UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS - UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS - FMTAM MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS

Transcrição

1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS - UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS - FMTAM MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO MANAUS 2005

2 ii YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, como requisito para obtenção do título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientadora: Profª Dra. Maria das Graças Costa Alecrim Co-orientadores: Profª Dra. Maria das Graças Barbosa Prof º MSc. Wilson Duarte Alecrim MANAUS 2005

3 CHEHUAN, Yonne Francis Avaliação in vitro da sensibilidade do Plasmodium falciparum aos antimaláricos pelo ELISA pela captação da Proteína 2 Rica em Histidina / Yonne Francis Chehuan - Manaus - AM; Universidade do Estado do Amazonas, p. Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. 1. Malária 2. P. falciparum 3. ELISA 4. Proteína Rica em Histidina 5. In vitro 6. Quinino 7. Mefloquina I. Titulo

4 iii FOLHA DE JULGAMENTO AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Banca Julgadora: Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra. Presidente Profª. Ivete de Araújo Roland, Dra. Profª. Marinete Marins Póvoa, Dra.

5 iv DEDICATÓRIA Aos meus pais (in memorium) Mansour Francis Chehuan e Julia Abrahim Chehuan Seus exemplos, dedicação e amor, são os meus alicerces e guia para não me desviar dos caminhos que me ensinaram como percorrer com simplicidade, ética e respeito ao próximo. Aos meus amados filhos Dessana e Tigran pela compreensão dos inúmeros momentos de ausência e sacrifício em nosso convívio diário. Ao meu esposo Henrique pelo seu carinho e estimulo sempre presente nos momentos mais árduos. Não existem palavras que expressem a gratidão e o amor que sinto por vocês. Espero ser sempre motivo de orgulho e alegria. Dedico-lhes esta conquista com gratidão.

6 v Mais do que julgar, o importante é ensinar com amor, mostrando que sempre é possível seguir adiante. (Autor desconhecido) O mundo amazônico não poderá ficar isolado ou alheio ao desenvolvimento brasileiro e internacional, porém ele terá que se auto-sustentar em quatro parâmetros e paradigmas fundamentais: deve ser economicamente viável, ecologicamente adequado, politicamente equilibrado e socialmente justo. Prof. Samuel Benchimol

7 vi AGRADECIMENTOS A conquista para ser plenamente vitoriosa deve ser compartilhada. Assim, com o cuidado que merece de não cometermos o descuido da omissão, reverenciamos com profunda gratidão a todas as pessoas e Instituições, indistintamente, que de maneira direta ou indireta foram agentes incentivadores para a realização desta Dissertação de Mestrado, sem os quais teria sido difícil desenvolve-la. De modo particular a: Deus não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos. Agradeço, por Sua infinita benção em minha vida. A Profª Dra Maria das Graças Costa Alecrim pela orientação e ao Professor Wilson Duarte Alecrim pela co-orientação com os quais iniciei o aprendizado da pesquisa, pelo incentivo e apoio para a concretização deste estudo. Aos meus queridos irmãos Naylê, Neydelê, Yvone, Francis e Iman sempre presentes apoiando e incentivando a conquista da vitória independente dos obstáculos; amo todos vocês. A minha co-orientadora Profª Dra Maria das Graças Barbosa, pela orientação, apoio, confiança, estimulo e paciência para a conclusão desta jornada, tantas vezes difícil. Ao Marcus Vinícius Lacerda o meu reconhecimento e sincera gratidão pelo apoio e orientação para a conclusão deste estudo. À Gerente de Malária da FMTAM MSc Mônica Regina Farias Costa Manso, pela compreensão para a conclusão deste trabalho. À Ana Ruth Lima Arcanjo, Márcia Almeida de Araújo e Flor Ernestina Martinez amigas certas das horas incertas nesta conquista. Ao mestrando Franklin Simões Santana Filho, companheiro de lutas e ideais, muito obrigado pela amizade, apoio, solidariedade, incentivo e paciência ao longo desta trajetória. A Eva Batista Carvalho pelo incentivo amigo. À técnica Maria José Siqueira e as bolsistas Glenda Janaína de Souza Oliveira, Dácia Sarina de Azevedo Parente e Danielly de Alencar Arruda Almeida pela contribuição valiosa na execução deste estudo. Aos funcionários, Raimunda Ericilda de Araújo, Marly Marques, Rosemary Santos, Eckner Falcão e Laurendina Pereira Batalha, pelo apoio e colaboração constante.

8 vii Aos funcionários da Gerência de Malária da FMTAM pelo convívio diário amistoso e apoio administrativo. Aos microscopistas pela contribuição no diagnóstico dos portadores de malária falciparum incluídos neste estudo. Ao Dr. Pedro Paulo Vieira,, MSc Michele de Souza Bastos e a Bioquímica Eliete Pereira de Azevedo pelo apoio durante a execução deste trabalho e colaboração na execução dos testes. Ao Gerente de Informática da FMTAM, Marco Antonio Sabóia pela competência e prestimosa colaboração prestada. A Profª Dra Marinete Marins Póvoa agradeço a amizade, o apoio, o incentivo, os ensinamentos e a oportunidade de compartilhar e aprimorar os meus conhecimentos e experiência profissional. Ao Prof Dr Álvaro Augusto Ribeiro D Almeida Couto que concedeu gentilmente um exemplar da sua Tese de Doutorado, o meu especial agradecimento. Ao Dr. Leonardo Carvalho do Laboratório de Pesquisa em Malária da FIOCRUZ que à distância reservou espaço nos seus compromissos para compartilhar seus conhecimentos técnicos com importantes sugestões nos momentos críticos, meu agradecimento pela atenção e o apoio. À Universidade do Estado do Amazonas pela criação do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. Aos professores, colegas de curso e as funcionárias Maria da Conceição dos Santos Tufic e Luzanira Araújo da Silva do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas, pelo apoio e solidariedade. À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas pela oportunidade concedida para o aprimoramento do conhecimento. A Superintendência da Zona Franca de Manaus e Ministério da Saúde do Brasil como fontes financiadoras deste estudo. A Fundação de Apoio Institucional MURAKI, pelo suporte na compra dos insumos para a realização deste estudo. Aos amigos que à distância me acompanharam, auxiliaram e orientaram para a conclusão desta jornada, o meu reconhecimento e gratidão. A cada um dos pacientes de malária que foram imprescindíveis para o desenvolvimento deste estudo, mais que agradecimento, meu respeito. Ao Ministério da Saúde (Secretaria de Vigilância em Saúde/GerênciaTécnica de Malária) e a Organização Pan-Americana da Saúde que através RAVREDA deram suporte técnico-financeiro e confiança para o desenvolvimento deste estudo proporcionando o aprimoramento da minha formação como pesquisadora.

9 viii RESUMO Os rápidos e progressivos mecanismos que os plasmódios desenvolvem para subterfugir aos efeitos dos quimioterápicos têm se tornado o principal agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. A expansão da resistência do plasmódio aos antimaláricos dimensiona a magnitude e gravidade do problema, frente à limitação da ausência de uma vacina antimalárica, tornando cada vez mais importante, iminente e indispensável como fonte de dados para a vigilância de droga-resistência, o desenvolvimento e aplicação in vitro de métodos simples e confiáveis, particularmente sob condições de campo. Como parte do protocolo multicêntrico da Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA), executou-se um estudo para avaliação do desempenho do método ELISA baseado na quantificação da Proteína 2 Rica em Histidina (HRP2) na estimativa da sensibilidade com isolados frescos do Plasmodium falciparum às drogas antimaláricas em análise de correlação dos resultados com os obtidos pelo método da maturação de esquizontes (microteste/oms), em um laboratório de referência, na cidade de Manaus. Os 35 isolados frescos de P. falciparum testados com sucesso pelo ELISA HRP2 e analisados em função da concentração da inibição 50% (IC 50 ) com o intervalo de confiança 95% foram de 225,19 nm (IC95%: 182,24 268,14 nm) e 40,03 nm (IC95% 32,54 47,52 nm) ao quinino e à mefloquina, respectivamente Os resultados mostraram uma associação fortemente significante com aqueles obtidos com o teste padrão de maturação de esquizontes da Organização Mundial da Saúde (OMS) (R=0,977; p<0,001) para quinino e (R=0,946; p<0,001) para mefloquina. Com base no ponto de corte do microteste/oms, a resistência in vitro do P. falciparum ao quinino foi de 22,8% e 42,8% à mefloquina. A aplicação deste novo método ELISA HRP2 sugere ser factível em estudos epidemiológicos do monitoramento da resistência às drogas antimaláricas, na medida em que a técnica é sensível, permite a execução de múltiplos testes simultaneamente, podendo ser adaptada facilmente às exigências de laboratórios individuais em áreas endêmicas. Palavras-chaves: Malária. P. falciparum. ELISA. Proteína Rica em Histidina. in vitro. Quinino. Mefloquina.

10 ix ABSTRACT The Plasmodium resistance to the antimalarials is becoming the major problem for the malaria control in Brazil and worldwide. With the increase of the resistance to antimalarials, of single and reliable methods for in vitro continuous studies of the Plasmodium sensitivity to antimalarial drugs, as data source for the surveillance of drug resistance is a need. As part of the multicenter activities of the Amazon Network of Surveillance of Resistance to Antimalarial Drugs (RAVREDA), an experimental study was performed in order to evaluate the sensitivity to antimalarials using the ELISA test based on the quantification of the Histidine-rich Protein 2 (HRP2) with fresh isolates of Plasmodium falciparum, in a laboratory of reference, in the Manaus city. The 35 fresh isolates of P. falciparum tested with success disclosed inhibitory concentration at 50% (IC50) of nm and nm, to quinine and mefloquine, respectively. The results showed a highly significant association with those obtained with the standard test of maturation of schizonts from the World Health Organization (WHO) for quinine (R=0.977; p<0.001) and mefloquine (R=0.946; p<0.001). Based on the cut-off from the microtest/who, the in vitro resistance of P. falciparum to quinine was 22.8% and 42.8% to mefloquine. The use of the new method seems to be useful in epidemiological studies for the monitoring of resistance to antimalarial drugs, since the technique is sensitive, rapid and of easy execution, with the possibility of adaptation in individual laboratories in endemic areas. Key words: Malaria. P. falciparum. ELISA. Histidine-rich Protein. in vitro. Quinine. Mefloquine.

11 x LISTA DE FIGURAS E TABELAS FIGURA 1 Quimioterapia da malária 22 FIGURA 2 Representação estrutural das quinolinas-metanóis 4 FIGURA 3 Ciclo biológico do P. falciparum 26 FIGURA 4 Princípio do método imunoenzimático da quantificação da PfHRP2 41 FIGURA 5 Setores da Gerência de Malária FMTAM 45 FIGURA 6 Concentração das drogas quinino e mefloquina nas microplacas 48 FIGURA 7 Preparação do sangue e teste de sensibilidade in vitro do P. falciparum 50 FIGURA 8 Técnica ELISA PfHRP2 54 FIGURA 9 Distribuição dos pacientes segundo sexo a faixa etária 56 FIGURA 10 Distribuição dos 59 participantes do estudo por local provável de infecção 57 FIGURA 11 Distribuição dos 32 participantes do estudo por local provável de infecção no município de Manaus 58 FIGURA 12 Microteste (OMS): a) Trofozoítos pela gota espessa; b) Trofozoítos e pré-esquizontes cultura; c e d) esquizontes com três ou mais cromatinas 59 FIGURA 13 Distribuição dos resultados das culturas de P. falciparum após o período de incubação 60 FIGURA 14 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino 62 FIGURA 15 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquina 63 FIGURA 16 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de

12 xi esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino 65 FIGURA 17 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquina 65 FIGURA 18 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo ELISA HRP2 66 FIGURA 19 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo Microteste (OMS) 67 FIGURA 20 Análise de correlação do IC50 do quinino determinado pelos métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS) 68 FIGURA 21 Análise de correlação do IC50 da mefloquina determinado pelos métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS) 68 TABELA 1 Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas 34 TABELA 2 Concentrações das drogas in vitro para aos níveis de TABELA 3 sensibilidade/ resistência Concordância dos resultados entre os métodos Microteste (OMS) e ELISA HRP2 TABELA 4 Avaliação dos 39 isolados pela (CMI%) e IC50 do P. falciparum ao quinino (QN) e mefloquina (MF) pelo microteste (OMS)

13 xii LISTA DE ABREVIAÇÕES Ag-Ac Antígeno/anticorpo AP Amapá APAD Acetil Piridina Adenina Dinucleotídeo cm Centímetro CMI Concentração Mínima Inibitória CO 2 Gás Carbônico Cut-off Ponto de corte D0 Dia zero D28 Dia 28 DDT Dicloro-difenil-tricloroetano DHFR Dihidrofolato-redutase DNA Ácido desoxirribonucléico DO Densidade ótica EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético EGCM Estratégia Global para o Controle da Malária ELISA Enzyme-linked immunosorbent FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FNS/ FUNASA Fundação Nacional de Saúde HRP2/ PfHRP2 Proteína 2 Rica em Histidina IC50 Concentração inibitória 50% do crescimento IC90 Concentração inibitória 90% do crescimento IC95 Intervalo de confiança 95% L Litro LDH Lactado desidrogedonase humano MF Mefloquina mg Miligrama ml mililitro MS Ministério da Saúde do Brasil N 2 NAD NaHCO3 nm Nitrogênio Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Bicarbonato de sódio Nanomolar

14 xiii O 2 OMS/WHO OPS/PAHO Oxigênio Organização Mundial de Saúde Organização Pan-Americana da Saúde P. falciparum Plasmodium falciparum P. malariae Plasmodium malariae P. ovale Plasmodium ovale P. vivax Plasmodium vivax PA Pará Pfcrt Plasmodium falciparum chloroquine resistance-related transporter Pfdhfr Plasmodium falciparum Pfdhps Plasmodium falciparum Pfmdr I Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene I PIACM Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária pldh Lactado desidrogedonase Parasito PM Peso molecular pmol Picomol PNCM Programa Nacional de Controle da Malária QN Quinino RAVREDA Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas RI, II e III Resistência in vivo tipo I, II e III RNA Ácido ribonucléico RPMI Roswell Park Memorial Institute S Sensível SP Sulfadoxina+pirimetramina SUCAM Superintendência de Campanhas de Saúde Pública SUFRAMA Superintendência da Zona Franca de Manaus SVS Secretaria de Vigilância em Saúde TA Temperatura ambiente USAID United States Agency for International Development μg/ml Micrograma C Graus Celsius µl Microlitro

15 xiv SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ASPECTOS GERAIS ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS Vetor Agente etiológico Ciclo biológico do plasmódio CARACTERÍSTICAS DAS DROGAS ANTIMALÁRICAS RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM AOS ANTIMALÁRICOS HISTÓRIA DA RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS TESTES IN VITRO OBJETIVOS MATERIAL E MÉTODOS MODELO DO ESTUDO LOCAL DO ESTUDO POPULAÇÃO ESTUDADA CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ASPECTOS ÉTICOS RECURSOS FINANCEIROS PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS PLACAS PRÉ-DOSADAS DE DROGAS QUININO E MEFLOQUINA COLETA E PREPARAÇÃO DO SANGUE CULTURA E TESTE DE SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM ÀS DROGAS ANTIMALÁRICAS (MICROTESTE/OMS) TESTE IN VITRO DE SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM PELA QUANTIFICAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA (PFHRP2) PELO ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO ELISA 35 38

16 xv 3.8 ANÁLISES ESTATISTICAS RESULTADOS DADOS EPIDEMIOLÓGICOS CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS DISCUSSÃO DADOS EPIDEMIOLÓGICOS CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS LIMIAR DE SENSIBILIDADE/RESISTÊNCIA DO P FALCIPARUM ÀS DROGAS ANTIMALÁRICAS 5.5 AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DO P. FALCIPARUM ÀS DROGAS QUINOLINAS-METANOIS CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXOS 88

17 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 Aspectos gerais A malária apesar de ser uma doença que tem sua história intrinsecamente relacionada com a própria história da humanidade, continua sendo ainda hoje um grande obstáculo ao desenvolvimento socioeconômico e político nos países tropicais e subtropicais, não obstante os resultados alcançados pelos programas de controle que reduziram sua extensão geográfica ou sua incidência em muitas áreas (PAHO/WHO, 1997). Segundo Bruce-Chwatt (1985), o número expressivo de baixas provocadas pela malária durante a Primeira Guerra Mundial motivou principalmente na Europa o desenvolvimento de pesquisas que objetivavam encontrar medidas eficazes para o combate e controle da doença, que teve na cloroquina e no DDT (dicloro-difeniltricloroetano) importantes resultados. Em 1955, a Organização Mundial de Saúde (OMS), diante dos resultados promissores, elaborou um conjunto de medidas visando à erradicação da malária no mundo (NAJERA, 1989). Todavia, ao longo das últimas décadas, a malária vem reaparecendo ou se intensificando em regiões no mundo, conseqüência do surgimento e dispersão de parasitos resistentes às drogas antimaláricas e de mosquitos resistentes aos inseticidas, associados à desestruturação dos programas de controle da malária resultado das dificuldades sociais, políticas e econômicas (TRIGG e KONDRACHINE, 1998; GREENWOOD e MUTABINGWA, 2002). A doença foi erradicada da Europa e América do Norte, contudo permanece como grave problema de Saúde Pública nos países em desenvolvimento pelos

18 2 fatores condicionantes e determinantes relacionados à população suscetível, ao agente etiológico e ao vetor, associados às condições ecológicas, geográficas, econômicas, sociais e culturais. A mais recente intervenção para o controle da malária no Brasil foi em 2000, com a implantação do Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária (PIACM) na Região Amazônica, pelo Ministério da Saúde (MS), em parceria com estados e municípios com os objetivos de reduzir a incidência, evitar o surgimento de epidemias localizadas, reduzir a gravidade da doença e, conseqüentemente, o número de internações e óbitos. Dentre outras, as estratégias estavam centradas nos seguintes pontos: a) estruturação dos sistemas locais de saúde; b) diagnóstico e tratamento precoce; c) intervenções seletivas para o controle vetorial; d) aprimoramento e agilização do sistema de informação; e) detecção imediata de epidemias; f) capacitação de recursos humanos; g) monitoramento da resistência às drogas e inseticidas (BRASIL/MS/SVS, 2005). Empenhado em estabelecer uma política permanente para a prevenção e o controle dessa endemia, e consolidar o processo de descentralização, inclusive na região extra-amazônica, o Ministério da Saúde editou, em 2003, o Programa Nacional de Controle da Malária (PNCM) pactuado com os governos estaduais e municipais, em parceria com a sociedade organizada, a fim de executar as atividades necessárias ao controle da doença, dando continuidade aos avanços já proporcionados pelo PIACM (BRASIL/MS/SVS, 2003). Em 2001, foi criado a Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA), para subsidiar a política de medicamentos, com

19 3 a execução de um sistema de vigilância de fármaco-resistência aos antimaláricos em toda Região Amazônica, com propósito de efetivar as ações de controle. Fazem parte da rede amazônica os oito países que compõem a Bacia Amazônica Sul Americana. O Projeto é coordenado pela Organização Pan-americana da Saúde (OPS) e OMS, apoiado com recurso da United States Agency for International Development (USAID). No Brasil, a gestão e gerenciamento da RAVREDA pela Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, com a participação dos Centros Colaboradores instalados em sete dos nove, estados da Amazônia Legal (divisão política do território nacional que engloba os Estados: Amazonas, Pará, Acre, Roraima, Rondônia, Amapá, Tocantins e Maranhão), estão realizando estudos de resposta terapêutica dos esquemas de primeira linha preconizados pelo PNCM/MS de adesão do paciente ao tratamento para malária, controle de qualidade dos medicamentos, sensibilidade e estabilidade de testes de diagnostico rápido e estudos in vitro de avaliação da suscetibilidade aos antimaláricos (MANGABEIRA e MONTOYA, 2004; BRASIL/MS/SVS, 2005). A resistência do plasmódio às drogas antimaláricas tem se tornado o principal agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. Os rápidos e progressivos mecanismos que os plasmódios desenvolvem para subterfugir aos efeitos dos quimioterápicos dimensionam a magnitude e gravidade do problema. Frente à limitação da ausência de uma vacina antimalárica, o controle da malária depende quase exclusivamente da quimioterapia que é ofertada gratuitamente à população e do controle de vetores.

20 4 1.2 Aspectos Epidemiológicos A malária configura-se como a antropozoonose de maior prevalência no mundo. A doença é endêmica em 107 países, com aproximadamente 3,2 bilhões de pessoas expostas ao risco de infecção. Nas Américas, cerca de 36% da população vivem em áreas favoráveis à transmissão da doença. Estima-se que anualmente entre 350 a 500 milhões pessoas adquirem malária com mais de um milhão de mortes no mundo, principalmente crianças, ao lado das infecções respiratórias e diarréicas, figura como uma das principais causas de mortalidade no mundo. Na África sub-saárica são registrados 60% de todos os casos de malária do mundo, o restante está distribuído por regiões da Ásia, América do Sul e Oceania (PAHO/WHO, 2001; TAYLOR-ROBINSON, 2002; WHO, 2002a; OMS e UNICEF, 2005a). Em 2002, o Brasil contribuiu com aproximadamente 40% do número total dos casos de malária nas Américas. Mais de 99% dos casos diagnosticados pelo exame parasitoscópico ocorreram na Amazônia Legal, onde residem cerca de 12% da população de país. Destacaram-se pela intensidade de transmissão os Estados do Pará, Amazonas e Rondônia, responsáveis por 88% dos casos relatados (OMS e UNICEF, 2005a). No Brasil, no início da década de 70, a malária apresentava sinais de controle, com casos registrados em A partir de 1975, houve um aumento progressivo, registrando-se em casos (BRASIL/MS/SUCAM, 1989). Comparando os casos notificados na Amazônia Legal no ano de

21 5 2004, em relação aos em 1999; observa-se resultado positivo com uma redução da doença, atribuída à política de intensificação das ações do controle da malária do Ministério da Saúde em parceria com estados e municípios (BRASIL/MS/SVS, 2005). A elevação da ocorrência da doença nas décadas de 70 e 80 no Brasil estava relacionada a diversos fatores, com uma forte influência do movimento migratório movido por projetos desenvolvimentistas na ocupação de grandes espaços da Amazônia. Destacam-se as grandes invasões nas áreas periurbanas das cidades de Manaus e Porto Velho, ocasionando uma ocupação espacial desordenada, e ainda associada às alterações ambientais com a construção de estradas e hidrelétricas, extração de madeira e minérios, assim como as precárias condições de infraestrutura e socioeconômicas da população migrante não imune (MARQUES e PINHEIRO, 1982; SAWYER, 1986; TAUIL, 1986; BRASIL/FUNASA, 2000). O ecossistema característico da Amazônia, com alto índice pluviométrico, uma ampla malha hídrica e a densa vegetação, aliados aos fatores sociais e ambientais citados, favorecem a proliferação do vetor e a exposição de grande quantidade de pessoas à doença. No Estado do Amazonas, a malária tem se comportado com períodos variáveis e nos últimos anos, ascendente, com casos diagnosticados em 2002 e casos em 2003, representando um acréscimo de 100% em relação ao ano anterior e continuando a aumentar em 2004, com casos e

22 6 até junho de 2005, com um aumento de 35,7% comparado ao mesmo período do ano anterior (BRASIL/MS/SVS, 2005; FMTAM, 2005). É importante considerar no agravamento progressivo da malária como problema de Saúde Pública os seguintes fatores: a) resistência do vetor aos inseticidas; b) hospedeiro; c) parasitos; d) meio ambiente; e) quimioterapia antimalárica. Os notáveis avanços científicos nas áreas do diagnóstico, tratamento, fisiopatologia, imunologia, biologia molecular e inúmera constatações epidemiológicas não refletiram um melhor paralelo com o controle da endemia ao longo desses anos (WONGSRICHANALAI et al., 2002; RIGBY et al., 2002). 1.3 Características Clínicas e Epidemiológicas Vetor - Os transmissores da malária aos mamíferos são insetos da ordem dos dípteros, da família Culicidae do gênero Anopheles. No Brasil, as espécies de vetores em potencial são: A. darlingi, A. aquasalis, espécies do complexo A. albitarsis, A. cruzii e A. bellator. O A. darlingi destaca-se pela sua importância epidemiológica, particularmente na região da Amazônia Brasileira, pelo seu hábito antropofílico e endofílico, e a elevada suscetibilidade à infecção plasmodial (TADEI e DURATY THATCHER, 2000; BRASIL/MS/FUNASA, 2002) Agente etiológico - Os parasitos causadores da malária fazem parte do Filo Apicomplexa, Ordem Eucoccidiidae, Subordem Haemosporinae, Família Plasmodiidae, Gênero Plasmodium.

23 7 A malária humana é causada por uma ou mais das quatro espécies de protozoários esporozoários intracelulares do gênero Plasmodium. Segundo Garnham e Duggan (1986) essas espécies são: Plasmodium malariae (Laveran, 1881), Plasmodium vivax (Grassi e Feletti, 1890), Plasmodium falciparum, (Welch, 1897) e Plasmodium ovale (Stephens, 1922). No Brasil, destaca-se com maior importância epidemiológica o P. vivax e o P. falciparum. Embora com baixa letalidade, o P. vivax constitui importante causa de morbidade e é responsável por grande número de recaídas nas regiões endêmicas. O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos graves e óbitos, além de desenvolver com maior freqüência resistência às drogas usadas no tratamento da malária (WHO, 2001b; BANNISTER e MITCHELL, 2003) Ciclo biológico do plasmódio - O ciclo evolutivo dos plasmódios da malária se caracteriza por apresentar duas fases distintas de reprodução: a) Sexuada do tipo esporogonia, que se passa no hospedeiro invertebrado ocorre na fêmea do mosquito anofelino após o repasto sangüíneo; os eventuais gametas existentes no estômago do mosquito se unem formando o ovo ou o zigoto e, por esporogonia, formam-se os esporozoítos, que são inoculados por hematofagia no homem. b) Assexuada do tipo esquizogonia, que ocorre no hospedeiro vertebrado o homem - inicia quando esporozoítos infectantes são inoculados no homem pelo vetor; após um curto período na circulação sangüínea (30-60 minutos), alojam-se nos hepatócitos onde, por esquizogonia tissular, formam merozoítos, que são lançados na circulação e vão invadir os eritrócitos; reproduz-se por esquizogonia, formando novos merozoítos e, por ruptura das células sangüíneas, ao final do ciclo,

24 8 se libertam para em seguida invadir novos eritrócitos, reiniciando o ciclo. Depois de algumas gerações de merozoítos sangüíneos, algumas formas se diferenciam em estágios sexuados (os gametócitos) que não mais se dividem e continuarão os seus desenvolvimentos nos mosquitos vetores. A esquizogonia sangüínea se repete em intervalos regulares para cada espécie: a cada 48 horas, nas infecções pelo P. falciparum e P. vivax, e a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (NEVES, 1979; SOUZA et al., 1997). 1.4 Características das Drogas Antimaláricas A eficácia de um agente terapêutico no tratamento da malária depende da interação de três fatores: humano (imunidade), do parasito (resistência à droga) e da farmacocinética (variação individual). A quimioterapia adequada e oportuna da malária é hoje fundamental no controle da doença. Tão importante quanto é o conhecimento das características químicas e farmacológicas dos antimaláricos é o entendimento das propriedades farmacocinéticas, eficácia, grau de tolerância e a capacidade de induzir os efeitos tóxicos do parasito (PAGE et al., 1999) (Figura 1). Imunidade Humano (DNA) Farmacocinética Farmacogenética (Efeitos adversos) Parasito (DNA) Droga Farmacodinâmica (Resistência à droga) Figura 1: Quimioterapia da malária

25 9 Os antimaláricos podem ser classificados de acordo com as características químicas, farmacológicas, locais de ação no ciclo biológico do parasito, entre outras. Dois grandes grupos de drogas têm sido muito utilizados no tratamento da malária: os alcalóides, que são substâncias encontradas em alguns grupos vegetais, em geral nitrogenados, heterocíclicos, com pronunciada ação sobre os animais, e os antifolatos que agem sobre a síntese do DNA, representados pelos inibidores da dihidrofolato-redutase (DHFR) e as sulfas. As drogas antimaláricas podem ser classificadas pelo grupo químico e de acordo com o local de ação no ciclo do parasito (RANG e DALE, 1993; PAGE et al., 1999; BRASIL/MS/FNS, 2001) e os principais em uso são: 4-aminoquinolinas (cloroquina e amodiaquina) o complexo mecanismo de ação envolve a fragmentação do RNA do parasito e é capaz de se intercalar no DNA. Atua por concentrar-se nos lisossomos dos parasitos, inibindo a digestão da hemoglobina, reduzindo o suprimento de aminoácidos necessários para a viabilidade do parasito. 8-aminoquinolinas (primaquina) agem inibindo a respiração mitocondrial do parasito; são particularmente ativas contra as fases estacionárias (sem crescimento) do parasito. Peróxido de lactona sesquiterpênica (derivados de artemisinina) são os princípios ativos de um tradicional medicamento chinês para o tratamento da malária a erva quinghao. O composto ativo foi isolado e caracterizado em A artemisinina e seus derivados possuem uma configuração peróxido (trioxano), responsável pela ação no metabolismo das proteínas.

26 10 Antibióticos (tetraciclina, doxiciclina e clindamicina) possuem uma ação marcante, porém lenta, sobre os estágios eritrocitários da malária. São agentes inibidores da síntese de proteínas ribossômicas. Arilaminoálcoois (quinino, mefloquina, e halofantrina) - os metanóis da quinolina e o fenantreno metanol são esquizonticidas sangüíneos eficazes nos estágios sangüíneos do parasito da malária envolvidos na digestão da hemoglobina. As duas quinolina-metanóis mais usadas são: o quinino e a mefloquina (Figura 2). CH=CH 2 N NH CHOH CHOH CH 3 O Quinino N CF 3 N Mefloquin CF 3 Figura 2: Representação estrutural das Quinolinas-metanóis A porção quinolina é representada em cor laranja O quinino é o principal alcalóide derivado da casca da cinchona, também conhecida como casca peruana; as propriedades dessa planta foram reconhecidas em 1630 na América do Sul (TRACY e WEBSTER Jr., 1996). O mecanismo de ação

27 11 como antimalárico não é bem conhecido, mas, como a cloroquina, sabe-se que inibe a polimerização da hemina tóxica em hemozoína (pigmento malárico), esse grupo heme quando livre é tóxico para o parasito, e acredita-se que seja inserida no DNA. A droga é eficaz esquizonticida de ação contra cepas de P. falciparum. A mefloquina é um composto quinolina-metanol, quimicamente relacionada ao quinino e como tal, também se liga ao pigmento malárico (hemozoína), mas ao contrário deste (quinino), não se insere no DNA. É um esquizonticida sangüíneo de ação prolongada (até 30 dias), eficaz contra todas as espécies de malária, incluindo parasitos P. falciparum multi-resistentes. As pressões seletivas das drogas antimaláricas são geralmente classificadas em termos de ação contra os diferentes estágios do ciclo do parasito (Figura 3): Esquizonticidas teciduais ou hipnozoiticidas - atuam nas formas exoeritróciticas no fígado, destruindo os hipnozoítas latentes de P. vivax e P. ovale. Esquizonticidas sangüíneos - atacam os parasitos nas células sangüíneas, prevenindo ou terminando a crise clínica. Gametocitocidas - destroem as formas sexuadas do parasito (gametócitos) no sangue, impedindo a transmissão. Esporontocidas - interrompem o desenvolvimento da fase esporogônica nos mosquitos que se alimentaram de portadores de gametócitos, de modo que os mosquitos não conseguem transmitir a infecção. Até o momento não existe nenhuma droga desse grupo disponível para uso em humanos.

28 12 DROGAS ESQUIZONTICIDAS TECIDUAIS: 8-aminoquinolinas Inibidores de folato Inoculação dos esporozoítas pelo Anopheles MOSQUITO TROFOZOÍTOS DROGAS ESQUIZONTICIDAS SANGÜÍNEAS: Artemisinina Quinolinas Inibidores de folato GAMETÓCITOS DROGAS GAMETOCITOCIDAS 8-aminoquinolinas Figura 3: Ação dos antimaláricos no ciclo biológico do P. falciparum 1.5 Resistência do P. falciparum aos antimaláricos O início da resistência do plasmódio falciparum à cloroquina marcou um capítulo novo na história da malária. A cloroquina foi sintetizada 1934 e representou nas últimas quatro décadas a droga mais importante no tratamento da malária (RIDLEY, 1998). É o antimalárico mais amplamente prescrito nos trópicos, entretanto, o seu uso atualmente não é

29 13 recomendado para o tratamento das infecções pelo P. falciparum, em razão do elevado nível de resistência em vários países (FOOTE et al., 1990; TRIGG e KONDRACHINE, 1998; BRAY et al., 1998), conduzindo ao aumento significativo da taxa de mortalidade (THIMASARN, 1999). Apesar da alta prevalência da resistência do parasito à cloroquina, essa droga ainda permanece como uma das mais importantes para o tratamento da malária pelo P. falciparum em muitas regiões da África (KYLE et al., 2002), embora exista a necessidade de antimaláricos alternativos. A rápida propagação mundial da malária falciparum resistente à cloroquina levou em 1973, finalmente, à substituição dessa droga pela combinação de sulfadoxina+pirimetramina (SP) como esquema de tratamento de primeira escolha. O problema da resistência tornou-se ainda mais grave pela crescente prevalência de resistência do parasito às associações de drogas. Nos anos 80 a mefloquina se tornou à droga de escolha em áreas onde as 4-aminoquinolinas e os antifolatos não eram mais suficientemente efetivos (WERNSDORFER, 1998). O desenvolvimento rápido da resistência à mefloquina (WONGSRICHANALAI et al. 1992a) conduziu, na metade da década de 90, à introdução da artemisinina e seus derivados, tendo o combate à malária assumido novas perspectivas. De fato, esta droga propicia um rápido clareamento parasitário, com boa evolução clínica do paciente. Suas propriedades têm levado ao uso indiscriminado da droga, o que gerou opiniões consensuais sobre o possível desenvolvimento de resistência, especialmente quando ingeridos por via oral (WHO, 1998).

30 14 Desde a adaptação da Estratégia Global para o Controle da Malária (EGCM) no ano de 1992, em Amsterdã, o Brasil e outros países seguiram a recomendação da OMS, transformando o antigo programa de erradicação em programa de controle da malária, re-direcionando objetivos, metodologia e estratégias. Vários problemas de ordem administrativos, financeiros e técnicos (esses representados principalmente pela resistência dos plasmódios aos antimaláricos) contribuíram para que os programas de erradicação ou controle no Brasil não atingissem seus objetivos finais (ANDRADE et al., 1992; HAWLEY et al., 1998; HEPPNER e BALLOU, 1998; BRASIL/FUNASA, 2000). A resistência do P. falciparum às drogas antimaláricas emergiu como um dos maiores desafios a ser enfrentado para o controle de malária, com implicações no aumento da mortalidade nas áreas hiper e holoendêmicas (HOWELLS, 1992; TRAPE et al., 2002) e contribuiu para o aparecimento e ampliação de novos focos de malária falciparum, mas acima de tudo foi identificado como um fator no contingenciamento econômico do controle da malária (BLOLAND, 2001). Diferentes mecanismos podem modificar o padrão de sensibilidade de vários organismos às drogas (BEALE, 1980). No caso particular do P. falciparum, o aparecimento da resistência, atribuído em primeiro lugar à ocorrência de mutações gênicas espontâneas (embora não exista ainda comprovação científica demonstrando que os antimaláricos utilizados rotineiramente exerçam efeitos mutagênicos sobre os plasmódios) e, em segundo lugar, à pressão seletiva desenvolvida pelos medicamentos sobre as populações de parasitos sensíveis e parasitos resistentes, independentes da dose utilizada. Assim, a resistência que

31 15 aparece em casos tratados com pequenas doses torna os plasmódios refratários também a altas doses da droga (WHO, 1973; ROSÁRIO, 1976, WONGSRICHANALAI et al., 2002). 1.6 História da resistência do P. falciparum Historicamente, a resistência do P. falciparum aos antimaláricos é conhecida desde o início do século passado quando Neiva (1910) e Nocht e Werner (1910) assinalaram no Brasil os primeiros insucessos no tratamento da malária com quinino. Em 1947, começaram a surgir referências ao aparecimento de plasmódios resistentes de regiões tratadas com antimaláricos sintéticos. Peters (1970) descrevem, a primeira evidência da diminuição da sensibilidade do P. falciparum à cloroquina em 1957 na Tailândia. Em 1958, Bustamante referiu que o aparecimento da resistência do P. falciparum ao quinino se tornou um sério problema à terapêutica da malária. Moore e Lanier (1961) notificaram o primeiro caso de P. falciparum cloroquina-resistente em dois pacientes procedentes de Bogotá. No mesmo ano, Young e Moore, em estudo posterior, comprovaram a resistência da cepa à cloroquina. No Brasil, no início da década de 60, foram descritos os primeiros casos de resistência à cloroquina, em pacientes com malária falciparum procedentes da região Amazônica e do Nordeste (RODRIGUES, 1961; SILVA, 1961a; 1961b; SILVA

32 16 et al., 1961). Ferraroni e Hayes (1979) descreveram resistência à cloroquina em índios do Estado do Amazonas. Na década de 80, Alecrim (1981, 1986), em estudos in vivo e in vitro sobre a resistência às drogas antimaláricas na Amazônia, demonstra 100% de resistência in vitro à cloroquina. Santos et al., (1987), em estudo in vitro, no período de 1983 a 1986, com cepas da Amazônia Brasileira, mostraram 83% de resistência à cloroquina, 56% e 51% ao quinino e à amodiaquina, respectivamente, e 2,3% à mefloquina. Kremsner et al., (1989a; 1989b), no Estado do Acre, em área de colonização, verificaram através de testes in vitro cepas resistentes à cloroquina (84%), amodiaquina (73%) e quinino (2,3%) e 100% de sensibilidade à mefloquina. Couto et al., (1993a), avaliando a resposta de cepas de P. falciparum em testes in vitro em sete municípios do sul do Estado do Pará em diferentes períodos, observaram resistência elevada para cloroquina (71%), relativamente baixa para amodiaquina (25,8%) e para o quinino apenas 8,2%. Para a mefloquina, apesar de não ter sido evidenciada resistência em nenhum dos isolados, os resultados demonstraram perda da sensibilidade, quando comparada a resistência em dois períodos distintos. Evidenciaram também cepas multi-resistentes em dois dos municípios estudados.

33 17 Wongsrichanalai et al., (1992a, 1992b), na Tailândia, no período de 1980 a 1990, identificaram a modificação do padrão de resistência do P. falciparum às drogas antimaláricas, em um estudo epidemiológico onde os dados demonstravam claramente a expansão e o aparecimento da resistência a mefloquina. Couto et al., (1995), ao realizarem os resultados análise temporal do perfil de resistência no período de 1983 a 1991, com cepas isoladas de Paragominas (PA) e Lourenço (AP), revelaram nas duas áreas uma aparente semelhança no padrão de resposta do P. falciparum, com alta prevalência de resistência à cloroquina (68,4% e 79,8%, respectivamente) flutuação, dependendo do período, para amodiaquina e quinino, e sensibilidade para mefloquina, embora descreva discreta perda de sensibilidade nas amostras coletadas no Amapá quando comparadas com as do Pará. Alin e Bjorkman (1997), na Tanzânia, em estudos in vitro com isolados de P. falciparum, mostraram alta sensibilidade à mefloquina e artemisinina. Cerutti et al., (1999b), testando a suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas in vivo e in vitro, no Estado do Mato Grosso, constataram in vivo uma elevada sensibilidade ao quinino e à mefloquina e reportaram in vitro a resistência de 96,6% à cloroquina, 3,3% ao quinino, enquanto 100% dos isolados foram sensíveis à mefloquina. Segundo FUNASA (2000), a migração na Amazônia é um importante fator para o aumento da transmissão e disseminação de cepas multi-resistentes entre

34 18 localidades e Couto (2001), observou esta forte influência no estudo de caracterização das cepas de P. falciparum e monitoramento longitudinal da resistência às drogas em duas áreas da Amazônia Brasileira. Calvosa et al., (2001) relataram pela primeira vez resistência à mefloquina in vitro em cepas isoladas na parte oriental da Amazônia Brasileira, no município de Marabá, no Estado do Pará. Noeld et al., (2003c), em um estudo in vitro com cepas de P. falciparum de Bangladesh e da Tailândia, observaram altos níveis de resistência à cloroquina e acentuada para mefloquina. Os resultados demonstraram também, na maioria dos isolados, alta sensibilidade para quinino e 100% para artemisinina. Os autores concluíram que a alta prevalência da resistência do parasito à mefloquina em Bangladesh sugere a necessidade de uma ação de vigilância para verificar problemas de difusão de cepas multi-resistentes na área. 1.7 Métodos de avaliação de resistência aos antimaláricos Um importante fator limitante do sucesso no tratamento da malária é a resposta variada dos parasitos às drogas usadas. Considerando esse fato, recomenda-se que o estudo da resistência seja sistemático, como instrumento para o controle da endemia (KROGSTAD et al., 1987; SUROLIA e PADMANABAN, 1991; SANCHEZ e LANZER, 1997; VASCONCELOS et al., 2000).

35 19 Os estudos de eficácia terapêutica, testes in vitro e marcadores moleculares tornaram-se ferramentas que se complementam para o entendimento de uma visão global da suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas (WHO, 2002a). O primeiro protocolo padronizado para avaliação da resposta in vivo do P. falciparum à droga foi elaborado pouco tempo depois do conhecimento sobre a resistência dessa espécie à cloroquina (WHO, 1965). Esse sistema de avaliação foi posteriormente revisado em 1967, modificado em 1972 (WHO, 1973) sendo a versão mais atual de 2001 (WHO, 2003). Esses protocolos foram editados originalmente para cloroquina, entretanto, com as modificações pertinentes, são aplicáveis também para avaliar a resposta a outros medicamentos esquizonticidas sangüíneos. Em 1973, a OMS, baseada em observações clínicas e parasitológicas, definiu como resistência à capacidade do plasmódio de sobreviver e multiplicar-se, apesar da administração e absorção de um medicamento em doses iguais ou superiores às prescritas habitualmente, observando-se os limites de tolerância dos pacientes (WHO, 1973; WERNSDORFER e PAYNE, 1988). Os estudos de seguimento da eficácia terapêutica e a resposta qualitativa ao tratamento permitem a interpretação do nível de suscetibilidade do plasmódio sem excluir o papel da imunidade inata do organismo nos pacientes com malária. O perfil de resposta dos parasitos assexuados às drogas esquizonticidas sangüíneas segue o modelo direcionado geralmente para o clareamento parasitário e a ocorrência da recrudescência dentro de um período de observação, que varia entre o início do tratamento, ou seja, dia zero (D0) num período de observação de 28 dias (D28) de

36 20 acordo com a classificação em sensível (S) e três níveis de resistência (RI, RII e RIII) (Tabela 1). Tabela1: Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas antimaláricas (MS/FNS, 2001) Resposta Símbolo Sinais Observados Sensibilidade S Negativação da parasitemia assexuada RI dentro de sete dias após o 1º dia de tratamento, sem recrudescência. Negativação da parasitemia assexuada como na sensibilidade, porém seguida da recrudescência. Resistência RII Redução acentuada da parasitemia RIII assexuada, porém sem negativação. Não apresenta redução acentuada da parasitemia assexuada. Nas áreas de alta transmissão da doença, os métodos de avaliação in vivo tanto de sete dias (RII) quanto o de 14 dias (RIII) só são capazes de detectar resistência em nível avançado, o que dificulta e retarda as medidas de avaliação e ações de intervenção. Além disso, casos verdadeiros de resistência da droga podem não ser identificados devido a variações da farmacocinética, re-infecção, múltiplas infecções e interferência da resposta imune adquirida (BASCO e RINGWALD, 2000). Em 2000, Basco e Ringwald propuseram estabelecer novos critérios para resistência a drogas, baseados no fracasso terapêutico, no valor alto da

37 21 concentração inibitória 50% (IC50), nas populações de parasitos idênticos no início e durante o tratamento, na presença de mutações associadas com a resistência da droga in vitro e em concentrações plasmáticas adequadas da droga. A vigilância da sensibilidade dos plasmódios às drogas antimaláricas se tornou mundialmente uma ação de importância extrema para a conduta terapêutica, bem como para o planejamento de políticas de controle da malária. 1.8 Testes in vitro As dificuldades associadas à avaliação da resistência às drogas antimaláricas in vivo levaram, no final dos anos 70, à introdução de uma variedade de testes in vitro capazes de medir a suscetibilidade do P. falciparum aos medicamentos. Embora as provas in vitro de sensibilidade do P. falciparum aos medicamentos antimaláricos não substituam as observações verificadas in vivo, elas constituem ferramenta útil na investigação básica que serve de suporte para a elaboração e avaliação das políticas de saúde em malária (WHO, 1990). É um importante instrumento de avaliação na estimativa da resposta temporal e geográfica aos medicamentos, na vigilância da introdução de novos isolados em uma dada região e fundamentalmente no estudo pré-clínico de uma nova droga antimalárica (WHO, 1994). O teste in vitro permite com a remoção do parasito da circulação sangüínea do paciente e sua transferência para um ambiente de laboratório altamente

38 22 controlável, uma avaliação mais específica da sensibilidade do parasito à droga, independentemente do sistema imune do hospedeiro, e revela com maior precisão a resistência à droga antimalárica. Esses métodos não só expressam resultados quantitativos como também determinam o fenótipo do parasito, independente da imunidade e das condições fisiopatológicas do hospedeiro (TALISUNA et al., 2004), além de oferecer a oportunidade de executar ensaios com múltiplos isolados, avaliar várias drogas simultaneamente e testar drogas experimentais (BLOLAND, 2001). Tradicionalmente os testes in vitro de sensibilidade do plasmódio às drogas são todos baseados na medida do efeito da droga no crescimento e desenvolvimento dos parasitos da malária. Tal efeito permite observar o grau de inibição do crescimento e/ou morte parasitário, refletindo o grau de suscetibilidade do parasito a um determinado fármaco e a uma determinada concentração. Inicialmente, as investigações in vitro com plasmódios de malária humana eram limitadas, principalmente pela indisponibilidade de método apropriado para a produção de biomassa parasitária suficiente para a realização das técnicas. A possibilidade de manter in vitro cepas de P. falciparum em cultura contínua (TRAGER e JENSEN, 1976) revolucionou as investigações sobre a malária humana, dando início a uma nova fase de grande importância no estudo da malária. A capacidade de cultivar o P. falciparum in vitro representou um avanço importante para a evolução de muitos estudos na bioquímica, parasitologia, imunologia e quimioterapia, além de propiciar a criopreservação de parasitos vivos, principalmente para entender a biologia dos parasitos que causam a malária

39 23 falciparum (DIGGS et al., 1975; TRAGER e JENSEN, 1997) e a identificação de populações de diferentes áreas geográficas (CARTER e VOLLER, 1985; ROSÁRIO et al., 1986a, 1986b). O primeiro ensaio laboratorial descrito capaz de medir a capacidade do parasito se desenvolver da fase de anel jovem para esquizonte, usando as mudanças morfológicas para o monitoramento dos antimaláricos, foi o macroteste, desenvolvido por Rieckmann et al. (1968). O método foi aplicado pela primeira vez no mundo em 1969, num estudo realizado em Cuiabá, no Brasil, com cepas cloroquina-resistentes (RIECKMANN e LOPEZ-ANTUÑANO, 1971). Dez anos depois Rieckmann et al. (1978), vislumbrando determinar as áreas "cloroquina-resistentes", pelas evidências da resistência do P. falciparum às drogas, simplificaram o procedimento em microcultura para medir a inibição de maturação de esquizonte em 24 horas, que passou a ser conhecida como microtécnica. O aprimoramento da técnica teve por objetivo tornar sua execução mais prática e de baixo custo para utilização no monitoramento da sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas em condições de campo (PAYNE, 1984), e permanece até o presente como uma das técnicas mais simples para a avaliação de sensibilidade de drogas in vitro. Os estudos com cepas cloroquina-resistentes foram bem sucedidos e os autores começaram a usar a técnica para testar outras drogas. Desjardins et al. (1979b), avaliaram cepas já resistentes e sensíveis in vivo à cloroquina, quinino, primaquina, amodiaquina e mefloquina, mostrando predomínio da sensibilidade para