Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1

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1 Artigo Original Rev Bras Nutr Clin 2007;22(1): Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1 Electronic microscope study of physical stability of lipid emulsions in 3x1 mixtures Estudio a la microscopia electrónica de la estabilidad física de emulsiones lipídicas en mezclas 3 en 1 Márcia de Souza Antunes 1 Unitermos Lipídeos; nutrição parenteral; microscopia eletrônica Keywords Lipids; parenteral nutrition; microscopy, electron Unitérminos Lípidos; nutrición parenteral; microscopía electrónica Endereço para correspondência: Rua Miguel de Frias, 211/ 303 Icaraí CEP Niterói/RJ mantunes@huap.uff.br Submissão 5 de junho de 2006 Aceito para publicação 17 de janeiro de 2007 Estudo realizado no Laboratório de Patologia Investigativa do Departamento de Patologia Clínica da Faculdade de Medicina da UFF 1 Mestre em Patologia Clínica pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal Fluminense (UFF), especialista em Terapia Nutricional pela Sociedade Brasileira de Nutrição Parenteral Enteral (SBNPE), farmacêutica industrial pela Faculdade de Farmácia da UFF, membro do Centro de Terapia Nutricional Enteral e Parenteral do Hospital Universitário Antônio Pedro (HUAP/UFF) Resumo O estudo consiste na determinação da estabilidade dos lipossomas das ELs utilizadas como fonte calórica em 28 composições de NPTs, denominadas misturas 3 em 1, por meio da avaliação à microscopia eletrônica de transmissão. Foi verificada a ocorrência ou não de instabilidade como floculação/agregação ou coalescência/aglutinação das partículas e foram medidos os respectivos maiores diâmetros encontrados, sendo estudadas as ELs originais e as formulações mais comuns em nossa prática clínica, nos tempos 0, 24, 48, 72 horas. Foram avaliados e calculados alguns dos fatores predisponentes e de favorecimento de instabilidade como: dosagem de ph, valores de CAN (número de agregação crítica) e avaliação farmacêutica dos insumos adicionados. Os resultados encontrados foram cinco formulações com ELs estáveis, 16 com floculação e sete com coalescência. Para as amostras com floculação, o fator de maior contribuição foi a diminuição do ph, interferindo nas forças eletrostáticas. Para a coalescência, a instabilidade ocorreu supostamente pela alteração do ph, pela adição de heparina e cátions divalentes em concentrações elevadas. Como conclusão, os lipossomas não se alteram morfologicamente quando: a seqüência de manipulação das formulações encontra-se em condições controladas, são analisadas farmaceuticamente, apresentam os componentes em concentrações e ordem de adição adequada, e quando o tempo e a temperatura após preparação forem os recomendados. O uso clínico da mistura 3 em 1 deve ser limitado aos parâmetros sugeridos. Abstract The study consists of determination of liposome stability of ELs utilized with caloric font in 28 TPNs compositions, denominated 3 in 1 mixtures, through evaluation by transmission electronic microscopy. These were in occurrence or not with the stability of floculation/agregation or coalescence/agglutination particles and the larger diameter found was measured. We studied the original ELs and the most usual formulations in our clinical practice at these hours: 0, 24, 48, 72. Appraised and estimated some of the predisposed factors in favor of instability with ph, values of CAN (critical aggregation number) and the pharmaceutical valuation of added components. The results found were five formulations with ELs stability, 16 with flocculation and seven with coalescence. For the samples with flocculation, the largest contribution factor was the ph decrease, interfering in the electrostatic potential barrier against coalescence. For the coalescence, the instability occurred at supposed ph alteration and the addition of heparin and divalent cations in high concentrations. In conclusion, the liposomes were not altered morphologically when the mixing sequence of formulation was in controlled condition, when pharmaceutically analyzed, which adequate concentrations of the mixture components in order of addition, and the age and temperature of the mixture as well. The clinical use of 3 in 1 mixtures is within these limited guidelines. Resumen El estudio consiste en la determinación de la estabilidad de los liposomas de las ELs utilizadas como fuente calórica en 28 posiciones de NPTs, nombradas mezclas 3 en 1, a través de la evaluación a la microscopia electrónica de transmisión. Fueron verificadas la ocurrencia o no de inestabilidad como floculación, agregación o aglutinación de las partículas y medidos los respectivos mayores diámetros encontrados, siendo estudiadas las ELs originales y las formulaciones más comunes en nuestra práctica clínica, en los tiempos 0,24,48,72 hs. Fueron evaluados y calculados algunos de los factores de favorecimiento de inestabilidad como: ph, valores de CAN (número de agregación crítica) y evaluación farmacéutica de pres-

2 Antunes MS criciones. Los resultados encontrados fueron 5 formulaciones con ELs estables, 16 con floculación y 7 con coalescencia. Para las muestras con floculación el factor de mayor contribución fue la disminución del ph, interfiriendo en las fuerzas electroestáticas. Para la coalescencia, la inestabilidad ocurrió supuestamente por la alteración del ph, por la adición de heparina y cationes divalentes en concentraciones elevadas. Como conclusión los liposomas no se alteran morfológicamente cuando: la secuencia de manipulación de las formulaciones se encuentra en condiciones controladas, son analizadas farmacéuticamente, presentan los componentes en concentraciones y orden de adición adecuados y cuando el tiempo y la temperatura después de la preparación sean los recomendados. El uso clínico de la mezcla 3 en 1 debe ser limitado a los parámetros sugeridos. Introdução A técnica mais comumente usada nas manipulações de soluções nutritivas administradas por via venosa no início dos anos 70 era a adição de hidrato de carbono (HC), sais minerais normais, vitaminas e oligoelementos nos frascos de vidro ou bolsas plásticas de cloreto de polivinila (PVC) e, em separado, a administração de emulsões lipídicas (ELs) endovenosas, que são preparações farmacêuticas, constituídas por duas fases, sendo uma delas uma substância gordurosa. No ano de 1972 foi descrito, por Solassol e Joyeux pela primeira vez a técnica de manipulação e o uso clínico de soluções contendo todos os nutrientes necessários como: aminoácidos, glicose, lipídeos, sais minerais, vitaminas e oligoelementos, adequados para administração por via endovenosa em um único envase. Essa mistura foi denominada mistura 3 em 1. Somente em 1982, nos EUA, o Food and Drug Administration (FDA), órgão regulamentador de medicamentos e alimentos, aprovou o uso clínico da mistura 3 em 1. O uso da mistura 3 em 1 apresenta algumas desvantagens, entre elas a sua instabilidade e o tempo exíguo de estocagem, que não deve ser superior a 30 horas, de acordo com sua composição 1. Dentre as muitas causas de instabilidade nas preparações das misturas 3 em 1, podemos citar a sua composição eletrolítica, interferindo na atuação do agente emulsivo utilizado industrialmente na fabricação das ELs que, nesse caso, é a lecitina obtida dos fosfolipídios da gema de ovo ou de semente de soja, ésteres glicefosfóricos da colina e de ácidos graxos diversos. São agentes emulsivos do tipo O/A e, como tal, produzem barreira mecânica e eletrostática contra a coalescência dos lipossomas 2. O agente emulsivo atua por meio da formação de uma película ao redor de cada partícula oleosa, de modo que a fração lipofílica fica orientada para a fase oleosa e a fração hidrofílica orientada para a fase aquosa, constituindo-se uma barreia mecânica e pela ionização do grupo fosfato na fase aquosa fornecendo uma barreira eletrostática (potencial zeta) na superfície de cada lipossoma, pois a carga negativa apresentada por este grupamento estabelece uma repulsão mútua entre eles 3. As ELs endovenosas normalmente possuem ph entre 5,5-8, faixa essa em que o agente emulsivo atua muito bem. Com diminuições do ph, o potencial eletrostático é reduzido, as forças de repulsão decrescem e o sistema pode tornar-se instável. Com o ph na faixa de aproximadamente 2,5, pode ocorrer a perda total das forças de repulsão, quando os lipossomas passam a colidir livremente. A solução de glicose e os eletrólitos adicionados em concentrações ou condições inadequadas alteram o mecanismo de equilíbrio entre as forças eletrostáticas, deflagrando-se o mecanismo de instabilidade. A glicose exerce efeito prejudicial quando reduz excessivamente o ph da solução 4. Os sais de cálcio, magnésio e fósforo são componentes da nutrição parenteral (NPT) que, pela suas cargas divalentes, possibilitam a formação de precipitados, que são potencialmente causadores de interferência nas forças eletrostáticas, neutralizando as cargas negativas dos lipossomas 5. Pela fórmula de Schultz-Hardy, que calcula o valor do número de agregação crítico de cátions (CAN, de critical agregation number ), podemos prever a quantidade de mudança catiônica possível de causar interferência na estabilidade das ELs utilizadas nas formulações de NPTs 3. Quando acontece a floculação/agregação dos lipossomas, seja por qual for a interferência, ocorre aumento nos tamanhos dos mesmos e, conseqüentemente, há a possibilidade de ocorrer a coalescência. Esse efeito é atenuado quando a glicose e os eletrólitos estão diluídos no volume total da solução em água para injeção e com a solução de aminoácidos, que exerce efeito tampão devido ao ph que possuem. As soluções de aminoácidos aumentam a barreira mecânica em torno dos lipossomas, diminuindo sua agregação. Os lipossomas tem em média 0,6µ de diâmetro nas ELs originais, possuindo centros homogêneos. Um lipossoma com diâmetro acima de 5µ entrando na corrente circulatória pode causar embolia gordurosa 6. Material e métodos Na avaliação das amostras estudadas, os seguintes parâmetros da ultraestrutura dos lipossomas foram observados ao microscópio eletrônico: suas camadas superficiais externas, o diâmetro e a presença ou não de corpúsculo com núcleo luminoso, alterações de floculação/agregação e coalescência/aglutinação. A floculação consiste na reunião dos lipossomas da fase dispersa em agregados ou flóculos, sendo que esta alteração não representa modificação irremediável, é possível recompor-se o sistema disperso inicial por simples agitação. A coalescência é uma alteração que se dá de maneira muito mais profunda, irreversível, e, quando ocorre, não 46

3 Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1 permite a recomposição. O ritmo de coalescência depende de diversos fatores como o tempo e temperatura de estocagem, as interações entre os cátions adicionados entre outros, mas, principalmente, das características físicas da película formada pelo agente emulsivo ao redor dos glóbulos dispersos. Nesse estudo, foram avaliadas amostras triplicatas de 28 formulações de NPTs, mais comumente usadas na prática clínica, nos tempos de 0, 24, 48 e 72 horas após sua manipulação, dosados os valores respectivos de ph, calculados os valores de CAN nas soluções básicas para adultos, pediatria e neonatos, abaixo descritas: Emulsão lipídica pura com triglicérides de cadeia longa (TCL); Emulsão lipídica pura com mistura de 50% de triglicérides de cadeia longa e 50% de cadeia curta (MCT/LCT); Nutrição parenteral básica para pacientes adultos, variando a glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, oligoelementos e 15% de EL; Nutrição parenteral básica para pacientes adultos, aditivada de L-alanil L-glutamina, glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20, 25%, sais normais, vitaminas, oligoelementos e 15% de EL; Nutrição parenteral básica para pacientes adultos, variando a glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, aditivadas com composição de oligoelementos contendo zinco, cobre, manganês, cromo, selênio, ferro, iodo, fluor e L-alanil L- glutamina e 15% de EL; Nutrição parenteral para pacientes adultos, fixando em 15% de proteína, glicose hipertônica, sais normais, vitaminas, oligoelementos em concentrações fixas e elevadas de EL para administração em veias periféricas, aditivada de heparina e L-alanil L-glutamina; Nutrição parenteral básica para pacientes adultos, variando a glicose hipertônica nas concentrações de 10, 20 e 25%, sais normais, vitaminas, aditivadas de L-alanil L-glutamina, insulina nas concentrações de 1/5,1/10, 1/15 e 15% de EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicose hipertônica nas concentrações comuns usadas, vitaminas, oligoelementos, sais normais, gluconato de cálcio acima do limite normal de reposição (600mg/kg/dia) e EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicose hipertônica, vitaminas, oligoelementos, concentração de eletrólitos normais (cálcio e fósforo), aditivada de 0,1 UI de heparina por ml e EL; Nutrição parenteral básica para neonatos, glicose hipertônica, vitaminas, oligoelementos, concentração de eletrólitos normais (cálcio e fósforo), aditivada de 0,2 UI de heparina por ml de solução e EL; Nutrição parenteral básica para pediatria, glicose hipertônica, sais normais, vitaminas, oligoelementos, aditivadas de L-alanil L-glutamina. No procedimento experimental, as NPTs foram preparadas conforme as recomendações das Boas Práticas de Preparação de Nutrição Parenteral, do Regulamento Técnico para Terapia de Nutrição Parenteral, Portaria nº. 272, de 15 de abril de 1999, do Ministério da Saúde (MS), que preconizam a preparação asséptica em área classificada (área com ar ambiente controlado e filtrado) e sob capela de fluxo unidirecional classe 100, e que contribuíram para manutenção da esterilidade dos insumos utilizados. A cada 0,1 ml de amostras em triplicatas das NPTs preparadas, foram adicionados 0,2 ml de tetróxido de ósmio à temperatura de 8ºC e centrifugadas a rpm, durante uma hora. As amostras foram banhadas em óxido de propileno puro e incluídas em resina pura, mantida em repouso durante uma hora na estufa a 37ºC 7,8. Todas as amostras estudadas das NPTs tiveram uma amostra enviada ao Laboratório de Controle de Qualidade em Alimentos e Produtos, onde não se evidenciou crescimento microbiano após cinco dias de sua preparação. Para o estudo, foram preparadas composições básicas de NPTs para pacientes adultos, neonatos e pediátricos e acrescidas variações a partir dessas (Tabelas 1, 2, 3 e 4): As composições das ELs originais e das misturas 3 em 1 de nutrição parenteral que formaram as amostras desse estudo estão descritas abaixo: Amostra 1 Emulsão com TCL pura a 20%; Amostra 2 Emulsão com TCM/TCL pura a 20%; Amostra 3 Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC e 15% EL; Amostra 4 Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC e 15% EL; Amostra 5 Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC e 15% EL; Amostra 6 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil L-glutamina (6,0 ml), 10% HC e 15% EL; Amostra 7 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil L-glutamina (6,0 ml), 20% HC e 15% EL; Tabela 1 - Composição de nutrição parenteral básica para pacientes adultos. Insumo Quantidade (ml) Solução de aminoácido a 10% 50 Fosfato de potássio 2 meq/ml 1 Cloreto de sódio 20% 1 Acetato de potássio 2 meq/ml 1 Sulfato de magnésio 10% 1 Polivitamínico 0,2 Oligoelementos 1 Gluconato de cálcio 10% 1 Água para injeção qsp

4 Antunes MS Tabela 2 - Composição de nutrição parenteral básica para neonatos. Insumo Insumo Etapa I Tabela 4 - Composição de nutrição parenteral básica para pacientes pediátricos. Quantidade (ml) Solução de aminoácido a 10% 20 Fosfato de potássio 2 meq/ml 1 Solução de glicose a 50% 40 Cloreto de sódio 20% 1 Acetato de Potássio 2 meq/ml 1,3 Polivitamínico 2,5 Oligoelementos 1 Água para injeção qsp 100 Quantidade (ml) Solução de Aa para neonatos 10 Solução de glicose a 50% 10 Água para injeção 15 Cloreto de sódio 20% 0,44 Cloreto de potássio 10% 1,12 Sulfato de magnésio 1 meq/ml 0,5 Oligoelementos 0,3 Acetato de zinco (rediluído) 0,4 Polivitamínico 1 EL 5 VT 50 Etapa II Solução de Aa para neonatos 10 Solução de glicose a 50% 10 Água para injeção 23 Cloreto de sódio 20% 0,44 Fosfato de potássio 2 meq/ml 0,73 Polivitamínico B 0,5 EL 5 Peso para cálculo: 1,0 kg; aminoácido: 2 g/kg; hidrato carbono: 7 mg/kg/min; lipídeo: 2 g/kg; 3 meq/kg de NaCl; 1,5 meq/kg de KCL; 0,5 meq/kg de sulfato de magnésio; 0,8 mmol/kg de fosfato de potássio; cota básica de vitaminas e oligoelementos; volume: 100 ml/kg em duas etapas, separando a administração de cálcio e fósforo Tabela 3 - Composição de nutrição parenteral básica para pacientes pediátricos. Insumo Quantidade (ml) Solução de aminoácido a 10% 20 Solução de glicose a 50% 40 Cloreto de sódio 20% 1 Acetato de potássio 2 meq/ml 1,3 Sulfato de magnésio 1 meq/ml 0,5 Polivitamínico 2,5 Oligoelementos 1 Gluconato de cálcio 10% 2 Água para injeção qsp 100 Peso para cálculo: 26 kg; idade: oito anos; VT = 80 ml/kg/dia; 80 kcal/kg/dia; Aa: 1,5g/kg; HC: 20%; Lip: 30%; relação 1/250. Peso para cálculo: 26 kg; idade: oito anos; VT = 80 ml/kg/dia; 80 kcal/kg/dia; Aa: 1,5 g/kg; HC: 20%; Lip: 30%; relação 1/250. Amostra 8 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de L-alanil L-glutamina (6,0 ml), 25% HC e 15% EL; Amostra 9 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de oligoelementos com selênio e ferro, 25% HC e 15% EL; Amostra 10 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de oligoelementos com selênio e ferro, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), 10% HC e 15% EL; Amostra 11 Nutrição parenteral básica para adultos, aditivada de oligoelementos com selênio e ferro, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), 25% HC e 15% EL; Amostra 12 Nutrição parenteral periférica para adultos, 15% de Aa, 30% HC, 55% EL, aditivada de L-alanil L-glutamina (6,0 ml) e heparina (100 UI); Amostra 13 Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/5 e 15% EL; Amostra 14 Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/5 e 15% EL; Amostra 15 Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina relação 1/5 e 15%; Amostra 16 Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; Amostra 17 Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; Amostra 18 Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/10 e 15% EL; Amostra 19 Nutrição parenteral básica para adultos, 10% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 20 Nutrição parenteral básica para adultos, 20% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 21 Nutrição parenteral básica para adultos, 25% HC, L-alanil L-glutamina (6,0 ml), insulina na relação 1/15 e 15% EL; Amostra 22 Nutrição parenteral básica para neonatos, adição de cálcio (600 mg/kg/dia) e EL; Amostra 23 Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de cálcio (300 mg/kg/dia) aditivada de heparina 0,1 UI/mL; Amostra 24 Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de fósforo (0,8 mmol/kg/dia) aditivada de heparina 0,1 UI/mL; Amostra 25 Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de cálcio (300 mg/kg/dia) aditivada de heparina 0,2 UI/mL; 48

5 Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1 Amostra 26 Nutrição parenteral básica para neonatos, concentração normal de fósforo (0,8 mmol/kg/dia) aditivada de heparina 0,2 UI/mL; Amostra 27 Nutrição parenteral básica para pediatria, concentração normal de cálcio (200 meq/ml), aditivadas de L-alanil L-glutamina (0,2 g/kg); Amostra 28 Nutrição parenteral básica para pediatria, concentração normal de fósforo (45 meq/ml), aditivadas de L-alanil L-glutamina (0,2 g/kg). As análises dos lipossomas basearam-se nos seguintes aspectos ultraestruturais à microscopia eletrônica: suas camadas de superfície, podendo apresentar-se com aspecto liso, irregular ou rugoso; fina, moderadamente espessada ou espessada; e quanto a corpúsculos no núcleo dos lipossomas, sendo ausentes ou presentes, e normal ou pigmentado. Foram analisado o estado de integridade física da EL, podendo apresentar o primeiro estágio do processo de alteração, a floculação, ou o último estágio de alteração, antes da separação de fases, a coalescência/aglutinação, utilizando como referência o diâmetro dos lipossomas nas ELs a 20% antes de misturadas, que apresentaram-se em média com tamanho de 0,6µ. Resultados As amostras estudadas foram comparadas com as amostras controle com lipossomas na EL original de padrão normal (Figura 1) e com lipossomas em coalescência (Figura 2). Os achados referentes à presença ou não de instabilidade, como floculação/agregação e ou coalescência/aglutinação, avaliados ultraestruturalmente, encontram-se resumidos na Tabela 5. Discussão Das 28 amostras representativas de NPTs, cinco apresentaram ELs estáveis, 16 ELs com lipossomas em fase de floculação/agregação e sete ELs com lipossomas em fase de coalescência/aglutinação. Dentre as amostras que apresentaram floculação/agregação podemos discutir os seguintes aspectos observados: Para as amostras 4 e 5: a presença de 20 e 25% de glicose nas soluções é responsável pelo declínio do ph final, com valores encontrados 5,7 e 5,5 respectivamente, que propiciam modificações relativas nas forças eletrostáticas, facilitando a aproximação dos lipossomas, mas sem que ocorra sua aglutinação. Os diâmetros desses apresentaram-se referencialmente maiores que das ELs originais. Os valores de CAN estavam dentro da faixa de segurança. Para as amostras 7 a 11, 13 a 20 e 28 (Figuras 3 e 4): a floculação ocorreu supostamente devido a adição de glicose, mesmo em diferentes concentrações apresentadas nas diversas formulações estudadas que, como já descrito anteriormente, levam ao declínio do ph, modificando relativamente as forças eletrostáticas e aproximando os lipossomas, sem que sofram agregação. Os valores de CAN encontrados estavam dentro da faixa de segurança. Dentre as amostras que apresentaram coalescência/aglutinação podemos discutir os seguintes aspectos observados: Para a amostra 12 (Figura 5): a coalescência ocorreu supostamente devido a três situações: alta concentração de glicose (30%), responsável pelo declínio no valor do ph da solução final, pela elevada concentração de EL (55%) na formulação e pela adição de heparina diretamente à mistura 3 em 1, aumentando o tempo de contato da heparina com os in- Figura 1 - Lipossomas de padrão normal EL 20% original, 0,6µ ( X). Figura 2 - Lipossomas em coalescência após contato glicose 50%, 2,76µ ( X). 49

6 Antunes MS sumos componentes. A heparina é estável em NPTs, como misturas 3 em 1 em concentrações de até UI/L por pelo menos 30 horas 5. O fenômeno de incompatibilidade entre a heparina e a EL em mistura 3 em 1 está condicionado à presença de cálcio, à concentração deste na formulação, à adição na manipulação, à sua estocagem após preparação e à temperatura. Na amostra referida, mesmo com o valor de CAN na faixa de segurança, supomos que o cálcio foi complexado por polissacarídeos. O complexo cálcio/heparina neutralizou as forças eletrostáticas, nas quais o cálcio funcionou com uma ponte catiônica entre os grupos aniônicos da heparina e dos lipídeos 9,10. Figura 3 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica adulto 20% HC; T = 72h ( X). Figura 4 - Eletromicrografia de transmissão da NPT pediátrica, fósforo normal, glutamina; T = 72h ( X). 50 Tabela 5 - Floculação/ agregação e/ ou coalescência/ aglutinação. Am ph Diâm (µ) CAN HC EL Ins Glu Hep Estab Hora 1 6,5 0, % Est 0h 2 6,5 0, % Est 0h 3 5,6 0, % 15% Est 0h 4 5,7 0, % 15% Floc 24h 5 5,5 0, % 15% Floc 24h 6 6,0 0, % 15% Est 0h 7 6,0 0, % 15% Floc 0h 8 5,9 0, % 15% Floc 0h 9 5,7 0, % 15% Floc 0h 10 6,0 0, % 15% Floc 0h 11 6,0 0, % 15% Floc 24h 12 4,0 2, % 55% Coal 48h 13 6,0 0, % 15% 1/5 0 0 Floc 0h 14 6,0 0, % 15% 1/5 6 ml 0 Floc 0h 15 6,0 0, % 15% 1/5 6 ml 0 Floc 0h 16 5,7 0, % 15% 1/10 6 ml 0 Floc 0h 17 5,7 0, % 15% 1/10 6 ml 0 Floc 0h 18 5,7 0, % 15% 1/10 6 ml 0 Floc 0h 19 6,0 0, % 15% 1/15 6 ml 0 Floc 0h 20 5,7 0, % 15% 1/ Floc 0h 21 4,5 2, % 15% 1/ Coal 48h 22 5,7 2,1 980,36 TIG NOR Coal 24h 23 6,0 2,05 500,36 TIG NOR 0 0 0,1 Coal 72h 24 5,7 0,52 48,22 TIG NOR 0 0 0,1 Est 0h 25 5,9 2,08 500,36 TIG NOR 0 0 0,2 Coal 24h 26 5,9 2,07 48,22 TIG NOR 0 0 0,2 Coal 48h 27 7,0 2,04 411,80 20% 30% 0 0,2 ml 0 Coal 24h 28 7,0 0,61 91,80 20% 30% 0 0,2 ml 0 Floc 0h TIG = 7 mg/kg/dia; Ins = UI/gHC; Glu= g/kg; Hep = UI/mL

7 Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1 Para a amostra 21 (Figura 6): o processo de coalescência foi supostamente desencadeado pela concentração da glicose a 25% (que já é o limite máximo de concentração estável) após 48 horas da manipulação e também responsável pelo declínio no ph da solução final, que diminuiu a barreira eletrostática entre os lipossomas. Acreditamos que a insulina na presente concentração 1/15 (1 UI para cada 15 gramas de glicose), assim como nas demais concentrações, conforme descrição na Tabela 5, que são inclusive concentrações maiores (1/5 e 1/10), não contribuiu para a alteração da formulação. Para a amostra 22 (Figura 7): a coalescência ocorreu supostamente pela perda da barreira eletrostática e, conseqüentemente, da barreira mecânica, dependentes do estresse físico-químico causado pela concentração de cátion divalente (Cálcio) elevado. Com a neutralização das forças eletrostáticas pelos cátions divalentes, ocor- reu rompimento do filme interfacial e da barreira mecânica ao redor dos lipossomas, e esses passaram a colidir sucessivamente, favorecendo a coalescência. Ocorrendo perda das camadas de superfície dos lipossomas, formaram-se partículas de diâmetros maiores, podendo variar de 2µ a 15µ Os lipossomas com esse diâmetro, mesmo estando ainda em dispersão, escapam da faixa de acuidade visual na inspeção e apresentam um grande potencial de risco clínico. Ao analisarmos o valor do CAN calculado com os cátions da formulação da amostra em questão podemos confirmar que o resultado encontra-se acima da faixa de segurança. O valor de ph encontrado, que não sofreu alteração, pareceu não interferir favorecendo mais efetivamente na instabilidade da solução 3. Para a amostra 23 (Figura 8): a coalescência ocorreu supostamente pela perda da barreira eletrostática e conseqüen- Figura 5 - Eletromicrografia de transmissão da NPT periférica, adulto, glutamina, heparina; T = 48h, 2,13µ ( X). Figura 7 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica, neonatos, Ca elevado; T = 24h, 2,10µ ( X). Figura 6 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica, adulto, 25% HC, glutamina, 1/15; T = 48h, 2,14µ ( X). Figura 8 - Eletromicrografia de transmissão da NPT básica neonatos, Ca normal, heparina 0,1 UI/mL; T = 72h, 2,05µ ( X). 51

8 Antunes MS Figura 9 - Eletromicrografia de transmissão da NPT neonatos Ca normal, heparina 0,2 UI/mL; T = 24h, 2,08 µ ( X). Figura 11 - Eletromicrografia de transmissão da NPT pediátrica, Ca normal, glutamina; T = 24h, 2,06µ ( X). Figura 10 - Eletromicrografia de transmissão da NPT neonatos fósforo normal, heparina 0,2UI/mL; T = 72h, 2,07µ ( X). presença de cátion divalente como o fosfato e a heparina, em neutralização ao potencial zeta dos lipossomas. O ph mantendo-se em 5,9 (valor dosado), não favoreceu a coalescência, mas a presença de heparina em uma concentração de 0,2 UI/mL, pode efetivamente ser um promotor da instabilidade 9,10. Para a amostra 27 (Figura 11): a coalescência ocorreu após 24 horas da preparação supostamente pela concentração de 20% da glicose em relação a concentração de EL da fórmula, alterando o potencial zeta ao redor dos lipossomas. Mesmo com uma concentração de aminoácidos como a L-alanil L-glutamina adicionados, que elevam o ph e atuam com um efeito tampão, não ocorreu o aumento do mesmo. O declínio do ph justifica-se, pois a concentração do aminoácido glutamina foi computada na concentração final de aminoácidos proposta pela prescrição e não excedendo a relação entre os componentes da formulação temente da barreira mecânica, dependentes também de estresse físico-químico causado pelo complexo cálcio/heparina, mesmo em baixas concentrações de ambos, após 72 horas. Podemos avaliar que o ph não sofreu grande declínio e não foi um fator de interferência na instabilidade, assim como o valor obtido no cálculo do CAN para os cátions, cujo resultado encontra-se dentro da faixa de segurança 9,10. Para a amostra 25 (Figura 9): a coalescência ocorreu supostamente pela complexação de cálcio/heparina na amostra, mesmo estando o cálcio em valor normal de concentração e o CAN na faixa de segurança. A observação sugere que com essa concentração de heparina, (0,2UI/mL) após um tempo de contato, que, no caso, foi de 24 horas, houve desencadeamento da instabilidade da EL. O valor de ph encontrado não sugere uma interferência no processo de coalescência 9,10. Para a amostra 26 (Figura 10): a coalescência ocorreu após 48 horas do preparo da solução, supostamente pela Conclusões Nas condições do presente estudo, obtivemos as seguintes conclusões: A dosagem do ph deve ser sempre realizada, por ser um dos fatores predisponentes mais importantes de instabilidade. Para ph em declínio, na faixa de 4,0 a 5,0, as forças eletrostáticas são facilmente neutralizadas ao redor dos lipossomas facilitando sua instabilidade; Os cálculos dos valores de CAN, que considera a interferência dos cátions na estabilidade, devem ser realizados em todas as formulações, excetuando as previamente estudadas e padronizadas, pois definem as possibilidades de interferência após a adição das ELs na estabilidade nas soluções; Dentre os insumos utilizados mais freqüentemente nas NPTs, a glicose representa o de maior risco, como obser-

9 Estudo à microscopia eletrônica da estabilidade física de emulsões lipídicas utilizadas em misturas 3 em 1 vamos nos resultados obtidos nas análises em triplicatas das amostras 4, 5, 7, 8, 10 e 11, nas quais esse componente supostamente influenciou na floculação, causando coalescência somada a adição de heparina em concentrações como de 30% na amostra 12; A estabilidade cálcio/fósforo é maior com concentrações maiores de soluções de aminoácidos, pela formação complexa solúvel com ambos, diminuindo a quantidade desses íons livres, que interferiram em menor escala nas formulações, e conseqüentemente na solução final após a adição da EL; A adição de heparina em misturas 3 em 1 na concentração de 1 UI/mL contendo cálcio para manutenção/reposição e não em concentrações mais elevadas é estável até 24/30 horas; A adição de heparina na concentração de 0,2 ml/ml em misturas 3 em 1 com CANs elevados é proibitiva de preparação; A adição de eletrólitos deve ser sempre que possível a de manutenção e não de reposição; A adição de L-alanil L-glutamina em concentrações recomendadas 11 na literatura são protetoras dos lipossomas das ELs, estudadas em igual observação para as misturas 3 em 1 contendo TCM/TCL ou TCL puro, contribuindo para sua estabilidade. Referências bibliográficas 1. Antunes M; Guedes J. Controle de qualidade de misturas de ácidos aminados, hidrato de carbono e emulsão de lipídeos para uso parenteral (3 em 1). Arq Bras Méd 1994;68(5): Prista LN, Alves AC, Morgado RR. Técnica Farmacêutica e Farmácia Galénica II volume 3ª ed. Lisboa. Fundação Calouste Gulbenkian p. 518., III volume 3ª ed. Lisboa Fundação Calouste Gulbenkian p. 602., I volume 4 ª ed. Lisboa Fundação Calouste Gulbenkian p Driscoll DF, Bhargava HN, Li L, Zaim RH, Babayan VK, Bistrian BR. Physicochemical stability of total nutrient admixtures. Am J Health Syst Pharm. 1995;52(6): Li J, Caldwell KD. Strutural studies of comercial fat emulsions used in parenteral nutrition. J Pharm Sci 1994;83(11): Trissel LA, Gilbert DL, Martinez JF, Baker MB, Walter WV, Mirtallo JM. Compatibility of Medications with 3-in-1 parenteral nutrition admixtures. JPEN 1999;23(2): Hill SE, Heldman LS, Goo ED, Whippo PE, Perkinson JC. Fatal microvascular pulmonary emboli from precipitation of total nutrient admixture solution.jpen 1996;20: Universidade Federal Fluminense Serviço de Microscopia Eletrônica. Técnicas básicas para Microscopia Eletrônica Rio de Janeiro, Hamilton VL, Du Plessis J, Van Wyk CJ. A new scanning electron microscope (SEM) method for the determination of particle size in parenteral fat emulsions. J Micros 1987;145 (Pt 3): Hayat MA. Principles and Techniques of Electron Microscopy Biological Applications Third Edition. Crc Press. Inc. Raton, Flórida p Silvers KM, Winterbourn CC. The destabilization of total parenteral nutrition by heparin How real is the problem? N Z Med J 1997 Oct 10;110(1053):386. Silvers KM, Darlow BA, Winterbourn CC. Pharmacoligic levels of heparim do not destabilize neonatal parenteral nitrition. J.PEN 1998;22: Waitzberg DL. Nutrição oral, enteral e parenteral na prática clínica. Volumes 1 e 2, 3ª ed. São Paulo Editora Atheneu,