EMERSON LUIZ BARTOLI CENTRO UNIVERSITÁRIO FMU. Uso de Gonodatrofina Coriônica Humana no Controle Reprodutivo de Éguas

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1 EMERSON LUIZ BARTOLI CENTRO UNIVERSITÁRIO FMU Uso de Gonodatrofina Coriônica Humana no Controle Reprodutivo de Éguas SÃO PAULO/ 2009

2 EMERSON LUIZ BARTOLI CENTRO UNIVERSITÁRIO FMU Uso de Gonodatrofina Corionica Humana no controle reprodutivo de Éguas Trabalho de conclusão de curso apresentado no curso de Medicina Veterinária da FMU, sob orientação da Profª Dra. Cynthia Maria Carpigiani Teixeira. SÃO PAULO/ 2009

3 AGRADECIMENTO Primeiramente agradeço a Deus, porque sem Ele eu não chegaria ate aqui. Agradeço aos meus pais Nilton Luiz Bártoli e Marisa Mara Pires Bártoli por terem lutado muito para que eu conseguisse alcançar essa meta. Aos meus irmãos Elton L. Bártoli e Everton L. Bártoli por fazerem parte da minha vida, a minha namorada Gisele por ter me ajudado sempre com paciência. A minha professora Cynthia por ter aceitado ser minha orientadora. Aos componentes da minha banca, aos meus colegas de faculdade e aos animais que mais amo : os cavalos.

4 O cavalo é a mais bela criatura. O melhor mistério é criá-lo, a melhor ocupação é tratá-lo e o melhor prazer é montá-lo. Paula Nascimento

5 SUMÁRIO LiSTA DE FIGURAS... pág. x LISTA DE TABELAS... pág. y INTRODUÇÃO... Pág REVISÃO DE LITERATURA... Pág FISIOLOGIA DO CICLO ESTRAL...Pág NEURO-ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO... Pág HIPOTALÁMO... Pág HIPÓFISE... Pág MECANISMO DE AÇÃO DOS HORMONIOS... Pág DINÂMICA FOLICULAR... Pág. 7 2.GONODATROFINA CORIONICA HUMANA (hcg)... Pág. 9 3.OBJETIVOS... Pág MATERIAIS E MÉTODOS... Pág RESULTADOS E DISCUSSÃO...,...Pág CONSIDERAÇOES FINAIS... Pág REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... Pág. 13

6 Resumo O hcg é uma molécula de glicoproteina, extraída da urina de mulheres grávidas, e muito utilizada na reprodução de eqüinos para induzir a ovulação. O presente estudo foi realizado no Haras Leni, localizado em.piracaia.., a partir com o inicio da estação de monta em outubro de 2008, examinando-se o trato reprodutivo de éguas por palpação retal e ultra-sonografia. Foi analisado a eficácia do hcg em éguas da raça Mangarlarga e em éguas sem raça definida. O hcg é um indutor de ovulação eficiente, promovendo a indução da ovulação em um período entre 12 e 48 horas após a administração do produto em éguas com folículos maiores que 35 mm, não demonstrando ser eficaz em folículos menores.

7 LISTA DE FIGURAS Fig 1: Controle hormonal do ciclo estral na égua... Pág. 6 Fig 2.Alterações hormonais... Pág. 8 x

8 LISTA DE TABELAS Resultados Esperados... Pág. 12 y

9 Glossário hcg Gonodotrofina corionica eqüina PGF - Prostaglandina LH- Hormônio luteinizante FSH - Hormônio folículo estimulante h - horas ml mililitros IA Inseminação Artificial CL Corpo Lúteo SC sub-cutâneo mm milímetros EF Folículo esquerdo DF Folículo direito

10 Introdução O setor de eqüinocultura, nos últimos cinco anos, vem sofrendo um aumento na comercialização e no numero de criadores. Com isso tem-se difundido cada vez mais o avanço da biotecnologia aplicada a reprodução (MELO, 2006). Como comportamento de poliéstrica estacional, a égua é um animal que apresenta no período de 12 meses distintos as fases quanto ao ciclo reprodutivo. Havendo variações sazonais no ciclo estral em éguas, porém nem todas entram em anestro estacional no inverno ( WINTER et al., 2007). Apesar de várias éguas, no hemisfério norte, apresentarem comportamento de cio em fevereiro, março e abril, durante esta época do ano o cio não é acompanhado de ovulação e a taxa de concepção é baixa. No hemisfério norte, as melhores taxas de concepção ocorrem nas éguas cobertas de maio a julho, sendo que a mesma situação ocorre no hemisfério sul para as correspondentes situações. Aquelas bem alimentadas e estabuladas tende a ciclar o ano todo, portanto no inicio da estação reprodutiva fértil esta intimamente associada ao manejo em que os animais são submetidos ( HAFEZ, 2004). Cada égua, individualmente, pode apresentar uma variabilidade quanto à duração do período de estro, momento da ovulação, bem como do diâmetro folicular e ovulação. A aplicação das modernas biotecnologias na reprodução eqüina, dentre elas a transferência de embrião e a inseminação artificial, requerem um rigoroso controle do ciclo estral (MELO, 2006). O cio da égua dura cerca de 5 a 7 dias e a ovulação ocorre no final deste período, sendo que a inseminação deve ser realizada o mais próximo possível da ovulação. O ideal é que se faça controle folicular com acompanhamento ultrasonográfico de inseminação de eqüinos, a fim de prever a ovulação e decidir o melhor momento para inseminação, limitando assim o número de inseminações ( LEÃO, 2003). Alguns agentes de indução da ovulação são administrados comumente em éguas no estro para estimulação da ovulação, em período programado. Agentes hormonais são usados para que haja esta indução como gonodatrofina corionica humana ( hcg) ( McCUE, 2007). 1

11 Este hormônio é utilizado em éguas onde o folículo ovariano seja igual ou superior a 35 mm, seu efeito primário é a luteinização (ruptura do folículo), fazendo assim a expulsão do ovócito ( BARBACINI, 2000). Objetivo: Analisar o tratamento hormonal com hcg, aplicados a folículos pré-ovulatórios maiores que 35mm. 2

12 1. Revisão de Literatura 1.1 Fisiologia do Ciclo Estral Vários ciclos estrais são manifestados, em éguas, em um determinado período do ano, coincidindo com os dias longos. Durante o ciclo estral, hormônios envolvendo o eixo hipotálamo, hipófise, ovário e útero se inter-relacionam e exercem papel fundamental na ciclicidade, determinando fases específicas do ciclo (MEIRA, 2008). O ciclo estral pode ser definido como intervalo entre o inicio de um estro e o inicio do estro subseqüente, comportamento que se repete de forma cíclica. Cada ciclo apresenta duração de 21 a 22 dias em média, com variação de 16 a 26 dias. É dividido em fases foliculares ou estral e diestro ou progestacional. A fase de estro perdura por cerca de 6 a 7 dias e de diestro de 13 a 15 dias. Durante cada ciclo, observa-se o desenvolvimento e a regressão folicular, que ocorrem de forma dinâmica (CUNNINGHAM, 2004). 1.2 Neuro-Endocrinologia da Reprodução O sistema neuro-endócrino deve manter uma relação direta e harmônica entre os centros hipotalamicos, hipofisario e gonadais, relação essa que deve estar em funcionamento pleno e sincrônico para que os animais manifestem seu potencial reprodutivo, sendo que qualquer interferência nesse processo leva a um transtorno reprodutivo (HAFEZ, 2004). O controle neuro-endocrino ocorre por uma comunicação celular neuroendocrina e endócrina tendo como mensageiro os neurotransmissores, entre eles os hormônios e neurohormonios são essenciais. Outros fatores como os de crescimento são importantes nas fases de desenvolvimento folicular préantral exercendo influencia na inter-relação dos hormônios (CUNNINGHAM, 2004). 3

13 1.2.1 Hipotálamo Ocupando apenas uma porção do cérebro apresenta vasta irrigação e inervação permitindo contato com hormônios circulantes no organismo, interação com informação neuro-endocrinas gerada pelo próprio cérebro (ARANGO & NEWCOMBE, 2007). Segundo MEIRA (2008), o hipotálamo é constituído por neurônios formando núcleos hipotalamicos especializados, cada um com sua função. O de maior interesse no processo reprodutivo é um núcleo arqueado e o ventromedial que constitui o centro tônico de liberação de gonodatrofina como o FSH e o LH, área hipotalamica anterior e principalmente o núcleo pré-ótico e supra isquiático que constitui o centro de liberação pré-ovulatório de gonadotrofina, em que o núcleo supra ótico e paraventricular sintetiza a ocitocina Hipófise É dividida em neurohipofise e adenohipofise, a ultima possui 5 tipos celulares localizados a vasos sanguíneos e secretam 6 hormônios relacionados direta e indiretamente com os processos reprodutivos. As células somatotroficas sintetizam somatotrofinas (GH), cortitotroficas (ACTH), mamotroficas ( prolactina), tireotroficas (TSH) e as células gonadotroficas que sintetizam e liberam FSH e LH (CUNNINGHAM, 2004). A adenohipofise possui sistema de irrigação próprio denominado sistema porta-hipofisário, permitindo a troca de substancias hormonais entre esta e o hipotálamo (MEIRA,2008). 4

14 1.3 Mecanismo de ação dos hormônios A secreção e liberação de gonodatrofina hipofisária se dá pela ligação do GnRH em receptores de proteína-g, localizados na membrana das células gonadotróficas, havendo processos bioquímicos e intra-celulares resultando em síntese e liberação de gonodatrofina ( SQUIRES, 2008). Ocorrem alterações no trato genital feminino, bem como o comportamento sexual são controlados através desses hormônios. O GnRH é um decapeptídio sintetizado e armazenado no hipotálamo, é responsável pela conexão entre o sistema endócrino e nervoso, estimulando a síntese e liberação de LH e FSH pela hipófise anterior ( HAFEZ, 2004). A freqüência dos pulsos de GnRH é mediada, em éguas através da liberação de melatonina. Uma baixa freqüência ocorre durante o anestro devido a alta concentração de melatonina, por causa da baixa luminosidade nos períodos de outono e inverno ( MELO, 2006). A glândula pineal (GP) integra o hipotálamo, mostra-se sensível à luz e secreta um hormônio, a melatonina. Sua secreção é estimulada na ausência de luminosidade e parece interferir na adaptação das funções reprodutivas às condições de luminosidade, especialmente em animais que se reproduzem sazonalmente, possibilitando o nascimento dos filhotes em época mais favorável (CUNNINGHAM, 2004). O hormônio folículo estimulante é responsável pelo crescimento dos folículos ovarianos, e na presença do LH estimula a produção do estrógeno através da sua ligação nas células da granulosa aumentando a sensibilidade das gonodatrofinas. Essa secreção de FSH é estimulada pelo comprimento do dia, sendo que durante a estação de monta as concentrações de FSH atinge dois picos, em intervalo de 10 a 11 dias, como é demonstrado na Figura 1 ( MEIRA, 2008). 5

15 Próximo ao final do estro ocorre o primeiro pico de FSH coincidindo com pico de LH próximo ou após a ovulação e segundo pico na metade do diestro, onde a atividade folicular esta baixa, portanto este pico é responsável pelo desenvolvimento de uma nova onda folicular ( CAMILLO et al. 2002). O limiar pré-ovulatório de LH é responsável pela ruptura da parede do folículo e ovulação, suas concentrações plasmáticas são baixas nos dias de 6 a 15 após a ovulação devido a ação do feedback negativo da progesterona no hipotálamo causando supressão do GnRH. Aumentos de suas concentrações começam próximo ao inicio do estro, quando não existe efeito da progesterona. ( HAFEZ, 2004). Já as concentrações de estrógeno folicular atingem o pico 1 a 2 dias antes da ovulação, decrescendo 2 dias após a ovulação. Na ausência da progesterona o estrógeno secretado pelo folículo pré-ovulatório induz a receptividade sexual, relaxamento da cérvix, estimula a produção de secreções do trato genital, permite a passagem e transporte espermático fazendo com que ocorra a maturação folicular e ovulação ( SQUIRES, 2008). A regulação do FSH se da através da inibina um hormônio gonadal, que é produzido pelas células da granulosa durante a fase folicular ( SAMPER, 2008). 6

16 Fig 1: Controle hormonal do ciclo estral na égua. AP, hipófise anterior; LH, hormônio luteinizante; GnRH, hormônio liberador de gonadotrofina 1.4 Dinâmica Folicular Os eqüídeos possuem ondas foliculares dividida em maiores e menores. As ondas maiores se caracterizam pelo desenvolvimento inicial de um grupo de folículos, em que 1 ou 2 são selecionados e crescendo rapidamente exercendo dominância sobre os demais, essas são subdivididas em primária e secundária. Quando a emergência (crescimento folicular) ocorre durante o cio e inicio de diestro, denomina-se onda folicular secundária dando origem ao folículo dominante de diestro, que pode regredir ou ovular. A emergência da onda no meio de diestro é chamada de onda folicular primária, produzindo o folículo dominante que irá ovular durante o estro ( GINTHER et al, 2008). Com a diferenciação entre dominante e subordinados, o dominante adquiriu a capacidade de refratariedade dos níveis decrescente de FSH. Com a diminuição dos níveis de FSH circulantes, a aquisição de receptores para LH pelas células da granulosa e as mudanças na vascularização folicular parecem ser fundamentais para a continuação do crescimento e diferenciação celular resultando em ovulação, demonstrado no gráfico da Figura 2 ( MOREL & NEWCOMBE, 2007). A fase lútea inicia-se após ovulação e se mantém por cerca de 14 dias. As células foliculares remanescentes após a ovulação se luteinização se transformando em corpo lúteo. Há 2 tipos de células que são observadas no corpo lúteo, as células luteais grandes formadas a partir das células das granulosas e as células luteais que se origina das células da teca, possuindo característica de células secretoras e são responsáveis pela síntese de progesterona ( BEREZOWSKI et. al, 2004). 7

17 Fig 2.Alterações hormonais ocorridas durante do ciclo estral normal de 21 dias na espécie eqüina, as setas demonstram o dia da ovulação. FONTE: GHINTER,

18 2. Gonadotrofina Corionica Humana ( hcg ) A indução da ovulação em éguas é uma biotécnica que permite maior sincronismo entre a ovulação, inseminação ou cobertura (GINTHER et al, 2008). Gonadotrofina Corionica Humana (hcg) é uma glicoproteína formada por uma subunidade alfa e beta com peso molecular de dáltons. A porção alfa possui 92 aminoácidos e 2 cadeias de carboidratos, ela é similar a subunidade alfa do LH em humanos, suínos, ovinos e bovinos, já a subunidade beta possui 145 aminoácidos e 5 cadeias de carboidratos ( HAFEZ, 2004). O papel do β-hcg durante a gravidez, em humanos, é prevenir a desintegração do corpo lúteo do ovário, e desta forma manter a produção de progesterona, que é crítica para o período de gravidez. O β-hcg pode ter funções adicionais, por exemplo acha-se que ele afeta a tolerância imunológica durante a gravidez. Testes de gravidez geralmente são baseados na detecção e medição do β-hcg ( WINTER & RUBIN, 2005). O hcg é extraído da urina de mulheres grávidas. Depois da fertilização do óvulo, o modo de manter os altos níveis de progesterona varia: no caso da mulher, a implantação do embrião induz o endométrio a produzir a gonadotrofina coriônica humana e passa a manter a atividade luteínica (ARANGO & NEWCOMBE, 2007). Por apresentar efeito fisiológico semelhante ao hormônio luteinizante (LH), vem sendo utilizado como hormônio indutor de ovulação, pois sua utilização promove a maturação e ovulação de folículos de forma sincrônica por apresentar longa meia-vida, em torno de 10 horas, sendo provavelmente um dos hormônios mais utilizado no manejo da reprodução eqüina. Quando administrado em éguas, o hcg reduz a duração do estro e aumenta o número de animais que ovulam em até 48h pós-indução ( SQUIRES, 2008). O medicamento utilizado, hcg, deve ser sempre usada parenteralmente, pois após a administração oral, é destruída pelo trato gastrointestinal. Após a aplicação IM, alcança-se um nível plasmático em 6 horas, distribuindo-se primariamente nos ovários das fêmeas ( SAMPER, 2008). Tem sido utilizado por muitos anos para diminuir o período de estro e acelerar a ovulação, sua eficiência é amplamente demonstrada na indução da 9

19 ovulação quando um folículo pré-ovulatório é detectado, a administração do hcg em éguas com um folículo pré-ovulatório de pelo menos 35 mm é capaz de induzir a ovulação em até 48 horas em 80% dos casos ( BEREZOWSKI et al, 2004). Aumenta a probabilidade de um ciclo ovulatório estar associado a uma única cobertura, viabilizando o planejamento do acasalamento. A administração do hcg, em éguas no cio, contendo mais de um folículo pré-ovulatório tem ampliado a possibilidade de ocorrer dupla ovulação ( MOREL & NEWCOMBE, 2007). É utilizada para induzir a ovulação, não existe um padrão ou nível de dose, variando entre 1000UI a 6000UI ou mais, sendo que a maioria das doses utilizadas é entre 2000 a 3000 UI, geralmente de 1 a 2 ml em dose única. (FLEURY, 2007). Devido ao fato de ser uma grande molécula glicoprotéica, induz a uma ação antigênica por parte do sistema imunológico quando utilizado mais do que três vezes na mesma estação reprodutiva, apresenta a inconveniência de induzir a formação de anticorpo após algumas injeções sucessivas ( CAMILLO et al. 2001).Alguns autores demonstram que a formação de anticorpos se inicia após 2 a 5 injeções de hcg. Sendo assim, o uso de análogos do GnRH (deslorelina) e do extrato de pituitária eqüina tem sido uma alternativa ao uso do hcg na sincronização e indução da ovulação em éguas (MEIRA, 2008). O momento da administração do hcg normalmente é ditado pela associação de alguns fatores, dentre eles: a período do ano, comportamento de estro, eco textura uterina, tônus uterino e cervical, eco textura da parede do folículo pré-ovulatório e diâmetro e formato do maior folículo. De todos os fatores citados, a administração do hcg é realizada quando um folículo atinge 35 mm de diâmetro durante a fase folicular (MELO, 2006). 10

20 3. Objetivos O presente trabalho teve como principal objetivo a análise do tratamento hormonal com hcg aplicados em éguas no estro com folículos pré-ovulatórios maiores que 35mm. 4. Materiais e Métodos Foram utilizadas 15 éguas da raça Mangalarga, as quais são doadoras de embriões, e 10 éguas sem raça definida, receptoras de embriões. A estação de monta se iniciou no mês de outubro de 2008 e seu término ocorreu no final de março de 2009, os animais eram palpados diariamente com auxílio de ultra-sonografia, o controle folicular incluía o diâmetro do folículo, flutuação, ao qual foi mensurado de 1 a 5, espessamento da parede folicular e presença de edema uterino. Aqueles animais que possuíam o corpo lúteo, sem presença de folículo primário, recebiam 1 ml de prostaglandina SC, aguardado 4 dias e retornava a ser palpada diariamente. Com a detecção de um folículo dominante pré -ovulatorio, com presença de edema uterino, flutuação 4 5, espessamento de parede folicular e o folículo com diâmetro igual ou superior a 35 mm, foram aplicados 1ml de hcg subcutâneo e realizada a IA 48 h após essa aplicação (FLEURY, 2007) 11

21 5. Resultado e Discussão ANIMAIS Diâmetro folicular Flutuação 1-5 Espessamento de parede folicular Edema uterino Dias Responsiv o ao após aplicação de hcg Bruna EF 48mm d Carlota DF 38mm d Copacabana EF 46mm d Conquista EF 42mm d Chalana EF 40mm 4/ d Diadema DF39mm d Façanha DF 41mm d Gênova EF 44mm d Imperatriz DF 46mm d Modena DF42mm Regrediu Namorada DF 36mm d Nirvana EF45mm d Safira DF 50mm d Tailandinha EF35mm d Tisbe EF 39mm d 240 EF41mm 4/5 + + Regrediu 252 EF47mm d 269 DF 42mm d 345 EF 49mm d 349 DF 36mm d 355 DF 41mm d 358 EF 42mm 4/ d 361 DF 38mm d 388 EF 40mm d 12

22 No presente estudo, 50 % dos animais analisados, responderam ao hcg 48 h após sua aplicação denotando os mesmos princípios previstos por SQUIRES (2008), 10% responderam 12 h após o uso desse hormônio, 20 % ovularam após 70 h de sua administração, ou seja, três dias após a aplicação, e no restante dos animais houve regressão do folículo, portanto não foram responsivos ao tratamento. Analisando o fato ocorrido podemos afirmar que esses 20% dos animais que responderam 70 h após a administração do hormônio, deram resultado errôneo, pois na verdade, esses folículos não responderam ao tratamento, ovulando em um período que seria o mesmo se não tivéssemos aplicado o hcg. Segundo MOREL & NEWCOMBE (2007) a administração do hcg em éguas em cio contendo mais de um folículo pré-ovulatório tem ampliado a possibilidade de ocorrer dupla ovulação, o que não ocorreu nas éguas analisadas no presente estudo, pois éguas que possuíam mais que 1 folículo pré-ovulatório, com a administração do hcg, teve uma regressão folicular de um desses folículos. Devido ao fato de ser uma grande molécula glicoprotéica, induz a uma ação antigênica por parte do sistema imunológico quando utilizado mais do que três vezes, apresenta a inconveniência de induzir a formação de anticorpo após algumas injeções sucessivas ( CAMILLO et al. 2001). Alguns autores demonstram que a formação de anticorpos se inicia após 2 a 5 injeções de hcg. Como a maioria das éguas eram multíparas e utilizadas em estações de monta anteriores, confirma-se a teoria relatada acima. 13

23 6. Considerações Finais A espécie eqüina, dentre os animais domésticos, possui menor eficiência reprodutiva, por esse motivo a utilização de biotécnicas como a inseminação artificial, transferência de embrião e os protocolos hormonais têm valor e permite um incremento nas taxas reprodutivas. E necessário o entendimento correto do ciclo estral das éguas para, que de certa maneira, possamos otimizar as taxas de prenhez. Alguns hormônios são utilizados para que seja feita a inseminação artificial em tempo determinado, facilitando a vida das pessoas envolvidas nesse meio. O hcg é um indutor de ovulação eficiente, promovendo a indução da ovulação em um período entre 12 e 48 horas após a administração do produto em éguas com folículos maiores que 35 mm, não demonstrando efeitos colaterais em folículos menores, porém repetidas aplicações numa mesma estação de monta pode não ter o efeito desejado, pois o hcg é uma glicoproteina em que o organismo vê como um antígeno produzindo assim anticorpos contra tal molécula. 14

24 7. Bibliografia Arango JC, Newcombe JR, Repeatability of preovulatory follicular diameter and uterine edema pattern in two consecutive cycles in the mare and how they are influenced by ovulation inductors, pages 7, Berezowski CJ, Stitch KL, Wendt KM, Clinical Comparison of 3 Products Available to Hasten Ovulation in Cyclic Mares, volume 24, number, Camillo F, Vannozzi I, Rota A, Romagnoli S, Ária G. Comparison of embryo recovery rates from 2-year-old and mature mares In: Proceedings of the 5 th International Symposium on Equine Embryo transf, Cunningham, James G. Tratado de Fisiologia Animal. Editora Guanabara Koogan, Nº de pags: 596, Ed. 3ª,Ano: Fleury P D.C., Alonso M A., Sousa F A.C., Andrade A.F.C., Arruda R. P, Uso da gonadotrofina coriônica humana (hcg) visando melhorar as características reprodutivas e fertilidade de receptoras de embriões eqüinos, Rev Bras Reprod Anim, Belo Horizonte, v.31, n.1, p.27-31, jan./mar Ginther OJ, Beg MA, Gastal EL, Gastal MO, Cooper DA, Treatment with human chorionic gonadotropin (hcg ) for ovulation is associated with na immediate 17beta- estradiol decrease and a more rapid LH increase in mares, pages 7, Hafes ESE, Hafez B, Reprodução Animal, sétima edição, editora Malone ltda

25 McCue PM, Comparison of compounded deslorelin and hcg for induction of ovulation in mares, Meira C, Endocrinologia da Reprodução, Dinâmica Folicular, Superovulação e Transferência de Embriões na Espécie Eqüina, Referente ao Curso Teórico de Inseminação Artificial e Transferência de Embriões em Eqüinos, Botucatu Morel CG, Newcombe JR, The efficacy of different hcg dose rates and the offect of hcg on ovarian activity: Ovulation, multiple ovulation. Pregnancy. Multiple pregnancy. Synchrony of multiple ovulation; in the mare, pages 11, Winter GR, Rubim MI, O ciclo estral e caracteristicas reprodutivas sazonais da egua crioula RS, Samper JC, Induction os estrus and ovulation: Why some mares respond and others do not, pages 3, Squires EL, Hormonal manipulation of the mare, volume 28, pages 11,