GERMOPLASMA VEGETAL INTERCÂMBIO E QUARENTENA DE

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1 INTERCÂMBIO E QUARENTENA DE GERMOPLASMA VEGETAL IInIntrodução de materiais estratégicos para pesquisa agrícola nacional e onterceptação de pragas querentenárias Maria de Fatima Batista (PhD); José Nelson L. FOnseca (Bsc); Renata C.V. Tenente ( Pós-PhD); Marta A.S. Mendes (Msc); Maria Regina V. de Oliveira (PhD); Denise N. Ferreira (ms); Pesquisadores do cenargem. exchenge@cenargen.embrapa.br Fotos cedidas pelos autores 1. Intercâmbio A pesquisa agropecuária é dinâmica e necessita estar sempre criando e/ou adaptando novas metodologias para garantir ao povo brasileiro uma alimentação rica e saudável. A maior parte dos produtos que fazem parte da nossa alimentação não é originária do Brasil, condições edafoclimáticas, resistentes a pragas e altamente produtivas. As novas leis de propriedade intelectual, que limitam as condições de uso do germoplasma introduzido, vão, conseqüentemente, reduzir o volume de germoplasma estabelecem normas de acordo com as necessidades de cada caso. A Portaria nº 224, de 3 de maio de 1977, credencia a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa) por meio de sua Unidade Descentralizada - Centro Nacional de Recursos Genéticos e Biotecnologia (cenargen) mas foi introduzida após vir por outros países e adaptada às nossas condições. Entre esses produtos estão arroz, o feijão, milho, soja, trigo, frutíferas e hortaliças exóticas. Com isso, a agricultura brasileira tem-se beneficiado com a introdução de germoplasma de diversas espécies vegetais, que permitiram ao país, por meio da pesquisa, obter variedades adaptadas às nossas vegetal intercambiado, devido às várias restrições impostas em um acordo de transferência de germoplasma vegetal. Para viabilizar a importação de germoplasma vegetal, estratégica para o país e de fundamental importância para o enriquecimento genético dos programas de melhoramento, sem o que as pesquisas agrícolas ficariam comprometidas, é necessário que haja uma regulamentação fitossanitária que estabeleça os critérios para uma importação segura e que, ao mesmo tempo, não a prejudique. A legislação brasileira sobre importação e quarentena de material vegetal baseia-se no Decreto-lei nº , de 12 de abril de 1934, assim como nas portarias complementares que regulamentam o assunto e autorizando-a a proceder o intercâmbio de germoplasma e a adotar os procedimentos de quarentena, bem como a dar pareceres técnicos nos processos de importação de germoplasma no interesse da Embrapa e de outras instituições do Sistema Nacional de Pesquisa Agropecuária (SNPA), coordenado por ela. O intercâmbio e os procedimentos quarentenários de vegetais e de solo para pesquisa ou outros fins científicos foram normatizados pela Portaria nº 148, de 15 de junho de 1992, como descrito resumidamente a seguir: 32 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

2 Os pedidos de importação de germoplasma das unidades da Embrapa devem ser encaminhados diretamente ao Cenargen, à Área de Intercâmbio e Quarentena de Germoplasma Vegetal (AIQ), que providenciará o parecer técnico, para, junto com o requerimento e a listagem do material, obter a "Permissão de Importação" junto ao Departamento de Defesa e Inspeção Vegetal (DDIV) do Ministério da Agricultura e do Abastecimento (MA). Os requerimentos das importações solicitadas pelos demais órgãos oficiais e particulares de pesquisa deverão ser enviados à Delegacia Federal de Agricultura (DFA) do seu respectivo Estado, que o encaminhará ao DDIV e este, antes de emitir a "Permissão de Importação", solicitará um parecer técnico ao Cenargen. Os procedimentos seguintes da importação serão feitos pela DFA e a quarentena, pelo Cenargen. As espécies vegetais são classificadas em duas categorias: de livre importação e de importação restrita. Os materiais vegetais de livre importação necessitam apenas do Certificado Fitossanitário para seu intercâmbio; já os de importação restrita necessitam de declarações adicionais no Certificado Fitossanitário. As exigências que devem constar nas declarações adicionais estão estabelecidas nas portarias complementares. A Portaria n.º 437, de 25 de novembro de 1985, regula as importações de sementes e/ou mudas para o comércio. Nesse caso, o pedido é formulado à DFA do Estado correspondente, que, achando necessário, solicita parecer técnico de alguma instituição para assegurar a importação. Os demais procedimentos são estabelecidos pelo DDIV, que prescreve as medidas de quarentena, as quais, então, são acompanhadas e fiscalizadas, até a liberação, pela DFA do Estado. No que se refere à exportação de vegetais para o comércio, as normas estão estabelecidas na Portaria n.º 93, de 14 de abril de 1989, publicado no Diário Oficial da União(Brasil, 1982). 2. Quarentena A palavra "quarentena" é derivada do Latim "quadraginata" e do Italiano "quaranta", que significa quarenta. No italiano, a palavra "quarantina" foi originalmente, aplicada para o período de 40 dias de isolamento requerido para que um navio, incluídos seus passageiros e a carga, permanecesse ancorado em um porto de chegada quando proveniente de um país onde ocorressem doenças epidêmicas, de modo que, naquele período, fossem desenvolvidos e subseqüentemente detectados os sintomas de algumas dessas doenças nos passageiros, antes do seu desembarque (Kahn, 1989). Quarentena vegetal, literalmente, e por extrapolação, significaria o isolamento de plantas por 40 dias, como período de incubação para o aparecimento e detecção de sintomas de doenças. Na verdade, este procedimento constitui apenas uma fração das diversas ações que podem ser utilizadas em um programa de exclusão de organismos indesejáveis (Kahn, 1989). A quarentena vegetal tem como objetivo prevenir a introdução de organismos nocivos em áreas isentas, utilizando a exclusão como estratégia no controle contra pragas exóticas, sendo aplicada a produtos de importação e exportação (Kahn, 1989), Marques et al., 1995). Portanto, a quarentena deve ser encarada como uma das facetas nos programas nacionais de controle ou manejo integrado de pragas. As suas ações são baseadas em atos legislativos e em procedimentos técnicos, cuja eficácia depende fundamentalmente da existência de pessoal treinado e de estrutura operacional adequada. O serviço de quarentena também deve envolver uma ativa cooperação de toda a comunidade, à medida em que as restrições impostas pela Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 33

3 legislação sejam devidamente aceitas e acatadas integralmente. A quarentena de produtos importados utiliza ações reguladoras para excluir pragas que possam infestar ou contaminar materiais vegetais. Se não forem interceptadas, essas pragas poderão ser disseminadas e causar grandes prejuízos ao país importador. A quarentena de produtos para exportação utiliza procedimentos para proteger a agricultura dos países importadores, de acordo com os regulamentos ou condições especificadas por estes (Kahn, 1989). O uso da exclusão para prevenir a introdução de uma determinada praga pode ser simplificado como um esforço para eliminar ou reduzir severamente sua população, por meio de medidas reguladoras, ao longo de sua trajetória de entrada (Foster, 1991). A quarentena deve basear-se em evidências biológicas e nunca ser resultante de pressões políticas ou econômicas. A primeira e básica preocupação deve ser o conhecimento da situação dentro e fora do país em relação à ocorrência de pragas, com o objetivo de determinar riscos potenciais e estabelecer medidas de precaução por ocasião da introdução de plantas ou partes de plantas. Por outro lado, a quarentena, particularmente a de germoplasma, não deve funcionar como uma barreira que venha prejudicar o trabalho dos melhoristas ou mesmo o comércio de germoplasma melhorado; a sua função deve ser a de "filtro", a fim de evitar a entrada de pragas exóticas que eventualmente possam estar associadas ao material introduzido. As medidas de quarentena não devem ser estáticas ou definitivas, elas devem ser alteradas sempre que as condições mudarem ou novos fatos se tornarem evidentes. Assim, restrições podem e devem ser incluídas dependendo da situação. de germoplasma, sem, contudo, contrariar a legislação vigente. Procedimentos mais rígidos são adotados quando, por evidências biológicas, os riscos são considerados grandes. cultivos; perda de mercados de exportação; pela presença de pragas de importância quarentenária no País; aumento dos gastos com controle de pragas; impacto sobre os Em geral a atitude dos melhoristas em relação à entrada de germoplasma no país é visivelmente liberal, enquanto a dos responsáveis pela quarentena tende a ser conservadora (Kahn, 1989). O Cenargen tem adotado um enfoque positivo quanto à introdução e quarentena O importante é fazer chegar ao melhorista o germoplasma indispensável ao seu programa de melhoramento, com o menor risco possível de introdução de novas pragas.o valor da quarentena vegetal não pode ser demonstrado experimentalmente (Neergard, 1977 citado por Marques et al., 1995), mas pode ser avaliado em função das conseqüências desastrosas resultantes da introdução de pragas exóticas em áreas produtoras. Estas conseqüências podem ser de diversas naturezas, como danos e perdas de programas de manejo integrado de pragas em execução ou em desenvolvimento; danos ao ambiente, pela frequente necessidade de aplicação de defensivos; para o controle da espécie introduzida; custos sociais, como desemprego, por causa da eliminação ou da diminuição de um determinado cultivo em uma região; ou redução de fontes de alimento importantes para a população (Brasil, 1995). O movimento desordenado de material vegetal inevitavelmente envolve riscos de introdução de pragas em áreas não contaminadas. Importações inadvertidas de material vegetal tem causado sérios prejuízos à agricultura 34 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

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5 brasileira. Exemplos mais conhecidos são: o cancro-cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas campestris pv. citri (Hasse) Dye, que exigiu gastos acima de 5 milhões de dólares para sua erradicação, que mesmo assim continua presente em São Paulo e em outras partes do país; o vírus da tristeza do Citrus, que na época da sua introdução por essa praga já ultrapassam R $500 milhões, porém o impacto causado no ambiente pelo uso excessivo de agrotóxicos é inestimável (M.R.V. de Oliveira, comunicação pessoal). A quarentena faz-se, então, imprescindível em todo o processo de intercâmbio de germoplasma. é baseada nas características morfológicas, utilizando-se para isso bibliografia específica. Laboratório de Nematologia - Material sendo preparado para análise de nematóides. O germoplasma, quando na forma de sementes, é sempre fumigado com fosfeto de alumínio (fosfina) por uma ou duas vezes, dizimou parte dos nossos pomares; o fungo Peronosclerospora sorghi (Weston & Uppal) C. G. Shaw em sorgo; a ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk & Br., introduzida no Brasil em 1970 e que quando não controladopode causar perdas em torno de 30 por cento na produção, o que eqüivale a, aproximadamente, 500 milhões de dólares (Mônaco, 1978); o moko da bananeira, cujo agente etiológico é a bactéria Pseudomonas solanacearum (Smith) Smith., raça 2; e o inseto Anthonomus grandis Boheman, o bicudo do algodoeiro, o qual causou perdas de até 100% em algumas regiões do país, principalmente no Nordeste. Recentemente foram detectados dois novos patógenos da cultura de soja: o nematóide do cisto, Heterodera glycines I Ichinohe, em 1992 (Mendes & Dickson, 1993), e Diaporthe phaseolorum (Cke. & Ell) Sace. f. sp. meridionalis agente do cancro da haste, em 1988, que tornaram uma ameaça a essa cultura com níveis de perdas que vêm atingindo 100% em determinadas áreas (Yorinori, 1990). A mosca-branca, Bemisia tabaci raça B (=Bemisia argentifolii) entrou no país no início da década de 90, e hoje está disseminada em 17 estados da Federação, atacando inúmeras culturas de importância econômica. Os prejuízos causados Procedimentos quarentenários realizados em germoplasma vegetal: As atividades de intercâmbio e quarentena realizadas pela Embrapa/Cenargen iniciaram-se em 1976 (Warwick et al. 1983; Rocha et al. 1984, Marques et al. 1995), tendo movimentado até 1997, acessos de germoplasma vegetal (Tabela 1) e impedido a introdução e disseminação de numerosas espécies de pragas exóticas no país (Batista et al., 1995; Mendes & Ferreira, 1994; Tenente et al., 1994 e 1996). Inspeção no ponto de ingresso do germoplasma: O Germoplasma, ao chegar, é inspecionado no ponto de ingresso, que pode ser um aeroporto, ou porto, correio ou posto de fronteira, por um inspetor da DFA. O inspetor examina as condições sanitárias e a documentação do material. Satisfeitas as exigências legais o material é liberado pela DFA para cumprir os procedimentos quarentenários no Cenargen. Quarentena em germoplasma vegetal no Cenargen: Os acessos de germoplasma, quando chegam à Área de Intercâmbio e Quarentena de Germoplasma Vegetal (AIQ), do Cenargen, são examinados quanto a presença de bactérias, fungos, nematóides, vírus, viróides, ácaros e insetos, em laboratórios especializados, por uma equipe de fitopatologistas, entomologistas e técnicos com experiência em quarentena. Laboratório de Entomologia: todo germoplasma vegetal é primeiramente examinado quanto a presença de ácaros e insetos. Os métodos utilizados são: inspeção visual, uso de refletor com lente de aumento, observação sob microscópio estereoscópio e peneiramento de sementes (para ácaros). A identificação das espécies dependendo do estágio de desenvolvimento das pragas contaminantes, enquanto que os materiais introduzidos na forma de propagação vegetativa são tratados com solução de defensivos químicos. Fitopatologia: As análises nos laboratórios de Micologia, Bacteriologia, Virologia e Nematologia são realizadas por amostragem, pois as técnicas utilizadas normalmente destroem os materiais. No caso de sementes, são retiradas amostras que variam de 2 a 10% para ser divididas entre os laboratórios. Em outras formas de propagação vegetativa tais como bulbos, estacas, mudas e rizomas, as análises são realizadas em 100% do material. Laboratório de Micologia: Para detecção de fungos em sementes ou partes da planta, são utilizados os métodos tradicionais de plaqueamento em papel de filtro ou em meio de cultura, lavagem das sementes em água e sedimentação, aprovados pelo "International Seed Testing Association" (ISTA), e descritos detalhadamente em Mendes & Ferreira (1994). Técnicas de biologia molecular, tais como RFLP e RAPDS/ PCR, são ferramentas adicionais para caracterizar patógenos de trigo, milho e sorgo a nível de DNA genômico (Urben, 1994; Ferreira et al., 1996). 36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento

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8 Laboratório de Bacteriologia: Para a detecção de bactérias nas sementes são empregados os seguintes métodos: plantio de sementes em solo esterilizado dentro de câmara úmida para observação dos sintomas em plântulas; plantio de sementes em papel germinador e incubação a 100% de UR; e plaqueamento de extrato de sementes em meio seletivo (Schaad, 1982 e Bradbury, 1986). A identificação das espécies são baseadas em testes fisiológicos e bioquímicos. Laboratório de Nematologia: Uma ou mais técnicas são empregadas rotineiramente para extração de nematóides de sementes, de solo ou de partes vegetativas, São elas: funil de Baermann modificado, peneiramento, centrifugação, flutuação, sistema de bandejas e exame direto sob microscópio estereoscópico (Southey, 1986; Zuckerman et al., 1970). As espécies são identificadas com base nas suas características morfométricas e morfoanatômicas, de acordo com literatura específica (Mai et al., 1975; Tenente e Manso, 1987). Isolamento em meio de cultura específico para detecção de fungos. Laboratório de Virologia: As seguintes técnicas são empregadas para a detecção e aidentificação de vírus ou viróides: plantio de sementes em solo esterilizado em quarentenário para a observação se sintomas, uso de plantas indicadoras, sorologia (imunodifusão e ELISA), microscopia eletrônica ("leaf deep", secções ultrafinas), R- PAGE (Reverse Polyacrylamide Gel Electrophoresis) e NASH (Nucleic Acid Spot Hybridization), descritos detalhadamente em Batista et al (1995). 3. Medidas quarentenárias De acordo com o suplemento ao Diário Oficial nº 195, do Ministério da Agricultura, e do Abastecimento (Brasil, 1995), medidas fitossanitárias referem-se a "qualquer legislação, "standard", diretriz, recomendação ou procedimento oficial que tem o propósito de prevenir a introdução e/ou disseminação de pragas quarentenárias, assim como o seu controle e erradicação" (Ferreira, 1997). Comumente as restrições quarentenárias impostas pelos regulamentos fitossanitários são consideradas como impedimento ao comércio internacional. Entretanto, a utilização de medidas quarentenárias coerentes com o risco que representa a importação de cada produto, pode facilitar a comercialização entre os países (Ganapathi, 1994). As medidas quarentenárias comumente utilizadas são: inspeção fitossanitária e interceptação de pragas em pontos de entrada, quarentena de pós-entrada e proibição, restrição ou requisição de tratamentos quarentenários para a importação de produtos provenientes de países onde espécies de pragas de importância quarentenária são assinaladas. Pode-se também solicitar que os produtos sejam provenientes de áreas livres de pragas (Brasil, 1995). A inspeção fitossanitária é uma medida quarentenária que possibilita a interceptação de organismos nocivos associados ao material vegetal, assim que este chega ao país. A inspeção do material vegetal também fornece algumas informações para se estimar o risco que representa a importação de um dado produto de um país ou região. A identificação dos organismos detectados é de fundamental importância para se decidir sobre o procedimento que deve ser adotado em relação ao material importado. Quando pragas quarentenárias são detectadas durante a inspeção de produtos, uma das três ações seguintes é normalmente tomada: realização de tratamentos, devolução do lote importado ao país de origem ou destruição dos produtos infestados (Baker et al., 1993). Para que um tratamento seja considerado quarentenário, todos os organismos associados ao material vegetal devem receber doses letais sem que o material seja danificado. São poucos os tratamentos que podem realmente alcançar os altos níveis de controle exigidos pelos regulamentos quarentenários. Tratamentos quarentenários efetivos podem auxiliar a evitar o movimento de pragas e facilitar as restrições impostas para a importação de produtos vegetais provenientes de países onde ocorrem pragas de importância quarentenária (MacDonald & Mills, 1994). 4. Pragas de importância quarentenária para o Brasil As medidas quarentenárias são baseadas nas listas de pragas de importância quarentenária formuladas para cada país ou para grupo de países geograficamente próximos. As pragas de importância quarentenária para o Brasil estão contidas nas listas A1 e A2 aprovadas pelo Comitê de Sanidade Vegetal dos países do Cone Sul (COSAVE), publicada no Diário Oficial (Brasil, 1996). As espécies incluídas nas listas A1 e A2 devem ser revisadas periodicamente, devendo ser incluídas e/ou retiradas as pragas, de acordo com relatos da literatura de novas ocorrências. A lista A1 contém as espécies não registradas no Brasil e que podem vir a causar perdas econômicas às culturas, se introduzidas. Na lista A2, estão as pragas de distribuição geográfica localizada e que estão sob controle oficial. Praga quarentenária: É qualquer espécie, raça ou biotipo de vegetal, animal ou agente patogênico nocivo a vegetais ou a produtos vegetais, ausente no país ou, se presente, não amplamente distribuída e sob controle oficial. Praga de qualidade: A praga de qualidade ou nociva é uma praga não-quarentenária, que afeta diretamente o uso proposto dos vegetais ou produtos vegetais, causando perdas econômicas importantes. Cada vez mais, enfatiza-se a importância dos países justificarem seus regulamentos fitossanitários. A meta atual é que os serviços de quarentena aprimorem o processo utilizado para identificar quais são as pragas para as quais as barreiras fitossanitárias são justificáveis, isto é, as que apresentam importância quarentenária, em meio aos milhares de organismos contra os quais as medidas fitossanitárias não podem ser biologicamente sustentadas. Por isso, o processo para determinação de quais as espécies que devem ser consideradas pragas quarentenárias, deve ser claro e consistente (Hopper, 1991). Preparação do teste NCM Elisa para detecção de vírus. Para decidir que espécies serão definidas como pragas de importância quarentenária para um país ou região, uma série de informações deve ser considerada (EPPO, 1993). Por exemplo, é necessário avaliar o potencial das espécies exóticas em causar prejuízos no país em questão. Esse processo é o componente preliminar da Análise de Risco de Pragas (ARP) (Baker et al., 1993; Hopper, 1991 e 1993). Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento 39