REPLICAÇÃO DO HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5) EM PBMC BOVINO E MACRÓFAGOS MURINOS

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1 REPLICAÇÃO DO HERPESVIRUS BOVINO 5 (BoHV-5) EM PBMC BOVINO E MACRÓFAGOS MURINOS Ferrari, A. B.; Laguardia-Nascimento, M.; Serufo, A. V.; Cardoso, T. O.; Alves, L.C.; Barbosa-Stancioli, E. F. Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG Departamento de Microbiologia - ICB Av. Antônio Carlos, Pampulha - CEP Belo Horizonte, MG - Brasil amdferrari@yahoo.com.br Resumo - O Herpesvirus bovino 5 (BoHV-5) causa encefalite em bovinos de leite e corte, e, a disseminação viral no animal infectado não está totalmente elucidada. Sendo o papel dos macrófagos e células mononucleares de sangue periférico (PBMC) na disseminação do Herpesvirus humano 1 (HHV-1) bem estabelecido. Este trabalho objetivou investigar se o BoHV-5 multiplica-se em PBMC bovino e macrófagos murinos. Análises pós-infecção de 24 horas com uma multiplicidade de infecção (m.o.i.) = 0,1 mostrou que, para PBMC bovino não houve alteração na viabilidade celular (100% e 98% para os animais 2 e 1, respectivamente em comparação ao controle). Nos macrófagos infectados a viabilidade teve uma queda de 25% e a concentração de óxido nítrico foi 3,3 vezes maior que o controle; para PBMC não houve alteração em relação ao controle. A análise de mensageiros virais mostrou acumulação de RNAm do gene codificador da gb em todas as células testadas, RNAm da TK somente em macrófagos e RNAm da glicoproteína G somente em PBMC do bovino 2. Estes resultados sugerem que as células testadas puderam ser infectadas pelo BoHV-5 e que, assim como para o HHV-1, estas podem estar implicadas no espalhamento viral. Palavras-chave: Herpesvirus bovino 5, PBMC, Macrófago e Infecção. Área do Conhecimento: Microbiologia. Introdução Os Herpesvirus bovino 5 (Vírus da Encefalite Bovina - BoHV-5) pertence à ordem Herpesvirales, família Herpesvidae, subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Varicellovirus (ICTV, 2009). Estes vírus são de crescimento rápido in vitro e causam lise das células infectadas (FENNER et al, 1993). Uma outra característica importante desta ordem é a capacidade de estabelecer infecções latentes, que podem ser reativadas periodicamente com liberação de partículas virais. O sítio principal de latência da subfamília Alphaherpesvirinae é o núcleo dos neurônios dos gânglios sensoriais (ACKERMANN et al, 1982). Os animais afetados pelo vírus BoHV-5 são de idade variada, com predominância de bezerros, com idade entre 5 e 7 meses. Os principais sinais clínicos são anorexia, corrimento nasal e ocular, salivação excessiva, depressão profunda, nistagmo, opistótono, tremores, marcha em círculos, andar cambaleante, cegueira, paralisia da língua, bruxismo e decúbito com movimento de pedalagem (SALVADOR et al, 1998). A letalidade é próxima dos 100%, de acordo com Carrillo e colaboradores (1983), e a duração do quadro clínico pode variar de 1 a 15 dias, com evolução média de 6 dias (SALVADOR et al, 1998). Riet-Correa e colaboradores (1996) relataram animais que sobreviveram até 7 dias após o início dos sinais clínicos. Formas nervosas associadas com comprometimento do sistema digestivo e/ou respiratório foram relatadas (RIET- CORREA et al, 1989). Embora o vírus não seja primariamente associado à enfermidade respiratória, a inoculação experimental com BoHV- 5 pode causar sinais clínicos respiratórios leves e transitórios (BELKNAP et al, 1994). A infecção do sistema nervoso central (SNC) pelo BoHV-5 se caracteriza histologicamente pelo desenvolvimento de meningoencefalite não supurativa com necrose do córtex cerebral e corpúsculos de inclusão intranucleares podem ser encontrados em astrócitos e neurônios (ELIAS et al, 2004). O primeiro relato de meningoencefalite não supurativa no Brasil foi feito no estado do Rio Grande do Sul. Desde então, alguns surtos esporádicos foram relatados no Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul (SALVADOR et al, 1998), Paraná, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Espírito Santo e São Paulo (GOMES et al, 2002). Um problema encontrado quando se diagnostica BoHV-5 é a facilidade com que se pode confundir os sintomas neurológicos com outras patologias, como raiva, poliencefalomalácia e intoxicação por chumbo. 1

2 Segundo Roehe (1998) ainda não é possível saber a prevalência do BoHV-5 no rebanho nacional devido aos diagnósticos errôneos, falta de um diagnóstico prático que possa diferenciar BoHV-5 e BoHV-1, além do reduzido número de laboratórios no Brasil capazes de realizar diagnóstico virológico. Embora não existam estudos definitivos, acredita-se que as formas de transmissão do BoHV-5 sejam contato direto das mucosas genital ou respiratória, saliva, aerossóis e via sêmen (GOMES et al, 2002), o que ressalta a importância de testes diagnósticos tanto em touros quanto em partidas de sêmen utilizadas por centrais de inseminação artificial. Os principais fatores que vêm contribuindo para a difusão dessa enfermidade são a introdução nos rebanhos de animais oriundos de leilões ou de importações, a crescente utilização de confinamentos para a engorda de animais, a não obrigatoriedade do controle virológico do sêmen comercializado no país e, principalmente, a falta de informação dos criadores, das autoridades e veterinários sobre esta virose (SILVA et al, 1998). A presença de animais portadores favorece a perpetuação do vírus no rebanho, uma vez que eles têm recorrências da infecção eliminando o vírus e, quando a porcentagem de vacas infectadas é alta, elas infectam o rebanho jovem antes da idade reprodutiva (ROEHE et al, 1997). Infecções experimentais têm demonstrado que a via olfatória e a trigeminal são vias de acesso para o BoHV-5 invadir o Sistema Nervoso Central (SNC), porém, a disseminação para outros órgãos não tem sido estudada. Para o Herpesvirus humano 1 (HHV-1) tem sido postulado que a susceptibilidade ou resistência à doença depende da interação vírus-macrófago, e que o movimento destes através dos tecidos, tem um papel importante na disseminação viral (LOPEZ et al, 1979). Quanto ao Herpesvirus bovino 1 (BoHV-1), estudos mostraram que PBMC previamente estimuladas com um mitógeno e posteriormente infectadas com o BoHV-1 entraram em processo de apoptose após 24 a 48 horas de incubação (HAMON et al, 1996). Baseado nas semelhanças entre o BoHV-5 e o BoHV-1, propriedades estruturais, biológicas, antigênicas e moleculares e na necessidade de se elucidar a patogênese do BoHV-5, esse trabalho objetivou investigar se o BoHV-5 multiplica-se em PBMC bovino e macrófagos murinos. Metodologia Foram utilizados macrófagos murinos (C57BL/6) e PBMC bovino (proveniente de 2 animais) inoculados com BoHV-5 amostra EVI-88 (isolado de uma vaca com encefalite) utilizando uma m.o.i. = 0,1. Células incubadas na ausência do vírus foram utilizadas como controle. Obtenção de PBMC Os tubos de coleta contendo aproximadamente 7mL de sangue foram submetidos a centrifugação, e ao término o plasma foi retirado, transferido para microtubos e armazenado a -20 C. Em seguida, o sedimento leucocitário do tubo de coleta foi diluído em meio RPMI não suplementado, transferido cuidadosamente para tubos de 50mL contendo ficol e foram centrifugados. Ao término da centrifugação o anel correspondente ao PBMC foi coletado e transferido para novos tubos de 50mL. Em seguida, foi adicionado RPMI não suplementado, as células foram homogeneizadas, centrifugadas e o sobrenadante descartado. Esse processo de lavagem foi realizado por três vezes e as células foram diluídas em 1mL de RPMI não suplementado. Posteriormente foram coradas com azul de tripan, transferidas para a Câmara de Neubauer e contadas. Em seguida, distribuídas em placas de 6 e 96 poços, na proporção de 1x10 6 células/por poço. Obtenção do macrófago Os camundongos, ainda vivos, foram inoculados via intraperitoneal com 2mL de meio tioglicolato 3%. Após 4 dias, os animais foram sacrificados. Em seguida, a cavidade peritoneal foi lavada por 5 vezes com PBS gelado e o volume aspirado, transferido para tubos de 50mL em gelo. A amostra foi centrifugada, o líquido da camada superior foi desprezado e o pellet diluído em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células foram coradas com azul de tripan (1:10), transferidas para a Câmara de Neubauer e contadas. Em seguida, distribuídas em placas de 96 poços, na proporção de 2x10 5 células/por poço. Ensaio de Infecção de PBMC e Macrófago As células, PBMC e macrófagos, foram inoculadas em duplicata nas placas de 6 poços para PBMC e em triplicata nas placas de 96 poços para PBMC e macrófago, com a amostra EVI-88 (BoHV-5) utilizando uma multiplicidade de infecção (m.o.i. = 0,1) e também controle de células. Após esse procedimento as placas foram incubadas por 1 hora a 37 C em uma estufa de CO 2 e a cada 15 minutos agitadas cuidadosamente. Ao término da incubação foi adicionado o meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino nas placas, totalizando um volume final de 200µL em cada poço, e novamente as placas foram 2

3 incubadas por 24 horas a 37 C em uma estufa de CO 2. Ensaio de Viabilidade Celular Após o período de incubação das células, foram adicionados 100µg da solução de MTT, as placas foram protegidas da luz e incubadas por 4 horas a 37ºC em estufa de CO 2. Ao término da incubação foram retirados 150µL do conteúdo de cada poço e adicionados 150µL de isopropanol (0,04M HCl), os poços foram agitados com o auxílio da pipeta e em seguida, a leitura das placas foi realizada no Espectrofotômetro (ASYS Hitech GmbH)(λ = 595 nm). Dosagem de Óxido Nítrico (NO) A dosagem da concentração de NO nos sobrenadantes, recolhidos após 24 horas foi realizada em placas de 96 poços, adicionando-se 100µL da amostra, 50µL da solução A (sulfanilamida 2% em ácido fosfórico 5%) e 50µL da solução B (alfa-naphytil-ethilenodiane (NEED) 0,2% em água destilada). As amostras ficaram à temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida, a absorbância (λ = 540 nm) foi determinada em Espectrofotômetro (ASYS Hitech GmbH). Os resultados obtidos em µm foram determinados a partir de uma curva padrão realizada com nitrito de sódio (Sigma ). As dosagens e a curva padrão foram feitas em triplicata. Observação do efeito citopático em macrófagos Após o ensaio de obtenção dos macrófagos e infecção, as células foram incubadas por 24 horas a 37ºC em estufa de CO 2. Ao término do período de incubação as células foram observadas em um microscópio óptico, para a verificação da propagação viral na cultura de célula e o efeito citopático causado. e água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). O mix foi reservado e armazenado em gelo. Em seguida, foram adicionados em novos microtubos as amostras de RNA, Oligo DT e água DEPC. As amostras foram incubadas por 5 minutos a 70 C e ao término da incubação submetidas a um banho de gelo por 5 minutos. Após o banho de gelo o mix foi adicionado em cada amostra e a reação de amplificação foi feita em um termociclador (MJ Research Inc.). Amplificação dos genes β-actina, Glicoproteína G, Glicoproteína B e Timidina Kinase (TK) A reação de PCR, para cada amostra, foi feita a partir da solução mix, com as concentrações ajustadas para cada gene, contendo MgCl 2, tampão, dntp, iniciador senso, iniciador antisenso, Taq DNA Polimerase e água estéril ultrapura. A reação de amplificação foi feita em um termociclador (MJ Research Inc.). Eletroforese Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8%, acrescido de brometo de etídio (0,5µg/mL) (Sigma ). O gel foi submetido a uma corrente elétrica 80V por 40 minutos, na presença de tampão TBE 1x. Para a determinação do tamanho do produto de PCR utilizou-se um marcador de tamanho molecular 100pb DNA Ladder Plus (Fermentas Life Sciences). Resultados Analisando com microscopia ótica os macrófagos, observou-se que o isolado viral (EVI- 88) após 24 horas de inoculação induziu morte celular. A figura 1 mostra macrófagos murinos infectados com perda de definição de membrana e formação de sincício; vacuolização e granulação. Extração de RNA Após as 24 horas de incubação das placas infectadas, os sobrenadantes de cada poço foram coletados e reservados em microtubos a -20 C para posterior dosagem de NO. A extração de RNA celular foi realizada pelo método de TRIZOL (Invitrogen TM ) (CHOMCZYNSKI & SACCHI, 1987). Reação de Transcrição Reversa seguida de PCR A reação de RT-PCR, para cada amostra, foi feita a partir da solução mix, contendo MgCl 2, RT tampão, dntp mix, RNAsin, Transcriptase reversa Figura 1: Macrófago peritoneal murino inoculado com o isolado de BoHV-5 (EVI-88) na m.o.i. = 0,1. A - Macrófago não inoculado e B - Macrófago inoculado (microscópio Olympus Ix70). 3

4 Utilizando a PCR, após transcrição reversa, os amplicons correspondentes ao gene normalizador β-actina e codificador da gb foram vistos em todas as amostras (PBMC e macrófago). O mesmo resultado não foi obtido para o gene codificador da gg, onde as amostras PBMC 1 (animal 1)e macrófago não amplificaram e somente o amplicon do PBMC 2 (animal 2) foi visto. Para o gene da TK as amostras PBMC 1 e PBMC 2 não amplificaram e somente o amplicon do macrófago foi visto. A dosagem de óxido nítrico foi medida pelo método de Griess (em PBMC e macrófago). Observou-se diferença estatística (ANOVA teste t não pareado) somente entre amostra viral e o controle de macrófago. Os PBMCs não apresentaram diferenças estatísticas em relação aos seus respectivos controles. Figura 2: gel de agarose 1,2%, corado com brometo de etídeo. PCR utilizando iniciniadores do gene normalizador, gg, gb e TK. Canaletas: P - Padrão de tamanho molecular 100pb; 1 - PBMC 1 infectado com EVI-88; 2 - PBMC 2 infectado com EVI-88; 3 - Macrófago infectado com EVI-88 e M - Controle master mix. A viabilidade celular foi medida usando o ensaio de MTT (em PBMC e macrófago). Observou-se diferença estatística (ANOVA teste t não pareado) somente em macrófagos inoculados x não inoculados (p=0.0004), onde houve uma queda de 25% nas células inoculadas. A viabilidade de PBMCs não mostrou diferença estatística em relação a células inoculadas e seus respectivos controles. Figura 3: Viabilidade celular. As células, PBMC 1 (animal 1), PBMC 2 (animal 2) e macrófagos, foram infectados (m.o.i. = 0,1) com uma amostra do vírus BoHV-5 (EVI-88) e incubadas por 24 horas a 37ºC em estufa de CO 2. Ao término do período de incubação, as células foram avaliadas quanto a viabilidade celular. Figura 4: Dosagem de óxido nítrico utilizando o método de Griess. As células, PBMC 1, PBMC 2 e macrófagos, foram infectados (m.o.i. = 0,1) com uma amostra do vírus BoHV-5 (EVI-88) e incubadas por 24 horas a 37ºC em estufa de CO 2. Ao término do período de incubação o sobrenadande de cada célula foi coletado e avaliado quanto a produção de óxido nítrico. Discussão Efeito citopático No que diz respeito à observação da propagação viral em cultura de células permissivas, várias abordagens podem ser realizadas a fim de se detectar a propagação viral nas células inoculadas (SANTOS et al, 2008). Pesquisas mostraram que tanto o BoHV-1 como o BoHV-5 produzem efeito citopático bastante evidente em vários tipos celulares. Esses vírus causam efeito citopático visível entre 22 e 72 horas após inoculação (FLORES et al, 2008). Nos macrófagos murinos utilizadas nesse trabalho pode ser observado claramente o efeito citopático característico dos herpesvírus nas células após 24 horas de incubação com o vírus BoHV-5 (EVI-88), mostrando que as células são permissivas a esse vírus. Ressalta-se que com 9 horas pós-infecção os herpesvírus bovinos já geram nova progênie (Babiuk et. al, 1996). Análise da PCR As glicoproteínas desempenham funções vitais no processo de infecção viral, mediando os processos de reconhecimento e adsorção às células alvo, penetração do vírion, fusão e 4

5 disseminação do vírus célula a célula em cultivos celulares (ROIZMAN, 1996). Estudos realizados com a Timidina Kinase (TK) de BoHV-1 mostraram que deleções neste gene levam à perda de virulência do vírus, apesar de conservar a capacidade de neuroinvasão (MUYLKENS et al, 2003). O gene da glicoproteína B é essencial componente para BoHV-1 e BoHV-5, pois possui um papel crucial na entrada do vírus na célula hospedeira (ROS et al, 2002). No vírus BoHV-1, foi demonstrado que a glicoproteína G é necessária para a propagação de célula a célula e neurovirulência (MUYLKENS et al, 2003) e que esta proteína é uma viroquina, bloqueando a ação de muitas quimiocinas celulares. Pode ser observado na figura 2 que o PBMC do animal 2 foi o único a apresentar viabilidade de 100% e foram as únicas células a terem a amplificação para o gene codificador desta viroquina positiva, pontuando que novos estudos necessitam ser realizados para elucidar esta relação e o papel da produção desta viroquina no uso dos macrófagos e células mononucleares como carreadores e disseminadores do BoHV-5 no organismo. Viabilidade Celular Hamon e colaboradores (1996) realizaram um estudo utilizando PBMC e o Herpesvirus bovino 1 e concluíram que houve replicação viral em pelo menos uma fração das células infectadas. Neste estudo aqui realizado, com PBMC observou-se que o vírus BoHV-5 não interferiu totalmente no processo de proliferação celular das amostras PBMC 1 e PBMC 2, com isso, as células se mostraram ainda viáveis (98 a 100%). Com base nesses resultados, pode ser hipotetizado que o vírus teria a capacidade de subverter este sistema celular no sentido de utilizar as células como carreadoras, facilitando o processo natural de proliferação. Estudos realizados com macrófagos e o HHV-1 mostraram que a susceptibilidade ou resistência à doença dependem da interação vírus-macrófago, e que o deslocamento destes através dos tecidos possui um papel importante na disseminação viral. Lopez e colaboradores (1979) observaram que, em ensaios in vitro utilizando macrófagos murinos, o vírus HHV-1 foi capaz de se multiplicar. Contudo, quando analisadas in vivo essas células iniciaram uma potente resposta imunológica antiviral, com a produção de IFN do tipo I. Com isso, as células impediram a multiplicação viral. Nos ensaios in vitro aqui apresentados, utilizando macrófagos murinos, observamos que o vírus interferiu no processo de proliferação celular, diminuindo a viabilidade dessas células em 25% em relação ao seu controle, demonstrando dessa forma a interação vírus-macrófago, conforme observado pelos pesquisadores no estudo acima. Dosagem de óxido nítrico Flores e colaboradores (2009) avaliaram a produção do óxido nítrico (NO) em coelhos infectados via intramuscular e intranasal pelo vírus BoHV-5 (EVI-88). Os pesquisadores propuseram que o NO produzido principalmente por células da glia e astrócitos, poderia ter atividade antiviral no início da infecção, mas em fases mais avançadas e em níveis maiores, poderia ser neurotóxico. Observaram também que a replicação do BoHV-5 no encéfalo é acompanhada de elevação significativa dos níveis de NO. Nesse trabalho observou-se que a produção de óxido nítrico nas amostras de PBMC 1 e PBMC 2 infectadas com o vírus BoHV-5 não apresentou alteração em relação aos seus respectivos controles, mostrando que a produção de óxido nítrico nessas células foi de certa forma equilibrada. Em contrapartida, o mesmo resultado não foi observado nos macrófagos, onde a produção de óxido nítrico na amostra (macrófago) infectada com o vírus foi 3,3 vezes maior que o seu respectivo controle (p=0.0004). Conclusão Com base nesses resultados sugerimos que as células testadas (PBMC bovino e macrófago murino) puderam ser infectadas pelo BoHV-5 e que, assim como para o HHV-1, estas podem estar implicadas no carreamento viral nos animais infectados. Referências - ACKERMANN, M.; PETERHANS, E.; WYLER, R. DNA of bovine herpesvirus type 1 in the trigeminal ganglia during latently infected calves. American Journal Veterinary Research, V.43, n.1, p.36-43, BABIUK, L.A.; VAN DRUNEN LITTEL-VAN DEN HURK, S.; TIKOO, S.K. Immunology of bovine herpesvirus 1 infection. Veterinary Microbiology, V. 53, p.31-42, BELKNAP, E. B.; COLLINS, J. K.; AYERS, V. K.; SCHULTHEISS, P. C. Experimental infection of neonatal calves with neurovirulent bovine herpesvírus type 1.3. Veterinary Pathology, V. 31, p ,

6 - CHOMCZYNSKI P, SACCHI N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem, V.162, p , ELIAS, F.; SCHILD, A.L.; RIET-CORREA, F. Meningoencefalite e encefalomalácia por Herpesvírus Bovino-5: distribuição das lesões no sistema nervoso central de bovinos naturalmente infectados. Pesquisa Veterinária Brasileira, V. 24, n.3, p , FENNER, F. J.; GIBBS, E. P. J.; MURPHY, F. A.; ROTT, R.; STUDERT, M. J.; WHITE, D. O. Veterinary Virology. 2. ed. San Diego: Academic Press, 1993b. Cap.1, p cap 25, p.: Flaviviridae. - FLORES, E. F. Herpesviridae. Virologia Veterinária. Capítulo 17, p.451, FLORES, E. F.; WEIBLEN, R.; VOGEL, F. S. F.; DEZENGRINI, R.; ALMEIDA, S. R.; SPILKI, F. R.; ROEHE P. M. Neuropatogênese experimental da infecção pelo herpesvírus bovino tipo 5 em coelhos1. Pesquisa Veterinária Brasileira, V.29, n.1, p.1-16, GOMES, L. I.; ROCHA, M. A.; COSTA, E. A.; LOBATO, Z. I. P.; MENDES, L. C. N.; BORGES, A. S.; LEITE, R. C.; BARBOSA-STANCIOLI, E. F. Detecção de herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) em bovinos do Sudeste Brasileiro. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, V.54, n.2, p.1-5, HAMON, E.; VANDERPLASSCHEN, A.; LYAKU, J.; KEIL, G.; DENIS, M.; PASTORET, P. P. Inactivated bovine Herpesvirus 1 induces apoptotic cell death of mitogen-stimulated bovine peripheral blood mononuclear cells. Journal of Virology, V. 70, n.6, p , LOPEZ, C.; DUDAS, G. Replication of Herpes Simplex Virus type 1 in macrophages from resistant and susceptible mice. Infection and Immunity, V.23, n.2, p , RIET-CORREA, F.; VIDOR, T.; SCHILD, A. L.; MÉNDEZ, M. C. Meningoencefalite e necrose do córtex cerebral em bovinos causadas por herpesvírus bovino-1. Pesquisa Veterinária Brasileira, V.9, n.1-2, p.13-16, ROEHE, P. M.; SILVA, T. C.; NARDI, N. B.; OLIVEIRA, D. G.; & ROSA, J. C. A. Diferenciação entre o vírus da rinotraqueíte infecciosa bovina (BHV-1) e o herpesvírus da encefalite bovina (BHV-5). Pesquisa Veterinária Brasileira, V.17, p.41-44, ROEHE, P. M.; TEIXEIRA, M. B.; ESTEVES, P. A.; MELO, S. V.; ALMEIDA, R. S.; D ARCE, R. C. F.; SILVA, T. C.; LEMOS, R. A.; OLIVEIRA, L. G. Situação do BHV-1 e BHV-5 no Brasil. In: Simpósio Internacional Sobre Herpesvírus Bovino (Tipo 1 e 5) e Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), 1998, Santa Maria. Anais... Santa Maria, RS, p ROIZMAN, B. Herpesviridae. Fields Virology. Chapter 71, p ROS, C & BELÁK, S. Characterization of the glycoprotein B gene form ruminant Alphaherpesviruses. Virus Gene, V.24, n.2, p , SALVADOR, S. C.; LEMOS, R. A. A.; RIET- CORRÊA, F.; ROHE, P. M.; OSÓRIO, A. L. A. R. Meningoencefalite em bovinos causada por herpesvírus bovino-5 no Mato Grosso do Sul e São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira, V. 18, n.2, p.75-82, SANTOS, N. S. O.; ROMANOS, M. T. V.; WIGG, M. D. Virose dermatrópica. Introdução à Virlogia Humana. Capítulo 7, p.185, SILVA, A.M. et al. (Org). Herpesvírus bovino (tipo 1 e 5) e vírus da diarréia viral bovina (BVDV). In: Simpósio Internacional Sobre Herpesvirus Bovino (Tipo 1 e 5) e Vírus da Diarréia Viral Bovina (BVDV), 1998, Santa Maria. Anais... Santa Maria, RS, MUYLKENS, B. MEURENS,; SYNTHS, F.; THIRY, E. Les facteurs de virulence des alphaherpèsvirus. Virologie, V.7, n.6, p , RIET-CORREA, F.; MOOJEN, V.; ROEHE, P.M.; WEIBLEN, R. Viroses confundíveis com febre aftosa: revisão bibliográfica. Ciência Rural, V.26, p ,