito antiviral predominante, também seja ativo. A terapia com IFNα deve ser considerada em pacientes com hepatite crônica B, com evidências de replicação viral (HBeAg e VHB-DNA positivos) e doença hepática ativa, (aminotranferases elevadas e atividade necroinflamatória à biópsia do fígado). 18 A Lamivudina foi o primeiro análogo nucleosídico utilizado no tratamento da hepatite crônica B. A droga é utilizada por via oral na dose de 100 a 150mg/dia dependendo da formulação empregada. Em pacientes HBeAg positivos, um ano de uso de lamivudina resulta em melhora histológica (52% dos casos), queda do DNA-VHB sérico (44% dos casos), soroconversão HBeAg para anti-hbe (17% dos casos) e normalização da ALT (41% dos casos); se a droga é suspensa antes da soroconversão, todos os pacientes recidivam, com

24 9 retorno da replicação viral; portanto, tratamento a longo prazo é necessário na maioria dos doentes. 18 Assim como o HIV é resistente aos antivirais, o uso prolongado da lamivudina leva ao desenvolvimento de VHB resistente. A freqüência de VHB resistente pode variar de 17-46% no primeiro ano, até 67 a 75% no terceiro e quarto anos de tratamento contínuo. Apesar da alta prevalência de VHB resistente à lamivudina, parece não haver maiores complicações em pacientes imunocompetentes. Entretanto, o VHB resistente pode levar a uma hepatite grave em pacientes co-infectados com HIV. Após transplante hepático, VHB resistente pode estar associado à fibrose hepática e processo necroinflamatório importante. 27 A terapia combinada de duas drogas pode melhorar os efeitos antivirais, permitindo utilizar doses menores e diminuindo os efeitos colaterais, e com possibilidade de menor ou retardo do aparecimento de vírus resistentes. Pode ser usado simultâneo ou seqüencial, a escolha vai depender do entendimento dos mecanismos de ação dos antivirais. 18,33 As principais vantagens dos análogos de nucleosídeos/nucleotídeos são administração oral e supressão expressiva da carga viral. Com relação aos demais parâmetros de avaliação, são em geral, semelhantes ou levemente superiores à Lamivudina. Como desvantagens ressaltam-se a indefinição da duração do tempo necessário para sustentar a resposta ao tratamento. Além disso, o risco da resistência antiviral tem demonstrado aumento com a duração da terapia antiviral Mutação do genoma do vírus da hepatite B Mutação na região da polimerase A polimerase do VHB é uma proteína multifuncional que tem quatro domínios: uma região de iniciação, uma região espaçadora de função desconhecida, uma região catalítica que funciona como uma RNA-polimerase dependente de RNA-polimerase/DNA-polimerase e uma região carboxi-terminal que possui a atividade da ribonuclease H (Figura 3A). Apesar da estrutura cristalina da polimerase do VHB ser desconhecida, grande parte da sua estrutura foi deduzida a partir da transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1 RT), com base na sua homologia. Independentemente das suas sequências de aminoácidos e

25 10 diferenças de estrutura do domínio, todas as polimerases parecem ter uma configuração com a mão direita comum com o polegar, a palma da mão, e um domínio de dedos (Figura 3B). O domínio de palma parece ser o local ativo e catalisa a reação de transferência de fosforilo, o domínio de dedos facilita a interação com os dntp de entrada, bem como a base de molde a que se encontra emparelhado, e o domínio de polegar pode desempenhar um papel no posicionamento do DNA duplex, processabilidade e translocatição. Análogos Nucleosídeos e dntps se ligam em um local que está localizado no subdomínio palma ao lado o terminal = 3 do iniciador strand. Uma propriedade interessante da polimerase de VHB parece ser a sua preferência por nucleótidos com a configuração L, em contraste com outras polimerases que preferem nucleótidos com a configuração D.67 A região catalítica pode ser subdividida em sete domínios: A-G (Figura 3A). Comparando o domínio A do HIV-1 RT que está em estreita proximidade com os dois aspártico de resíduos de ácido do domínio C e forma parte integrante da ligação do dntp. Resíduos neste domínio estão envolvidos na coordenação da porção de entrada do trifosfato dntp e os íons de magnésio. Domínio B do VHB RT forma uma hélice com uma região do laço e está envolvida no posicionamento da fita do inicio ao fim da região do domínio catalítico. O domínio C contém uma sequência de 4 aminoácidos, tirosina, aspartato, metionina e aspartato (YMDD), que é altamente conservada entre as polimerases virais/transcriptase reversa que se liga a dois íons de magnésio e representa o local ativo das enzimas. No HIV-1 RT, resíduos dentro do domínio D, pode contribuir para ligação local do dntp e mutações neste domínio podem afetar indiretamente a geometria do sitio de ligação do dntp. O domínio E faz parte do sítio de ligação do iniciador molde, entre a palma da mão e o polegar, posição rtm230 e rtg231. Os resíduos de metionina e glicina presentes no domínio E são conservados em todos os isolados do VHB. Domínios F e G são após do domínio A. Esta região pode estar envolvido na interacção com o dntp de entrada e também com o modelo de nucleótidos.

26 Figura 4. (A) Diagrama esquemático da estrutura de leitura aberta de polimerase do VHB ilustrando os quatro domínios funcionais e os subdomínios 7 catalíticos A-G. (B) a estrutura proposta para a polimerase de VHB com base no modelo de HIV-1 RT e adaptado de Das et al 68 Bartholomeusz. Como ilustrado neste diagrama de fita, a polimerase do VHB tem uma configuração com a mão direita, com o polegar, de palma, e domínios dedos. As posições aproximadas dos os domínios conservados A-E são mostradas pelas fitas coloridas domínios A, C, D e talvez participam diretamente no dntp de ligação e catálise. Domínios B e E são envolvidos com um posicionamento preciso do iniciador-molde em relação ao local ativo. (C) Localização das principais mutações da lamivudina em relação aos domínios conservados. (D) Localização do adefovir e as mutações de tenofovir em relação aos domínios conservados. (E) Localização das principais mutações de entecavir em relação aos domínios conservados 11

27 Resistência Moleculares aos Análogos de Nucleos(t)ídeos O VHB tem uma elevada taxa de replicação, com virions produzidos por dia e uma taxa de mutação de aproximadamente 10 5 substituição/base/ciclo. Isso se traduz em cerca de mutações pontuais produzidos por dia em indivíduos com replicação ativa. Uma vez que o genoma do VHB tem apenas 3200 pares de base, todas as alterações possíveis podem ser produzidas em uma unica-base, por dia. A transcriptase reversa do VHB não têm uma função de revisão para reparar os nucleótidos incorrectamente incorporados. Portanto, as mutações podem ocorrer muito rapidamente. A probabilidade de uma mutação ser selecionadas durante a terapia depende da capacidade que o fármaco tem para suprimir a replicação viral. Por isso, um medicamento com atividade antiviral baixa, não exercem pressão seletiva substancial sobre o vírus, e a probabilidade de resistência à droga não é alta. Por outro lado, a supressão completa da replicação viral permite pouca oportunidade para resistência a surgir devido a mutagénese é a replicação dependente.69 Os Análogos Nucleos(t)ídeos por afetar a cadeia de cccdna de alguma forma importante inibem a replicação viral, sem contudo, eliminar os vírus existentes. Por outro lado, monoterapia que exerça modesta atividade antiviral e dirigidas a um único local alvo resulta em maior probabilidade de seleção de resistência viral a drogas. O regime de tratamento ideal deve ter atividades antivirais dirigidos a locais diferentes para reduzir o risco de seleção das espécies resistentes a drogas. Resistência surge quando a replicação ocorre mesmo na presença de drogas. Portanto, se nós podessemos conseguir a supressão completa da replicação, a resistência não seria um problema. Outros fatores que contribuem para o surgimento de resistência a fármacos são barreiras genética para o desenvolvimento de mutações, o mecanismo de resistência à droga, o espaço a replicação viral e fatores relacionados ao hospedeiro envolvidos no controle da replicação viral Mecanismos Moleculares de Resistência às Drogas O VHB é um vírus DNA pequeno, que apresenta relativamente poucos alvos específicos para intervenções antivirais. No presente, o alvo de escolha é a proteína polimerase, uma enzima que desempenha um papel essencial na replicação viral. Dentro de suas quatro regiões funcionais, a resistência da droga a lamivudina está associada a mutações na polimerase, isto é, no sitio conservado do domínio catalítico da transcriptase

28 13 reversa do gene P, localizado especificamente no locus de quatro aminoácidos consistindo de tirosina-methionineaspartate aspartato, denominado o motivo YMDD. Nessa região a lamivudina age na supressão da replicação viral. Dado que o VHB pode gerar até virions/dia 22, e que a partir dessa pressão seletiva exercida pela administração de lamivudina a longo prazo sobre o vírus favorece o surgimento de vírus mutantes. Quando ocorrem mutações, a configuração do motivo YMDD do tipo selvagem altera de tal forma que o medicamento já não exerce com sucesso sua ação inibitória no local. De forma que ambas as estirpes do vírus (selvagem e resistente) preenchem o fígado infectado. O HBV DNA e os níveis de ALT geralmente começam a recuperar, mas são geralmente mais baixos em comparação com os níveis da linha de base, quando apenas o vírus de tipo selvagem é encontrado. Três mutações chaves no gene da polimerase têm sido mostradas conferindo resistência a lamivudina e adefovir dipivoxil (Figura 2), embora muitas outras mutações também foram descritas. No que diz respeito à nomenclatura recentemente adoptada para o VHB mutações na região da polimerase. Os dois primeiros incluem a substituição de metionina (M), pelo aminoácidos isoleucina (I) ou valina (V) no motivo YMDD (domínio C) na posição rtm204v/i. Na maioria dos casos, estas mutações no motivo YMDD ocorrem em conjunto com uma mutação adicional de compensação no subdomínio B, isto é, a substituição de uma leucina por metionina cerca de 20 aminoácidos a além do domínio de YMDD na posição rtl180m. Finalmente, o mutante descoberto recentemente para adefovir (rtn236t) está localizado antes do motivo YMDD no domínio D da polimerase viral. Assumindo que a adesão do paciente ao tratamento acarreta resistência à terapia antiviral é presentemente definido como (i) um aumento dos títulos de HBV DNA no soro durante a terapia, depois de uma resposta virológica sustentada, e (ii) seleção de uma mutação no gene da polimerase viral (motivo YMDD da polimerase do domínio C), que não pôde ser detectado nos principais espécies virais antes da terapia, e que é não incluídos nas sequências consenso de HBV de bancos de dados (isto é, resistência genotípica). 67 A administração prolongada de lamivudina frequentemente provoca resistência viral caracterizada por uma replicação viral em um paciente aderente. A incidência de resistência a lamivudina é de 14% a 32% após 1 ano de tratamento, 38% após 2 anos, e 53% a 76% após 3 anos. As principais mutações associadas com resistência a lamivudina estão localizados no domínio C do motivo YMDD. São rtm204v (sequência YVDD), rtm204i (YIDD) e os rtm204s, mais recentemente identificado (YSDD).

29 14 Os VHB lamivudina mutantes resistentes com substituições de aminoácidos no motivo YMDD aparecem para replicar de forma menos eficiente do que o vírus de tipo selvagem, in vitro. No entanto, as substituições adicionais que são selecionadas simultanêamente com as substituições de resistência à transcptase reversa na posição 204 do domínio C, tais como rtl180m e rtv173l, localizadas no domínio B, pode compensar essa perda de eficiência da replicação in vitro. 17 O desenvolvimento de resistência ao adefovir no primeiro ano de tratamento é excepcional, mas após 5 anos de uso da medicação, 29% desenvolvem mutações de resistência (N236T e A181V/T), que se refletem por aumento dos níveis de DNA-VHB séricos e da ALT. 18 Figura 5: Mutações de resistência aos medicamentos utilizados para o tratamento da hepatite B crônica. 33 Entecavir também mostrou-se ativo em pacientes portadores de VHB resistentes à lamivudina; em um estudo que incluiu 181 pacientes portadores de VHB com mutações no lócus YMDD da polimerase viral, usando diferentes doses (0,1; 0,5; e 1mg/dia) de entecavir, foram testadas e comparadas com a lamivudina. Na semana 24 do tratamento o percentual de pacientes com DNA-VHB indetectável foi 19% com 0,1mg/dia, 53% com 0,5mg/dia e 79% com 1mg/dia comparado com 13% do grupo recebendo lamivudina. Portanto, 1mg/dia parece ser a dose ideal para tratar cepas resistentes a lamivudina. Ao contrário do observado em cepas sensíveis, resistência ao entecavir (9%) tem sido observada em pacientes com mutantes resistentes a lamivudina (mutações nas posições 184, 202 e 250). 18 Apesar do sucesso alcançado com a introdução dos programas de vacinação desde 1982, a infecção pelo vírus da hepatite B ainda representa uma das patologias infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e

30 15 mortalidade. A cada ano, estima-se que acima de um milhão de pessoas morrem em decorrência de patologias relacionadas à evolução da infecção crônica pelo vírus B, sendo a hepatite B considerada a sétima entre todas as causas de óbitos no mundo. A falta de informações relativas ao tema dificulta, portanto, a definição de ações específicas nessa área de atendimento clínico. A necessidade urgente de informações que subsidiem as intervenções clínicas e terapêuticas necessárias a esse grupo de pacientes, justificou a realização desse estudo que se propôs avaliar mutações de resistência na região da polimerase (domínio da transcriptase reversa) do genoma do vírus da hepatite B em isolados de pacientes procedentes da demanda espontânea da Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado.

31 16 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Investigar possíveis mutações associadas à resistência antiviral em portadores de Hepatite B Crônica atendidos na a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. 2.2 Específicos - Pesquisar mutações no gene da polimerase relacionadas à resistência antiviral em amostras de pacientes portadores de hepatite crônica pelo VHB; - Caracterizar os genótipos do VHB em amostras de portadores de Hepatite B crônica; - Verificar possíveis associações entre a pesquisa de mutações de resistência antiviral x carga viral do VHB x genótipos do VHB.

32 17 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Modelo de Estudo Estudo do tipo descritivo que visou à investigação de mutações de resistência do VHB associadas ao tratamento em portadores de hepatite B crônica. 3.2 Local de Estudo O estudo foi conduzido na cidade de Manaus, capital do estado do Amazonas, na Gerência de Virologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT- HVD), uma unidade Terciária de saúde referência no atendimento das doenças infecciosas e parasitárias, para a região Amazônica Ocidental brasileira e, especializada no atendimento, diagnóstico e tratamento dos portadores de doenças hepáticas agudas e crônicas, causadas pelos vírus das hepatites. Neste complexo está instalado o Laboratório da Rede de Carga Viral da Hepatite B do programa Nacional de DST, AIDS e Hepatites Virais do Ministério da Saúde, e ainda possui o Laboratório de Pesquisas em doenças Endêmicas LPDE. 3.3 Aspectos Éticos O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Fundação de Medicina Tropical HVD (Res. CNS196/96) processo n 0019/2011-CEP/FMT-HVD. Com o título Caracterização genotípica do vírus da hepatite B e investigação de mutações de resistência associadas aos antivirais em isolados de pacientes no Estado do Amazonas. (Anexo-1) 3.4 População de Estudo A população alvo deste estudo foram indivíduos portadores de Hepatite B crônica que fazem acompanhamento na FMT-HVD no ambulatório de DST, AIDS e Hepatites Virais e que solicitaram exame de carga viral, no período de novembro de 2010 a dezembro de 2011.

33 Critérios de Inclusão Foram utilizados os seguintes critérios: - Pacientes que realizaram exames de carga viral; - Ser portador do VHB independente do quadro clínico de infecção (cirrose hepática, hepatocarcinoma ou portador assintomático); - Pacientes em tratamento antiviral ou não; - Concordaram com Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Critérios de Exclusão Foram excluídos desde estudo os indivíduos com as seguintes características: - Co-infecções com os vírus: Hepatite D, Hepatite C, HIV; - Carga Viral do VHB abaixo de 350 UI/mL; - Amostra insuficiente; - Não aceitaram participar do estudo. 3.5 Procedimento para seleção dos pacientes Os pacientes foram convidados a participar do estudo no momento do atendimento médico no ambulatório de hepatite da FMT-HVD. Após serem esclarecidos dos objetivos da pesquisa, benefícios e confiabilidade dos registros e aceitarem participar do estudo, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo-2) e preencheram um questionário padronizado e individual (Anexo-3). Outras informações complementares ao estudo foram coletadas nos prontuários do banco de dados electrônico (I-Doctor). 3.6 Processamento das Amostras no Estudo De acordo com os registros do Banco eletrônico I-Doctor, foi identificado 911 registros de pacientes HBsAg positivo que realizaram o exame de Carga Viral no período de Novembro de 2010 á Dezembro de Utilizando os critérios de exclusão, 152/911 amostras de DNA VHB foram submetidas a amplificação por PCR e semi-nested PCR, destas 26 amostras

34 19 foram negativas e 126 amostras foram positivas e posteriormente sequenciadas. Segue abaixo fluxograma do processamento das amostras: N=911 Nov 2010 à Dez 2011 Critérios de Exclusão Co-Infecção N= 275 Carga Viral<350 UI/mL N=714 Não Encontrada N=45 N=152 PCR e PCR semi-nested TopTaq Master Mix DNA-VHB (-) N=26 Eletroforese 1200pb/680pb DNA-VHB (+) N=126 Sequenciamento Direto N=126 ABI3130xl Análise Filogenéticas e mutações N=113 Figura 6: Fluxograma do processamento das amostras no estudo. 3.7 Procedimentos de laboratório Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório da Gerência de Virologia e Laboratório de Pesquisas de Doenças Endêmicas da FMT-HVD. Como técnica de detecção molecular foi utilizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando iniciadores específicos para o VHB desenvolvidos e padronizados neste laboratório. Foram selecionados os iniciadores 2821, 783 e P1 (Oliveira, 2007). Que amplificam o gene S completo e a região

35 20 de interesse do gene da polimerase (1.200 nucleotídeos). As características gerais do ensaio são sumarizadas a seguir: Obtenção do DNA e Carga viral do VHB O DNA VHB utilizado neste estudo foi procedente da rotina do Laboratório da Rede de Carga Viral da Hepatite B do Programa Nacional de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministério da Saúde da FMT-HVD. A extração do DNA foi realizada no sistema automatizado Cobas AmpliPrep/TaqMan (CAP/CTM) v.2,0, Roche Diagnostic para processamento do exame de carga viral do VHB Reação da polimerização em cadeia O DNA viral foi amplificado pelo sistema de semi-nested PCR, sendo a primeira reação de PCR realizada com 5 μl do DNA procedente do Cobas AmpliPrep/TaqMan, e os iniciadores 2821 e 783. Na segunda PCR foi usado 1 L do produto da primeira reação com os iniciadores P O fragmento resultante da primeira amplificação foi pb, corresponde ao gene S completo (regiões pré-s1, pré-s2 e S). O fragmento da segunda amplificação corresponde a 680 pb (região da polimerase). Os ensaios da PCR foram realizados em um volume final de 25 μl contendo: 12,5 μl máster mix TopTaq (250U) (QIAGEN), 0,4pmol de cada iniciador e água RNase free para completar o volume. As condições de amplificação foram: um ciclo de 94ºC 5 minutos e 35 ciclos (94 C - 30 seg, 57,1 C 2min, 72 C 30 seg), seguidos de uma extensão final a 72 C por 7 minutos, na primeira reação e na segunda reação, um ciclo de 94ºC 2 minutos e 35 ciclos (94 C - 30 seg, 57,1 C 30 seg, 72 C 1 mim), seguidos de uma extensão final a 72 C por 5 minutos, em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient.. Os produtos amplificados por PCR foram analisados por corrida eletroforética em gel de agarose 1,5%. O gel foi corado por brometo de etídio (10 mg/ml), visualizado com luz ultravioleta e fotografado para documentação.

36 Seqüenciamento As reações de seqüenciamento foram realizadas utilizando 1-3 µl de produto de PCR, 0,33pmol do iniciador P1, 2,0 µl tampão 5x, 1,0 µl de Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) e água para completar o volume final de 10µL. As reações foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient. Os produtos da PCR foram purificados utilizando kit X-Terminator (Applied Biosystems), de acordo com as recomendações do fabricante. O seqüenciamento genético realizado no equipamento DNA Analyzer ABI 3130XL (Applied Biosystems). 3.8 Análise das seqüencias A edição das seqüências nucleotídicas foi feita utilizando os algoritmos do pacote BioEdit. As seqüenciada foram alinhadas com seqüências padrões obtidas no GenBank (http.// A validação da qualidade e montagem das seqüências consenso foi realizada utilizando o programa Phred-Phrap-Consed. Posteriormente, foi montada uma seqüência concenso das fitas sense e anti-sense no programa Consed. As seqüência obtidas foi depositadas no GenBank. 3.9 Genotipagem Para caracterização dos genótipos do VHB as sequencias obtidas foram submetidas à análise filogenética utilizando o programa MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) versão 5.0. Para construção da árvore filogenética adotando o método estatístico de Neighbor-Joining incluindo as substituições do tipo transições + transversões. Para o teste de confiabilidade da topologia da árvore filogenética foi adotado o método não paramétrico de replicações Bootstrap com percentual mínimo de 50% e 500 replicações.

37 Análises de mutações de resistência antiviral Para identificação de mutações de resistência aos antivirais as seqüência serão alinhadas juntamente com seqüências de referência nos programas de analise filogenéticas virtuais descritos abaixo: HepSeq HepSeq é um programa que foi desenvolvido especificamente para fenotipagem virtual de isolados de VHB. Possui um grande banco de dado, globalmente disponível para um acesso rápido, baseado em entrada de sequencias de ácidos nucleicos ou sequencias de aminoácidos de isolados clínicos de VHB. Usuários registrados podem acessar o programa on-line e introduzir as sequencias no web site: O Programa procura por homologia entre as sequencias de entrada com as outras já armazenadas no banco de dados, correlacionando dados de fenotipagem, história clínicas, a determinação do genótipo e subgenótipos, reportando quaisquer mutações descobertas, destacando aqueles que já se sabem ter significados clínicos. O banco de dados atualmente possui aproximadamente 3048 isolados clínicos de pacientes e inclui mais de sequencias diferentes de VHB em que aproximadamente variações foram identificadas GENAFOR O nome completo é Gesellsschaft für Forschung ev nachhaltige, em inglês. GENAFOR - Sociedade de Pesquisa sustentado. GENAFOR é uma sociedade científica sem fins lucrativos, o chamado'''' eingetragener Verein (ev) sob a lei alemã. Foi fundada por cientistas no ano de 2002 e está aberto a cientistas de todos os países que aceitam os seus estatutos; estatutos oficiais do GENAFOR em alemão pode ser encontrado no web site: sua sede encontra-se em Bonn, Alemanha. Ao submeter a seguir uma sequência de DNA de HBV gene-pol / gene-superfície irá obter um alinhamento da sequência com a sequência de consenso de HBV genótipo D, ou, alternativamente, a uma sequência de consenso do respectivo genótipo, uma lista das mutações de acordo com a transcriptase reversa do domínio pol gene e a SHB proteína da superfície do gene, e as

38 23 previsões de resistência fenotípica do vírus respectivo a cinco drogas anti-retrovirais.fig 7 Nota que para previsões confiáveis as seqüências devem conter uma parte substancial do domínio da RT, nenhuma decisão clínica deve ser baseado apenas no resultado do algoritmo usado. Figura 7: Resistência fenotípica do VHB a cinco drogas anti-retrovirais.e suas posições Análise Estatística As possíveis associações entre os genótipos e as variáveis investigadas, e a presença de mutações relacionadas à resistência antivirais foram analisadas em duas etapas: Análise univariada teste t de student e X²; Análise multivariada regressão múltipla foram estudadas as variáveis que apresentaram p<0,20, pela análise univariada. Obs. Os resultados serão apresentados em forma de artigo segundo formatação da revista.

39 24 4. RESULTADOS Mem Inst Oswaldo Cruz Caracterização genotípica e fenotípica do VHB Caracterização genotípica e fenotípica do vírus da hepatite B em pacientes da Amazônia Ocidental brasileira. Renata da Silva Galvão 1,2, Wornei Silva Miranda Braga 1,2, Márcia da Costa Castilho 1,2, Heline Lira Vasconcelos 2, Joelma Martins Rocha 1, Suellen Silva e Silva 2, Cíntia Mara Costa de Oliveira 1,2,3 Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical, Universidade do Estado do Amazonas, Manaus, AM, Brasil 1 Gerência de Virologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, Manaus, AM, Brasil 2 Centro de Apoio Multidisciplinar, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM 3. RESUMO A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) representa um importante problema de Saúde Pública mundial, um dos maiores desafios enfrentados durante o tratamento da infecção crônica pelo VHB é o surgimento de vírus resistentes às drogas usadas. O surgimento de mutações em regiões especificas do gene da DNA polimerase têm sido extensivamente correlacionadas à resistência aos anti-virais, uma vez que possibilita o reaparecimento do DNA do vírus no soro, principalmente em indivíduos submetidos a terapia prolongada. Neste estudo, nos propomos investigar mutações de resistência no gene da transcripatase reversa (RT) do VHB e caracterizar os genótipos em amostras de pacientes tratados e não tratados com antivirais, atendidos em uma Unidade Terciária de Saúde referência da região norte do Brasil. Uma região de 600pb da RT foi amplificada pela PCR e diretamente sequenciada. Foram sequenciadas 113 amostras, destas quatro (3,54%) apresentaram a mutação rtm204i tanto na região YMDD como no gene S ((1 (rta80v/rtm204i), 2 (rts202l/rtm204i), 4 (rts202q/rtm204i) and 13 (rts202i/rtm204l)). Os genótipos identificados foram A 71,68% (81/113), D 15,04% (17/1130) e F 13,28% (15/113). Dos 26 pacientes que apresentaram mutações de resistência na região rt do VHB, 88,46% eram pacientes não tratados. Verificou-se também que 8,8% das sequencias virais analisadas apresentavam mutações de escape de vacina. Esses resultados mostram que embora as estratégias de prevenção e controle sejam eficazes há necessidade de investigação constante e exaustiva sobre epidemiologia molecular do VHB na região. Palavras Chaves: Hepatite B, Mutação, Resistência, Genótipo, Brasil. Suporte financeiro: CAPES, CNPq, Departamento de DST, Aids e hepatites virais/ms. Autor Correspondente: dr.renatagalvao@hotmail.com

40 25 INTRODUÇÃO Apesar do sucesso alcançado com a introdução dos programas de vacinação desde 1982, a infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) ainda representa uma das patologias infecciosas mais desafiadoras à saúde pública mundial, causando elevados índices de morbidade e mortalidade (Lok & McMahon, 2007) (WHO, 2011). O vírus da hepatite B tem elevada taxa de replicação, com virions produzidos por dia e uma taxa de mutação de aproximadamente 10 5 substituição/base/ciclo. O equivalente a cerca de mutações pontuais produzidos por dia em indivíduos com replicação ativa (Sablon & Shapiro, 2005). A replicação do VHB é um processo muito complexo, inclui um evento de transcrição reversa com a produção de um RNA intermediário, chamada RNA pregenomico (pgrna) (Gao & Hu, 2007). Durante a síntese da fita negativa do DNA pela polimerase/transcrição reversa podem ocorrer erros originando mutações do genoma viral, resultando na coexistência de espécies genéticas virais distintas em indivíduos infectados (quasispecies) (Grimm, 2011). Como a enzima transcriptase reversa do VHB não possui função revisora dos nucleotídeos incorretamente incorporados e seu genoma é muito pequeno com cerca de 3200 nucleotídeos, todas as alterações possíveis podem ser produzidas em uma única-base, por dia (Girones & Miller, 1989) (Ljunggren et al. 2002). A polimerase do VHB é dividida em uma proteina terminal, uma região espaçadora (spacer), transcriptase reversa (RT) e a Rnase H. Há tempos, combinações de mutações no gene da RT do VHB têm sido extensivamente estudadas mostrando estreita relação com resistência às drogas antivirais (Hussain & Lok, 1999; Zhao et a, 2012; Lee et al, 2014). As mutações de importancia clínica ocorrem nos domínios B, C ou D da RT (Zoulim & Locanini, 2009; Kwon & Lok, 2011). A probabilidade de uma mutação ser produzida durante a terapia antiviral depende da capacidade que o fármaco tem para suprimir a replicação viral, portanto, um medicamento com atividade antiviral baixa, não exerce pressão seletiva substancial sobre o vírus, e a probabilidade de resistência à droga é reduzida. Por outro lado, a supressão completa da replicação viral não permite resistência devido à mutagénese ser replicação

41 26 dependente. Analagos núcleos(t)ide (NA) e Interferon são usados na inibição da replicaçao viral. No entanto, tratamentos prolongados aumentam a chance de resistencia às drogas, podendo levar ao fracasso do tratamento. A resistência virologica é definida com base no aumento de 1 Log (10 vezes) o nível de DNA VHB no soro após 6 meses de tratamento. A lamivudina (LAM), adefovir (ADV), telbivudina (LDT) e entecavir (ETV) ter sido amplamente usados, enquanto tenofovir e adefovir (TDF) foram mais recentemente introduzidos (Chao & Hu, 2013; Soriano & McMahon, 2013). As mutações rtm204i/rtm204v envolvem a substituição metionina para valina ou isoleucina isoladas (3) e rtm204q simultânea com rtm204i/v, rta181t, rtl180m, rtt184i são as que aparecem com maior taxa de incidência (Liu et al, 2014). Estudos mostram que o uso de drogas análogos nucleos(t)ídeos inibem a replicação viral e o risco de transmissão de VHB, mas não eliminam o vírus completamente. Monoterapias que exercem modesta atividade antiviral resultam em maior probabilidade de seleção de virions resistentes às drogas. Por outro lado, terapias com potentes drogas antivirais parecem reduzir o risco de seleção de espécies resistentes (Sablon & Shapiro, 2005). Portanto, a determinação da atividade viral durante o regime de tratamento é importante para avaliar a adesão ao tratamento e o risco de surgimento de populações de vírus resistentes aos medicamentos. Outro fator importante, é que durante a terapia de longo prazo, mutações podem ocorrer não só no gene da polimerase, mas também no gene S, resultando no surgimento de mutantes na superfície da proteína. Dois tipos de mutantes de superfície são reconhecidos. O primeiro como resultado de substituições de aminoácidos, causando mutações de resistência primária e compensatória no gene da polimerase e gene S, simultaneamente; o segundo tipo ocorre devido à supressão viral prolongada levando a eliminação (seroclearance) do antígeno de superfície do VHB (HBsAg), podendo selecionar mutantes de escape de vacina. O segundo tipo de mutantes não possuem mutações de resistência primária do gene da polimerase. Algumas mutações no gene S relacionadas ao uso de drogas são

42 27 mutações nonsense e levam a truncagem das proteínas de superfície. Entre elas, a rta181t/sw172 que tem efeito negativo dominante na secreção, bem como um aumento do potencial oncogénico. Devido às altas taxas de mutação no DNA-HBV, o vírus pode ser classificado 10 genótipos com um padrão de divergência genômica intergrupo >8% considerando sequencias do genoma completo e >4% em sequencias do gene S (Okamoto, 1988), (Arauz-Ruiz et al. 2002), (Tatematsu et al. 2009), (Yu, 2010). Baseados nessa taxa são conhecidos dez genótipos do VHB, designados A-J. Distribuídos de acordo com as características geográficas da população, o genótipo A, é pandêmico, porém mais prevalente na América do Norte, Europa (excetuando região Mediterrânea), África Central e Meridional; os genótipos B e C são característicos dos países asiáticos; o genótipo D é mundialmente distribuído, sendo mais prevalente na região Mediterrânea e Oriente Médio; o genótipo E predomina entre portadores africanos (Kidd et al. 2002), (Magnius & Norder, 1995), (Norder, 1993); genótipo F apresenta a mais elevada divergência entre todos os genótipos (França, 2004; Norder, 1993) sendo considerado próprio das Américas, verificando-se uma associação forte entre este genótipo e populações nativas da América Central e do Sul (Mello1 et al, 2013) ; os genótipos G e H são encontrados na América do Norte e na França (Stuyver, 2000), América Central e México (Arauz, 2002); I e J foram descritos na China e no Japão, respectivamente (Tatematsu, 2009) (Yu, 2010). Os objetivos deste estudo foi caracterizar padrões de mutações, genótipos e sub-genótipos do VHB em pacientes monoinfectados tratados e não trados com drogas antivirais. MATERIAL E MÉTODOS Pacientes- Foram incluídos no estudo pacientes de ambos os sexos, maiores de 18 anos, HBsAg positivos, com e sem uso de medicamento antiviral e carga viral >superior a 350UI/mL, esse último parâmetro foi estabelecido baseado na experiência previa do grupo na amplificação do genoma VHB. Todos os pacientes foram referenciados do ambulatório de hepatites virais da Fundação de Medicina Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD), atendidos de acordo com o Protocolo Clínico e Terapêutico para

43 28 Tratamento da Hepatite B crônica e co-infecções (MS, 2009a). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMT-HVD, processo n 0019/2011-CEP/FMT-HVD e conduzido no período de novembro de 2010 a dezembro Os dados sócios demográficos referentes à idade, procedência e gênero, bem como os dados clínicos, bioquímicos (níveis de ALT) e sorológicos, foram coletados no banco dados eletrônico I-Doctor (FMT-HVD). Extração do DNA-VHB - O DNA HBV utilizado neste estudo foi processado usando 650 µl de soro no sistema automatizado COBAS AmpliPrep Instrument (Roche Diagnostic, US-IVD). Carga viral do VHB Os resultados de quantificação dos níveis de HBV-DNA no soro foram obtidos no Laboratório da Rede de Carga Viral de Hepatite B do Programa Nacional de DST, Aids e Hepatites Virais do Ministério da Saúde instalado na FMT-HVD, usando COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (Roche Diagnostic,USA), com intervalo de detecção de 20 a 1.7E+08 IU/ml. Após quantificar os níveis de HBV-DNA os extraídos foram armazenados em freezer -70 o C para posterior análise por PCR convencional. Amplificação do DNA BHV por PCR - Para amplificação da região S/Pol/Rt foram realizadas duas reações de PCR, a primeira usando 5.0 μl do DNA e 0.4 pmol de cada um dos primers, sense 2821 (5'- GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA CA-3 ) e anti sense 783 (5 -CTC ACGATG CTG TAC AGACTT-3 ) (Dias et al. 2012) e a segunda usado 1.0 l do produto da primeira PCR e 0.4 pmol do primer sense P1 (5 -TGCCTCTCACATCTCGTCAA-3 ) (Oliveira et al. 2008) e do 783. Todos os ensaios da PCR foram realizados usando 12.5 μl de TopTaq Máster mix kit (250U) (QIAGEN, GmbH) e água Nuclease free (Ambion/Applied Biosystems, Brasil) para completar o volume final de 25 μl. O tamanhos do amplicon da primeira reação equivale a pb (regiões S-1/S-2/S/Pol/Rt) e 680 pb (região S/Pol/Rt) na segunda reação. As condições de amplificação foram: um ciclo de 94ºC por 5 min e 35 ciclos (94 C por 30 seg, 57.1 C por 2 min e 72 C por 30 seg) e extensão final a 72 C por 7 min. Na segunda reação foi usado um ciclo de 94ºC por 2 min e 35 ciclos (94 C por 30 seg, 57.1 C por 30 seg, 72 C por 1 mim) e extensão

44 29 final a 72 C por 5 min. Os ensaios foram realizados em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient (Eppendorf, ). Os produtos da PCR foram analisados por corrida eletroforética em gel de agarose 1.5% corado com brometo de etídio (0.1 µg/ml) e visualizado em luz ultravioleta. Sequenciamento - As reações de sequenciamento foram realizadas usando 1-3 µl (20-30 ng) de produto de PCR, 0.3 pmol do primer P1 ou 783, 2.0 µl tampão 5x, 1.0 µl de Big Dye Terminator v.3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) e água para completar o volume final de 10 µl. Após purificação da reação se sequenciamento com X-Terminator kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) foi realizado sequenciamento pelo método de Sanger usando DNA Analyzer ABI 3130XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Edição das sequências nucleotídicas A análise das sequencias foi realizada usando os programas BioEdit v (Hall.2005) e MEGA v.6 (Kumar et al. 2013). Foram incluídas nessa análise sequências padrões dos 10 diferentes genótipos do VHB (A-J) identificadas em diferentes países obtidas no GenBank. A validação da qualidade e montagem das sequências consenso foi realizada utilizando o programa Phred-Phrap-Consed. Análise filogenética - A genotipagem foi realizada por reconstrução filogenética usando sequências de referência de todos os genótipos obtidas no GenBank. Foi usado o método estatístico de Neighbor-Joining (NJ) incluindo substituições do tipo transições + transversões. O teste de confiabilidade da topologia da árvore filogenética foi estabelecido usando o método não paramétrico de replicações bootstrap com percentual mínimo de 50% e 1000 replicações. A phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted using MEGA version 6 (Kumar et al. 2013). Análises de mutações de resistência A pesquisa de mutações de resistência aos antivirais e escape de vacina foi realizada em programas de fenotipagem virtuais disponíveis no endereço eletrônico: e Análise estatística - analisou-se a relação entre as características sócio epidemiológica dos pacientes (sexo, idade e local de procedência), condições do fígado (hepatite crônica, cirrose e níveis de

45 30 Alamina Amino Transferase-ALT), características da infecção viral (antígenos HBsAg e HBeAg, níveis de carga viral em log e UI) e características genéticas viral (polimorfismo, padrão de mutações nos genes S e Pol/Rt e substituições de aminoácidos e se o paciente estava ou não em tratamento com antivirais). As variáveis foram comparadas no programa SPSS aplicando o teste estatístico teste-t de student e X². RESULTADOS Foram analisadas 113 amostras de pacientes HBsAg positivos e carga viral >300 UI/ml. A idade desses pacientes variou entre 19 a 71 anos com média de 41,1 anos, desvio padrão 11,4 e mediana de 42 anos. Na Tabela 1 estão descritos os aspectos sociodemográficos e laboratoriais da população do estudo: Tabela 1 Características da população do estudo N % Sexo M 64 56,6 F 45 43,4 Procedência Manaus ,2 Zona Rural 10 8,8 Cirrose Sim 8 7,1 Não ,3 Tratamento Sim 12 10,6 Não ,4 ALT Normal 86 76,1 Alterada 25 22,1 HBeAg Pos 12 10,6 Neg 99 89,4 Carga Viral (log) 10³ 21 18,6 >10³ ~ ,6 > ,8 Genótipo A 81 71,7 D 17 15,0 F 15 13,3

46 31 Investigação de Mutações de resistência no gene da polimerase (rt) do VHB Analise de 113 sequencias de VHB mostrou que 87/113 (76.99%) apresentavam tipo selvagem e 26/113 (23.01%) apresentavam mutações no gene da polimerase associadas à resistência ao uso de antivirais. Na Tabela 2 estão descritos os dados referentes às características genotípicas, carga viral, uso de medicamentos, resistências e possíveis resistências aos antivirais. A mutação rtm204i/y/k/n/r/l foi frequente em 14/113 (12,39%) das sequências. Relacionando a variação de aminoácidos aos genótipos, obteve-se o seguinte resultado: rtm204i/rtm204y/rtm204l (genótipo F2), rtm204i/rtm204k e rtm204i/rtm204n (genótipo A1), rtm204i/m204r (genótipo D3) e rtm204i/m204l (genótipo F2). A relação presença de mutação versus uso de drogas antivirais, mostrou que das 14 sequências que tinham a mutação na posição rt 204, 8 (57.14%) apresentavam resistência a lamivudine e telbivudine. A análise do perfil dos pacientes portadores dessas cepas virais revelou que dois (2 e 26) estavam em tratamento com entecavir, tinham alta carga viral (Log de 4.56 e 4.32, respectivamente) mas indicação de possível resistência a essa droga. Outra mutação importante foi da posição S202A/I/AR/V isoladamente, presente em 4.42% das sequências, isoladas de pacientes sem uso de antivirais, com carga viral muito alta, indicando um perfil de possível resistência ao entecavir. A cepa isolada do paciente 09 apresentou três mutações L80V/L180M/ A181G e pertencia ao genótipo A, o paciente não estava em tratamento, tinha resistência a lamivudina e possível resistência a adefovir, telbivudine. Mutações simultâneas tanto no gene rt quanto no gene S foram encontradas em cepas virais de quatro pacientes 1 (rts202l/rtm204i/sm133i=a1), 2 (rta80v/rtm204i/sl109v), 14 (rts202r/sq129r) e 21 (rts202v/rtm204r/g145r), todos com indicação de possível resistência ao entecavir, sendo que o paciente 2 estava em tratamento com entecavir. O paciente 21 apresentava carga viral alta com Log de 8.07 e estava infectado com genótipo D3.

47 32 Tabela 2 Caracterização de Mutações da Região da Polimerase(rt) e gene S. Mutação Carga Viral Paciente Genótipo Mutação (rt) Resistência Possível Resistencia Tratamento Log Gene S UI/mL 1 A1 S202L/M204I M133I Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,11 2 A1 A80V/M204I L109V Lamivudine, Telbivudine Entecavir Entecavir ,56 3 D A80V - - Lamivudine, Telbivudine Entecavir ,8 4 A1 S202L/M204I - Lamivudine, Telbivudine AUSENTE Não ,15 5 D3 I233G - - Adefovir Não ,63 6 A2 S202A - - Entecavir Não ,96 7 F2 M204Y - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não ,6 8 F2 S202I - - Entecavir Não A1 L80V/L180M/ A181G - Lamivudine Adefovir, Telbivudine Não ,26 10 D3 M204Y - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não ,16 11 D3 S202A - - Entecavir Não 451 2,65 12 A1 M204K - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não 808 2,81 13 D3 S202Q/M204I - Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,24 14 D1 S202V Q129R - Entecavir Não ,32 15 A1 S202R - - Entecavir Não 977 2,99 16 A1 M204I - Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,55 17 A1 M204N - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não ,38 18 A1 M204I - Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,67 19 A1 S202A - - Entecavir Não ,41 20 A1 M204I - Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,04 21 D3 S202R/M204R G145R - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não ,07 22 A A80V - - Lamivudine, Telbivudine Não ,85 23 A1 A80V - - Lamivudine, Telbivudine Não ,23 24 F2 S202I/M204L - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Não ,46 25 A1 M204I - Lamivudine, Telbivudine Entecavir Não ,76 26 D3 S202R/M204R - - Lamivudine, Telbivudine, Entecavir Entecavir ,32 27 F - T140S - - Não ,85 28 F2 - S132P - - Não ,1 29 A1 - M133L - - Não ,64 30 A1 - M133L - - Não ,86 31 A1 - M133T - - Não ,57 32 A1 - G130N - - Não ,85

48 33 Mutações Os resultados da análise de mutações no gene da polimerase e gene S foram relacionados às variáveis: sexo, genótipo, ALT, carga viral, cirrose, HBeAg e tratamento estão descritos na Tabela 3. Tabela 3 Mutações na polimerase, região do YMDD e gene S do VHB Mutações no VHB Variaveis Polimerase YMDD Gene S Polimerase/S % p % p % p % p Masculino 30,6 10,2 8,2 4,1 Sexo 0,11 0, Feminino 17,2 14,1 9,4 3,1 Genótipo ALT Carga Viral Cirrose HBeAg Tratamento A D 20,3 41,2 0,23 11,4 17,6 0,8 7,6 11,8 0,79 2,5 11,8 F 20 13,3 13,3 0 Alterada ,05 0,76 0,81 Normal 22,1 12,8 9,3 2,3 10³ 19 4,8 0 0 >10³ ~ ,55 16,4 0, ,11 4,1 > ,8 5,3 10,5 5,3 Sim 37,5 12,5 12,5 12,5 0,15 0,66 0,71 Não 20,6 12,7 8,8 2,9 Positivo 0 0 8,3 0 0,002 0,13 0,82 Negativo 24,2 14,1 9,1 4 Sim 25 8,3 8,3 8, Não 22,8 12,9 8,9 3 0,3 0,43 0,42 0,47 0,58 0,36 Muta ções na região do a determinante do gene S, proteína de superfície SHBsAg (aa ) relacionadas a escape mutante da vacina contra o VHB foram encontradas em 10/113 (8,85%) sequências descritas como de escape de vacina, detectadas nas posições sq129r, genótipo D1; sg130n, genótipo A1; ss132p genótipo F2; sm133t/l/i, genótipoa1; I140S, genótipo F; L109V, genótipo A1 e a clássica mutação sg145r, genótipo D3. A análise no programa Genafor identificou na sequência 009 e 004 as mutações st140s e sl109v também como mutação de escape de vacina.

49 34 As demais substituições de aminoácidos nas posições 122, 127, 128, 131, 134 e 143 da proteína HBsAg são polimorfismos associados as mutações no gene rt e não apresentam relevância quanto ao escape de vacina. Figura 1- Sequências parciais de aminoácidos da região do Determinante a, os números de 01 a 010 são amostras de pacientes, alinhadas com duas sequências consenso obtidas no GenBank. Em destaque as mutações de escape mutante de vacina. Distribuição de genótipo e subgenótipos do VHB A análise filogenética do fragmento de 600 pb do gene S, agrupou as 113 sequências em três diferentes genótipos A, D e F (Figura 2). O genótipo A foi o mais frequente 71.68% (81/113), sendo identificados os subgenótipos A1 e A2, 15.04% (17/113) foi genótipo D, subgenotipos D1, D2, D3 e D4 e o 13.28% (15/113) genótipo F, subgenótipos F1 e F2. A árvore filogenética foi construída com 108 sequências, 5 foram excluídas da árvore por terem menos de 600 pb, o genótipo dessas sequências bem como os subgenotipos foram caracterizados usando o programa Genafor e HepSEQ-Research Database System.

50 35 A X51970 USA AM14694 AM43013 AM19035 AM5894 AM18642 AM51691 AM45776 AM55561 AMS6 A AF Arg AM58754 AM AM96306 AM48216 AM51940 AM53982 AM13881 AM59529 AM18625 AM AM AM30028 AM AM57590 AM77826 A GQ Afr Sul AMS13 AM35103 AM93403 AM45040 AM67335 AM21278 AMS14 AM85906 AM07375 AM65857 AM50710 AM19855 AM07273 AM76160 AM40023 AM58788 AM55528 A FJ Hai AM AM78954 AM26421 AM01400 AM88559 AM35147 AM36498 AM43901 AM54235 AM67032 AM AM85584 AM85584 AM62830 AM49018 AM53879 AM55244 AM AM70060 AM66388 AM56386 AM5700 AM01343 AM26759 AM32213 AM26771 AM29992 A EU Arg AM08466 AM72776 AM62742 AM71177 A AB Jap AM64849 AM26456 AM08324 AM AM AM65151 AM78153 AM25724 AM55896 AM95270 D AY USA D JN Ind AM D FJ Hai AMS2 AM AM609929P AM AM AM AM D DQ Alem AM B Genotype E Genotype 67 C Genotype G Genotype 99 F EU Per 55 AM F AY El Sal AM20 95 H Genotype 51 AM AM62351 AM AM AM68 AM27546 F AY Arg F DQ Ven AM3340 AM27 AM77744 AM13912 AM51804 AM84990 AM14945 AM94922 F FJ Col AM93300 AF046996_Woolly_monkey Figura 2- Reconstrução filogenética de sequencias nucleotidicas correspondente a 600 pb do gene de superfície do VHB, usando o método estatístico de Neighbor-joining. O teste foi calculado usando o método de Bootstrap baseado em 1000 replicações e o modelo de substituição nucleotítica Kimura 2- parametros, incluindo substituições do tipo Transições + Transversões e parâmetro gama = 2.5 G.

51 36 DISCUSSÃO De acordo com os resultados obtidos em nosso estudo, observou-se que a população em questão apresentou média de idade de 41,1 anos e mediana de 42 anos, demonstrando a forma de transmissão vertical ou perinatal como predominante. Observou-se também que embora com pouca diferença, a maioria dos pacientes era do gênero masculino. Estudos anteriormente realizados nesta região também mostram esse perfil (Fonseca 2007; Victoria, 2008; Dias, 2012). Em relação ao local de procedência dos pacientes, sem por cento dos participantes era natural do estado do Amazonas com somente 8,8% residentes nas zonas rurais dos municípios. Essa significativa diferença deve-se provavelmente ao local de realização do estudo, pois todas as amostras foram da demanda de uma unidade de saúde referência no atendimento e tratamento de portadores de hepatopatia crônica localizada em Manaus, capital no estado. Os achados sorológicos e clínico mostraram que 89,4% dos pacientes apresentavam o marcador HBeAg negativo. Desses, 7,1% tinham cirrose hepática. Em um estudo realizado por Fonseca, 2007 a incidência anual de cirrose hepática variou de 2% a 6% entre pacientes com hepatite crônica HBeAg positivos e 8% a 10 % nos pacientes com HBeAg negativos. Segundo o autor essa alta incidência de cirrose hepática nos pacientes com hepatite crônica HBeAg negativos ou hepatite crônica anti- HBe positivo, está relacionada com a idade mais avançada dos pacientes (> 35 anos de idade), fator também observado em nosso estudo. O elevado percentual de pacientes com hepatopatia crônica, HBeAg negativo (89,4%), encontrado em nosso estudo sugere a necessidade de investigação de mutações na regiões do pré-core ou core-promoter do VHB, pois estes mesmos indivíduos podem estar infectados com cepas mutantes que não expressão o marcador HBeAg (Lyra et al. 2008). Mutações na região core-promouter estão também associados ao aumento dos níveis de HBV DNA (>2.000 UI/mL), elevado níveis séricos da ALT, geralmente intercalados com períodos de normalidade e achados histológicos de necro-inflamação

52 37 no fígado, habitualmente em indivíduos mais velhos. Todas essas características foram observadas em nossa população de estudo. Em relação às mutações detectadas nas posições 80, 180, 181, 202, 204 e 233 no gene da polimerase, estudos associam essas mutações à resistência aos análogos de núcleos(t)ídeos entecavir, adefovir, telbivudine e lamivudina com índices de até 27,7% nos portadores assintomáticos e 26,9% nos doentes com Hepatite B Crônica (Haddad et al. 2010, Panigrahi et al. 2013). Em nosso estudo, esse índice em portadores de hepatite B crônica atingiu 23,01%. Desses, 7,96% apresentavam resistência aos análogos lamivudina e telbivudine e/ou possível resistência a lamivudina, telbivudine e entecavir, sendo que três deles estavam em tratamento com entecavir. Outro achado importante deste estudo foi em relação ao grupo de pacientes não tratados, mas infectados com cepas resistentes ou com perfil de possível resistência a lamivudina, telbivudine e entecavir, mostrando que as cepas mutantes estão circulando e que um indivíduo pode ser infectado com uma cepa já resistente. Por outro lado, estudos mostram que a mutação 204 no domínio YMDD geralmente causada pela terapia com lamivudina também pode ocorrer espontaneamente em pacientes portadores de Hepatite B crônica não tratados. Isso ocorre geralmente devido à incorporação aleatória de nucleótideos e falha na atividade revisora da enzima transcriptase reversa do VHB durante o processo de replicação. As substituições mais comuns são isoleucina (rtm204i, YIDD mutante) ou valina (rtm204v, YVDD mutante) (Tan et al. 2012). Em nosso estudo, 15 (13,27%) pacientes que apresentavam cepas com mutação de resistência na posição 204 não tinham sido submetido a nenhum tipo de tratamento com drogas antivirais. Estudos indicam que a introdução de lamivudina (LAM) aumenta rapidamente o risco de seleção de mutantes resistentes, podendo atingir índices de 80% de mutações de resistência no domínio RT do VHB após quatro anos de tratamento (Locarnini & Yuen, 2010), como no Amazonas o tratamento com LAM foi introduzido a mais de 10 anos fica difícil estabelecer se essas mutações são de ocorrência natural ou se esses indivíduos foram infectados com cepas resistentes provenientes de

53 38 indivíduos submetidos a tratamento com LAM no passado. Até porque, estudos prévios mostram que o padrão de infecção na população local é o intrafamiliar (Castilho et al. 2012). Analisando a relação entre as substituições de aminoácidos no gene rt e os diferentes genótipos identificados, verificamos que 41,2% das substituições ocorreram em sequencias do genótipo D enquanto que sequências do genótipos A e F apresentaram percentuais de 20,3% e 20% substituições, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos em estudo realizado no sul do Brasil na cidade de Ribeirão Preto, SP com 50 pacientes portadores de hepatite B crônicas em tratamento com Lamivudina, com percentual de 26,6% de mutações no genótipo D e 20% em sequências do genótipo A (Haddad et al. 2010). Mello e colaboradores analisaram amostras de soro de 129 pacientes HBsAgpositivos de diferentes estados brasileiros [Rio de Janeiro, Espírito Santo, Minas Gerais e Santa Catarina] e também detectaram um maior número de mutações em isolados do genótipo D (Mello et al. 2012). Em relação à caracterização de mutações escape mutante da vacina, encontrado em 8,85% (10/113) das cepas virais. Não foi possível determinar se esses indivíduos foram infectados por transmissão vertical de mães não vacinadas ou se por falha na vacina contra o VHB. Apesar da literatura afirmar que o anticorpo policlonal recombinante gerado a partir da vacinação seja capaz de proteger os indivíduos contra a infecção por VHB mutante SG145R (Locarine, 2008) o monitoramento continuo dessas mutações é importante pelo potencial risco de surgimento de reservatórios de vírus mutantes na população, podendo ser transmitido para seus descendentes. Além disso, conforme demonstrado no estudo de Chang 2010, em longo prazo, evidencia-se uma ameaça potencial para o sucesso do programa de vacinação. A sobreposição da polimerase viral aos quadros de leitura das proteínas do envelope do VHB resulta em mutações associadas à resistência antiviral e em alterações importantes para nos domínios neutralizantes de anticorpos envolvidos na ligação do antígeno de superfície (HBsAg) do VHB e o aparecimento de mutantes de escape de vacina associados à droga (ADAPVEMs). A importância do

54 39 ADAPVEMs para a saúde pública é considerável em termos de programas global de controle da hepatite B para imunização infantil universal. A prevenção da resistência requer a adoção de estratégias que não só controlem efetivamente replicação do VHB, mas também que evite o surgimento de ADAPVEMs (Locarnini & Yuen, 2010; Tan et al. 2012). Portanto, de acordo com os resultados obtidos em nosso estudo, isto é, maiores níveis de carga viral (>10³ ~ 10 5 ) em amostras com mutantes no gene da polimerase, reforça-se a necessidade imediata de estratégias de controle efetivo da replicação do VHB em prol do sucesso do programa de vacinação. Em nosso estudo foram identificados três genotípicos A, D e F. O genótipo A foi predominante na população, seguido dos genótipos D e F. Estudos anteriores realizados em populações da região norte do Brasil (Oliveira, et al. 2008; Dias et al. 2012) (Castilho et al. 2012; Godoy et al. 2013) destacam o genótipo A como o mais prevalente, seguido do genótipo F. Em outras regiões brasileiras o genótipo D aparece como o segundo mais frequente acompanhado do C (Becker et al. 2010; Haddad et al. 2010; Mello et al. 2012; Eloy et al. 2013; Araujo et al. 2013). Em conclusão, este é o primeiro estudo a descrever o perfil de resistência antiviral em portadores de hepatite B crônica correlacionando aos genótipos na região. As mutações de resistência encontradas em pacientes naives mostra a necessidade de uma abordagem longitudinal para monitorar mutações de resistência e realização de testes de genotipagem antes de iniciar a terapia antiviral dos pacientes. AGRADECIMENTOS Ao programa de pós-graduação de Medicina Tropical, a Fundação de Medicina Tropical Heitor Vieira Dourado, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e colaboradores. REFERÊNCIAS Arauz-Ruiz P, Norder H, Robertson BH, Magnius LO. Genotype H: a new Amerindian genotype of hepatitis B virus revealed in Central America. J Gen Virol 2002; 83:

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59 44 5. CONCLUSÃO De acordo com resultados obtidos concluiu-se que: Há evidencias de mutações de resistência antivirais no gene da polimerase do VHB circulantes na região; Mutações de resistência foram identificadas em 22,8% dos pacientes que não faziam uso de antivirais; Mutações de resistências foram identificadas em 14 sequencias do genótipo A, 8 do genótipo D e 3 do genótipo F; As mutações de resistências identificadas foram relacionadas aos antivirais lamivudine e telbivudine; Foi também identificado mutações relacionadas a possível resistência à entecavir e adefovir; Identificou-se o mesmo padrão genotípico de estudos anteriores, genótipos A, D, F e C, com predominância do genótipo A; Os achados de mutação de resistência e escape de vacina demonstrou a relevância dessa investigação, nos trazendo uma alerta, para maiores e incessantes investigações.

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66 ANEXOS 51

67 ANEXO 1 Parecer de Aprovação Comitê De Ética 52

68 ANEXO 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 53