MANUAL DE PRÁTICAS DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS

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1 Universidade do Estado do Rio de Janeiro FACULDADE DE TECNOLOGIA ENGENHARIA DE PRODUÇÃO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E AMBIENTAL PROCESSOS BIOQUÍMICOS MANUAL DE PRÁTICAS DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS APOSTILA DAS AULAS PRÁTICAS Denise Celeste Godoy de Andrade Rodrigues Telma Temóteo dos Santos Agosto de 2011

2 Índice 1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS Roteiro da Prática 1 Quantificação de Micro-organismos Preparo da Suspensão de Células Determinação do peso seco de células (%p/v) Turbidimetria Contagem de células em câmara de NEUBAUER Determinação do volume do centrifugado (% v/v) Estudo Dirigido Relatório da Prática DOSAGEM DE AÇÚCARES Método do DNS (3,5 dinitro salicilato) Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/ml Construção da Curva Padrão Estudo Dirigido Relatório da Prática ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART) Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e Açúcares Redutores Totais (ART) Determinação de Açúcares Redutores (AR) Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART) Dosagem de açúcares pelo método do DNS Relatório da Prática Grau Brix Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX Procedimento Relatório da Prática Cinética do Crescimento Microbiano Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de Leveduras Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células Determinação da concentração de biomassa (X) Relatório DA Prática Produção de Etanol Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-de-açúcar Fermentação Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase) Relatório da Prática Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2% Preparo da solução de YED 2% Produção de células e de etanol e consumo de glicose Determinação do álcool pelo método do dicromato Relatório da Prática Acidez de vinhos Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos Procedimento Relatório da Prática Preparo de Soluções e Indicadores...40

3 1. ESPECTROFOTOMETRIA E CURVAS-PADRÃO O termo espectro foi utilizado inicialmente por Newton, quando este descobriu que a luz branca, ao atravessar um prisma, é dividida em várias cores. Atualmente, sabe-se que o espectro visível é apenas uma pequena parte do espectro eletromagnético. A luz é, portanto, definida como uma forma de energia eletromagnética, formada por ondas que apresentam comprimentos diferentes. O comprimento de onda é medido em nm onde 1,0 nm equivale a 10-9 m. A tabela 1.1 mostra as regiões do espectro em relação ao comprimento de onda. Tabela 1. 1: Regiões do espectro em função do comprimento de onda Região Comprimento de onda (nm) Raios X 0,1 a 100 Ultravioleta 100 a 400 Visível 400 a 800 Infravermelho 800 a Mico-onda a A capacidade que as diversas substâncias químicas têm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinação quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absorção é característico para uma determinada substância e a quantidade de absorção (intensidade) é dependente da concentração do composto. Os métodos instrumentais estão sendo expandidos para a escala industrial e abrangem as mais diversas análises nas inúmeras áreas de atuação na industria química destacando-se os métodos espectrofotométricos. A espectrofotometria medida de absorção ou transmissão de luz é uma das mais valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem como em análises clínicas e biológicas. Alguns exemplos de aplicação incluem: determinação de atividade enzimática ou nas dosagens de compostos orgânicos em fluidos biológicos, como glicose, uréia, proteínas, etc, em que se dosa um produto colorido, obtido por meio de uma reação química, ou um produto incolor que absorva na região do UV ou do IV. A técnica baseia-se no fato de que quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 2

4 e da espessura da solução caminho óptico (Figura 1.1). Deve-se utilizar um feixe de luz monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado. Beer em 1852 observou a relação existente entre a transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma determinada solução absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto, isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente ". Figura 1. 1: Esquema de Absorção da Luz Fonte: A análise quantitativa em espectrofotometria é realizada através da medida da absorbância, a qual se relaciona linearmente com a concentração dentro de uma faixa de concentração, seguindo a lei de Lambert- beer. Para medidas de absorção de luz visível e ultravioleta na pesquisa bioquímica a indústria especializada fabrica vários tipos de aparelhos, comumente chamados de espectrofotômetros (Figura 1.2). Nos espectrofotômetros a luz, fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou rede de difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes monocromáticas). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida. A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotoelétrica) porque o sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele. O sinal elétrico amplificado e visualizado no galvanômetro em números é lido como uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvente existente na cubeta. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 3

5 Figura 1. 2: Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam: (a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador. Se houver proporcionalidade entre a absorbância e a concentração da substância, pode-se determinar a concentração da substância em amostras de concentração não conhecida com base numa curva de calibração, que relaciona absorbância e concentração. Na Figura 1.3 á apresentada uma curva de calibração, que corresponde à relação gráfica entre os valores de absorbância e os de concentração. Figura 1. 3: Curva de Calibração: Absorbância em função da Concentração Para se plotar uma curva padrão é necessária a leitura de pelo menos quatro pontos, se esta estiver na faixa de linearidade ou de dez pontos, caso não esteja. Além disso, é preciso trabalhar, ao menos em triplicata para cada ponto. A curva é obtida a partir da inserção de uma linha de tendência que passe pelos pontos experimentais. No exemplo da Figura 1.3 observa-se que o ajuste dos pontos experimentais foi feito com uma reta. A qualidade do ajuste é avaliada pelo valor do R 2, não mostrado neste exemplo. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 4

6 Com base na análise gráfica da Figura 1.3 é possível verificar a linearidade da reação e calcular um fator de conversão de valores de absorbância em concentração. FC = Média (C p /A p ) C = A.FC Onde: FC - fator de conversão ou fator da curva Ap - absorbância do padrão Cp - concentração do padrão C - concentração da amostra A - absorbância da amostra Observação: Pode-se trabalhar com a Absorbância (A), como mostrado no texto, ou com a Transmitância (T). Na prática, a transmitância, que é medida em uma escala de 0 (no escuro) a 100% (com o branco na passagem da luz), é pouco utilizada, pois é substituída pelo valor de densidade óptica (D.O.) ou absorvância, termo mais aceito atualmente, que corresponde ao logaritmo do inverso da transmitância: A = log 1/T Referências: BRACHT, A; ISHII-IWAMOTO, E. L. Métodos de Laboratório em Bioquímica. São Paulo: Manole, Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 5

7 2. QUANTIFICAÇÃO DE MICRO-ORGANISMOS Os micro-organismos possuem a capacidade de ocupar e modificar um determinado ambiente de forma rápida. A partir da proliferação, os micro-organismos também excretam enzimas que modificam reagentes para a formação de novos produtos. Diante disso, a quantificação microbiana é um importante acompanhamento em processos industriais que envolvam micro-organismos diretamente, exemplo da fermentação alcoólica, ou para se verificar a minimização dos mesmos quando estes não são desejáveis, como é o caso das salas de preparo de injetáveis nas indústrias farmacêuticas. Como exemplo de quantificação microbiana na industria tém-se a Portaria nº 518/04, que estabelece que a quantidade de bactérias heterotróficas presentes na água não pode ultrapassar 500 UFC/ml senão há a necessidade de reteste,inspeção da fonte ou outras providências cabíveis. Uma situação oposta, ao se considerar alimentos com atividade próbiótica, a contagem mínima deve ser de 10 8 a 10 9 UFC na dose diária recomendada ou a empresa deve comprovar a eficácia do produto como probiótico. O crescimento dos micro-organismos pode ser mensurado por diferentes técnicas, tais como pelo acompanhamento da variação no número ou peso de células, por exemplo. A escolha do método é função do Micro-organismo e das características do meio de fermentação (cor, sólidos presentes, etc.). Não existe um método absoluto para a quantificação microbiana ou determinação da viabilidade celular de uma população de células. Para estimar a proporção de células viáveis em uma cultura ou processo fermentativo, métodos baseados no plaqueamento ou observação microscópica têm sido utilizados. Os métodos de contagem direta são rápidos e simples, exigindo um mínimo de equipamento, permitindo que seja observada, simultaneamente, a morfologia celular. Outros métodos amplamente empregados são densidade ótica (ou absorbância), peso seco de células, volume de centrifugado, número mais provável, dentre outros. Alguns destes métodos serão vistos na prática 1. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 6

8 Referências: Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Brasil, Portaria nº 518, de 25 de março de Estabelece os procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade, e dá outras providências. D.O.U. - Diário Oficial da União; Poder Executivo, de 26 de março de Disponível online em: < Acesso em: 31/07/2008. FDA, Bacteriological Analytical Methods, Disponível online em: < Ultimo acesso em: 29/07/2008. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 7

9 2.1 Roteiro da Prática 1 Quantificação de Micro-organismos Material 1 balão volumétrico de 100 ml 6 balões volumétricos de 250 ml 2 balões volumétricos de 1000 ml 1 Becher de 100 ml 1 Bastão de vidro 1 tubo de centrífuga pipetas volumétricas de 2, 3, 5, 10 e 15 ml 1 pesa-filtro Equipamentos estufa espectrofotômetro UV-Visível centrífuga balança dessecador câmara de Neubauer microscópio Reagentes Fermento Biológico Água Objetivo: Determinar a concentração de células de levedura em uma suspensão, usando 4 diferentes técnicas de quantificação Preparo da Suspensão de Células Pesar cerca de 1 g de fermento biológico em um becher de 100 ml Dissolver em água destilada e diluir em balão volumétrico de 100 ml Determinação do peso seco de células (%p/v) Pipetar 10 ml da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e transferir para pesa-filtro de tara conhecida. Secar em estufa entre 100 e 120ºC até peso constante. Determinar, por diferença de massa, o peso seco de células e expressar o resultado em termos de massa seca de células (g) / 100 ml de suspensão Turbidimetria Diluir alíquotas de 2, 3 e 5 ml da suspensão de células em balões volumétricos de 250 ml e alíquota de 15 ml em balão volumétrico de ml (fazer em duplicata). Ler a absorbância das suspensões diluídas em espectrofotômetro (=570 nm), usando água destilada como branco. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 8

10 Contagem de células em câmara de NEUBAUER Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Diluir a suspensão 50 vezes. Gotejar a suspensão diluída em câmara de NEUBAUER e cobrir com a lamínula. Efetuar a contagem de 5 dos 25 quadrados da câmara (Figura 2.1). Expressar o resultado em termos do número de células / ml da suspensão original, com base no seguinte cálculo: ( 5 quadrados) x (5x10 4 ) x diluição Figura 2. 1: Câmara de Neubauer. A. O círculo indica a área aproximada coberta pelo aumento de 100 vezes ao microscópio (10X ocular e 10X objetiva) de uma câmara de contagem padrão. B. Aspecto de um quadrado integrante do quadrado médio, mostrando que devem ser contadas as células que tocam as linhas do topo e da esquerda do quadrado, desprezando aquelas que tocam a linha de baixo e da direita do quadrado. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 9

11 Determinação do volume do centrifugado (% v/v) Pipetar 10 ml da suspensão de células recém preparada, previamente agitada e transferir para tubo de centrífuga graduado. Centrifugar por 15 minutos. Anotar o volume de células. Expressar o resultado em termos de volume de células / 100 ml da suspensão Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de micro-organismos e para controle de qualidade. 2) Quais as possíveis fontes de erro das técnicas utilizadas nesta prática? 3) Discutir a aplicabilidade de cada técnica utilizada nesta prática. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 10

12 Relatório da Prática 1 Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários: - Determinação do volume do centrifugado (% v/v) volume da suspensão: volume de células: % v/v: - Determinação do peso seco de células (%p/v) volume da suspensão: tara do pesa-filtro: pesa-filtro + células secas: peso das células secas: Peso seco (g/100 ml): - Contagem de células em câmara de NEUBAUER Contagem quadrados: A =, B =, C =, D =, E = 5 quadrados (A+B+C+D+E) = [células] da suspensão diluída 50 vezes = ( 5 quadrados) x (5x10 4 ) x (diluição) [células] da suspensão original = (nº células / ml) - Turbidimetria Diluição Vol. Susp. (ml) Vol. balão (ml) ABS 570nm ABS média Nº células células/ml Peso seco (g/100 ml) 2) Construir os seguintes gráficos, determinando a reta de calibração e o fator da curva: Absorbância 570 nm x peso seco das suspensões diluídas Absorbância 570 nm x nº células/ml das suspensões diluídas Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 11

13 3. DOSAGEM DE AÇÚCARES Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Os carboidratos, ou açúcares, com fórmula empírica (CH 2 O) n são um dos maiores grupos de compostos orgânicos conhecidos na natureza, e juntamente com as proteínas formam os principais constituintes dos organismos vivos. Os carboidratos simples mais abundantes são as pentoses e hexoses. Os açúcares possuem um ou mais átomos assimétricos de carbono, portanto podem existir na forma de estereoisômeros. Os carboidratos têm diversas classificações, de acordo com seu tamanho, com o grupo funcional que é derivado, entre outras. As classificações podem ser: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Os monossacarídios são carboidratos simples que não podem ser hidrolisados a açúcares de menor peso molecular. Podem ser classificados em aldoses (poliidroxialdeídos) e cetoses (poliidroxicetonas), sendo subdivididos em trioses, tetroses, pentoses e hexoses, de acordo com o número de carbonos na cadeia. Os oligossacarídios são polímeros compostos de resíduos de monossacrídios unidos por ligações hemiacetálicas, neste caso denominadas ligações glicosídicas, em número que variam de duas, até, aproximadamente, dez unidades. São compostos importantes na determinação de estruturas de polissacarídios. Na indústria existem diversas reações tanto de degradação como de formação de açucares que são determinantes no controle de qualidade dos produtos produzidos. Um açúcar redutor é um açúcar no qual o carbono da carbonila não está envolvido em uma ligação glicosídica e, portanto, pode sofrer oxidação. Os monossacarídeos podem ser oxidados por agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férrico e cúprico. O carbono do grupo carbonila é oxidado a ácido carboxílico. Todos os monossacarídeos são potencialmente redutores, devido a presença da carbonila. Outros carboidratos necessitam ser hidrolisados para se tornarem redutores. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 12

14 3.1 Método do DNS (3,5 dinitro salicilato) Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Um dos métodos empregados na quantificação de açúcares redutores é o método do DNS. É um método rápido e prático na determinação de açúcares redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de aplicação temos: controle de qualidade na caracterização das matérias primas para fins de processamento, e verificação se determinado produto está dentro dos parâmetros e padrões exigidos pela legislação; indústria açucareira, no acompanhamento do processo de fermentação, que permite verificar as taxas de consumo de açúcar pelo micro-organismo. A determinação de açúcares redutores pelo método do DNS baseia-se na redução, em meio alcalino, do 3.5-dinitrosalicilato (coloração amarela). O produto formado é estável, com coloração laranja-avermelhado (3-amino 5-nitro salicilato) na proporção estequiométrica e máxima absorção da luz visível no comprimento de onda de 535 nm. Neste método ocorre a seguinte reação de oxidação (Figura 3.1): Figura 3. 1: Reação de oxidação da carbonila pelo reagente DNS. Para se aplicar o método é necessário se fazer inicialmente uma curva-padrão do açúcar que se deseja quantificar, como será realizado na prática 2 deste manual. Referências: MILLER, G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar, Anal. Chem., n. 31, p.426, WANG, Nam Sun. Glucose assay by dinitrosalicylic colorimetric method. Disponível em: Acesso em: 10 ago Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 13

15 3.2 Roteiro da Prática 2 - Curva Padrão do Método DNS Material 1 balão volumétrico de 100 ml 1 Becher de 50 e de 100 ml 1 Bastão de vidro Buretas de 10 e 50 ml 7 tubos de ensaio com tampa de rosca Pipeta volumétrica de 1 ml Equipamentos espectrofotômetro UV-Vis balança termômetro banho-maria Reagentes Glicose Reagente DNS Objetivo: Construir uma curva padrão para determinação de açúcares redutores pelo método do DNS, empregando a glicose como padrão. Sensibilidade do método: 1-20 µmols glicose Preparo da Solução Padrão de Glicose: 5 µmols/ml Pesar, em um becher de 100 ml, 90 mg glicose. Anotar a massa para realizar os cálculos. Solubilizar com água destilada e transferir para balão volumétrico de 100 ml. Avolumar o balão Construção da Curva Padrão Em tubos de ensaio com tampa, e com auxílio da bureta de 10 ml, preparar os seguintes pontos da curva, em duplicata com exceção do branco: Água destilada (ml) Solução Padrão (ml) branco 1,0-1 0,8 0,2 ml 2 0,6 0,4 ml 3 0,4 0,6 ml 4 0,2 0,8 ml 5-1,0 ml Adicionar 1 ml de DNS em cada tubo. Agitar e aquecer à 100 C em banho-maria durante 5 min. Resfriar e acrescentar 13 ml de água destilada em cada tubo, com auxílio da bureta de 50 ml. Tampar os tubos e homogeneizar (volume final = 15 ml). Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 14

16 Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em: = 540 nm Estudo Dirigido 1) Pesquisar outras metodologias para quantificação de açúcares. 2) Ler o artigo Comparação de Métodos para Determinação de Açúcares Redutores e Totais em Mel, disponível na pasta da Disciplina de Processos Bioquímicos ou no link 3) Quais as possíveis fontes de erro na prática em questão? Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 15

17 Relatório da Prática 2 Componentes do Grupo: 1) Preencher os espaços abaixo, efetuando os cálculos necessários: Tubo ABS (540 nm) ABS média [glicose] (µg/ml) ) Construir a curva padrão de glicose: Abs x [glicose] µg/ml, determinando o coeficiente angular e o fator da reta obtida. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 16

18 4. ACÚCARES REDUTORES (AR) E AÇÚCARES REDUTORES TOTAIS (ART) A qualidade da cana-de-açúcar era determinada exclusivamente pela sacarose aparente (POL). Atualmente, englobam-se características físico-químicas e microbiológicas dessa matéria-prima, que podem afetar, significativamente, a recuperação deste açúcar na fábrica e a qualidade do produto final. Dois tipos de fatores afetam a qualidade da matéria-prima destinada à indústria: fatores intrínsecos: relacionados à composição da cana (teores de sacarose, açúcares redutores, fibras, compostos fenólicos, amido, ácido aconítico e minerais), sendo estes afetados de acordo com a variedade da cana, variações de clima (temperatura, umidade relativa do ar, chuva), solo e tratos culturais; fatores extrínsecos: relacionados a materiais estranhos ao colmo (terra, pedra, restos de cultura, plantas invasoras) ou compostos produzidos por microrganismos devido à sua ação sobre os açúcares do colmo. Desta forma, existem indicadores que permitem avaliar tanto a riqueza da cana como a qualidade da mesma para a recuperação dos açúcares. A Figura 4.1 ilustra a coleta de amostras de cana para avaliação da sua qualidade. A Tabela 4.1 apresenta os principais indicadores da qualidade da cana. Figura 4. 1: Coleta de amostras de cana no caminhão na entrada da empresa. Fonte: CONTAG01_138_ html Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 17

19 Tabela 4. 1: Indicadores da qualidade e valores recomendados para a cana-de-açúcar. Fonte: Ripoli e Ripoli (2004). Abaixo, seguem as definições de alguns destes indicadores: POL: teor de sacarose aparente na cana. Para a indústria canavieira, quanto mais elevados os teores de sacarose, melhor. Pureza: é determinada pela relação POL/Brix x 100. Quanto maior a pureza da cana, melhor a qualidade da matéria-prima para se recuperar açúcar. Todas as substâncias que apresentam atividade óptica podem interferir na POL, como açúcares redutores (glicose e frutose), polissacarídeos e algumas proteínas. ATR ou ART (Açúcares Redutores Totais): indicador que representa a quantidade total de açúcares da cana (sacarose, glicose e frutose). O ART é determinado pela relação POL/0,95 mais o teor de açúcares redutores. A concentração de açúcares na cana varia, em geral, dentro da faixa de 13 a 17,5%. Entretanto, é importante lembrar que canas muito ricas e com baixa percentagem de fibras estão mais sujeitas a danos físicos e ataque de pragas e microrganismos. Os estudos mostram que nas primeiras 14 horas de deterioração da cana, 93% das perdas de sacarose foram Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 18

20 devidas à ação de microrganismos, 5,7% por reações enzimáticas e 1,3% por reações químicas, resultantes da acidez. Açúcares redutores: é a quantidade de glicose e de frutose presentes na cana, que afetam diretamente a sua pureza, já que refletem em uma menor eficiência na recuperação da sacarose pela fábrica. A determinação de açúcares redutores pode ser realizada pelo método de DNS, utilizando-se como padrão a glicose. Na determinação de açúcares redutores totais, promove-se preliminarmente a hidrólise da sacarose com ácido clorídrico à quente, como será realizado na prática 3. Referências: RIPOLI, T. C. C.; RIPOLI, M. L. C. Biomassa de cana-de-açúcar: colheita, energia e ambiente. Piracicaba: Barros & Marques Ed. Eletrônica, p. VIAN, Carlos Eduardo Freitas. Qualidade de matéria-prima. Disponível em: Acesso em: 10 Jul Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 19

21 4.1 Roteiro da Prática 3 - Determinação de Açúcares Redutores (AR) e Açúcares Redutores Totais (ART) Material balão volumétrico de 500 ml 6 balões volumétricos de 100 ml pipetas volumétricas de 1, 2, 5, 10, 25 e 50 ml provetas de 25 e 100 ml 8 tubos de ensaio com tampa de rosca Buretas de 10 e 50 ml Becher de 100 ml Equipamentos espectrofotômetro UV- Vis banho-maria termômetro Reagentes 100 ml de Caldo de cana HCl 1:1 NaOH 0,1 mol/l Reagente DNS Padrão de glicose (aula anterior) Objetivo: Determinar a concentração de sacarose, glicose e frutose presentes no caldo de cana Determinação de Açúcares Redutores (AR) Diluir 1, 5 e 10 ml de caldo de cana in natura, ou melaço, em balões volumétricos de 100 ml. Pipetar 1 ml do caldo de cana, ou melaço, diluído e transferir para tubo de ensaio com tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior Determinação de Açúcares Redutores Totais (ART) Diluir 50,00 ml de caldo de cana in natura, ou melaço, em balão volumétrico de 500 ml. Adicionar a seguir 70 ml de água destilada. Inserir um termômetro no balão e levar o conjunto para banho-maria (~70 C) Quando a temperatura da solução atingir 65 C, retirar o balão do banho-maria e adicionar imediatamente 25 ml de HCl 1:1. Homogenizar e deixar em repouso, à temperatura ambiente, por 30 minutos. Após este tempo, avolumar o balão até volume final. Transferir 2, 10 e 25 ml do hidrolisado diluído para balões volumétricos de 100 ml. Adicionar NaOH 0,1 mol/l até completar o volume do balão. Pipetar 1 ml de cada solução acima para tubo de ensaio com tampa, devidamente identificado. Guardar as amostras para dosagem posterior. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 20

22 Dosagem de açúcares pelo método do DNS Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Preparar um padrão de glicose, como na prática anterior, para ler a absorbância junto com as amostras. Proceder a dosagem de açúcares redutores (amostras do item 4.1) e redutores totais (amostras do item 4.2) pelo método do DNS: adicionar 1 ml de DNS às amostras já colocadas nos tubos e levar ao banho-maria por 5 min. Deixar esfriar e completar com 13 ml de água destilada. Preparar amostra em branco (1 ml de água + 1 ml de DNS). Proceder a leitura da absorbância em espectrofotômetro em: = 540 nm. Se a absorbância da amostra estiver fora da curva de calibração, repetir o procedimento variando a diluição do hidrolisado. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 21

23 4.1.4 Relatório da Prática 3 Componentes do Grupo: 1) Dados obtidos na Prática: Diluição (AR) ABS (AR) Diliução (ART) ABS (ART) Concentração do Padrão de Glicose (µg/ml) = ABS do padrão de glicose = 2) Calcular o teor de sacarose e de açúcares redutores no caldo de cana (g/100ml) usando as seguintes equações: % AR = (C x B x F x 10-4 ) / P (g/100 ml) % ART = (A x B x F x 10-4 ) / P (g/100 ml) % sacarose = [%ART - %AR] x 0,95 (g/100 ml) onde: A = absorbância da amostra processada conforme item 2. B = concentração do padrão de glicose em µg/ml (ponto da curva de calibração) C = absorbância da amostra processada conforme item 1. P = absorbância do padrão de glicose (ponto da curva de calibração) F = fator de diluição Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 22

24 5. Grau Brix Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Uma das variáveis agroindustriais mais facilmente determinadas em laboratório ou mesmo em campo, é o Brix. Quando se trata de cana madura existe estreita relação entre essa porcentagem e o conteúdo de sacarose na solução. A cana é considerada madura com Brix mínimo de 18 entre outros fatores. Por consenso, admite-se o Brix como sendo a porcentagem de sólidos solúveis contidos em uma solução açucarada, ou seja: 1 BRIX corresponde a 1 g de sólidos dissolvidos em 100 g de solução à 20 C Sendo a sacarose um dos sólidos do caldo (80-90%), o aumento do seu conteúdo acaba por resultar em aumento do Brix do caldo. Portanto, em soluções com alto teor de açúcares, como por exemplo o melaço, o valor do Brix é uma medida aproximada do teor de açúcares presentes no meio. A medida do Brix pode ser feita através de refratômetro ou pelo Sacarímetro de Brix, que que será utilizado na prática 4. A escala do Sacarímetro de Brix varia de 0 a 90º Brix com divisões de 0,1 / 0,2 / 0,5 e 1º Brix. Referências: DOUMER, M. E.; MARTINS, G. A.; MOREIRA, A. da S.; SILVA, S. D. dos A.. Avaliação de graus brix de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) da parte inferior e superior de colmos. Disponível em: Acessado em: mai INCOTERM. Instruções de Uso do sacarímetro de Brix. Disponível em: Acesso em mai Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 23

25 5.1 Roteiro da Prática 4 - Determinação do BRIX Material proveta de 500 ml Equipamentos sacarímetro de Brix termômetro Reagentes 500 ml de Caldo de cana Objetivo: Determinar o teor de sólidos dissolvidos em uma solução, através da medida da densidade utilizando o sacarímetro de BRIX Procedimento Transferir o caldo de cana ou melaço para a proveta de 500 ml Mergulhar o sacarímetro de BRIX cuidadosamente, de modo a não umedecer a haste acima do líquido. Deixar o instrumento flutuar livremente e não deixar tocar nas paredes ou no fundo da proveta. Aguardar 5 minutos. Proceder a leitura olhando em nível com a superfície da solução, anotando o valor do BRIX. Verificar a temperatura da solução. Efetuar as correções, utilizando a tabela 5.1. A correção é aditiva quando a temperatura da solução for maior do que a temperatura padrão (20 C) e subtrativa quando a temperatura da solução for menor do que a temperatura padrão. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 24

26 Relatório da Prática 4 Componentes do Grupo: Leitura no sacarímetro ( BRIX): B temperatura padrão 20 C Temperatura da solução: C Fator de correção: BRIX = leitura no sacarímetro +/- fator de correção: B Tabela 5. 1: Tabela de Correção para Grau Brix Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 25

27 5. Cinética do Crescimento Microbiano Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do número de células e não ao aumento das dimensões celulares. Quando se estuda a cinética de crescimento a escolha da técnica de quantificação microbiana é um parâmetro importante, pois dela depende os cálculos que serão realizados. É importante também se determinar a taxa de crescimento microbiano e o tempo de geração do micro-organismo em estudo, nas condições de processo utilizadas. A Taxa de crescimento (velocidade específica de crescimento) é a variação no número ou massa de microrganismos por unidade de tempo. Define-se Tempo de geração como o intervalo de tempo necessário para que uma célula se duplique. O tempo de geração é variável para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos até dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de geração não corresponde a um parâmetro absoluto, uma vez que é dependente de fatores genéticos e nutricionais, indicando o estado fisiológico da cultura. O conhecimento da cinética de um processo ou da cinética de crescimento microbiano é importante industrialmente, pois permite a análise de perigos e pontos críticos do processo (APPCC); previsão de eventos fora do processo; determinação de vida-de-prateleira; análise de Risco. Na Figura 5.1 é mostrada uma curva típica de crescimento microbiano. O crescimento microbiano pode apresentar quatro fases distintas, a saber: Fase Lag ou de Adaptação - fase de adaptação metabólica ao novo ambiente, onde ocorre rearranjo do sistema enzimático (síntese de enzimas), traumas físicos (choque térmico, radiação, entre outros) e traumas químicos (produtos tóxicos, meio de cultura). O número de indivíduos não aumenta nesta fase, podendo até mesmo decrescer. A duração dessa fase depende das condições ambientais nas quais as células se encontravam anteriormente. Fase Log ou Exponencial - Nesta etapa, as células estão plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Fase na qual o número de células da população dobra a cada geração. A taxa de crescimento exponencial é variável, de acordo com o tempo de geração do organismo em Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 26

28 questão. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Esta taxa de crescimento não pode ser mantida indefinidamente em um sistema fechado. Após um determinado período de crescimento exponencial, as condições ambientais tornam-se desfavoráveis pela escassez de nutrientes essenciais, acúmulo de metabólitos tóxicos e limitação de espaço. A taxa de crescimento da população diminui e segue-se a fase estacionária. Fase Estacionária - Fase em que a taxa de crescimento diminui significativamente devido às condições limitantes do meio. As células continuam metabolizando e se dividindo, mas parte das células torna-se inviável e a taxa de divisão celular é muito próxima da taxa de morte celular, o que mantém constante o número de células viáveis na população. A curva de crescimento atinge um platô. A duração da fase estacionária depende do balanço entre a taxa de divisão celular e o número de células que vão se tornando inviáveis (morte celular ou incapacidade de se dividir) devido às condições ambientais tornarem-se progressivamente desfavoráveis. É na fase estacionária que são sintetizados vários metabólitos secundários, que incluem antibióticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre também a esporulação das bactérias. Fase de Declínio ou de Morte - Fase de declínio exponencial do número de células viáveis: a taxa de morte celular torna-se maior que a taxa de divisão. O número de células viáveis entra em declínio progressivo até a completa extinção da população. Figura 5. 1: Curva característica do crescimento celular de um micro-organismo Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 27

29 Leitura Complementar: STREMEL, D. S., VIDAURRE, T.C., SILVA, F.S., KELLER, L.E. Estudo da cinética de crescimento microbiano do Bacillus subtilis em meio alternativo na produção de Biocontrolador de fungos fitopatogênicos. XVIII Congresso Regional De Iniciação Científica e Tecnológica. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 28

30 5.1 Roteiro da Prática 5 - Cinética do Crescimento de Células de Leveduras Material pipetas volumétricas de 1, 2, 3, 5 ml pipetas graduadas de 5, 10 e 25 ml proveta de 100 ml 5 Becher de 50 ou 100 ml 8 tubos com tampa de rosca 1 Erlenmeyer de 250 ml Bastão de vidro Equipamentos espectrofotômetro UV-Vis agitador tipo shaker balança Reagentes fermento biológico extrato de lêvedo glicose KH 2 PO 4 (NH 2 ) 2 SO 4 Objetivo: Determinar a taxa específica de crescimento de células de levedura em meio sintético (YED 2%) Preparo da solução de YED 2% e inoculação das células Preparar a solução de YED em erlenmeyer de 250 ml: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de KH 2 PO 4 e 0,2 g de (NH 4 ) 2 SO 4. Acrescentar 100 ml de água destilada e solubilizar todos os reagentes. Pesar entre 90 e 100 mg de fermento biológico. Anotar a massa. Inocular o meio sintético transferindo o fermento para a solução de YED 2%, com o auxílio da própria solução. Colocar o erlenmeyer em agitador tipo shaker e iniciar agitação contínua Determinação da concentração de biomassa (X) Após inocular as células, retirar uma alíquota de 3 ml. Transferir um pouco da amostra para a cubeta e proceder a determinação de biomassa em 570 nm, utilizando a curva de quantificação de micro-organismos. Se a absorbância for maior do que o último ponto da curva, proceder à diluição da mesma. Repetir o procedimento, retirando alíquotas a intervalos de 30 min, aumentando a diluição, se necessário. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 29

31 Relatório DA Prática 5 Componentes do Grupo: 1) Determinação da concentração de biomassa (X) Tempo (h) Absorbância (570 nm) diluição [biomassa] (g/ ml) 2) Construir a curva de crescimento: (i) [biomassa] x tempo, (ii) Ln [biomassa] x tempo. 3) Determinar a taxa específica de crescimento (µ X ) das células de levedura em meio YED. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 30

32 6. Produção de Etanol O álcool (etanol) pode ser obtido de diversas formas de biomassa, sendo a canade-açúcar a realidade econômica atual. Investimentos portentosos estão sendo efetuados para viabilizar a produção de álcool a partir de celulose, sendo estimado que, em 2020, cerca de 30 bilhões de litros de álcool poderiam ser obtidos desta fonte, apenas nos EUA. O benefício ambiental associado ao uso de álcool é enorme, pois cerca de 2,3 t de CO 2 deixam de ser emitidas para cada tonelada de álcool combustível utilizado, sem considerar outras emissões, como o SO 2. A cana-de-açúcar é a segunda maior fonte de energia renovável do Brasil com 12,6% de participação na matriz energética atual, considerando-se o álcool combustível e a co-geração de eletricidade, a partir do bagaço. Dos 6 milhões de hectares, cerca de 85% da cana-de-açúcar produzida no Brasil está na Região Centro-Sul (concentrada em São Paulo, com 60% da produção) e os 15% restantes na região Norte-Nordeste. Na safra 2004, das cerca de 380 milhões de toneladas moídas, aproximadamente 48% foram destinadas à produção de etanol. O bagaço remanescente da moagem é queimado nas caldeiras das usinas, tornando-as auto-suficientes em energia e, em muitos casos, superavitárias em energia elétrica que pode ser comercializada. No total foram produzidos 15,2 bilhões de litros de etanol e uma geração de energia elétrica superior a 4 GWh durante a safra, o que representa aproximadamente 3% da nossa geração anual. O etanol é um produto da fermentação do açúcar, mais freqüente entre os microorganismos. As principais produtoras de álcool são as leveduras principalmente linhagens de Saccharomyces cerevisae. As leveduras são, como na maioria dos fungos, organismos aeróbicos. No entanto, sob condições de anaerobiose fermentam carboidratos à etano e gás carbônico. C 6 H 12 O 6 2 C 2 H 5 OH + 2 CO 2 A fermentação da glicose à etanol e gás carbônico pela levedura Saccharomyces cerevisae segue o caminho da frutose bifosfato. A transformação de piruvato à etanol resume-se em duas etapas. Primeiro, o piruvato é descarboxilado a acetaldeído sob ação da piruvatodescarboxilase (e cooperação da tiaminopirofosfato). O acetaldeído é, em seguida, reduzido a etanol pela álcool-desidrogenase com NADH 2. Referências: Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 31

33 6.1 Roteiro da Prática 6 - Produção de Etanol em caldo de cana-deaçúcar Material 2 Erlenmeyer de 500 ml Proveta de 200 ml 2 Becher de 50 ml Becher de 100 ml Bastão de vidro Fermentômetro Equipamentos balança Reagentes 350 ml de Caldo de cana 60 g de fermento biológico NaF Objetivo: Produzir etanol utilizando caldo de cana como matéria prima e observar as fases da fermentação alcoólica Fermentação Pesar cerca de 25 g de fermento biológico em becher. Transferir 150 ml de caldo de cana para o erlenmeyer de 500 ml. Acrescentar o fermento biológico previamente pesado e adaptar o fermentômetro. Anotar a massa total do conjunto (m). Deixar que a fermentação se processe, pesando e anotando a massa do conjunto a cada 30 min Inibição da fermentação por NaF (inibidor da enolase) Repetir o procedimento do item 6.1, acrescentando-se ao caldo de cana 0,315 g de NaF. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 32

34 Relatório da Prática 6 Componentes do Grupo: 1) Para os procedimentos 6.1 e 6.2, responda: a) Qual a quantidade de gás carbônico produzido? b) Qual a quantidade de etanol produzido? c) Qual a quantidade de glicose consumida? 2) Calcule o grau de inibição provocado pelo NaF. 3) Calcule o rendimento e a eficiência da fermentação. Dado: rendimento teórico = 0,511 4) Construa o gráfico S CO2 x t, S etanol x t. 5) Pesquise a função da enzima enolase. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 33

35 6.2 Roteiro da Prática 7 - Produção de Etanol em YED a 2% Material Parte 1: Erlenmeyer de 250 ml Provetas de 50 e 100 ml Pipeta volumétrica de 1 ml 2 Becher de 50 e 100 ml 10 tubos com tampa de rosca 3 tubos de centrífuga 4 balões volumétricos de 250 ml 2 balões volumétricos de 100 ml Bastão de vidro Pipeta graduada de 5 ml Bureta de 25 ml Parte 2: Pipetas graduadas de 1, 5 e 10 ml 3 Erlenmeyer com tampa de borracha Proveta de 200 ou 250 ml Proveta de 25 ml ou pipeta graduada de 20 ml Bureta de 25 ml Equipamentos Parte 1: Balança Espectrofotômetro Destilador centrífuga Reagentes Parte 1: 60 g de fermento biológico Glicose Padrão de glicose de 10 mol/ml DNS Extrato de lêvedo KH 2 PO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 NaOH 0,1 N Parte 2: Padrão de dicromato de potássio H 2 SO 4 concentrado H 3 PO 4 85 % Indicador Sulfato ferroso amoniacal Objetivo: Calcular a eficiência de uma fermentação de glicose por células de leveduras através da medida da produção de etanol e do consumo de glicose Preparo da solução de YED 2% Colocar em um erlenmeyer de 250 ml: 1 g de extrato de lêvedo, 2 g de glicose, 0,2 g de KH 2 PO 4 e 0,2 g de (NH 4 ) 2 SO 4. Acrescentar 100 ml de água destilada e solubilizar todos os reagentes. Retirar uma alíquota de 3 ml para a dosagem de açúcar pelo método do DNS Produção de células e de etanol e consumo de glicose Inocular o erlenmeyer de 250 ml, contendo YED com 20 % (pu/v) de células. Agitar e imediatamente retirar uma alíquota de 1,0 ml (tempo 0) e verter para balão volumétrico de 250 ml, completando com água destilada. Fazer a leitura da ABS a 570 nm (dosagem de células). Manter o mosto inoculado agitando periodicamente por 1 h. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 34

36 Após 1 h de fermentação, retirar alíquota de 3 ml para determinação da concentração celular. Diluir a amostra 1:250 e ler a ABS a 570 nm. Centrifugar cerca de 30 ml do meio fermentado. Recolher o sobrenadante (tempo 1 h). Do sobrenadante, guardar 5 ml para determinação do teor de açúcar e colocar 10 ml no compartimento do destilador. No destilador, adicionar em seguida 10 ml de H 2 O e 0,5 ml de NaOH 0,1 N. Fechar o sistema e recolher os 8 ml iniciais do destilado. Completar este volume a 10 ml com exatidão. Congelar a amostra para posterior determinação do teor de etanol pelo método do dicromato. Diluir 100 vezes uma alíquota dos sobrenadantes (tempos 0 e 1 h) e determinar a quantidade de glicose pelo método do DNS Determinação do álcool pelo método do dicromato Colocar 10 ml de solução de dicromato em 3 frascos cônicos e adicionar, em seguida, 5 ml de H 2 SO 4 concentrado, resfriando-se em água da torneira. Colocar em cada frasco 5,0, 2,5 e 1,0 ml do destilado e completar o volume a 5,0 ml de água, quando for o caso. Agitar e aguardar, em repouso, durante 15 min para o etanol ser quantitativamente levado a ácido acético. Após 15 min, adicionar 165 ml de água destilada, 18 ml de ácido fosfórico e 0,5 ml de indicador. Titular com sulfato ferroso amoniacal até a cor da solução mudar de púrpura para verde e anotar o volume consumido (n). Para o ensaio em branco adicionar 5 ml de água destilada no lugar da amostra e repetir o procedimento. Anotar o volume consumido (N). Cálculos: Alíquota de 5 ml do destilado Alíquota de 2,5 ml do destilado Alíquota de 5 ml do destilado A = 2 (1 n/n) A = 4 (1 n/n) A = 10 (1 n/n) Onde A = concentração de etanol na amostra original (%) Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 35

37 Relatório da Prática 7 Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Componentes do Grupo: 1) Calcular as concentrações de glicose e de células para os tempos 0 e 1 h. 2) Calcular a massa de etanol formado. 3) Calcular o rendimento e a eficiência da fermentação a partir dos resultados. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 36

38 7. Acidez de vinhos Sabe-se que a acidez dos vinhos se deve a presença de ácidos como o tartárico, málico e cítrico, entre os mais importantes. Estes ácidos garantem a conservação do vinho bem como outras características de suma importância. O grau de acidez está também relacionado com a acidez total titulável, o ph, a quantidade de ácidos dissociados e não dissociados, e a quantidade relativa de cada um dos ácidos presentes. Dentro dos padrões comerciais, a acidez do sumo fica no intervalo de 0,6 a 0,9 % (expresso como a quantidade de ácido tartárico por 100ml de sumo ou vinho). Os vinhos doces têm acidez no intervalo de 0,4 a 0,65%. Na fabricação do vinho é importante saber a acidez titulável do mostro para poder determinar a quantidade correta de dióxido de enxofre que será adicionada e também decidir se é ou não necessária uma correção da acidez. A acidez titulável do vinho é normalmente expressa em ácido tartárico % (m/v); massa molar do C2H4O2(COOH)2 = 150,09g/mol. Lembrar que o ácido tartárico tem dois hidrogênios tituláveis ate a viragem da fenolftaleína. Ácido tartárico ( g/100ml) = (Vb).(C NaOH).( 150,09).(100) (1000).2.(Vam) onde: Vb é o volume, em ml, da solução de NaOH usada na titulação. C NaOH é a concentração da solução de NaOH, em mol/l. Vam é o volume, em ml, da amostra titulada. Esta determinação está sujeita à interferência do CO 2 dissolvido. Este erro pode ser minimizado diluindo o vinho com água quente, próximo da fervura, e depois deixando esfriar até a temperatura ambiente antes de titular. Geralmente esse erro é pequeno. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 37

39 7.1. Roteiro da Prática 8 - Determinação da acidez total de vinhos Material 2 Erlenmeyers de 250 ml 1 Becher de 100 ml Pipeta volumétrica de 25 ml Reagentes Vinhos branco e tinto secos Água destilada Solução alcoólica de fenolftaleína a 1% NaOH 0,1 M Objetivo: determinar a acidez titulável do vinho branco e tinto. O ácido tartárico expressa a acidez titulável do vinho. Esta expressão pode ser obtida por meio de uma equação que determina a concentração do ácido tartárico em g/ml Procedimento Transferir 25 ml de vinho branco seco para um erlenmeyer de 250 ml. Adicionar 100 ml de água deionizada e 5 gotas de solução alcoólica de fenolftaleína a 1%. Titular com uma solução padrão de NaOH 0,1M. O ponto final é indicado pela permanência de uma leve cor rósea por mais de 30 segundos. Repetir o procedimento acima para o vinho tinto, com o cuidado de que o ponto final é evidenciado pelo aparecimento de uma cor cinza-esverdeada. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 38

40 7.1.2.Relatório da Prática 8 Componentes do Grupo: 1) Calcule a acidez do vinho analisado. 2) Determine o erro da análise, comparando o valor obtido com o contido no rótulo. 3) Compare com os valores comerciais. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 39

41 8. Preparo de Soluções e Indicadores Apostila das aulas práticas de Processos Bioquímicos Reagente DNS Preparar separadamente, por dissolução à quente e a agitação, as soluções abaixo: - 10g ácido 3,5-dinitro salicílico em 200 ml NaOH 2 mol/l (fica uma massa pastosa) g tartarato duplo de sódio e potássio (C 4 H 4 O 6.Na.K.4H 2 O) em 500 ml água destilada Misturar as duas soluções e completar o volume a 1000 ml com água destilada aquecida. Meio sintético YED 2% Solubilizar em água destilada o extrato de lêvedo (1%), glicose (2%), KH 2 PO 4 (0,2%) e (NH 4 ) 2 SO 4 (0,2%) Indicador: 0,25 g de sal de bário do ácido 4-difenilalanina-sulfônico dissolvido, com leve aquecimento, em 50 ml de água. Filtrar em papel de filtro faixa azul. Líquido sobrenadante é usado. Solução padrão de dicromato de potássio: 8,454 g K 2 Cr 2 O 7 dissolvidos em água, completado a 250 ml. Solução de sulfato ferroso amoniacal: 67,55 de FeSO 4 (NH 4 ) 2 SO 4.6H 2 O, dissolvido em 300 ml de água e 10 ml de H 2 SO 4 concentrado. Filtrar em papel faixa azul para balão de 500 ml e completar o volume com água destilada. Profa. Dra. Denise C. G. A. Rodrigues 40