OTIMIZAÇÃO DE MEIO DE CULTURA PARA MICROALGAS COM APLICAÇÕES ENERGÉTICAS: BOM PARA ECONOMIA E BOM PARA O MEIO AMBIENTE

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1 Porto Alegre/RS 23 a 26/11/2015 OTIMIZAÇÃO DE MEIO DE CULTURA PARA MICROALGAS COM APLICAÇÕES ENERGÉTICAS: BOM PARA ECONOMIA E BOM PARA O MEIO AMBIENTE Danielle Altomari Teixeira (*), Cristina A. G. Nassar, Maria Isabel Rodrigues, Caio T. R. Coelho da Costa, Leonardo B. B. Mendes. *Universidade Federal do Rio de Janeiro, Programa de Engenharia Ambiental-danielle_altomari@yahoo.com.br RESUMO Empresas do setor energético investem cada vez mais em processos sustentáveis, com os quais almejam alcançar os benefícios econômicos, com baixo impacto ambiental, atendendo as demandas energéticas das gerações atuais e futuras. Para a produção de biomassa algácea grandes volumes de meio de cultura são utilizados, o que representa uma parcela significativa dos custos de produção. Quanto maior a complexidade do meio de cultivo, em termos nutricionais, maior será o custo e o tempo de produção acarretando em maior preço final do produto. A otimização do meio de cultivo para a produção de biomassa de microalgas, corresponde a uma estratégia sustentável para a melhor eficiência na utilização dos recursos energéticos e naturais, com baixo impacto ambiental e benefício econômico. O presente estudo teve como objetivo a simplificação da composição do meio de cultura para produção de microalgas através da reavaliação dos componentes nutricionais e concentrações dos mesmos. Para tanto, foi utilizada a metodologia estatística de desenho de experimentos denominada DOE (em inglês Design of Experiments). Foram calculados os efeitos resultantes das interações dos compostos presentes no meio de cultivo sobre o crescimento da microalga Trebouxiophyceae e sobre o seu acúmulo lipídico. O meio de cultivo BG-11 modificado foi utilizado como base para otimização do meio de cultivo para a microalga Trebouxiophyceae. A utilização da ferramenta estatística de desenho de experimentos (DOE) permitiu uma redução significativa do número de ensaios, economizando tempo e recursos financeiros para a obtenção de resultados representativos. A partir dos resultados foi possível reduzir em nove componentes a composição química do meio BG-11 modificado, sendo que deste total, seis correspondem a compostos da solução de metais traço. O meio de cultivo simplificado apresentou concentração lipídica superior ao meio controle e deverá ser utilizado na etapa final dos cultivos destinados à obtenção de biomassa com aumento do conteúdo lipídico para fins energéticos. Os resultados dessa pesquisa promoveram uma redução de 38% no custo do meio simplificado em comparação ao meio de cultura controle, apresentando um custo final de R$ 7,2 por 1000 litros de cultivo. Este valor possibilita uma significativa redução no preço da biomassa algácea produzida, gerando impacto positivo na precificação do produto final. PALAVRAS-CHAVE: microalgas, meio de cultura, desenho experimental, eficiência energética. INTRODUÇÃO A preservação do meio ambiente, em especial, o uso racional dos recursos naturais e a minimização dos impactos ambientais decorrentes dos processos industriais é uma questão de fundamental interesse coletivo e é exigida, cada vez mais, por uma sociedade ambientalmente consciente, em toda a cadeia produtiva. As indústrias almejam a redução dos passivos ambientais e ao mesmo tempo a prosperidade econômica de seus negócios. Desse modo, precisam produzir produtos de modo a não prejudicar o meio ambiente e ao mesmo tempo com valores competitivos aos produtos tradicionais, baseados em processos energéticos que utilizam fontes fósseis. As fontes fósseis são finitas, e o conhecimento deste fato faz com que haja um grande interesse em explorar fontes energéticas renováveis, que estarão substituindo de forma progressiva a matriz energética atual. A produção de energia renovável a partir de biomassa algácea corresponde a uma alternativa energética (PATHAK; CHAUDHARI; FULEKAR, 2013). Entretanto, para a sua aplicação comercial grandes investimentos em pesquisa e desenvolvimento deverão ser realizados para minimizar os gargalos tecnológicos referentes ao aumento da produção em larga escala. Os sistemas de cultivo de microalgas possuem inúmeras questões técnicas e científicas para o aumento da geração de biomassa algácea. A escolha do tipo de microalga, atrelada a uma otimização nos processos de cultivo (tipos de reatores, nutrientes, luz, ph, temperatura, etc.) está diretamente associada à etapa inicial do processo (upstream), para a geração de biomassa algácea (REIS et al., 2014; RAWAT et al., 2013). Nesta etapa, há inúmeros custos operacionais significativos, relacionados principalmente ao consumo energético (insumos de compostos químicos, água e energia). IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais 1

2 Porto Alegre/RS - 23 a 26/11/2015 Após a obtenção da biomassa algácea, observam-se novamente custos operacionais elevados nos processos de downstream, como por exemplo: as etapas de coleta, separação, extração, em determinados casos, a purificação e as etapas de conversão (óleos) (AMARO; GUEDES; MALCATA, 2011). Entretanto, nos processos de downstream observam-se também custos ambientais crescentes, provenientes dos impactos ambientais significativos, resumidos neste caso, como a geração de resíduos sólidos e efluentes (ricos em nutrientes). A otimização do processo produtivo de biomassa algácea é fundamental para a viabilidade econômica e sustentabilidade ambiental. É uma alternativa com potencial para auxiliar na mudança progressiva da matriz energética atual. O desenvolvimento de tecnologias para as otimizações ao longo de todo processo produtivo é fundamental para a produção de produtos energéticos a partir de biomassa algácea. Estas tecnologias devem proporcionar o maior aproveitamento energético e a menor geração de impactos ambientais. Dessa forma, reduções significativas nos custos do processo das etapas de upstream e downstream devem ocorrer para viabilizar a produção em escala competitiva. O processo de obtenção de biomassa algácea envolve o consumo de grandes volumes de meio de cultura. Quanto maior a complexidade, em termos de constituintes energéticos, maior será o preço do investimento, o que contribuirá em um incremento no preço final do produto. A simplificação de um meio de cultivo para a produção de biomassa de microalgas, corresponde a uma estratégia sustentável para a melhor eficiência na utilização dos recursos energéticos, minimizando os impactos ambientais sem comprometer a prosperidade econômica dos negócios. OBJETIVO GERAL Determinar o meio de cultura mais simples e econômico, em termos de constituintes energéticos (simplificado), que tenha potencial de ocasionar o crescimento celular e o incremento lipídico da biomassa algácea de forma simultânea. METODOLOGIA A otimização do meio de cultivo foi realizada para os cultivos com a microalga da classe Trebouxiophyceae. O meio de cultura definido como padrão para ser otimizado foi o BG-11 modificado (ALLEN; STANIER, 1968; ALLEN, 1968; RIPPKA et al., 1979), com quatorze variáveis (concentração inicial de algas; ácido cítrico; ureia; MgSO 4.7H 2 O; EDTA dissódico; H 3 BO 3 ; MnSO 4. H 2 O; ZnSO 4.7H 2 O; CuSO 4.5H 2 O; Na 2 MoO 4.2H 2 O; CoCl 2.6H 2 O; FeCl 3. 6H 2 O; (NH 2 )H 2 PO 4 ; salinidade), considerando apenas duas condições (+1 e -1) para cada uma das variáveis. Para a execução dos experimentos foram utilizados fotobiorreatores de vidro, com a capacidade de um litro, contendo diferentes composições de meio de cultura e concentrações de microalgas. Estes fotobiorreatores foram dispostos em capelas, contendo um painel de luz no seu interior, com fotoperíodo controlado (12 horas claro/ 12 horas escuro). As análises de quantificação de biomassa foram realizadas pela determinação do peso seco por gravimetria com desconto de cinzas após o processo de calcinação. As análises de extração e quantificação dos lipídios foram realizadas utilizando a metodologia desenvolvida a partir do método Schmid-Bondzynski-Ratzlaff (WILLART; STIG; NILSSON, 1959) no final de cada sequência de experimentos. O estudo de otimização de meio de cultura foi realizado através da aplicação da ferramenta estatística de Desenho de experimentos (DOE). A metodologia de DOE baseia-se, em um primeiro momento, na seleção das variáveis principais que podem influenciar na resposta do processo em otimização. A cada variável é atribuída níveis que correspondem a diferentes condições dessa variável. Dependendo do número de variáveis uma estratégia sequencial de planejamento é escolhida. Conforme o processo a ser otimizado, mais de um delineamento sequencial pode ser utilizado. Após a obtenção dos resultados a análise estatística foi realizada para a análise dos efeitos das variáveis sobre a resposta. Dessa forma, foi realizada a interpretação dos resultados sob a óptica dos efeitos, sendo esses positivos, negativos ou não significativos (PARK, 2007; RODRIGUES; IEMMA, 2009). A Figura 1 apresenta uma representação de um processo geral de desenho de experimentos (DOE) (RODRIGUES e LEMMA 2009; adaptado de PARK 2007). A definição da melhor estratégia de planejamento experimental está diretamente relacionada ao número de fatores que 2 IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais

3 Porto Alegre/RS 23 a 26/11/2015 se deseja estudar (variáveis independentes) atrelado ao conhecimento sobre o processo de interesse (RODRIGUES; IEMMA, 2009). Dessa forma, a estratégia inicial foi a de utilizar a matriz de Plackett e Burman (PB) com vinte ensaios (PB 20). Uma vez realizado este primeiro DOE para análise dos efeitos destas quatorze variáveis na produção de biomassa, foi definido o delineamento PB 16. Após a realização deste delineamento foi selecionado o Fracionado 2 (4-1). Para cada planejamento as faixas de estudo (níveis) foram ajustadas de acordo com os resultados pretéritos de cada planejamento realizado anteriormente. Dessa forma, uma estratégia sequencial de otimização do processo foi realizada. Figura 1: Representação de um processo geral de Desenho de Experimentos (DOE) (adaptado de PARK, 2007; RODRIGUES; IEMMA, 2014) RESULTADOS E DISCUSSÃO Ao final dos três delineamentos estatísticos sequenciais foi possível reduzir a composição química do meio de cultura em nove componentes, sendo que deste total de componentes seis correspondem a compostos da solução de metais traço, obtendo uma composição simplificada. A Figura 2 apresenta a redução progressiva dos macronutrientes principais nitrogênio (ureia) e fósforo (MAP - monoamônio fosfato) ao longo da sequência de planejamento de experimentos. IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais 3

4 Porto Alegre/RS - 23 a 26/11/2015 Figura 2: Média dos valores de concentração de ureia e MAP (monoamônio fosfato) ao longo da sequência de planejamento de experimentos. Observa-se ao longo dos delineamentos uma redução das concentrações iniciais de Ureia e MAP. O meio de cultura simplificado, obtido ao final dos três delineamentos sequenciais, apresenta uma composição mais simples em termos de nutrientes e consequentemente mais econômica. A redução de compostos contribui também para a sustentabilidade dos cultivos em larga escala, uma vez que, a demanda por esses nutrientes será reduzida. Adicionalmente, cultivos com excesso de nutrientes podem ocasionar impactos ambientais significativos relacionados à eutrofização dos corpos hídricos, através do descarte de efluente não tratado (ABDEL-RAOUF, 2012; CLARENS et al., 2009; PITTMAN; DEAN; OSUNDEKO, 2011) A composição do meio simplificado, por ser bastante simples, tem potencial para utilização somente na etapa final do cultivo, com o objetivo de ocasionar um estresse pela limitação nutricional. No meio simplificado todos os micronutrientes foram retirados. Ainda assim, foi observado crescimento em todos os ensaios. Provavelmente, as microalgas possuíam reservas de micronutrientes para suportar o seu desenvolvimento, já que, o crescimento das microalgas não depende somente dos macronutrientes essenciais (carbono, nitrogênio e fósforo). Íons como Ca 2+, Mg 2+ SO 4 2+ e Cl - e micronutrientes como o ferro, zinco, manganês, cobalto, cobre e molibdênio são essenciais para as funções metabólicas (SUNDA; PRICE, 2005). Assim, o meio simplificado se mostrou eficiente para a etapa final de cultivo. Entretanto, não seria adequado para a geração do inóculo inicial de microalgas, pois este processo demanda um meio mais rico. A razão nitrogênio e fósforo é considerada um fator chave para o controle do conteúdo lipídico nas microalgas. Contundo, não há consenso sobre a razão nitrogênio e fósforo ideal para o aumento do teor lipídico sem comprometer a produtividade de biomassa algácea (CHU et al., 2014; RASHID et al., 2014; XIN et al., 2010) Os ensaios controle correspondem à formulação de meio de cultura definida pela equipe da PETROBRAS como sendo adequada para crescimento e teor lipídico, em cultivos de microalga em uma escala piloto. A Figura 3 apresenta os valores médios de biomassa para os meios simplificados e controle ao longo de quinze dias. 4 IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais

5 Porto Alegre/RS 23 a 26/11/2015 Figura 3: Valores de biomassa (média ± desvio padrão) para os meios simplificado e controle ao longo de quinze dias. Para avaliar o efeito do meio de cultura sobre o crescimento da microalga ao longo do tempo foi utilizado uma análise de variância de dois fatores (two-way ANOVA). O resultado da análise indicou diferenças altamente significativas (p<0,01) tanto para o fator meio de cultura quanto para o fator tempo. O meio de cultura controle apresentou crescimento superior em relação ao meio simplificado. Ao final de quinze dias foi observado no meio simplificado valores médios de concentração de biomassa de 0,69 g l -1 e no meio de cultura controle de 1,14g l -1. A dificuldade em manter as mesmas condições de luminosidade (em decorrência da posição dos frascos no painel e luz), agitação e mistura de ar/co 2 pode ser uma explicação para a variação nos resultados dos ensaios dos diferentes meios de cultura, inclusive dos ensaios referentes aos pontos centrais. A Figura 4 apresenta a média dos valores de biomassa e lipídeos na etapa de validação. O teor lipídico foi maior na condição do meio simplificado em comparação ao controle, apresentando médias de 1,76% contra 0,98%. Essa diferença foi estatisticamente significativa considerando o valor de p 0,10, porém o mesmo não se observa ao considerar um valor de significância mais rígido como o de p 0,05. É importante ressaltar, que em estudos biológicos a utilização de um valor de significância mais abrangente (ex.0,10) é aceitável, uma vez que em sistemas biológicos, existem muitas variáveis diferentes, que por sua vez, nem sempre podem ser controladas (RODRIGUES; IEMMA, 2009). Adicionalmente, o presente experimento contou com apenas três repetições, o que demanda diferenças muito acentuadas para atingir valores de significância baixos. Apesar do cultivo da microalga da classe Trebouxiophyceae com o meio simplificado apresentar um aumento do teor lipídico em comparação ao controle, este teor é baixo não apresentou potencial para aplicação principal na produção de óleos para produção de energia. O valor máximo obtido do teor lipídico está muito aquém dos níveis de óleos encontrados em microalgas promissoras para fins energéticos, na faixa dos 20 a 50% do peso seco, como reportado por Chisti, * IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais 5

6 Porto Alegre/RS - 23 a 26/11/2015 Figura 4: Média dos valores de biomassa e teor lipídico na etapa de validação do meio de cultura controle e simplificado. O asterisco representa diferença significativa (p 0,10; ANOVA) entre os valores de lipídeos das biomassas avaliadas para cada um dos meios. A Figura 5 apresenta a média dos valores de biomassa e de ureia em função dos dias de cultivo na etapa de validação do meio simplificado (MS). Os resultados da concentração de ureia (mg l -1 ) nos ensaios da condição do meio simplificado indicam um consumo de ureia de aproximadamente 53,7 mg l -1 e os ensaios da condição do meio controle indicam um consumo total de ureia (Figura 5). O fato da ureia ter sido consumida de forma integral no meio controle pode ser um indicativo que essa forma de nitrogênio foi utilizada para promover o crescimento celular em um meio de cultura rico em nutrientes. O comportamento diferente observado no meio simplificado pode ser explicado pela hipótese de que em uma condição de estresse, ocasionada pela redução de compostos e concentrações, o nitrogênio pode ser utilizado para o acúmulo lipídico e não para crescimento. Segundo Benemann (2010), as microalgas quando submetidas a condições nutricionais limitantes, podem reduzir os processos fotossintéticos, alterando a dinâmica de formação de moléculas com potencial energético. Figura 5: Média dos valores de biomassa e de ureia em função dos dias de cultivo na etapa de validação do meio de cultura simplificado (MS). O meio de cultura controle (MC) foi utilizado nos testes de validação. A microalga estudada pertencente à classe Trebouxiophyceae não apresenta potencial para a produção de lipídeos, já que, apesar da simplificação do meio de cultura em componentes e concentrações, a concentração lipídica final não é suficiente para fins energéticos. O teor lipídico, com o perfil adequado, ideal para a utilização para fins energéticos deverá ser superior a 25%. No trabalho reportado por Penteado (2010) foi observado, de forma análoga ao presente estudo, uma redução no número de ensaios, o aumento do percentual lipídico e concentrações finais lipídicas insuficientes para a utilização desta alga para a produção de biocombustíveis. No trabalho supracitado, o meio de cultivo F/2 Guillard foi otimizado para o cultivo da microalga Phaeodactylum tricornutum para maximizar a produção de lipídeos. Caso a ferramenta de planejamento de experimentos não tivesse sido utilizada no processo de otimização de meio de cultura da referida microalga, cerca de ensaios teriam de ser realizados por técnicas de tentativa e erro, considerando apenas duas condições (níveis) para cada uma das 14 variáveis estudadas (2 14 ensaios). Entretanto, com o uso da ferramenta, foram realizados apenas 61 ensaios, o que se configurou em uma redução de cerca de 38 anos de trabalho e uma economia, apenas em homem-hora (HH) considerando apenas um técnico de nível superior para realizar todos os ensaios, de aproximadamente R$ 67mil/ano. Foi realizada uma comparação do preço do meio de cultura utilizado na planta piloto, denominado controle com o preço do meio simplificado. As Tabelas 1 e 2, respectivamente, apresentam a composição de cada meio de cultura e os respectivos preços por 1000 litros de meio de cultivo. 6 IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais

7 Porto Alegre/RS 23 a 26/11/2015 A redução dos compostos químicos no meio simplificado apresentou uma redução de custo de 38% em comparação ao meio controle. Esta redução de custo reflete em um ganho econômico significativo, quando se avalia sob a perspectiva de uma escala superior. Entretanto, as formulações de meios de cultura sintéticos por mais simples que sejam, não contribuirão para a economicidade de uma processo de produção de biomassa em uma escala industrial (RAWAT et al., 2013). Em uma escala industrial a utilização de efluentes industriais ricos em nitrogênio e fósforo se caracteriza como uma forma sustentável de se produzir biomassa algácea a um baixo custo. Adicionalmente, como uma forma também de compensação aos impactos ambientais (SORATANA; LANDIS, 2011). No presente trabalho foram utilizadas fontes alternativas de nitrogênio (ureia) e fósforo (MAP), visando a economicidade no processo de otimização do meio de cultura. O mesmo não foi observado no trabalho reportado por Hakalin (2014), no qual a fonte de nitrogênio otimizada para a microalga Scenedesmus sp. foi o nitrato. Além da utilização de uma fonte mais cara de nitrogênio, a otimização não foi realizada para todos os componentes do meio de cultivo (ASM1). Foi realizado um delineamento composto central rotacional (DCCR) somente para o nitrato, fosfato e vitaminas. Para uma completa otimização do meio de cultura, todos os componentes do meio de cultivo deveriam ter sido avaliados no planejamento experimental, para o cálculo do efeito resultante das interações de todos os componentes. Adicionalmente à substituição da fonte de nitrogênio, o uso de vitaminas, deveria ter sido retirado para a obtenção da sustentabilidade econômica do processo. O processo de exploração no meio natural dos compostos químicos (N, P, K, Mg, etc.) utilizados como nutrientes nos meios de cultivo de microalgas resulta em impactos ambientais negativos. Esses impactos estão relacionados a uma elevada emissão de gases do efeito estufa e consumo de energia, contribuindo de forma negativa no ciclo de vida dos processos produtivos de microalgas (CLARENS et al., 2009, 2011). Adicionalmente, o excesso de nutrientes no meio de cultivo pode contribuir para a ocorrência do fenômeno de eutrofização dos corpos hídricos, quando ocorre o descarte de água residual não tratada do cultivo (ABDEL-RAOUF, 2012; PITTMAN; DEAN; OSUNDEKO, 2011). CONCLUSÃO Tabela 1: Estimativa de preço do meio de cultura controle. Componentes Meio de cultura (R$ 1000l -1 ) EDTA dissódico 0,13 Ácido cítrico 0,15 Cloreto férrico 1,68 Ureia 5,88 Fosfato de monoamônio 0,03 Sulfato de magnésio 3,46 Metais traço 0,27 Custo total 11,6 Tabela 2: Estimativa de preço do meio de cultura simplificado. Componentes Meio de cultura (R$ 1000l -1 ) Ureia 6,30000 Fosfato de monoamônio 0,00216 Sulfato de magnésio 0,92200 Custo total 7,20000 A utilização da ferramenta estatística de desenho de experimentos (DOE) permitiu uma redução significativa do número de ensaios, economizando tempo e recursos financeiros para a obtenção de resultados representativos. A partir dos resultados foi possível reduzir em nove componentes a composição química do meio BG-11 modificado, sendo que deste total, seis correspondem a compostos da solução de metais traço. O meio de cultivo simplificado apresentou concentração lipídica superior ao meio controle e deverá ser utilizado na etapa final dos cultivos destinados à obtenção de biomassa com aumento do conteúdo lipídico para fins energéticos. IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais 7

8 Porto Alegre/RS - 23 a 26/11/2015 Os resultados dessa pesquisa promoveram uma redução de 38% no custo do meio simplificado em comparação ao meio de cultura controle utilizado na planta piloto da PETROBRAS, apresentando um custo final de R$ 7,2 por 1000 litros de cultivo. Este valor possibilita uma significativa redução no preço da biomassa algácea produzida, gerando impacto positivo na precificação do produto final. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ALLEN, M. M. Simple conditions for growth of unicellular blue-green algae on plates. Journal of Phycology, v. 4, n. 1, p. 1 4, BENEMANN, J. R. Microalgae biomass and biofuels economics. International microalgae and biofuels workshop. Brazilian Network on Green Chemistry. Anais. Fortaleza, Brazil CHISTI, Y. Biodiesel from microalgae beats bioethanol. Trends in Biotechnology, v. 26, n. 3, p , CHU, F. F.; CHU, P. N.; SHEN, X. F.; LAM, P. K.; ZENG, R. J. Effect of phosphorus on biodiesel production from Scenedesmus obliquus under nitrogen-deficiency stress. Bioresource technology, v. 152, p , CLARENS, A. F.; RESURRECCION, E. P.; WHITE, M. A.; COLOSI, L. M. Environmental life cycle comparison of algae t other boenergy feedstocks. Environmental Science and Technology, v. 44, n. 5, p , PENTEADO, D. M. R. Estudo de otimização de meio de cultura para a microalga Phaeodactylum tricornutum para a produção de lipídeos. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal do Paraná, Curitiba. p. 114, RASHID, N.; REHMANB, M. S. U.; SADIQD, M.; MAHMOODE, T.; HANB, J. Current status, issues and developments in microalgae derived biodiesel production. Renewable and Sustainable Energy Reviews, v. 40, p , RAWAT, I.; KUMAR, R. R.; MUTANDA, T.; BUX, F. Biodiesel from microalgae: A critical evaluation from laboratory to large scale production. Applied Energy, v. 103, p , RIPPKA, R.; DERUELLES, J.; WATERBURY, J. B.; HERDMAN, M.; STANIER, R. Y. Generic Assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. Journal of General Microbiology, v. 111, n. 1, p. 1 61, RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F. Planejamento de Experimentos & Otimização de Processo. 2 ed. Casa do Pão, Campinas, p. 358, RODRIGUES, M. I.; IEMMA, A. F. Experimental Design and Process Optimization. 1st. ed. CRC Press, Boca Raton, p SORATANA, K.; LANDIS, A. E. Evaluating industrial symbiosis and algae cultivation from a life cycle perspective. Bioresource technology, v. 102, n. 13, p , STIG, W.; NILSSON, R.; RASMUSSON, Y. The influence of lipolytic activity on the determination of the fat content in milk and dairy products with the Schmid-Bondzynski-Ratzlaff method. Alnarp, SUNDA, W. G.; PRICE, MOREL, F. M. M. Trace Metal Ion Buffers and Their Use in Culture In. Andersen, R. A. Algal culturing techniques. Elsevier Academic Press. Burlington, p XIN, L.; HU, H. Y.; KE, G.; SUN, Y. X. Effects of different nitrogen and phosphorus concentrations on the growth, nutrient uptake, and lipid accumulation of a freshwater microalga Scenedesmus sp. Bioresource technology, v. 101, n. 14, p , IBEAS Instituto Brasileiro de Estudos Ambientais