Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia. Glauciane da Silva Bifano Tavares

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1 Universidade Federal de Rondônia - UNIR Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO Unidade Laboratorial de Virologia Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia Glauciane da Silva Bifano Tavares Porto Velho - RO 2009

2 Universidade Federal de Rondônia - UNIR Centro de Pesquisa em Medicina Tropical - CEPEM Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO Unidade Laboratorial de Virologia Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia Orientado(a): Glauciane da Silva Bifano Tavares Orientador: Dr. Weber Cheli Batista Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação, Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia, como requisito para obtenção do grau de mestre em Biologia Experimental. Área de Concentração: Patógeno/ Hospedeiro. Apoio: Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM; Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO; Porto Velho - RO 2009

3 FICHA CATALOGRÁFICA Tavares, Glauciane da Silva Bifano Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia/ Tavares, Glauciane da Silva Bifano Porto Velho: fls. Dissertação (Mestrado) - Fundação Universidade Federal de Rondônia - UNIR. Porto Velho - RO, Área de concentração: Patógeno/ Hospedeiro Orientador: Dr. Weber Cheli Batista Palavras chaves dengue, RT-PCR, sequenciamento, genótipos, filogenia

4 Universidade Federal de Rondônia - UNIR Centro de Pesquisas em Medicina Tropical - CEPEM Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais - IPEPATRO Unidade Laboratorial de Virologia Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia Glauciane da Silva Bifano Tavares Porto Velho - RO 2009

5 AGRADECIMENTOS Ao meu Senhor Deus, que me deu o dom da vida, os dias e as noites, tendo cada dia como um presente, me dando forças e coragem nessa caminhada. A meus pais que mesmo distantes estiveram sempre presentes com palavras de incentivos, amor e carinho. Aos tios Luis Augusto, Maria Marta e prima Glauce Anne que me deram a oportunidade para lutar pelos meus ideais e chegar até aqui. Ao meu esposo Alcy Tavares, que de forma incondicional esteve ao meu lado, me ensinando a ser tolerante e paciente, sempre me dando palavras de incentivos. Aos meus sogros Hélia, Jorge, sobrinhos Cristine, Antonio, cunhados Julia e Neto, por me acolherem tão bem quando eu mais precisei. A minha amiga Danielle por sempre me incentivar. Aos meus colegas de laboratório pelo aprendizado e companheirismo. A aluna de iniciação científica Maiara, por sempre estar dispostas a me ajudar na bancada com os experimentos. A Marlucia (Kiki), Dona Nair, Adair e Antônio que sempre estiveram dispostos a ajudar e facilitar a parte técnica, dando suporte para nossos experimentos. Ao Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais- IPEPATRO e ao Laboratório de Virologia - CEPEM. As secretárias do CEPEM/IPEPATRO e todos aqueles que estiveram ao meu lado, ajudando diretamente e indiretamente para a finalização desta etapa tão importante da minha vida.

6 AGRADECIMENTOS ESPECIAIS Ao Prof. Luiz Hildebrando Pereira da Silva que possibilitou conhecer a pesquisa, sendo exemplo de dedicação. Ao Dr. Weber Cheli Batista, que abriu as portas do laboratório de virologia, com todo o suporte para desenvolvimento e conclusão experimental deste trabalho. Ao Doutorando Christian Julián Villabona do Laboratório de Evolução Molecular e Bioinformática da USP, por ter dado grande contribuição com as análises filogenéticas. A Msc. Deusilene Souza Vieira que forneceu ensinamentos científicos nos meus primeiros passos dentro da prática laboratorial. A Msc. Joana D Arc e ao Biólogo Francisco que estiveram ao meu lado quando precisei, com palavras de incentivos. Aos Laboratórios de Epidemiologia Molecular, Plataforma Técnica de Hepatites - CEPEM/IPEPATRO, e Dr. Eduardo Rezende Honda que me deram suporte para clonagem das amostras. MUITO OBRIGADA!

7 Índice Lista de Figuras Lista de Tabelas Abreviaturas Resumo Abstract 1- Introdução 1.1- Dengue Histórico do Dengue Dengue no Brasil Dengue no Estado de Rondônia Morfologia e Genoma do vírus dengue Diagnóstico Laboratorial Diagnósticos Sorológicos Isolamento Viral Diagnósticos Moleculares Sequenciamento Viral Objetivos 2.1- Objetivo Geral Objetivos Específicos Material e Métodos 3.1- Cadastro pessoal, coleta de dados clínicos e epidemiológicos Amostra biológicas Isolamento viral Extração do RNA Viral Transcrição Reversa e Reação da Polimerase em Cadeia (RT-PCR) Confecção do cdna PCR Primers D1 e D Primers DEN2-S e DEN2-C Eletroforese dos Produtos da PCR Gel de Agarose 1,5% Hemi-nested-PCR Eletroforese do Produto da Hemi-nested-PCR Gel de Agarose 2,0% Clonagem Purificação dos amplicons para clonagen Confirmação da Purificação Ligação em vetor de clonagem Preparo de bactérias competentes Transformação Bacteriana Extração do DNA Plasmidial

8 Digestão do vetor Sequenciamento Análise das Sequências BLAST Árvore Filogenética Resultados 4.1- Isolamento viral Em células C6/ RT-PCR Primers D1 e D Primers TS1, TS2, TS3 e TS Primers DEN2-C e DEN2-S Clonagem dos fragmentos Purificação dos fragmentos de DNA amplificados Ligação do fragmento ao vetor Confirmação da clonagem Sequenciamento Árvore Filogenética Genotipagem DENV-2 e DENV Discussão Conclusões Referências Anexo 8.1- Anexo I

9 Lista de Figuras Figura 1: Mapa do Estado de Rondônia Figura 2: Representação esquemática do vírus do dengue Figura 3: Genoma do dengue Figura 4: Monocamada de células C6/36, Figura 5: Local de anelamento dos primers D1/D Figura 6: Local de anelamento dos primers DEN2-S/ DEN2-C Figura 7: Representação Esquemática Vetor de Clonagem pdrive Figura 8: Modelo esquemático do vetor de clonagem após transformação Figura 9: Monocamada de células C6/36 não infectada A e infectada B Figura10 : Amplificação da RT-PCR com primers D1/D Figura 11: Amplificação da Hemi-nested-PCR Figura 12: Amplificação RT-PCR com primers DEN2-S/DEN2-C Figura 13: Purificação dos amplicons Figura 14: Ligação do inserto ao vetor de clonagem Figura 15: Digestão enzimática Figura 16a: Árvore filogenética dos vírus dengue 1 a Figura 16b: Árvore filogenética dengue Figura 16c: Árvore filogenética dengue

10 Lista de Tabelas Tabela 1: Distribuição de amostras analisadas nos municípios de Rondônia Tabela 2: Descrição das sequências dos primers D1/D Tabela 3: Descrição das sequências dos primers DEN2-S/ DEN2-C Tabela 4: Descrições das sequências dos primers TS1 a TS Tabela 5: Resultado da identificação do vírus dengue em Rondônia Tabela 6: Dados dos vírus dengue 2 e 3 isolados em Rondônia... 55

11 Lista de Abreviaturas AcK: Acetato de Potássio Amp: Ampicilina BOD: Biochemical Oxygen Demand C - : Controle Negativo C: Proteína Estrutural do capsídeo do vírus dengue C + : Controle Positivo C6/36: Célula de mosquito Aedes albopictus CaCl 2 : Cloreto de cálcio cdna: DNA complementar CEPEM: Centro de Pesquisa em Medicina Tropical DENV- 1: Vírus da dengue sorotipo 1. DENV- 2: Vírus da dengue sorotipo 2. DENV- 3: Vírus da dengue sorotipo 3. DENV- 4: Vírus da dengue sorotipo 4. DENV: Vírus dengue DMSO: DimetIl sulfoxido DNA: Àcido desoxiribonucléico dntps: Desoxirribonucleotídeos trifosfatados DO: Densidade óptica. DTT: Ditiotreitol. E. coli: Escherichia coli E: Proteína estrutural de envelope do vírus dengue EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

12 EUA: Estados Unidos da América FC: Fixação do Complemento FD: Febre do Dengue FHD: Febre hemorrágica da dengue GI: Genótipo I GII: Genótipo II GIII: Genótipo III GIV: Genótipo IV GV: Genótipo V GARLI: Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference GenBank: Banco de Dados GTR: General Time Reversible HI: Inibição de hemaglutinação IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IFI: Imunofluorescência Indireta IgG: Imunoglobulina da classe G IgM: Imunoglobulina da classe M IPEPATRO: Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais IPTG: Tio β-galoctopiranosídeos de isopropila Kb: kilobases KCl: Clorete de Potássio kda: kilodaltons L-15: Leibowitz-15 LB: Luria Bertani M: Proteína Estrutural de Membrana do vírus dengue

13 MgCl 2 : Cloreto de Magnésio MnCl 2 : Cloreto de Manganês NS1: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS2a: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS2b: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS3: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS4a: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS4b: Proteína não Estrutural do vírus dengue NS5: Proteína não Estrutural do vírus dengue OMS: Organização Mundial de Saúde ORF: Cadeia aberta de leitura PAHO: Organização Pan-Americana de Saúde PAUP: Phylogenetic Analysis Using Parsimony Pb: Pares de base PCR: Reação em cadeia da polimerase Pd(N) 6 : Primer randômico ph: Potencial hidrogeniônico prm: Proteína Precursora de Membrana PVH: Porto Velho q.s.p: Quantidade suficiente para o volume RNA: Ácido ribonucléico RT-PCR: Reação em cadeia da polimerase precedida de transcrição reversa. SCD: Síndrome de choque do dengue SVS: Secretaria de Vigilância em Saúde TA: Temperatura ambiente

14 TAE: Tris-acetato-EDTA Tetra: Tetraciclina TN: Teste de neutralização U: Unidades UV: Ultra violeta V: Volume WM: Marcador de peso molecular X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactosideo YFV: Vírus da Febre Amarela

15 Análise Filogenética dos vírus 2 e 3 do Dengue no Estado de Rondônia Unidade Laboratorial de Virologia, Centro de Pesquisa em Medicina Tropical de Porto Velho, Rodovia BR-364, Porto Velho- Rondônia, Brasil. RESUMO O dengue, pertencente ao gênero Flavivirus, é considerado a arbovirose de maior incidência e prevalência, constituindo um grave problema de saúde pública em regiões tropicais e subtropicais, afetando o homem tanto em termos de morbidade quanto em mortalidade, ocorre associado aos aspectos epidemiológicos característico das áreas tropicais, na qual as condições do ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do vetor. Esse trabalho teve como objetivo desenvolver um estudo filogenético molecular dos sorotipos 2 e 3 do vírus dengue, determinando os genótipos circulantes no estado de Rondônia entre 2002 a Foram analisadas 190 amostras sobrenadantes de cultura celular C6/36 infectadas com o vírus dengue isolados do soro de pacientes dos municípios: Porto Velho, Ariquemes, Cacoal, Colorado D Oeste, Jarú, Ouro Preto D Oeste e Vilhena. As amostras foram submetidas à extração do RNA viral, seguido da amplificação dos genes C/prM e E através da metodologia da RT-PCR utilizando dois pares de primers diferentes: D1/D2 seguido de Hemi-nested-PCR (Lanciotti et al., 1992) e DEN2-S/DEN2-C (Figueiredo et al., 1997), para confirmação do sorotipo viral. Os produtos foram clonados. As sequências obtidas foram analisadas através de programas (Garli/Paup) para obtenção de árvores filogenéticas. Das 190, somente 80 amostras foram identificadas como DENV, sendo 79 identificadas como DENV- 3 e apenas uma como DENV-2. Em seguida 15 amostras foram clonadas e seis sequenciadas, e classificadas em DENV-3 genótipos III e V, DENV-2 genótipo Américo/Asiático. O genótipo III do DENV-3 formou um ramo, onde os clados mostraram vírus de origem asiática, leste da África e América do Sul e Central, o genótipo V formou um ramo onde os clados mostraram vírus de origem das Américas, sul do Pacífico e Ásia. O DENV-2 genótipo Américo/Asiático formou um ramo, onde os clados se apresentam com vírus de origem das Américas e Ásia. Em conclusão, foram encontrados os genótipos III e V DENV-3 e genótipo Américo/Asiático DENV-2, e o estudo filogenético provê uma evidência da circulação do vírus dengue dentro do estado de Rondônia, vindo de outras áreas do Brasil ou até mesmo de outros países. Palavras-chave: dengue, RT-PCR, sequenciamento, genótipos, filogenia.

16 Phylogenetic analysis of Dengue 1 and 2 virus in the state or Rondônia Virology Lab.Unit. Tropical Medicine Research Center of Porto Velho, Rodovia 364, Porto Velho Rondônia, Brazil. ABSTRACT The dengue, which belongs to the Flavivirus gender, is considered the most current and frequent arbovirose, causing a huge public health problem in tropical and subtropical regions, affecting man not only in terms of morbity but also in mortality, it occurs associated with epidemiologic aspects in tropical areas, in which the environmental conditions are perfect to develop and spread the vetor. The objective of this work was to develop a molecular phylogenetic study of the serum 1 and 2 of the Dengue virus, determining the circulating genotype in the state of Rondônia between 2002 and It was analysed 190 samples of cellular culture of C6/36 infected with dengue virus isolated from the serum of the patient in Porto Velho, Ariquemes, Cacoal, Colorado do Oeste, Jaru, Ouro Preto do Oeste and Vilhena counties. The samples were subordinated to the extraction of the viral RNA, fallowed by the amplification of the part of the gene C/PrM and E through the methodology of RT-PCR (Lanciotti et al, 1992) and DEN2-S/DEN2-C (Figueiredo et al, 1997), for the viral type confirmation. The products were cloned. The obtained sequences were analysed by programs (Garli/Paup) to acquire phylogenetic trees. From 190 just 80 samples were mapped as DENV, being 79 mapped as DENV-3 and only one as DENV-2. After that 15 samples had beem clanadas and to sequence, and classified in DENV-3 genotype III and V, DENV-2 genotype American/Asian. The genotype III DENV-3 formed a branch where the clades showed virus from Asia, East Africa, also Central and South America. The genotype V formed a branch where the clades had shown virus originated from South America, South Pacific and Asia. The genotype Americ/Asiatic DENV-2 formed a branch of clades where has shown virus of America and Asia origin. In conclusion, the genotypes III and V DENV-3 and genotype Américan/Asian DENV-2 had been found, and the phylogenetic study provides an evidence of the dengue virus circulation inside the state of Rondônia, coming from other areas and even other countries. Key Words: Dengue, RT-PCR, Sequence, genotype, phylogeny.

17 1- INTRODUÇÃO

18 1.1- Dengue A dengue é considerada a arbovirose de maior incidência e prevalência, constituindo um grave problema de saúde pública em regiões tropicais e subtropicais, afetando o homem tanto em termos de morbidade quanto em mortalidade (Halstead, 1990, Monath, 1994). Atualmente, a febre do dengue e suas formas mais graves, mostram expansiva distribuição geográfica e atividade epidêmica. Apresenta-se como uma doença febril aguda, de etiologia viral, transmitida ao homem pela picada da fêmea do mosquito Aedes aegypti. O vírus do dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivírus ( Westaway et al.,1985, Gubler, 1987, Ruggli & Rice, 1999). Os DENV são classificados em quatro sorotipos específicos, devido suas características antigênicas: dengue sorotipo 1 (DENV-1), dengue sorotipo 2 (DENV-2), dengue sorotipo 3 (DENV-3) e dengue sorotipo 4 (DENV-4) (Scherer, 1968 apud Focaccia & Veronesi, 2002). Cada um desses sorotipos possui genótipos que diferenciam entre si por variações na sequência de nucleotídeos, em nível de genes da glicoproteína E, e da junção dessa glicoproteína com a proteína NS1 (Calisher et al., 1989) A infecção com qualquer um dos quatro sorotipos varia desde assintomáticas, levando a uma doença febril, podendo apresentar sintomas leves e moderados, conhecida como febre do dengue (FD), ou dengue clássico que pode comportar-se como uma síndrome viral inespecífica e benigna. As infecções podem evoluir para quadros mais graves ou até mesmo fatais, com o aparecimento de hemorragias, febre hemorrágica do dengue (FHD) ou síndrome choque do dengue (SCD) (Halstead, 1989, Gluber, 1998). Uma infecção primária com qualquer um dos sorotipos do DENV confere proteção parcial e temporária contra os outros sorotipos, sendo possível ocorrência de infecções secundárias ou sequenciais. Frequentemente se associa a gravidade da doença a infecções secundárias heterotípicas do dengue (Rothman & Ennis, 1999). Acredita-se que infecções secundárias ou múltiplas pelo DENV são um dos principais fatores de risco para evolução da FHD/SCD, além de outros fatores que podem influenciar como: virulência da cepa viral; características genéticas do hospedeiro; além do estado imunológico do paciente (Rosen, 1977, Gubler et al.,1978, Bravo et al., 1987).

19 Clinicamente, as formas mais graves da dengue, a FHD/SCD, são de difícil diagnóstico, podendo ser confundidas com outras doenças caracterizadas por distúrbios da permeabilidade capilar (Henchal & Putnak, 1990). No entanto, o processo fisiopatológico para o desenvolvimento da FHD/SCD da dengue ainda não foi totalmente esclarecido (Rothman, 2004, Guzman & Kouri, 2008) Histórico do Dengue As primeiras descrições e registros de epidemias compatíveis com dengue datam de aproximadamente , na Ásia, África e América do Norte ( Siler et al., 1926, apud Boletim Epidemiológico, PAHO, 1997). A primeira descrição clínica da dengue foi feita por Benjamin Rush em 1780, na Philadelphia- EUA, embora se suspeite que o DENV venha causando epidemias há vários séculos. Em 1906, Bancroft descreveu que a transmissão do DENV era feita pelo mesmo vetor da febre amarela, o mosquito Aedes aegypti. A partir de 1954, Hammon et al., descreveram uma nova manifestação clínica causada pelo DENV, caracterizada por hemorragia generalizada e estado de choque (Figueiredo & Fonseca, 1996). O DENV foi isolado pela primeira vez na década de 40 no Japão, a cepa isolada foi de dengue sorotipo 1 sendo então considerada a cepa padrão e denominada de Mochizuki (Hotta & Kimura, 2001, Zulkarnain et al., 1994). No ano de 1945, duas outras cepas de DENV foram isoladas, no Havaí e em Nova Guiné, observando a presença de características antigênicas distintas, levando a conclusão de que havia mais de um sorotipo (Sabin, 2002, Martinez-Torres, 1990). Em 1968, Scherer sugeriu ao comitê da Organização Mundial de Saúde (OMS) a classificação do DENV de acordo com suas características antigênicas, sendo assim, as cepas isoladas do Japão e Havai, foram classificadas em DENV sorotipo 1, de Nova Guiné em DENV sorotipo 2 e os isolados do sudeste asiático como DENV sorotipo 3 e 4 (Scherer, 1968 apud Veronesi, R. and Focaccia, R. Tratado de Infectologia, 2002). Na década de 50, a Organização Pan-americana de Saúde (PAHO, 1997), estabeleceu uma campanha para erradicar o Aedes aegypti, resultando na erradicação do ciclo viral na América Central e do Sul. Porém, os sorotipos DENV-2 e DENV-3 permaneceram circulando em algumas ilhas do Caribe

20 durante esse período, resultando em uma mudança de perfil clínico e epidemiológico da doença (Gubler e Clark, 1995). A primeira epidemia de febre hemorrágica ocorreu entre os anos de 1953 e 1954, nas Filipinas e Tailândia, expandindo-se para vários países asiáticos, ilhas do sul do Pacífico e nas Américas (Hammon et al., 2002). Na década de 70, o problema de epidemias do DENV agravou-se particularmente nos países tropicais de todos os continentes. A primeira epidemia de FHD/SCD descritas nas Américas, onde foi isolado DENV-2 acorreu nos anos 80, em Cuba (Kouri et.al., 1986). A severidade da doença foi associada à circulação do sorotipo DENV-2 de origem asiática (Rico-Hesse., 1990, Guzman et al., 1995). A FHD foi registrada na Venezuela em 1989, e em seguida foi notificado em outros países da América do Sul, simultaneamente com a introdução do DENV-3 que não havia sido notificado nas Américas desde A FHD não havia sido diagnosticada na América Central até o ano de 1994 (Gubler & Clark.,1995). Na década de 90, epidemias de dengue clássica e/ou FHD/SCD foram descritas em vários centros urbanos, afetando cerca de 25 países do continente americano (Pinheiro & Corber, 1997). Em 1994, registrou-se a reintrodução do sorotipo 3 que ocorreu simultaneamente no Panamá e Nicarágua, causando uma epidemia grave de dengue hemorrágico (Guzman et al., 1996, Harris et al., 1999), e em 1995, no México (PAHO, 1997) Dengue no Brasil A primeira epidemia do vírus dengue com confirmação laboratorial aconteceu em 1982, na cidade de Boa Vista, capital do Estado de Roraima, onde foram isolados DENV-1 e DENV-4. Estes agentes estavam circulando em diversos países do Caribe, no norte da América do Sul e sua introdução, possivelmente, ocorreu por via terrestre, pela fronteira da Venezuela (Osanai et al.,1986). Na década de 80 a dengue tornou-se um problema de saúde pública nacional quando houve a dispersão do DENV-1 por diversos estados do país, sendo introduzido na cidade de Nova Iguaçu-RJ (Schatzmayr et al., 1986). A situação da dengue foi agravada pela introdução do DENV-2 no estado do Rio de Janeiro no ano de 1990, que resultou no aparecimento das formas mais

21 graves da doença (Nogueira et al., 1990). No período compreendido entre 1986 e 1993, as epidemias atingiram mais os grandes centros urbanos, porém, a ausência de uma política nacional eficaz de combate ao vetor resultou na rápida dispersão do vírus pelo país e, consequentemente, na ocorrência de epidemias em diversos Estados (Boletim Epidemiológico- Fundação Nacional de Saúde, Ministério da Saúde, 1999) O DENV-3 foi introduzido no Brasil em 1998, oriundo de casos importados em São Paulo e se disseminou por todo país de forma rápida e desde então várias epidemias vêm ocorrendo simultaneamente em todo o país. Dois anos após a introdução, o mesmo sorotipo viral causou epidemias no estado do Rio de Janeiro com confirmação laboratorial de 91 casos em três diferentes municípios (Rocco et al., 2001) Dengue no estado de Rondônia O estado de Rondônia, localizado totalmente na Amazônia Legal e na região norte do Brasil, possui ,80 km 2. Faz fronteira com Bolívia em uma extensão de km de linha divisória em sua totalidade delimitada por rios. Os limites territoriais são: ao norte, nordeste e noroeste com o Estado do Amazonas; ao leste e sudeste com o Mato Grosso; ao sul e sudoeste com a República da Bolívia. Possui 32 municípios localizados na Amazônia Legal e 20 municípios situados em faixa de fronteira. Tem uma população estimada em habitantes (IBGE, 2007). Está em uma região favorável a propagação de arbovírus. Primeiro, por sua posição geográfica, ligando por rodovia o estado do Acre e atualmente o Peru através da Rodovia Interoceânica, uma rota importante para os portos do Pacífico, aos outros estados do Brasil, assim, havendo intensa circulação de caminhões das mais diversas regiões do país. Segundo, por fazer fronteira com a Bolívia possibilita a entrada de novos arbovírus. Terceiro, o Estado ainda está em plena expansão de suas fronteiras agrícolas, com a derrubada de floresta, colocando o homem como hospedeiro acidental e favorecendo o aparecimento de arboviroses silvestres. A figura 1 mostra a localização do estado de Rondônia em relação ao Brasil e em destaque a rodovia BR 364 e a fronteira com a Bolívia.

22 BR Fronteira Brasil/Bolívia BOLIVIA Fonte: Figura 1- Mapa mostrando a localização do estado de Rondônia em relação à região norte do Brasil. Em destaque vermelho o contorno da BR 364 e em azul a fronteira com a Bolívia Morfologia e Genoma do vírus dengue Os vírus dengue são esféricos, envelopados, com projeções na superfície e medem aproximadamente nm de diâmetro. O RNA viral é envolto por um nucleocapsídeo de simetria icosaédrica, composto por uma única proteína denominada proteína de capsídeo (C), circundada por uma bicamada lipídica associada às proteínas de membrana (M) e de envelope (E) (Russell et al., 1980, Schlesinger et al., 1990), conforme esquema ilustrado na figura 2. Figura 2- Representação esquemática do vírus do dengue. Em M: proteína da Membrana. Em E: proteínas do Envelope. Em C: proteína do Capsídio. Em ssrna: o material genético constituído por RNA de fita simples.

23 O genoma dos Flavivirus é constituído por uma única molécula de RNA de fita simples e polaridade positiva, com comportamento de RNA mensageiro. Com cerca de nucleotídeos (11Kb), é traduzido em uma poliproteína com peso molecular de 3.3x10 6 daltons (Rice, 1996; Monath, 1990), possui uma fase aberta de leitura, codificando proteínas estruturais e não estruturais. Os genes que codificam proteínas estruturais são: do nucleocapsídeo (C), proteínas da membrana (prm/m), envelope (E), estão localizados na região 5 do genoma viral. As proteínas estruturais têm um papel importante na biologia do vírus, uma vez que, são responsáveis por várias atividades biológicas, incluindo montagem e maturação do vírus, fusões celulares, imunogenicidade, induzindo anticorpos neutralizantes e anticorpos inibidores da hemaglutinação. Na extremidade 3, estão localizados os genes que codificam as proteínas não estruturais: NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b e NS5 que atuam como helicases, proteases e polimerases virais (Chambers et al., 1990; Lindenbach & Rice, 2003), conforme representado na figura 3. As proteínas não estruturais são responsáveis pela replicação do vírus e processamento da poliproteína, embora o mecanismo exato de ação da maioria delas ainda não esteja completamente esclarecido (Rice et al., 1985; Rice, 1996). Figura 3- Esquema representativo do genoma do dengue e proteínas codificadas (adaptado de Chambers et al., 1990)

24 1.4- Diagnósticos Laboratoriais O diagnóstico da infecção pelo vírus dengue pode ser realizado através de testes sorológicos, isolamento viral ou detecção do genoma viral (King et al.,1991, Guzman et.al, 1996) Diagnósticos Sorológicos Atualmente é usado o ensaio imunoenzimático - ELISA para detectar a presença de anticorpos anti-dengue no soro do paciente. O ELISA e suas variantes, como por exemplo, o MAC-ELISA, discrimina imunoglobulinas das classes M e G (IgM/IgG) distinguindo por indicações dos níveis séricos de uma ou outra a possibilidade de uma primo-infecção ou infecção secundária. Outros testes sorológicos menos utilizados por sua complexidade técnica são: inibição da hemaglutinação (IH), fixação do complemento (FC) e teste de neutralização (TN) (Chunguer et al., 1989) Isolamento Viral Quatro métodos são habitualmente usados para o isolamento viral: inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos; inoculação em cultura de células de mamíferos ou mosquitos e inoculação intratorácica em mosquitos; (King et al., 1991, Guzman & Kouri, 1996). A inoculação intracerebral em camundongos recém-nascidos foi inicialmente utilizada para o isolamento viral dos 4 sorotipos do DENV, no entanto, apresenta desvantagens tais como: elevado custo, demora para isolamento; e baixa sensibilidade. Esses problemas fazem com que a metodologia não seja recomendada para isolamento viral (Gubler et al., 1988). A inoculação em cultura de células de mamíferos, apresenta limitações e desvantagens similares com a metodologia descrita anteriormente. Esta metodologia embora empregada por muitos laboratórios, atualmente não é recomendada para isolamento de rotina do DENV, principalmente por ser uma metodologia que requer tempo e custo elevado (Guzman & Kouri, 1996). O cultivo em células de mosquito é uma das metodologias mais empregadas no isolamento viral (Gubler et al.,1988). A linhagem mais utilizada é a C6/36, clone do Aedes albopictus (Gubler et al.,1984). As células C6/36 proporcionam uma metodologia rápida, sensível e econômica para o

25 isolamento do vírus (Gubler et al., 1988). A confirmação do isolamento independente de alteração morfológica, efeito citopático, realizado após sete dias de incubação, utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais, sendo estes para o sorotipo-específico em teste de IF (Figueiredo et al., 1992). A metodologia de inoculação intratorácica em mosquitos é a mais sensível, no entanto, é o método menos utilizado para isolamento do DENV. As espécies de vetores mais utilizadas para o isolamento viral: Toxorhynchities amboinensis e Toxorhynchities splendens, onde ambos os sexos são suscetíveis. O DENV replica-se geralmente em altos títulos (10 6 a 10 7 MID 50 ), em cerca de quatro a cinco dias, dependendo da temperatura de incubação. A detecção viral é realizada através de imunofluorescência indireta (IFI) nos tecidos do mosquito, normalmente do cérebro ou glândulas salivares. As desvantagens são o intenso trabalho e a necessidade de insetário para a produção de um grande número de mosquitos (Kuberski et.al.,1977, Gluber et al., 197, Gubler et al., 1988) Diagnósticos Moleculares Nas décadas de 80 e 90, com o surgimento da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e da reação em cadeia da polimerase precedida da Transcrição Reversa (RT-PCR) a identificação de vírus tornou-se mais rápida (Chomczynski & Sacchi, 1987, Mullis et al., 1987). Diversos primers foram desenvolvidos e metodologias complementares, tais como a nested-rt- PCR foram incluídas na detecção do genoma viral (Henchal et al., 1991, Morita et al., 1991; Lanciotti et al., 1992, Tanaka et al., 1993, Deubel et al., 1997). A metodologia de RT-PCR foi descrita por Saiki e desenvolvida por Kari em 1986, sendo considerada uma técnica que possibilita da amplificação in vitro de uma determinada região do genoma viral. É considerada uma metodologia rápida e sensível, se corretamente padronizada, pode ser usada para detecção do genoma em amostras clínicas humanas, biópsias ou tecidos de autópsia (Deubel et al., 1990). Atualmente, novas metodologias moleculares vêm sendo desenvolvidas para o diagnóstico do DENV, tais como: hibridação de ácidos nucléicos e PCR em tempo real (Real time PCR).

26 No teste de hibridação dos ácidos nucléicos, é usado RNA extraído do sobrenadante de células infectadas com vírus ou pools de A. albopictus utilizando sondas biotiniladas ou com 32 P (Igarashi, 1978). Esta metodologia apresenta alta sensibilidade, sendo utilizado em estudos epidemiológicos, diagnóstico viral em amostras clínicas e também em tecidos fixados de autopsias (Henchal et al., 1987, Khan et al., 1987). O diagnóstico molecular baseado na amplificação de sequências de ácidos nucléicos através das técnicas de RT-PCR e Real-Time-PCR, estão substituindo gradualmente os métodos de isolamento viral de soro em fases agudas da infecção, podendo em alguns casos, determinar resultados mais rápidos e sensíveis (Lanciotti et al., 2000, Lanciotti., 2003, Shu & Huang, 2004). A metodologia de Real-Time-PCR, por ser um processo semiautomatizado, é considerada de alta confiabilidade e reprodutíbilidade (Bustin, 2002). Os avanços no desenvolvimento de fluoróforos e nucleotídeos quimicamente marcados permitiram o desenvolvimento da técnica de fluorocromos para Real-Time-PCR. Vários protocolos de aprimoramento e aplicação desta técnica, visando o diagnóstico do DENV, foram publicados demonstrando a sua aplicabilidade (Callahan et al., 2001, Houng et al., 2001, Drosten et al., 2002), no entanto, esta técnica requer aparelho sofisticado e pessoal qualificado Sequenciamento Viral Desde a década de 80, o genoma completo de vários Flavivírus foram sequenciados, começando pelo vírus da febre amarela (YFV), seguido pelos 4 tipos de DENV (Rice et al., 1985, Mason et al., 1987, Hahn et al., 1988, Osatomi et al., 1990). Através do sequenciamento do genoma pode se fazer o alinhamento dos nucleotídeos usando uma extensa variedade de programas com diversos algoritmos que fazem inferências na análise de similaridade das sequências nucleotídicas permitindo construir árvores filogenéticas com finalidade de analisar e comparar as relações evolutivas e até mesmo a origem dos sorotipos sequenciados. Atualmente o sequenciamento do genoma do DENV é utilizado não apenas para indicar a origem do vírus, mas também mutações que provavelmente podem causar diferença em sua patogenia (Aquino et al., 2005).

27 Diante da presença de diferentes sorotipos do vírus dengue no quadro epidemiológico do estado de Rondônia, e do fato de serem constantes as epidemias. Justifica-se esse estudo para possibilitar o conhecimento filogenético dos genótipos dos vírus dengue circulante, bem como suas origens, pois a presença de mais de um genótipo podem causar diferentes perfis clínico e uma maior incidência de Febre Hemorrágica do Dengue.

28 2- OBJETIVOS

29 2.1- Objetivo Geral Identificar os genótipos dos vírus dengue sorotipos 2 e 3, entre os períodos 2002 a 2006, através da análise filogenética e estabelecer a origem dos vírus circulantes no estado de Rondônia Objetivos Específicos Repassar em células C6/36 todas as amostras virais utilizadas no estudo, correspondente ao período de 2002 a 2006; Realizar a RT-PCR para obtenção dos fragmentos (amplicons) a serem utilizados na clonagem, ao mesmo tempo reconfirmar o sorotipo viral. Clonar em vetor pdrive (QIAgen) os amplicons obtidos para sequenciamento gênico; Obter árvores filogenéticas comparando os vírus isolados em Rondônia com os isolados no Brasil e em outros locais do mundo.

30 3- MATERIAL E MÉTODOS

31 3.1- Cadastro de dados do estudo Este estudo foi realizado durante o período de 2007 a 2009, com amostras sobrenadantes de cultura celular C6/36 infectadas com vírus dengue, caracterizadas pela unidade laboratorial de virologia, de indivíduos apresentando sintomas de 1 a 4 dias (período agudo da viremia) sugestivos para dengue, Anexo I, e que estavam estocadas a -80 ºC. Segundo parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do CEPEM/IPEPATRO Amostras biológicas Foram analisadas 190 amostras, coletadas entre os períodos de 2002 a 2006, nas localidades: Porto Velho no Ambulatório do CEPEM; na Policlínica Municipal Dr. Hamilton Gondin, na Policlínica Dr. José Adelino. Em Ouro Preto D Oeste no Hospital Municipal e no município de Colorado D Oeste na Unidade Mista Drª Laura Maria de Carvalho Braga, nos Prontos Socorros Municipais de Ariquemes, Cacoal, Jarú e Vilhena. Como demonstrado na tabela 1. Tabela 1: Distribuição das amostras analisadas nos municípios de Rondônia. Municípios Número de amostras Ariquemes 6 Cacoal 19 Colorado D Oeste 22 Jarú 13 Ouro Preto D Oeste 24 Porto Velho 94 Vilhena 12 Total 190

32 3.3- Isolamento viral Para o isolamento viral foram cultivadas células de mosquito Aedes albopictus, clone C6/36 em placas estéreis de 24 orifícios (Corning, USA) (Figueiredo, 1990). As células foram mantidas com meio Leibowitz-15 (L-15) (Gibco BRL, USA), suplementadas com 10% de soro fetal bovino (Gibco BRL, USA) 1000U/mL de penicilina e 1mg/mL de estreptomicina. As células foram mantidas em estufa BOD a 28ºC e visualizadas em microscópio invertido (Nikon, USA) diariamente até a formação de monocamadas celular confluente conforme figura 4. Figura 4: Fotografia de uma monocamada de células C6/36, obtida em microscópio óptico com aumento 400x. Para infecção da monocamada o fluído celular infectado foi diluído em 1:10 com volume final de 500 µl em meio L-15 completo. Foi inoculado o diluído por 1 hora em estufa BOD a 28ºC. Após esse período de incubação foi acrescentado 1mL do meio L-15 completo em cada poço das placas e armazenado a 28ºC durante 7 dias. As monocamadas celulares inoculadas eram inspecionadas diariamente em microscópio invertido (Nikon, USA) para detecção de efeito citopático, uma alteração morfológica que o vírus causa na célula formando vacuolização, arredondamento, aumento do núcleo e inclusões. No sétimo dia foi recolhido todo o material inoculado e armazenado no -80ºC até o momento do uso. Para obtenção de um maior título viral foram realizadas três passagens sucessivas do fluído em cultura celular. Como

33 controles foram utilizados: controles positivos cepas de DENV-2 (CEA 2462) e DENV-3 (PVH) e controle negativo, sobrenadante de cultura de C6/36 não infectada Extração do RNA Viral Para extração do RNA viral contido no sobrenadante de cultura celular infectada, foi utilizado o Kit QIAamp Viral RNA (QIAgen,, Alemanha), conforme instruções do fabricante Transcrição Reversa e Reação da Polimerase em Cadeia (RT-PCR) Confecção do cdna Para a confecção da fita de DNA complementar (cdna) através da transcrição reversa, incubou-se 5µL do RNA extraído com 1µL (3µg) de primer randômico pd(n) 6 (GIBCO BRL, USA), 1µL de dntps 10mM (Gibco BRL, USA). Aqueceu-se as amostras por 1 minuto a 95 C, em seguida incubou-se no gelo por 5 minutos e logo após acrescentou-se 4µL do tampão Buffer 5x (Gibco BRL, USA), 1µL DTT 0.1M, 200U/µL SuperScript (Gibco BRL, USA), 10U/µL de inibidor RNase (Gibco BRL, USA) e completou-se com água ultrapura volume para 20µL, incubou-se as amostras por 25 C por 10 minutos, 2 horas a 37 C e ao final por 5 minutos a 85 C para desnaturação da enzima transcriptase reversa PCR Primers D1 e D2 (Lanciotti et al., 1992) Para a amplificação do fragmento do gene das proteínas C-prM e identificar o vírus dengue, foram utilizados o par de primers D1 e D2, que amplifica um fragmento de 511pb, correspondente a sequência gênica que codifica parte das proteínas estruturais do capsídeo e pré-membrana (C-prM). As sequências dos primers estão indicadas na tabela 2, assim como uma representação do local de anelamento dos primers é mostrado na figura 5 (Lanciotti et al., 1992). Para a PCR misturou-se 5µL de cdna com 50nM de

34 iniciadores específicos, sense e anti-sense, 0,2 mm de desoxinucleotídeos, 1,5mM de MgCl 2, 2,5U de Taq DNA polimerase termoestável (Invitrogen - USA), solução tampão 10X da enzima (Invitrogen - USA), e água para completar um volume final de 50µL. As amostras foram submetidas a aquecimento inicial 94ºC por 5 min seguido de 30 ciclos térmicos nas temperaturas de 94ºC por 1min para desnaturação; 53ºC por 1min para anelamento, seguido de, 72ºC por 2min para extensão e uma extensão final de 72ºC por 10min em termociclador (Eppendorf, Alemanha). Os produtos da PCR, foram estocados a 4ºC até serem utilizados. Tabela 2: Descrição das sequências dos primers utilizados para amplificação da intersecção dos genes correspondente as proteínas do capsídeo e prémembrana do vírus do dengue. Primers D1 D2 Sequências 5 TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 3 5 TTG CAC CAA CAG TCA ATG TCT TCA GGT TC 3 Região do genoma C-prM C-prM Figura 5: Esquema representado o local de anelamento dos primers utilizados para a PCR no genoma do dengue.

35 Primers DEN2-S e DEN2-C (Figueiredo et al., 1997) Para identificação do vírus do dengue sorotipo 2, foi utilizado o par de primers DEN2-S e DEN2-C específicos para DENV-2, amplificando um fragmento de 210pb (Figueiredo et al., 1997). Para a PCR as amostras foram submetidas a aquecimento inicial de 94ºC por 5min seguido de 30 ciclos térmicos nas temperaturas de 94ºC por 1min para desnaturação; 54ºC por 1min para anelamento seguido de 72ºC por 2min para extenção e uma extenção final de 72ºC por 10min. Os produtos da PCR, foram estocados a 4ºC até serem utilizados. As sequências dos primers DEN2-S e DEN2-C estão descritas na tabela 3 assim como o gene amplificado por ele. Na figura 6 está representado o local de anelamento dos primers em relação ao genoma do vírus dengue. Tabela 3: Descrição das sequências dos primers utilizados para amplificação do gene E do vírus do dengue. Primers Sequências Região do genoma DEN2-S 5 GTT CCT CTG CAA ACA CTC CA 3 E DEN2-C 5 GTG TTA TTT TGA TTT CCT TG 3 E Primer DEN2-S E Primer DEN2-C Figura 6:- Esquema descritivo representado o local de anelamento dos primers utilizados na PCR com DEN2-C e DEN2-S específicos para dengue sorotipo 2.

36 Eletroforese dos Produtos da PCR Gel de Agarose 1,5%. Para confirmação da amplificação correspondente aos genes de interesse, foi realizada eletroforese em gel de agarose a 1,5% (GIBCO BRL, USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de Tris base, 0,09M de ácido bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo de etídio 0.1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL de cada amostra foi aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a 100V; 400W; por 30 minutos. Após, o gel foi visualizado em transluminador ultravioleta (UV). Os amplicons foram comparados a um marcador peso molecular de 100pb e controles positivos de DENV (Invitrogen - USA). Através da análise de relação com a migração dos amplicons e o marcador de peso molecular obteve-se os tamanhos de 511 pb e 210pb, respectivamente Hemi-nested-PCR (Lanciotti et al., 1992) Para caracterização do sorotipo viral do dengue foi realizado uma Heminested-PCR, utilizando os amplicons obtidos na PCR, juntamente com o primer D1 e os primers TS1, TS2, TS3 e TS4, que geram fragmentos de peso molecular conforme mostrados na tabela 4. A diferença de peso molecular determina qual é o sorotipo viral do dengue. Tabela 4- Descrições das sequências dos primers anti-sense utilizados para obtenção do sorotipo do vírus da dengue e seu peso molecular correspondente. Primers Sequências Tamanho do Amplicon Sorotip o viral TS1 5 CGT CTC AGT GAT CCG GGG G pb DENV 1 TS2 5 CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG pb DENV 2 TS3 5 TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C pb DENV 3 TS4 5 CTC TGT TGT CTT AAA CAA GAG A pb DENV 4

37 Para a Hemi-nested-PCR as amostras foram submetidas a um aquecimento inicial de 94ºC por 5 minutos seguido de 25 ciclos térmicos nas temperaturas de 94ºC por 1min; 53ºC por 1min e 72ºC por 2min seguido de uma extensão final de 72ºC por 10min em termociclador (Eppendorf, Alemanha) Eletroforese do Produto da Hemi-nested-PCR Gel de Agarose 2,0%. Para a confirmação da amplificação correspondente aos fragmentos de tamanhos diferentes, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose a 2,0% (GIBCO BRL, USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de Tris base, 0,09M de ácido bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo de etídio 0.1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL de cada amostra foi aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a 100V; 400W; por 30 minutos. Após, os fragmentos foram visualizados em transluminador ultravioleta (UV). Os amplicons foram então comparados a um marcador de 100pb e controle positivo para DENV-3 (Invitrogen - USA). 3.6 Clonagem Purificação dos amplicons para clonagen. Os amplicons correspondentes a 511pb foram seccionados do gel de agarose. Posteriormente colocados em microtubo de 1,5 ml, a purificação foi realizada com QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen, Alemanha) de acordo com instruções do fabricante Confirmação da purificação Para a confirmação da purificação foi realizada eletroforese em gel de agarose a 1,0% (GIBCO BRL, USA), com solução tampão TAE 1X (0.09M de Tris base, 0,09M de ácido bórico e 0,002M de EDTA) e acrescido de brometo

38 de etídio 0.1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA). Um volume de 5µL de cada amostra foi aplicada no gel de agarose e submetida à eletroforese, a 100V; 400W; por 30 minutos. Após, o gel foi visualizado em transluminador ultravioleta (UV). O produto purificado foi comparado com um marcador de 250pb (Invitrogen - USA). Em seguida ligado a um vetor de clonagem Ligação em vetor de clonagem Utilizou-se o kit de clonagem (QIAgen, Alemanha), para a inserção de fragmentos do gene da proteína C-prM. O vetor está representado esquematicamente na figura 7. Para ligação do fragmento ao vetor de clonagem foram utilizados: 3,0µL do produto de purificação, com cerca de 220ng, 0,5 µl do vetor, 2,5µL de tampão 5X com ligase, incubou-se a 4 C por 16 horas. O produto da ligação foi estocado a 20 C até o momento do uso. Fonte: Figura 7- Representação esquemática do vetor pdrive (QIAgen, Alemanha) Preparo de bactérias competentes Para obtenção de células competentes foram utilizadas bactérias da espécie Escherichia coli, linhagem TOP 10 F estocadas a -80 o C em meio LB/ DMSO 10%, foram semeadas em placas contendo meio sólido LB-agar 1,5%, 12,5µg/mL de tetraciclina e posteriormente incubadas a 37 o C por 18 horas.

39 Após o crescimento das colônias, uma de cada foi inoculada em 5mL de meio LB líquido com tetraciclina para crescimento a 37 o C durante 20 horas em agitação constante (250 rpm/minutos) e 0,5 ml da cultura foi inoculada em 50 ml de meio LB acrescido de 5µL de tetraciclina. As culturas foram coletadas em fase exponencial de crescimento determinada pela absorbância de 600 nm em 0,45 e 0,55 nm de densidade óptica (D.O.). Logo após foram adicionados às bactérias 1mL de MgCl 2 a 1M gelado e incubou-se a cultura por 15 minutos a 4 o C. Em seguida, as bactérias foram centrifugadas a 4500rpm por 15 minutos a 4 o C. O sedimento foi ressuspendido em 20mL de tampão contendo Acetato de potássio (AcK) 30mM ph:7,5, MnCl 2 50mM, CaCl 2 10mM e glicerol autoclavado a 15%, e novamente incubada por 15 minutos a 4 o C. E em seguida centrifugadas a 4500rpm por 15 minutos a 4 o C, o sedimento final foi ressuspendido em 2mL do tampão contendo: MOPS 10mM ph:7,0, CaCl 2 75mM, KCl 10mM e glicerol autoclavado a 15%. Para o armazenamento distribuiu alíquotas de 200µL e em seguida foram congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido e estocadas a -80 o C Transformação Bacteriana As células competentes TOP 10 F foram transformadas com DNA plasmideal utilizando a metodologia descrita por Sambrock et al. (1989) com algumas modificações. Brevemente, 2µL da reação de ligação ou 0,1 ng de DNA de plasmídeo pdrive (QIAgen, Alemanha), foram adicionadas a 50µL da suspensão de células competentes. A mistura foi colocada em gelo por 30 minutos. Após este período, as células foram mantidas a 42 o C por 1 minuto e novamente retornadas ao gelo por 10 minutos, logo após foram acrescentados 110µL de meio S.O.C (GIBCO BRL, USA) e incubada por 30 minutos a 37 o C para crescimento bacteriano e posteriormente semeadas em placas de LB-agar 1,5% suplementadas com ampicilina (100µg /ml), tetraciclina (50µg /ml) e adicionalmente IPTG (100µg /ml), X-gal (200µg /ml). As placas foram incubadas por 12 horas a 37 C.

40 3.6.5.Extração do DNA Plasmidial As colônias resultantes da transformação foram selecionadas com base em sua coloração, foram escolhidas as colônias brancas. A representação de uma placa com colônias com inserto (brancas) e sem inserto (azuis) são representadas na figura 8. As colônias brancas foram escolhidas ao acaso nas placas LB-agar/Tetra/Amp/IPTG/X-gal e processadas para isolamento de DNA plasmideal. As colônias selecionadas das placas foram cultivadas em 2mL de meio LB-líquido/tetraciclina/ampicilina a 37 o C por 18 horas, em agitação constante (280 rpm/minuto). Os plasmídeos foram extraídos usando o procedimento de mini-preparação descrito em Sambrock et al. (1989.) Colônias Brancas A B Figura 8- Em A: Modelo esquemático do vetor de clonagem. Em B: Após as bactérias sofrerem transformação Digestão do vetor Para verificar se os vetores extraídos pela metodologia de mini preparação possuíam o inserto, foi utilizada a enzima de restrição Eco RI (Promega, USA). Para isso, foram utilizados 3µL dos plasmídeos extraídos,

41 1µL de tampão 10X Buffer, 0,3µL de Eco RI e água q.s.p 10µL a mistura foi incubada a 37 C por 2 horas. Foi utilizada a eletroforese em gel de agarose a 1,5%, acrescido de brometo de etídio a 0,1% (Sigma Chemical Company, St.Louis, USA), para a confirmação visual da digestão e comparação ao marcador de 250pb (Invitrogen, USA) Sequenciamento Para determinação das sequências nucleotídicas da região C-prM as amostras de clones foram selecionados para o sequenciamento. Cada clone foi sequenciado utilizando o Big Dye Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystem, USA). A PCR seguiu os seguintes ciclos: um ciclo para desnaturação das fitas de 96ºC por 2 min; 25 ciclos de 96ºC por 45 segundos, 50ºC por 30 segundos e 60ºC por 90 segundos. Após os ciclos as amostras foram deixadas em 60ºC por 4 min e no gelo por 2 min conforme o manual do fabricante. (Applied Biosystem), o sequenciamento das reações foram realizados no sequenciador ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystem, USA), realizado no Instituto de Ciências Biológicas -ICB2 da USP, Dr. Gerhard Wunderlich Análise das Sequências Para obter a sequência do gene C-prM de DENV-2 e DENV-3 foi utilizado o programa ENTREZ do National Center for Biotecnology Informática NCBI. ( BLAST O BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) encontra regiões de similaridade entre as sequências. O programa compara sequências nucleotídeos ou proteínas com as contidas no banco de dados e calcula uma estatística significante. Foi usado para uma busca de similaridade após o sequenciamento, entre os clones e as sequências contidas no banco de dados.

42 Árvore Filogenética O método de bootstrap foi utilizado para testar a significância estatística para cada ramo da árvore gerada. Os valores de bootstrap foram obtidos por re-amostragem dos dados com 100 replicatas utilizando-se os programas Garli (Genetic Algorithm for Rapid Likelihood Inference) e Paup (Phylogenetic Analysis Using Parsimony), realizado no Laboratório de Evolução Molecular e Bioinformática- LEMB da USP, Dr. Paolo Zanotto. Os dados foram compilados nos softwares Garli, que usa um algoritmo genético modificado para inferir rapidamente filogenias baseadas em dados dos nucleotídeos. Ele usa o General Time Reversible (GTR), que é um modelo de substituição nucleotídica e simultaneamente verifica a mistura de topologia, ramos, taxa de heterogeneidade e modelo parâmetros que maximiza a probabilidade dos dados da filogenia. O Paup é usado para inferência evolucionária de árvores filogenéticas.