Palavras-chave Colesterol, LDL, LDL direto, LDL indireto, fórmula de Friedewald

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1 UMA COMPARAÇÃO ANALITICA ENTRE DOIS MÉTODOS UTILIZADOS PARA DETERMINAÇÃO DO LDL COLESTEROL Marcos da Costa Vieira RESUMO O presente trabalho tem como tema uma comparação analítica entre dois métodos utilizados para determinação do LDL-Colesterol, um método homogêneo direto e outro indireto estimativo utilizando a formula de Friedewald, com o objetivo de verificar a ocorrência de diferenças significativas entre ambos métodos. Para sua realização, além da pesquisa bibliográfica, foi feita pesquisa laboratorial onde coletou-se dados de 233 amostras aleatórias de pacientes que dirigiram-se espontaneamente a um laboratório particular com requisição médica para realizar as dosagens de LDL-Colesterol, HDL-Colesterol, Colesterol Total e do Triglicérides. O LDL-Colesterol desempenha papel importante como marcador de risco aterogênico, sendo utilizado para avaliação e diagnóstico do risco cardíaco e estabelecimento e acompanhamento de tratamentos adequados. Para sua correta utilização é importante ter métodos laboratoriais precisos e exatos. Palavras-chave Colesterol, LDL, LDL direto, LDL indireto, fórmula de Friedewald Farmacêutico Bioquímico, pós-graduando em Análises Clínicas Atualiza Pós-Graduação e Universidade Castelo Branco

2 1 INTRODUÇÃO As doenças cardiovasculares são as principais causas de mortalidades no mundo. Dentre elas, destaca-se a aterosclerose, doença inflamatória ativa e crônica, que inicia na primeira década de vida, possui longo período assintomático, caracterizado por disfunção dos endotélios, processo inflamatório e obstrução progressiva da luz arterial por placas de ateroma (placas de gordura) e trombos (KERBER; ANTUNES; CAVALETT, 2010). Dentre as principais enfermidades provindas da aterosclerose estão o infarto do miocárdio e o acidente vascular cerebral isquêmico. Como fatores de risco para o desenvolvimento da doença arterial coronariana encontramos fatores hereditários, a hipertensão, o diabetes, o tabagismo, a falta de atividade física, o estresse e as dislipidemias que são alterações metabólicas das lipoproteínas circulantes decorrentes de distúrbios em qualquer fase do metabolismo lipídico, ocasionando repercussão nos seus níveis séricos e tem sido demonstrada como um fator de risco importante na mortalidade por doença arterial coronariana (MOREIRA et al., 2006). Nas dislipidemias a elevação dos níveis plasmáticos de colesterol total, juntamente com um aumento da fração colesterol de baixa densidade (LDL-colesterol) e ou redução dos níveis plasmáticos de colesterol de alta densidade (HDL-colesterol) e também o aumento de triglicerídeos, tem sido usados como indicadores de ateromas e, também, associados a acidente vascular cerebral. Devido a sua participação no desenvolvimento das placas ateroscleróticas, o LDL-colesterol tem uma relação direta no surgimento de doença arterial coronariana, constituindo-se, assim, como um dos principais marcadores de risco aterogênico (SIQUEIRA; ABDALLA; FERREIRA, 2006). Por isso, a determinação laboratorial da fração LDL-colesterol vem sendo utilizada para avaliar o risco de doença arterial coronariana, com objetivos preventivos, diagnósticos ou para acompanhar o tratamento que baseia-se na redução dessa fração. Existem vários métodos para determinação laboratorial da fração LDL-colesterol. Devido ao baixo custo e facilidade de execução, a maioria dos laboratórios utilizam um método indireto estimativo: o cálculo pela fórmula de Friedewald. No entanto, esse método possui várias restrições na sua utilização, como: não é aplicável para concentrações de triglicerídeos superiores a 400 mg%; em amostras contendo quilomícrons; e, em pacientes com hiperlipoproteinemia Tipo III (CORDOVA et al., 2004). Por outro lado, fabricantes têm

3 desenvolvido métodos diretos homogêneos que surgem como uma opção de determinação laboratorial da fração LDL-colesterol, de fácil execução, sem as limitações do método indireto estimativo, mas ainda com alguma restrição devido ao seu elevado custo. Desta forma, o tema deste trabalho trata-se de um estudo comparativo entre duas metodologias utilizadas para determinação laboratorial do LDL-colesterol: um método direto homogêneo e o método indireto estimativo pela fórmula de Friedewald, que reside sua justificativa na importância da determinação laboratorial da fração LDL-colesterol para avaliação e diagnóstico correto do risco cardíaco e a determinação e acompanhamento de tratamentos adequados, portanto a escolha de um método mais preciso e exato a ser utilizado para a determinação dos níveis sanguíneos dessa fração é de extrema significância. Assim, este trabalho teve como objetivo principal verificar a ocorrência de diferenças significativas entre os dois métodos. Para a realização deste trabalho, além da pesquisa bibliográfica, foi feito pesquisa laboratorial onde coletou-se dados de amostras de sangue analisadas de pacientes que procuraram, espontaneamente, um laboratório de análises clínicas particular da cidade de Valença/Ba para realizar as dosagens de colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol e triglicerídeos, durante o período de 06/08/2010 a 05/11/2010. Para a comparação entre os resultados obtidos pelos dois métodos utilizou-se o teste estatístico t pareado de Student. 2 CONSIDERAÇÕES SOBRE A IMPORTÂNCIA DO LDL-COLESTEROL COMO MARCADOR ATEROGÊNICO Nos países em desenvolvimento, inclusive o Brasil, as doenças cardiovasculares estão entre as principais causas de mortalidade e vem apresentando elevações rápidas e substanciais. Persistindo essa tendência, a Organização Mundial de Saúde projeta um agravamento desse quadro de morbidade e mortalidade prevendo um quadro de epidemia de doença cardiovascular, caso não seja tomada medidas preventivas (SANTOS et al., 2001). Além do tabagismo, hipertensão, diabetes, sedentarismo e obesidade, as alterações no metabolismo das lipoproteínas, ou seja, as dislipidemias, despontam como um dos mais importantes fatores de risco para doença cardiovascular (MOREIRA et al., 2006). Estudos realizados já comprovaram que a diminuição dos níveis de colesterol total e LDL colesterol está associada a uma diminuição da incidência da doença cardiovascular e, outros estudos, provaram que há uma relação direta no surgimento da doença cardiovascular com elevados

4 níveis de LDL-colesterol, devido a sua participação no desenvolvimento das placas ateroscleróticas, constituindo-se assim como um dos principais marcadores de risco aterogênico (SIQUEIRA; ABDALLA; FERREIRA, 2006). De acordo Santos et al. (2001), a III Diretrizes Brasileiras sobre Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose do Departamento da Sociedade Brasileira de Cardiologia define categorias para os valores do LDL-colesterol em ótimo, abaixo de 100 mg%; desejável, entre 100 a 129 mg%; limítrofe, entre 130 a 159 mg%; alto, entre 160 a 189 mg%; e, muito alto, a partir de 190 mg%. Segundo Cordova et al. (2004) o National Colesterol Education Program, devido a essas faixas de valores serem estreitas, estabelece critérios para a utilização de metodologias para a dosagem do LDL-colesterol, as quais devem atender a um erro analítico não maior que 12%, com imprecisão menor que 4% e inexatidão, também, menor que 4%. Ainda de acordo Cordova et al. (2004), o método usado como referência para determinar o LDL-colesterol é a ultracentrifugação, porém é de elevado custo, tornando-se inviável seu emprego na rotina laboratorial. Na prática, o que se verifica é que a maioria dos laboratórios utilizam-se, para a determinação do LDL-colesterol, é o método indireto estimativo pela fórmula de Friedewald, devido a sua facilidade e ao seu baixo custo, inclusive. No entanto, este método baseado em cálculos a partir das concentrações do colesterol total, do HDL-colesterol e dos triglicérides, apresenta várias limitações, como não deve ser aplicado para concentrações de triglicérides superiores a 400 mg%; em amostras contendo quilomícrons; e, em pacientes com disbetalipoproteinemia. E, também, de acordo Sposito et al. (2007), há imprecisão do uso da equação em pacientes com hepatopatia colestática crônica, diabete melito ou síndrome nefrótica. Recentemente, fabricantes têm desenvolvido métodos diretos homogêneos para a determinação do LDL-colesterol que além de criar expectativas de atender os critérios estabelecidos pelo National Colesterol Education Program para a utilização de metodologias para a dosagem do LDL-colesterol, tais métodos superam as limitações existentes ao se utilizar o método indireto estimativo, porém são métodos ainda de alto custo limitando seu uso disseminado pelos laboratórios (PIVA; FERNANDES, 2006). Portanto, devido a forte associação do LDL-colesterol com doenças coronarianas e relacionado a mortalidade, é importante ter ao alcance dos laboratórios métodos mais exatos e precisos, contribuindo para evitar enganos diagnósticos e tratamentos equivocados.

5 3 MATERIAL E MÉTODOS As técnicas de pesquisa empregadas na realização deste estudo foram da documentação indireta, através da pesquisa bibliográfica, e da documentação direta, através da pesquisa experimental. Segundo Lakatos e Marconi (1987), na pesquisa bibliográfica trata-se do levantamento, seleção e documentação de toda a bibliografia já tornada pública com a finalidade de colocar o pesquisador em contato direto com tudo aquilo que foi escrito sobre o assunto em questão, permitindo ao pesquisador um reforço paralelo na análise de suas pesquisas ou na manipulação de suas informações. A pesquisa experimental que, de acordo Almeida (1996), tem como objetivo demonstrar como e por que determinado fato é produzido. Na pesquisa experimental o pesquisador procura refazer as condições de um fato a ser estudado, para observá-lo em situações controladas, exigindo instrumental específico, preciso, e ambientes adequados, para demonstrar as causas ou o modo pelo qual um fato é produzido, proporcionando assim o estudo de suas causas e efeitos (KELLER; BASTOS, 1991) O presente estudo avaliou 233 amostras de sangue de uma população heterogênea, de ambos sexos, diversas idades, a partir de 10 anos de idade, com jejum em torno de 12h, que no período de 06/08/2010 a 05/11/2010, dirigiram-se, espontaneamente, a um laboratório particular, Biolabor - Laboratório de Análises Clínicas, na cidade de Valença / Ba, com solicitação médica para realização de exames de Colesterol Total, Triglicérides, HDL Colesterol, LDL Colesterol. Os dados pessoais dos indivíduos foram tratados com o devido sigilo. As amostras de sangue foram obtidas por punção venosa e armazenadas em tubo com gel separador que após coagulação completada eram centrifugados e encaminhados para a realização dos ensaios. Na realização dos ensaios foi utilizado o equipamento para automação Selectra Jr (Vital Scientific). A determinação do colesterol total, triglicérides e HDL-colesterol foram realizadas com reagentes KOVALENT. Para a determinação do LDL-colesterol, optou-se por

6 um método homogêneo sem etapas de centrifugação para medição direta do LDL-colesterol, fabricado pela DIASYS, gentilmente, cedido pela BIOSYS e STRALAB. Em uma primeira etapa, o LDL é selecionadamente protegido enquanto que as não-lipoproteínas LDL são enzimaticamente processadas. Em uma segunda etapa, o LDL é liberado e o LDL-colesterol é determinado selecionadamente em uma reação de produção de cor enzimática. O HDLcolesterol foi determinado, de acordo com o fabricante Kovalent (2008), por um método direto homogêneo, sem etapas de centrifugação, pelo quais complexos antígenos-anticorpo são formados com as lipoproteínas: LDL, VLDL e quilomicrons de maneira que somente o HDL-colesterol é determinado seletivamente através de uma medida enzimática. O colesterol total e triglicérides foram determinados utilizando-se método enzimático fotocolorimetrico. Todos os testes foram calibrados em triplicata utilizando o calibrador TOPKAL para o colesterol total e triglicérides e TOPKAL HDL/LDL especifico para os respectivos testes, da KOVALENT. As dosagens do colesterol total e triglicérides no soro dos pacientes foram determinadas em duplicata. O equipamento Selectra Jr foi programado utilizando as respectivas programações fornecidas pelo fabricante dos kits. O LDL-colesterol determinado pelo método indireto estimativo foi obtido utilizando-se a fórmula de Friedwald: LDLColesterol = ColesterolTotal - HDL Colesterol - Triglicerides / 5 (FRIEDEWALD; LEVY; FREDRICKSON, 1972). Diariamente era utilizado no equipamento um controle interno fornecido pelo Programa Nacional de Controle de Qualidade da Sociedade Brasileira de Análises Clínicas, cumprindo as regras de Westgard para o gráfico de Levey-Jennings; os índices de coeficiente de variação (C.V.) obtidos durante o período do experimento atendem as recomendações do National Cholesterol Education Program respectivamente: Triglicérides....2,9% ; Colesterol total... 2,2% ; HDL-colesterol....3,1% ; LDL-colesterol(direto)....1,8%. Por uma acurácia melhor, dividiu-se os resultados dos pacientes em grupo de acordo com as faixas dos valores referenciais para triglicérides e colesterol total. No caso dos triglicérides: Grupo 1 amostras de soro de pacientes com valores até 150 mg%; grupo 2 amostras de soro de pacientes com valores de 151 a 200 mg%; grupo 3 amostras de soro de pacientes com valores de 201 a 400 mg%; amostras de soro de pacientes com triglicérides acima de 400 mg% não foram incluídas visto a própria fórmula de Friedewald não

7 recomendar sua aplicação nessa situação. Os grupos para o colesterol total foram: grupo 1 - amostras de soro de pacientes com valores até 200 mg%; grupo 2 - amostras de soro de pacientes com valores de 201 a 239 mg%; grupo 3 - amostras de soro de pacientes com valores a partir de 240mg%. 4 APRESENTAÇÃO E DISCUSSÃO DOS RESULTADOS Para a análise dos resultados foram calculadas as médias e desvios padrão para todas as variáveis quantitativas, no total e de acordo com seus grupos de estudo. As comparações entre as duas medidas de LDL (calculado e dosado) foram feitas pelo teste t pareado, por tratar-se de dados dos mesmos pacientes. A associação da diferença entre essas duas medidas foi estimada pelo coeficiente de correlação de Pearson (r). Foram considerados significativos todos os testes com valores de probabilidade 5%, ou seja, P<0,05. O Quadro 1 a seguir mostra os valores médios e desvios padrão do LDL calculado e dosado. Apresenta também o valor de t = 8,05, com probabilidade P< 0,001, ou seja, altamente significativo, mostrando ainda que a diferença média é 5,54 (±10,5), ou seja, os valores calculados são em média maiores que os valores dosados. Média N Desvio Padrão Teste t pareado LDL calculado 122, ,3 t = 8,05 LDL dosado 116, ,3 P < 0,001 Quadro 1 - Médias, desvios padrão e respectivo teste t As correlações entre as duas medidas de LDL e entre o LDL calculado com triglicérides e com colesterol total são apresentadas no Quadro 2. Pode-se observar que existe alta correlação entre as duas medidas de LDL (r=0,98; P<0,001). Assim como existe correlação significativa entre as duas medidas de LDL e triglicérides e também com colesterol total:

8 LDL calculado Triglicérides Colesterol total LDL dosado r (coeficiente de 0,980 0,249 0,948 correlação) P (probabilidade) 0,000 0,000 0,000 N LDL calculado r (coeficiente de correlação) 0,166 0,952 P (probabilidade) 0,011 0,000 N Quadro 2 Correlações entre LDL (calculado e dosado) com TG e com colesterol total. Quando se analisa a diferença entre as duas medidas de LDL, e se estima a correlação entre essa diferença e triglicérides, assim como com colesterol total, observa-se que não há correlação significativa com os valores de triglicérides (r= -0,112; P=0,089). Ou seja, a maior ou menor diferença entre as duas medidas não aumenta ou diminui com os valores de TG. Por outro lado, a correlação das diferenças entre as duas medidas com o colesterol total aumenta significativamente conforme aumenta o colesterol total (r= 0,743; P<0,001). Ou seja, quanto maior o valor do colesterol total, maior será a diferença (para maior) entre as duas medidas. O Quadro 3 mostra essas correlações e as Figuras 1 e 2 ilustram os dados de triglicérides. Como pode ser observado na Figura 2, as maiores diferenças estão no grupo entre 150 a 200 mg% e, portanto, não existe um direcionamento significativo de acordo com o valor de triglicérides:

9 Quadro 3 Correlações entre as diferenças (LDL calculado e dosado) e TG e colesterol total. Figura 1 Distribuição dos valores das diferenças entre LDL calculado e dosado e triglicérides. Figura 2 Médias das diferenças entre LDL calculado e dosado nos três grupos de triglicérides. As Figuras 3 e 4 ilustram os dados das diferenças com o colesterol total, e observa-se que, nesse caso, quanto maior o valor do colesterol total, maior a diferença média entre as duas medidas de LDL: Triglicérides Colesterol total Diferença r (coeficiente de correlação) -0,112 0,743 P (probabilidade) 0,089 0,000 N Ttriglicerides Diferença < a a 400 Triglicérides 0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 Diferença entre LDL calculado e dosado 5,7 8,6 2,1

10 Figura 3 Distribuição dos valores das diferenças entre LDL calculado e dosado e colesterol total. 20,0 Diferença entre LDL calculado e dosado 15,0 10,0 5,0 0,0 0,4 7,8 19,3 < a 239 > 240 Colesterol total Figura 4 Médias das diferenças entre LDL calculado e dosado nos três grupos de colesterol total. O Quadro 4 a seguir mostra os valores médios e desvios padrão do LDL calculado e dosado, para cada grupo de triglicérides. Apresenta também os respectivos valores de t e suas probabilidades. Pode-se observar que existe diferença altamente significativa (P < 0,001) nos dois primeiros grupos, porem no grupo triglicerides acima de 200 mg% não aparece diferença significante entre as duas medidas de LDL:

11 mg% Média N Desvio Padrão Teste t pareado TG <150 TG 150 a 200 TG 200 a 400 LDL calculado 116, ,94 t = 9,71 LDL dosado 110, ,52 P < 0,001 LDL calculado 139, ,37 t = 4,60 LDL dosado 130, ,68 P < 0,001 LDL calculado 125, ,94 t = 0,91 LDL dosado 123, ,68 P = 0,367 Quadro 4 - Médias, desvios padrão e respectivo teste t dos valores de LDL, separados pelos três grupos de triglicérides. No Quadro 5 a seguir, observa-se que nos valores mais baixos de colesterol total (<200) não existe diferença significativa entre os dois testes de LDL. No entanto, à medida que o valor de colesterol total aumenta, a diferença entre as duas medidas passam a ser altamente significativas. (P < 0,001): mg% Média N Desvio Padrão Teste t Pareado Colesterol total <200 Colesterol total 200 a 239 Colesterol total > 240 LDL calculado 96, ,062 t = 0,65 LDL dosado 95, ,322 P = 0,518 LDL calculado 137, ,023 t = 9,09 LDL dosado 130, ,893 P < 0,001 LDL calculado 184, ,238 t = 10,54 LDL dosado 164, ,434 P < 0,001 Quadro 5 - Médias, desvios padrão e respectivo teste t dos valores de LDL, separados pelos três grupos de colesterol total.

12 5 CONCLUSÃO Neste trabalho, os dados obtidos demonstraram que os resultados do LDL-Colesterol pelo método estimativo utilizando a Fórmula de Friedewald e pelo método direto a depender dos níveis de triglicérides e colesterol total apresentam diferenças estatisticamente significativas. Principalmente, quando avalia-se os respectivos dados de acordo com os níveis de colesterol, verifica-se que o método estimativo apresenta em medida maior discrepância no LDL quando o colesterol total é maior. Por outro lado, os resultados pelo dois métodos de acordo com o níveis de triglicérides observa-se que apresenta em medida discrepância maior conforme decresce o valor de triglicérides. Alem disso observou-se no método direto utilizado neste trabalho, boa precisão e coeficiente de variação baixo que atendem as exigências do National Cholesterol Education Program; por outro lado, o método estimativo pela Fórmula de Friedewald é pouco preciso, pois a diferença com o LDL dosado vai de -30 a +55, ou seja, valores significativamente altos. É necessário que haja novos estudos para que se conheça melhor as metodologias existentes, com o objetivo que se tenha métodos cada vez melhores, utilizados de forma ampla pelos laboratórios, evitando erros diagnósticos e de monitoramento das enfermidades decorrentes das dislipidemias. AN ANALYTICAL COMPARISON BETWEEN TWO METHODS USED FOR DETERMINING LDL CHOLESTEROL ABSTRACT The present work has as its theme a comparison between two analytical methods for determination of LDL-cholesterol, a homogeneous method direct and one indirect estimate using the Friedewald formula, with the objective of verifying the occurrence of significant differences between both methods. For its realization, beyond the literature search, laboratory research was conducted where data was collected from 233 random samples of patients who went voluntarily to a private laboratory with a medical statement to accomplish the assay of LDL-cholesterol, HDL-Cholesterol, Total and triglycerides. LDL-cholesterol plays an important role as a marker of atherogenic risk, being used for evaluation and diagnosis of cardiac risk and establishing and monitoring appropriate treatment. For its correct use is important to have precise and accurate laboratory methods. Keywords Cholesterol, LDL, LDL direct, indirect LDL, Friedewald formula

13 REFERENCIAS ALMEIDA, M. L. P. de. Tipos de pesquisa. Como elaborar monografias. 4. ed. Belém: Cejup, CORDOVA, C. M. M. de et al. Avaliação da dosagem direta do colesterol-ldl em amostras de sangue de pacientes em comparação com o uso da fórmula de Friedewald. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.83, n.6, dez FRIEDEWALD, Willian T.; LEVY, Robert I.; FREDRICKSON, Donald S. Estimation of the Concentration of Low-Density Lipoprotein Cholesterol in Plasma, without Use of the Preparative Ultracentrifuge. Clinical Chemistry, v. 18, n. 6, 1972 KELLER, V.; BASTOS, K. Pesquisa cientifica. Aprendendo a aprender. 2. ed., Petropolis: Vozes, KERBER, S. L.; ANTUNES, A. G. V.; CAVALETT, C. Avaliação do perfil lipídico em alunos de 10 a 18 anos em uma escola particular do município de Carazinho-RS. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, vol. 42(3): , LAKATOS, E. M.; MARCONI, M. A. Pesquisa. Técnica de pesquisa. 3 ed. São Paulo: Atlas, MOREIRA, R. O., et al. Perfil lipídico de pacientes com alto risco para eventos cardiovasculares na prática clínica diária. Arq Bras Endocrinol Metab, v.50, n.3, p , NCEP. National Cholesterol Education Program. Second report of the expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel II). Circulation 1994; 89: PIVA, J. P. J.; FERNANDES, T. R. L. Comparação analítica de valores de ldl-colesterol utilizando a dosagem direta e o cálculo pela fórmula de Friedewald. Revista Brasileira de Análises Clínicas, Rio de Janeiro, v.40, n.4, p , SANTOS, R. D., et al. III Diretrizes brasileiras sobre dislipidemias e diretriz de prevenção da aterosclerose do departamento de aterosclerose da sociedade brasileira de cardiologia. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.77, (supl III), p. 1-48, SIQUEIRA, A. F. A.; ABDALLA, D. S. P.; FERREIRA, S. R. G.. LDL: da síndrome metabólica à instabilização da placa aterosclerótica. Arq Bras Endocrinol Metab, v.50, n.2, p , SPOSITO, A. C., et al. IV Diretriz Brasileira sobre dislipidemias e prevenção da aterosclerose do departamento da sociedade brasileira de cardiologia. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v.88, (supl I), p. 1-19, 2007.

14 MARCOS DA COSTA VIEIRA UMA COMPARAÇÃO ANALITICA ENTRE DOIS MÉTODOS UTILIZADOS PARA DETERMINAÇÃO DO LDL COLESTEROL SALVADOR BAHIA 2011

15 MARCOS DA COSTA VIEIRA UMA COMPARAÇÃO ANALITICA ENTRE DOIS MÉTODOS UTILIZADOS PARA DETERMINAÇÃO DO LDL COLESTEROL Artigo apresentado à ATUALIZA e à UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO, como pré-requesito para obtenção do Certificado de Conclusão do Curso de Pós-Graduação Lato Sensu em Análises Clínicas. SALVADOR BAHIA 2011

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