CÉLULAS-TRONCO E SURGIMENTO DE TUMORES: um estudo comparativo entre o modelo determinístico e o modelo aleatório

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1 CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS Mestrado em Modelagem Matemática e Computacional Gleice Mônica Ferreira da Silva CÉLULAS-TRONCO E SURGIMENTO DE TUMORES: um estudo comparativo entre o modelo determinístico e o modelo aleatório Belo Horizonte 2012

2 Gleice Mônica Ferreira da Silva CÉLULAS-TRONCO E SURGIMENTO DE TUMORES: um estudo comparativo entre o modelo determinístico e o modelo aleatório Dissertação apresentada ao Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Modelagem Matemática e Computacional. Orientadora: Prof a. Dr a. Maria Elizabeth Gouvêa Co-Orientador: Prof. Dr. Allbens Atman Picardi Faria Belo Horizonte MG Brasil Julho / 2012

3 Gleice Mônica Ferreira da Silva CÉLULAS-TRONCO E SURGIMENTO DE TUMORES: um estudo comparativo entre o modelo determinístico e o modelo aleatório Dissertação apresentada ao Centro Federal de Educação Tecnológica de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Modelagem Matemática e Computacional. Prof. Dra. Maria Elizabeth Gouvêa (Orientadora) CEFET-MG Prof. Dr. Allbens Atman Picardi Faria (Co-Orientador) CEFET-MG Prof. Dr. Arthur Rodrigo Bosco de Magalhães CEFET-MG Prof. Dr. Carlos Bernardes Rosa Júnior IFMG-MG Belo Horizonte, Julho de 2012

4 AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus por ter me dado forças e saúde para buscar mais esta grande e importante etapa da minha vida. À minha orientadora Prof. Dra. Maria Elizabeth Gouvêa, pelas belas aulas lecionadas no curso de Modelagem Matemática, pelas orientações, apoio, compreensão, conselhos, pelo acolhimento e por ser um grande exemplo para mim. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Allbens Atman Picardi Faria por toda dedicação e disponibilidade. Ao Prof. Dr. Sérgio Ricardo de Sousa, pela atenção sempre prestada. À grande e verdadeira amiga Bruna, a quem conheci neste curso e que pretendo ter como amiga a vida toda. Sem você este trabalho não seria possível. A meu marido Pablo Julião, pelo apoio, compreensão e pelo companheirismo. À minha dádiva Henrique Julião, concebida a mim durante este curso e que é a razão do meu viver. Aos meus pais, minha mãe Eunice Pimenta da Silva Ferreira e meu pai Guilherme Roberto Ferreira, por toda ajuda e apoio sempre oferecidos. A meu irmão Guibson e irmãs, Glauce, Gicelle e Gizelle por existirem e completarem minha vida. E por último mas não menos importante, à minha amada Vó Dinda a quem foi fazer companhia a Deus durante este curso. Na sua simplicidade me perguntava sempre quando eu iria terminar este mesclado. Não deixa de ser uma mescla de conhecimentos, de autores e de ideias. Como eu queria tê-la aqui neste momento, mas sei que onde estiver, estas olhando por mim e como sempre me abençoando. Te amo demais.

5 O que mais surpreende é o homem, pois perde a saúde para juntar dinheiro, depois perde o dinheiro para recuperar a saúde. Vive pensando ansiosamente no futuro, de tal forma que acaba por nao viver nem o presente, nem o futuro. Vive como se nunca fosse morrer e morre como se nunca tivesse vivido." Dalai Lama

6 6 RESUMO Estudos mostram que só alguns tipos especiais de células são capazes de originar um tumor: são as células-tronco cancerígenas que possuem alto poder de transmitir as alterações ocorridas no seu material genético para toda a sua prole. A relação entre células-tronco cancerígenas e o desenvolvimento de alguns tipos de tumores tem sido verificada experimentalmente e, por isso, a pesquisa e caracterização de células-tronco tumorais são cruciais no entendimento do câncer enquanto doença. Este trabalho apresenta um estudo analítico e computacional de dois modelos, um determinístico e outro probabilístico, que retratam o crescimento de populações de um tecido virtual constituído por células tronco, células semidiferenciadas e células especializadas. Consideramos que, ao longo de sua evolução temporal, esses tipos de células podem acumular mutações que acarretam na aquisição de vantagens seletivas. O desenvolvimento da capacidade de desenvolver vasos para nutrir o interior do tumor é adquirido, também, através de uma mutação. Apresentamos um modelo para essa capacidade. Como em outros trabalhos existentes na literatura, investigamos o efeito da aquisição dessas mutações em diferentes sequências. Damos especial atenção a duas situações que levam a um crescimento acentuado da população de células anormais: a mudança no padrão de autorrenovação das células tronco e a capacidade que algumas células especializadas adquirem de evadir à telomerase. No modelo determinístico, todos os fatores que influenciam a proliferação das células são tratados por parâmetros que assumem valores constantes. O modelo probabilístico trata um desses fatores a taxa de mutação de modo aleatório. Os resultados obtidos pelos dois modelos são comparados. Palavras-chave: Modelo de crescimento do tumor. Câncer. Células-tronco. Modelo determinístico para crescimento de tumor. Modelo probabilístico para crescimento de tumor.

7 7 ABSTRACT Studies whole show that only few special types of cells are able to generate a tumor: cancer stem cells that have high power to convey the changes in its genetic material to all his offspring. The relationship between cancer stem cells and the development of some types of tumors has been experimentally verified, and therefore, research and characterization of tumor stem cells are crucial to the understanding of cancer. This work presents an analytical and computational study of two models, one deterministic and one probabilistic, which depict the growth of populations of a virtual tissue that consists of stem cells, half-distinguished, cells and specialized cells. We believe that throughout its evolution, these cell types can accumulate mutations that lead to the acquisition of selective advantage. The development of the ability to nourish the developing blood vessels within the tumor is acquired also by a mutation. We present a model for this capability. As in other studies in the literature, we investigated the effect of the acquisition of these mutations in different sequences. We pay special attention to two situations that lead to a marked population growth of abnormal cells, the change in pattern of selfrenewal of stem cells and the ability to acquire some specialized cells to evade the telomerase. In the deterministic model, all factors that influence cell proliferation parameters are treated by assuming constant values. The probabilistic model is one of these factors - the rate of mutation - a random manner. The results of both models are compared. Keywords: model of tumor growth. Cancer. Células stem. Deterministic model for growth of turmor. Probabilistic model for tumor growth.

8 8 LISTA DE FIGURAS Figura 2.1 Diagrama da dinâmica populacional das CTs, CSDs e 24 CEs. Figura 2.2 Evolução das CT num tecido saudável e num tecido com 36 mutação Figura 2.3 População de CSD: tecido saudável comparado com o 37 tecido com mutações Figura 2.4 População de CE: tecido saudável comparado com o 37 tecido com mutações Figura 4.1 Subpopulações de CTs de acordo com a quantidade de 46 mutações Figura 4.2 Subpopulações de CSD sem mutação acumulada 47 Figura 4.2a Subpopulações de CSD de acordo com a quantidade de 47 mutações Figura 4.3 Populações de CE com 0 e 4 mutações 48 Figura 4.4 População total comparada à população cancerígena 49 para a sequência IADR com padrão de autorrenovação normal das CT, com. Figura 4.5 Fatores angiogênicos: e 50 Figura 4.6 Evolução das populações e para a sequência de 51 mutações IADR com atuação de Figura 4.7 Evoluções das subpopulações de CTs com 1 a 4 52 mutações para e. Figura 4.8 Evolução da subpopulação de CSD com, para 53 e. Figura 4.8a Evolução das subpopulações de CSD com 1 a 4 53 mutações para e. Figura 4.9 Subpopulações de CE de acordo com o número de mutações 54

9 9 Figura 4.10 População total x população cancerígena para a 55 sequência IADR com padrão de autorrenovação normal das CT, para e. Figura 4.11 Evolução temporal da população de células cancerígenas 56 após aquisição da sequência IADR de mutações com e sem o fator angiogênico. Figura 4.12 Fator angiogênico: 57 Figura 4.13 Subpopulação de CE com 4 mutações ultrapassando 57 limite de Hayflick Figura 4.14 Evolução da população de CT com 4 mutações para 60 sequência IADR padrão normal e padrão 1 Figura 4.15 Evolução da população maligna padrão normal x maligna 61 padrão 1 Figura 4.16 Fator angiogênico caso IADR padrão 1 62 Figura 4.17 Evolução das populações de e ( caso 63 IADR padrão 1) Figura 4.18 População nos compartimentos CT, CSD e CE para o 64 padrão 1 de autorrenovação das CT Figura 5.1 População total CT para padrão normal de 70 autorrenovação Figura 5.1a População total CT para no padrão normal de 71 autorrenovação Figura 5.2 Subpopulações de CT para e padrão normal de 72 autorrenovação Figura 5.3 Subpopulações de CE ( e ) para padrão de 73 autorrenovação normal Figura 5.4 Subpopulações de CE ( ) para padrão de 73 autorrenovação normal (aleatório) Figura 5.4a Subpopulações de CE (m=1 a 3) para padrão de 74 autorrenovação normal (determinístico) Figura 5.5 População CSD com mutações acumuladas para 75. Figura 5.6 População CE com mutações acumuladas para. 75

10 10 LISTA DE TABELAS Tabela 2.1 Parâmetros das células-tronco 22 Tabela 2.2 Parâmetros das células semidiferenciadas 26 Tabela 2.3 Parâmetros das células especializadas 30 Tabela 2.4 Valores dos parâmetros referentes aos três 35 compartimentos celulares CT, CSD e CE. Tabela 2.5 Cálculo analítico das populações de CT 35 Tabela 3.1 Taxas de mortalidade de cada tipo celular antes e depois 39 da aquisição da mutação do tipo D. Tabela 3.2 Taxas de mutação de cada tipo celular antes e depois da 40 aquisição da mutação do tipo I. Tabela 3.3 Taxas de mitose de cada tipo celular antes e depois da 40 aquisição da mutação do tipo R. Tabela 3.4 Tipos de sequências 41 Tabela 4.1 Parâmetros das ações sofridas pelas células após 44 adquirirem a sequência de mutações Tabela 4.2 Parâmetros das ações sofridas pelas células após 58 adquirirem a sequência de mutações com alteração do padrão de autorrenovação das CT. Padrão 1: Tabela 4.3 Parâmetros das ações sofridas pelas células após adquirirem a sequência de mutações com alteração do padrão de autorrenovação das CT. Padrão 1: 63

11 11 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS CE CSD CT Célula Especializada Célula Semidiferenciada Célula-tronco Fator angiogênico População de células que adquiriram a mutação A População de células que adquiriram mutação Taxa de autorrenovação simétrica da célula-tronco Taxa de autorrenovação assimétrica da célula-tronco Taxa de diferenciação da célula-tronco Taxa de mortalidade da célula-tronco Taxa de mutação da célula-tronco Taxa de autorrenovação da célula semidiferenciada Taxa de diferenciação da célula semidiferenciada Taxa de mortalidade da célula semidiferenciada Taxa de mutação da célula semidiferenciada Quantidade máxima de divisões da célula semidiferenciada Taxa de autorrenovação da célula especializada Taxa de mortalidade da célula especializada Taxa de mutação da célula especializada Quantidade máxima de divisões da célula especializada

12 12 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Objetivos do trabalho MODELO DETERMINÍSTICO DE CRESCIMENTO CELULAR 20 BASEADO EM EQUAÇÕES DIFERENCIAIS Fator angiogênico Células-tronco Células semidiferenciadas Células especializadas Análise das populações de equilíbrio SEQUÊNCIAS DE MUTAÇÕES INVESTIGAÇÃO ANALÍTICA E SIMULAÇÃO DOS EFEITOS DAS 43 SEQUÊNCIAS DE MUTAÇÕES Análise da sequência de mutações IADR IADR com padrão de autorrenovação normal Sequência IADR considerando a extrapolação ao limite de 56 Hayflick Sequência IADR com alteração no padrão de autorrenovação 58 normal das CT: padrão Sequência IADR com alteração no padrão de autorrenovação 63 normal das CT: padrão MODELO COMPUTACIONAL COM TRATAMENTO ALEATÓRIO 65 DA TAXA DE MUTAÇÃO Introdução Modelo com mutação aleatória Método linear congruente para geração de números aleatórios Resultados CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 78

13 13 1 INTRODUÇÃO As células são as unidades fundamentais na composição dos seres humanos. Constituem a menor unidade capaz de manifestar as propriedades de um ser vivo. São capazes de sintetizar seus componentes, de crescer e de se multiplicar [1]. O processo de reprodução celular é cercado de rígidos procedimentos de verificação da integridade genética. Quando um desses procedimentos é removido, o resultado é algo parecido com um tumor. O câncer pode ser considerado uma só doença e ao mesmo tempo um de conjunto de várias doenças [2]. Todas estas patologias têm uma característica comum que é proliferação descontrolada de células, que geram tecidos de aspecto desorganizado. São esses tecidos desorganizados que constituem os tumores. Estudos [2] mostram que uma só célula pode ser responsável pelo surgimento de um tumor porque as alterações ocorridas no seu material genético serão transmitidas em toda a sua prole. Algumas pesquisas [2, 3] mostram que existe uma relação entre célulastronco cancerígenas e o desenvolvimento de alguns tipos de tumores. Por essa razão, a pesquisa e a caracterização de células-tronco tumorais são cruciais no entendimento do câncer enquanto doença. Cada vez mais, tem-se confirmado a noção de que o câncer é um tecido, ou uma unidade tecidual, que se desenvolve a partir de suas próprias células-tronco, que, por alguma razão, assumem um crescimento que não corresponde ao padrão do organismo [4]. No modelo utilizado nesta pesquisa, consideramos, assim como em Ashkenazi et al [5] e Tomlison e Bodmer [6], três compartimentos celulares: Células-Tronco (CT), Células Semidiferenciadas (CSD) e Células Especializadas(CE). Há dois tipos de células-tronco: as embrionárias que são caracterizadas por possuírem alta plasticidade, ou seja, alta capacidade de gerar outros tipos de células, e as células-tronco adultas com menor capacidade de diferenciação.

14 14 As células-tronco servem como um sistema de reparo biológico, com o potencial para desenvolverem-se em muitos tipos de células especializadas e, também, gerar outras células-tronco. Acredita-se que elas possuam potencial ilimitado de se dividir e que podem se diferenciar em uma ampla gama de tipos celulares. Dizemos, então, que uma célula-tronco pode sofrer um número infinito de mitoses e só a célula-tronco tem esse poder [7]. Em termos de divisão ou reprodução, as CT podem apresentar: - autorrenovação simétrica: a célula mãe dá origem a duas novas célulastronco; - autorrenovação assimétrica: a célula mãe dá origem a uma célula-tronco e uma célula semidiferenciada; - diferenciação simétrica: a célula mãe dá origem a duas células semidiferenciadas. É importante salientar que a nova célula-tronco gerada após uma mitose - simétrica ou assimétrica - é, em todos os sentidos, idêntica à sua mãe, isto é, tem o mesmo poder de divisão e de geração ou manutenção dos vários tipos de células de um tecido: essa é a razão do termo autorrenovação. Acredita-se que a autorrenovação assimétrica ocorra mais frequentemente do que a autorrenovação simétrica [8]. As células semidiferenciadas (CSD), também conhecidas como progenitoras, são células que darão origem, após um processo de amadurecimento, às células especializadas (CE). Nesse amadurecimento, as CSD passam por um número limitado de divisões. Outro tipo de células, as Especializadas, são aquelas que estão aptas a desempenhar uma função especifica no organismo. O número de divisões que podem sofrer depende do tipo de tecido e da função que exercem. Para preservar a integridade genética do tecido, um processo biológico conhecido por telomerase é responsável por controlar esse número divisões provocando o encurtamento do telômero da célula a cada divisão efetuada. Os telômeros são estruturas constituídas de fileiras repetitivas de proteínas e DNA não codificante, que tem a função de resguardar as extremidades dos cromossomos impedindo a fusão entre eles. Em 1965, Leonard Hayflick, um famoso médico americano, mostrou que células cultivadas in vitro, se dividiram cerca de 50 vezes antes de morrer. Este

15 15 limite de divisões, que depende do tipo de tecido, foi denominado limite de Hayflick e está relacionado ao processo de redução das extremidades dos cromossomos (telômeros) que ocorre a cada divisão celular. Tal processo está associado ao envelhecimento celular e denomina-se senescência. O processo da telomerase, ou seja, do controle do envelhecimento celular contribui para a manutenção da integridade genética das células, funcionando como se fosse um relógio biológico [9, 10]. As células embrionárias e as células-tronco apresentam um sistema de reposição das extremidades dos telômeros que lhes proporciona uma capacidade ilimitada de replicação [9]: acredita-se que as células tumorais também desenvolvem esse sistema de reposição. Em humanos, a incidência de câncer aumenta exponencialmente nas últimas décadas de vida, culminando em um risco de morte de 1 em 2 para homens e 1 em 3 para mulheres na faixa de idade compreendida entre 40 e 80 anos [11]. A princípio esta ligação entre envelhecimento e câncer está relacionada com o acúmulo sequencial de mutações ao longo da vida [5, 11]. Apesar de células tumorais apresentarem um grande número de mutações, apenas um pequeno subconjunto dessas células irá desenvolver um tecido neoplásico [12, 13], isto é, uma massa compacta de células anormais. Se essa massa permanece agregada, sem se dispersar, dizemos que o tumor é benigno [14]. Nesse estágio, a cura pode ser obtida pela remoção cirúrgica do tumor. No entanto, se as células anormais adquirem a capacidade de invadir outros tecidos., isto é, geram metástases, o tumor passa a ser considerado maligno. Conforme Alberts et al [14], a origem de um tumor pode ser rastreada mesmo quando metástases foram desenvolvidas. Além disso, tal origem advém da divisão de uma única célula que, por ter sofrido alguma mutação, adquiriu a capacidade de suplantar sua vizinha. Por muito tempo, acreditou-se [15] que qualquer célula cancerosa que permanecesse num indivíduo seria capaz de gerar um tumor. Por isso, os tratamentos se concentravam na remoção do maior número possível de células tumorais. No entanto, algumas experiências mostraram que apenas uns poucos tipos de células em um tumor são realmente capazes de gerar um novo tumor. Essas células especiais são denominadas células-tronco cancerígenas devido à sua capacidade ilimitada de reprodução: característica típica da célula tronco. Diversos tipos de câncer já foram mapeados, usando de técnicas de

16 16 reconhecimento celular, através das quais foram encontradas células-tronco cancerígenas, caracterizadas por alta capacidade de autorrenovação. Comprovadamente, algumas poucas células-tronco cancerígenas tinham a capacidade de autorrenovar e regenerar todo o conjunto de células do tumor original, mesmo após sua remoção [15, 27]. Nesse contexto, Hanaham e Weinberg [3] sugerem que uma característica comum do câncer é que um grupo de seis mutações na fisiologia das células é suficiente para que o câncer se desenvolva. Estas seis mutações, acompanhadas da instabilidade genética, são essenciais na origem e disseminação de tumores. Tais alterações são: - autossuficiência em produzir sinais de crescimento: para que as células se desenvolvam e cresçam é necessário que recebam sinais do exterior da célula para seu núcleo. A autossuficiência faz com que as células se desenvolvam e cresçam sem a demanda destes sinais. - apatia aos inibidores do crescimento: num tecido normal, estão presentes processos que, dependendo das condições, inibem o crescimento da população celular. Nas células tumorais, os processos inibidores são ignorados e as células continuaram a se proliferar descontroladamente. - evasão à apoptose (ou morte programada): a apoptose é um tipo de "autodestruição celular" que ocorre de forma ordenada, dependendo, também, das condições do tecido. Está relacionada com a manutenção da homeostase e com a regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, mas pode também ser causada por um estímulo patológico. Presente em todos os tecidos, a apoptose é um importante inibidor do desenvolvimento de tumores. A evasão a este procedimento favorece a disseminação das células malignas. - potencial replicativo ilimitado: como dito anteriormente, as células possuem um limitador para sua divisão que está relacionado com o tamanho do telômero. Porém, nas células cancerígenas, os mecanismos de defesa que levam a célula a entrar no processo de envelhecimento - chamado senescência - são inativados. Isso faz com que essas células consigam manter a integridade de seus telômeros e, consequentemente, adquirem potencial replicativo ilimitado. - angiogênese autossustentada: para que um tumor seja capaz de se manter, é necessário que receba nutrientes do organismo. Este procedimento é

17 17 satisfeito através da angiogênese: capacidade de induzir o crescimento de vasos capilares para nutrir as necessidades vitais da célula. Uma massa tumoral não poderá crescer acima de certo limite se não desenvolver a capacidade de se nutrir. O processo denominado angiogênese está relacionado com a capacidade de um tumor promover o surgimento de vasos sanguíneos que serão responsáveis por sua irrigação, oxigenação e manutenção. Se o tumor não for capaz de induzir o crescimento destes vasos sanguíneos em sua direção, suas células entrarão num processo de decadência e, consequentemente, de morte. Tais vasos também irão colaborar para aumentar os níveis de fatores de crescimento celular. - invasão de tecidos e metástase: é a capacidade de formação de um novo tumor em outras partes dos organismos. As células neoplásicas se desprendem do tumor primário, sendo levadas para outras regiões distantes onde formam uma nova colônia neoplásica. Para que as seis alterações citadas acima consigam formar uma quantidade apreciável de células malignas, a taxa de mutação deve ser drasticamente aumentada. Dizemos que células com grande capacidade de sofrer mutação são células geneticamente instáveis. Uma célula geneticamente instável só será favorecida pela seleção se tiver adquirido outra propriedade como as citadas acima - que lhe confira uma vantagem competitiva. Este trabalho dá continuidade ao trabalho que vem sendo desenvolvido por Gualberto-Leite [16] e Domingues [17], nesse tema, por nosso grupo de pesquisa no CEFET-MG. A dissertação de Gualberto-Leite [16] considerou, também, um modelo determinístico com três compartimentos celulares células-tronco, células semidiferenciadas e células especializadas hierarquicamente organizados e três tipos de mutações que conferem à célula mutante uma vantagem seletiva: evasão à apoptose, aumento da taxa de reprodução e instabilidade genética. Naquele trabalho, Gualberto-Leite [16] desconsidera que as células-tronco possam sofrer autorrenovação assimétrica. Esse tipo de autorrenovação é introduzido no trabalho de Domingues [17] que introduz, também, a habilidade de desenvolver vasos sanguíneos, isto é, desenvolver a angiogênese. Essa habilidade é também adquirida via mutação, como proposto por Spencer et al [18]. Os trabalhos de Gualberto-Leite [16] e de Domingues [17] analisam, como em [6] e [15], o efeito que a aquisição

18 18 sequencial das mutações, em diferentes ordens, tem sobre o crescimento do tecido neoplásico. Neste trabalho, consideramos, como Domingues [17], um modelo também determinístico que inclui os diferentes tipos de divisão que uma célulatronco pode sofrer e quatro tipos de mutações que conferem às células mutantes alguma vantagem. As mutações são: Mutação A: capacita a célula a induzir a angiogênese; Mutação R: Caracteriza-se pelo aumento da taxa de divisão celular, fazendo com que a célula se torne insensível em relação aos sinais que inibem seu crescimento e, em certas situações, tornando seu potencial replicativo ilimitado; Mutação D: caracterizada pela redução da taxa de mortalidade; Mutação I: provoca um aumento na taxa de mutação da célula. A mutação correspondente à angiogênese verifica sua ação inibidora do crescimento da população considerada cancerígena enquanto o tumor não adquire a capacidade de nutrir suas células. Para essa habilidade, propomos um submodelo diferente do proposto por Domingues [17], como também, estudamos mais detalhadamente dois casos alteração no padrão de autorrenovação das células-tronco e evasão à telomerase - que não foram devidamente analisados anteriormente. Além disso, nesse trabalho, consideramos um segundo modelo em que a aquisição da mutação ocorre de forma aleatória e comparamos os resultados para os dois modelos. 1.1 Objetivos do trabalho O objetivo geral deste trabalho consiste em implementar dois modelos matemáticos e computacionais para simular o crescimento da população celular verificando a influência que as mutações podem causar nesta população em termos de crescimento de tumores. Um dos modelos é totalmente determinístico enquanto o outro inclui certa aleatoriedade. Para ambos os modelos, analisamos quais os efeitos da aquisição sequencial de mutações para o tecido.

19 19 Verificamos também quais as consequências quando alteramos o padrão de divisão normal da célula tronco bem como o efeito da evasão à telomerase das células especializadas. Além disso, analisamos as características de diferentes fatores angiogênicos e seus efeitos sobre a população cancerígena. A linguagem C/C++ através da plataforma open source Code Blocks foi utilizada para a implementação dos modelos que fornecem, a cada iteração, o número total de células em cada compartimento considerado: CT, CSD e CE. Os métodos utilizados neste trabalho consistiu numa pesquisa bibliográfica, modelagem e simulação para atingir o objetivo proposto e validação dos resultados através de dados empíricos obtidos de artigos científicos. No capítulo 2, abordamos as equações que descrevem a dinâmica populacional das CT, CSD e CE, bem como a análise destas equações. No capítulo 3, faremos uma breve introdução sobre os tipos de mutações que o modelo envolve, bem como as possíveis sequências que estas mutações podem acumular nas células durante seu processo evolutivo. No quarto capítulo, relatamos os resultados e análises de algumas sequências de mutações em que obtivemos resultados mais notáveis. No capítulo 5, descrevemos o modelo da dinâmica populacional que considera as taxas de mutação aleatoriamente. Os resultados são comparados com o modelo determinístico. Por último, no capítulo 6, são feitas as conclusões gerais e propostas para trabalhos futuros.

20 20 2 MODELO DETERMINÍSTICO DE CRESCIMENTO CELULAR BASEADO EM EQUAÇÕES DIFERENCIAIS Neste capítulo, definimos as equações diferenciais que descrevem nosso modelo determinístico com base em alguns modelos de dinâmica populacional. Verificamos, também, as possíveis populações de equilíbrio que as populações podem atingir. Consideramos esta dinâmica populacional para um tecido virtual. As equações foram definidas para cada compartimento celular: Células-tronco (CT); Células semidiferenciadas ou progenitoras (CSD); Células especializadas (CE). Este modelo admite que as células possam acumular em seu DNA uma quantidade de mutações durante o processo de reprodução celular, sendo, onde o número máximo de mutações. Classificamos então as populações como normais, quando estas não possuem mutações acumuladas em seu DNA e anormais ou mutantes para. Para analisar os casos em que as células adquiriram mutações, serão considerados, como em Domingues [17], a inserção de dois fatores nas equações que descrevem a evolução dos compartimentos celulares: fator angiogênico e um fator limitador do crescimento celular denotado por. A função deste último fator é limitar o crescimento da população celular em situações em que o modelo prevê uma explosão celular. Nesses casos, sem a inserção desse fator limitador, os números obtidos no programa computacional podem ultrapassar o limite permitido computacionalmente. É importante ressaltar que a utilização desse fator não impede a identificação dos casos em que as mutações adquiridas favorecem um crescimento anormal de células anormais de modo a sugerir a formação rápida e descontrolada de um tumor. O fator angiogênico é o modelo que utilizamos para simular a ação da

21 21 angiogênese, como descrito a seguir. Esse modelo foi inspirado no trabalho de Spencer et al [18] e suas características estão descritas na seção seguinte. 2.1 Fator angiogênico Para que um tumor desenvolva e cresça é necessário que as células tumorais estimulem a formação de novos vasos sanguíneos para a sua nutrição e oxigenação, processo denominado angiogênese. De acordo com algumas referências [18, 28], um tumor não consegue crescer além de 1% da população de células normais, sem receber nutrientes do organismo. No nosso modelo, como em Spencer et al [18] e Domingues [17], representa a população de células que adquiriu a capacidade de induzir a angiogênese, isto é, adquiriu a mutação A, e é a população total das células que adquiriram alguma mutação durante seu desenvolvimento. Para representar o efeito da angiogênese sobre a dinâmica da população celular, introduzimos no nosso modelo o fator angiogênico. Utilizamos a função tangente hiperbólica para representá-lo uma vez que as características dessa função são adequadas para o comportamento esperado em nosso modelo, como veremos a seguir. (Eq. 2.1) onde p assume valores no intervalo (0,1]. Nesse trabalho, utilizamos dois valores para esse parâmetro: 0,50 e 0,90. Por isso, os resultados obtidos com cada um desses valores são designados, respectivamente, por f a 50% e f a - 90%. Para que a angiogênese ocorra, é necessário que pelo menos um percentual p da população de células anormais tenha adquirido a capacidade de induzir a angiogênese através da aquisição de alguma mutação. Assim,

22 22 enquanto esse percentual não é atingido, o fator proposto em (2.1) atua para desacelerar o crescimento da população de células anormais. Se essa população de células anormais continua a crescer até que o tumor tenha adquirido capacidade de se nutrir, isto é, se P A pp NM, então o fator proposto não mais impede o crescimento do tumor. No capítulo 4, analisaremos o efeito deste fator sobre a população celular. 2.2 Células-tronco A fim de descrever e posteriormente analisar as equações da dinâmica populacional destes tipos celulares, consideramos que as mesmas estão sujeitas às seguintes ações: i. autorrenovação simétrica: processo de divisão celular em que a célula mãe origina duas células filhas idênticas a ela; i. autorrenovação assimétrica: a célula mãe dá origem a uma célula filha idêntica a ela e outra célula diferenciada; iii. divisão celular seguida de diferenciação: uma célula dá origem a duas células diferenciadas; iv. morte. Consideramos também que as três primeiras ações descritas acima podem originar células filhas munidas de mutações adicionais. Para representar essas ações sofridas pelas células tronco, utilizamos a simbologia representada na tabela 2.1. Tabela Parâmetros das células-tronco Símbolos Parâmetros das CTs Taxa de autorrenovação simétrica Taxa de autorrenovação assimétrica Taxa de diferenciação Taxa de mortalidade Taxa de mutação

23 23 Como em Gualberto-Leite [16], separamos as equações que descrevem a evolução dessa população em dois grupos, de acordo com o número de mutações que foram acumuladas por elas. i. CTs sem mutações: ii. CTs com m de mutações:, onde é o número máximo de mutações que a célula pode acumular. No nosso caso consideramos. Utilizando a figura 2.1, podemos descrever as equações de evolução temporal dessas células para cada subcompartimento. Denotaremos as populações de CT num instante por. Para representar as mutações que as células podem adquirir durante sua evolução, utilizaremos um sobrescrito nos parâmetros. (i). Subcompartimento : Analisando quais seriam as perdas e os ganhos neste subcompartimento celular de um instante para, verificamos que ocorre perda por morte, divisão assimétrica, divisão simétrica e também por diferenciação. Por outro lado este subcompartimento recebe as duas células geradas sem mutação por autorrenovação simétrica e uma célula, também sem mutação, gerada pela autorrenovação assimétrica. Logo a equação para este compartimento é descrita por: (Eq. 2.2) onde e representam a população de células-tronco sem mutação nos tempos e respectivamente.

24 24 Figura 2.1 Diagrama da dinâmica populacional das CTs, CSDs e CEs. Fonte: Domingues, 2010.

25 25 (ii). Subcompartimento A equação de evolução temporal para este subcompartimento mostra que esta nova população terá as mesmas perdas e ganhos relatados na equação 2.2, porém, agora acumuladas de mutações. Além disso, há um ganho proveniente da população de células que possuía uma mutação a menos no estágio anterior, mas que, ao sofrer autorrenovações simétrica e assimétrica, ganharam mutação adicional. Sendo assim, esta população no instante, pode ser descrita pela equação 2.3: (Eq. 2.3). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ) e com alguma manipulação matemática, a equação 2.3 será descrita por: (Eq. 2.3a). Neste subcompartimento adotaremos um padrão de reprodução para as CT que chamaremos de padrão normal, onde consideraremos que as taxas de autorrenovação simétrica e a taxa de diferenciação são iguais, ou seja: (Eq. 2.4). Ainda em relação às equações de evoluções temporais, no caso em que a célula acumule o número máximo de mutações, devemos considerar, uma vez que a célula não pode mais adquiri-las. Sendo assim a equação 2.3 fica resumida a: (Eq. 2.5).

26 26 Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ) a equação 2.3 será: (Eq. 2.5a). 2.3 Células semidiferenciadas Ao diferenciarem-se, as células-tronco passam a constituir um grupo de células chamadas semidiferenciadas, que representa um grupo de células num estágio de transição entre as células-tronco e as especializadas. As CSDs são células que passam por um período de maturação. Para que estas células tornem-se especializadas é necessário que elas sofram divisões celulares. Sendo assim, neste grupo de células, teremos dois parâmetros a serem considerados: quantidade de mutações e número de divisões sendo e. Esses números acompanham os termos da equação em sobrescrito representado por onde representa o número de células semidiferenciadas nestas equações. Estas células, diferentemente das CT, sofrem somente o tipo simétrico de mitose e, sendo assim, estão submetidas às ações de morte, autorrenovação simétrica e diferenciação, sendo que estas duas últimas ações podem vir acompanhadas de mutação adicional. A tabela 2.2 representa os parâmetros utilizados nas equações de evolução temporal para as CSD. Tabela Parâmetros das células semidiferenciadas Símbolos Parâmetros das CSD Taxa de autorrenovação Taxa de diferenciação Taxa de mortalidade Taxa de mutação Quantidade máxima de divisões

27 27 Para o nosso modelo, assim como Gualberto-Leite [16], as equações de evolução temporal para este compartimento celular serão definidas de acordo com o número de mutações e divisões que estas células foram submetidas. Analisando primeiramente os casos em que as células ainda não sofreram nenhuma mutação temos: (i). Subcompartimentos : Caso : as células que contribuem para este compartimento celular são as CT que sofreram autorrenovação assimétrica sem acumular mutação, além das CT que passaram por diferenciação também sem acúmulo de mutação. Por outro lado, a população deste compartimento é reduzida pela ação da morte e da autorrenovação simétrica, uma vez que não podem diferenciar por não ter sofrido a quantidade mínima de divisões para isto. Portanto a equação que descreve a população neste subcompartimento é dada por: (Eq. 2.6). e são as populações de CSD que não sofreram nenhuma mutação nem divisão celular nos tempos e respectivamente. Caso : da mesma forma que o subcompartimento anterior, esta população sofre perdas por morte e autorrenovação simétrica. Entretanto, somente recebe células do estágio imediatamente anterior que sofreram autorrenovação sem acumular mutações em seu material genético. Neste caso, a equação da dinâmica celular é dada por: (Eq. 2.7). Caso : neste estágio as células sofreram o número máximo de divisões possível para as CSD, e desta forma não podem mais sofrer autorrenovação e sim diferenciação através da qual transformarão em CE. Sendo assim, este subcompartimento perde células por morte e por diferenciação; tem sua

28 28 população aumentada das células que vieram da etapa anterior após sofrerem divisão celular sem mutação, como descrito abaixo: (Eq. 2.8). (ii). Subcompartimento : Caso : este subcompartimento sofre perdas por morte e por autorrenovação. Tem sua população aumentada proveniente da população de células tronco que possuíam mutações e que sofreram divisão celular assimétrica e diferenciação, além de outras CT que possuíam uma mutação a menos em seu DNA e que, durante o processo de diferenciação e divisão celular assimétrica, adquiriram mutação adicional, ou seja: (Eq. 2.9). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ) a equação 2.9 será: (Eq. 2.9a). Caso : para este subcompartimento, as perdas ainda são por morte e divisão simétrica e há um ganho referente a população de CSD que já tinha mutações acumuladas e que sofreram divisão celular sem acumular mutações, além das CSD que tinham mutações em seu material genético e sofreram divisão acompanhada de mutação, como representado na equação:

29 29 (Eq. 2.10). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ) a equação 2.10 será: (Eq. 2.10a). Caso : A equação de evolução temporal para este subcompartimento é semelhante à equação 2.8, porém como as células atingiram o limite de divisões possíveis, agora elas sofreram diferenciação, transformando-se em CE. Neste caso: (Eq. 2.11). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ) a equação 2.11 será: (Eq. 2.11a). 2.4 Células especializadas Consideramos este estágio como o último que uma célula pode atingir. O que determinará a morte da célula será então o número de divisões que ela pode sofrer. Para as CE este número é definido por 50 divisões. Entretanto, algumas células adquirem a capacidade de extrapolar este limite de divisões entrando num processo de divisão ilimitada. Esta capacidade de dividir-se

30 30 indefinidamente é uma das características da célula cancerígena, que em nosso modelo é definida como tal quando adquire o número máximo de mutações ao longo de sua evolução. Neste compartimento celular, consideramos que estas células estão sujeitas a adquirirem mutações e assim como as células semidiferenciadas sofrerão um certo número de divisões que representaremos por sendo. O limite máximo de divisão que as CE podem sofrer é definido por e, como já visto anteriormente denominado, limite de Hayflick. As células especializadas estão sujeitas às ações de morte e autorrenovação já que formam o último estágio celular, não podendo sofrer diferenciação. Assim como foi feito para as demais células consideradas neste estudo, a tabela abaixo representa os parâmetros utilizados nas equações de evolução temporal para este compartimento celular. Determinamos as equações para a evolução das CE definindo subcompartimentos de acordo com a quantidade de mutações acumuladas e o número de divisões sofridas, enfatizando que para este compartimento celular teremos também uma equação para representar a população de células que podem extrapolar o número máximo de divisão. Tabela Parâmetros das células especializadas Símbolos Parâmetros das CE Taxa de autorrenovação Taxa de mortalidade Taxa de mutação Quantidade máxima de divisões (i). Subcompartimentos : Caso : Este subcompartimento tem sua população reduzida por morte ou divisão simétrica, mas recebe as células provenientes das CSD que se diferenciaram quando atingiram o limite máximo de divisões, sem acumular mutações. A equação temporal é descrita então por:

31 31 (Eq. 2.12). Caso : A equação deste subcompartimento envolve as perdas por morte e divisão celular das CE e o ganho referente às CE que vieram do estágio anterior por divisão celular sem ganho de mutações, como descrito abaixo: (Eq. 2.13). (ii). Subcompartimento : Neste subcompartimento temos as células que são consideradas sadias uma vez que não adquiriram mutações e também as células que adquiriram mutações mas entraram em senescência após as divisões. Entretanto, agora temos o caso das células consideradas malignas ou cancerígenas, pois ao atingirem mutações continuam a se dividirem após o limite. Caso : As perdas e ganhos neste subcompartimento são os mesmos considerados na equação 2.10, porém com mutações acumuladas, além do acréscimo da população de CSD que tinham uma mutação a menos e sofreram diferenciação celular com acúmulo de mutação, como representado na equação: (Eq. 2.14). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ), a equação 2.14 será: (Eq. 2.14a).

32 32 Caso : Este estágio é composto pelas CE com mutações que sofreram divisão celular sem mutação adicional e por CE com mutações que passaram por divisão celular com mutação adicional, além das perdas das CE que morreram ou se dividiram. A equação é assim determinada: (Eq. 2.15). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ), a equação 2.15 será: (Eq. 2.15a). Caso e temos a situação em que as células podem entrar no processo de divisão celular ilimitada e sua equação é dada por: (Eq. 2.16). Com a inserção do fator angiogênico ( ) e do fator limitador ( ), a equação 2.16 será: (Eq. 2.16a).

33 Análise das populações de equilíbrio O modelo desenvolvido neste trabalho contempla o crescimento e a estrutura multi-passo do desenvolvimento celular. Esta estrutura é marcada pela sequência de eventos ocorridos nas células tronco que culminam com sua diferenciação e especialização durante a geração de tecidos específicos. Tal modelo é baseado em Ashkenazi et al. [5] e evidencia que o processo de crescimento de tumor é progressivo e dependente da quantidade de mutações acumuladas em cada célula. Para validação dos resultados simulados e apresentados no capítulo 4 é desenvolvida a solução analítica do modelo em condições de equilíbrio populacional. O desenvolvimento analítico do equilíbrio para o compartimento das CT é feito a seguir. População de equilíbrio das CT A condição para que uma determinada população atinja o equilíbrio é que sua população no instante seja a mesma que no instante, indicando que sua estabilização. Portanto no equilíbrio: (Eq. 2.17). Analisamos para este compartimento o equilíbrio populacional para um tecido saudável e para um tecido com mutações acumuladas. Analisando a situação de equilíbrio para a população de células tronco (CT), aplicamos a condição 2.17 na equação 2.2 e verificamos que para que tal equilíbrio ocorra é necessário que: (Eq. 2.18).

34 34 i. Para um tecido saudável, ou seja,, temos que. Na condição 2.18: (Eq. 2.19). Como os parâmetros utilizados no nosso modelo satisfazem à condição 2.18, podemos concluir que a população de CT com funciona como um reservatório celular. ii. Num tecido com mutações acumuladas, para que a população de CT atinja o equilíbrio, uma análise da equação 2.3a, desconsiderando a atuação dos fatores angiogênicos e limitador (, nos impõe a condição: (Eq. 2.20). Uma vez satisfeita tal condição, a população de equilíbrio para as CT para este caso é dada por: Se ainda utilizarmos o padrão de autorrenovação das CT considerado como normal no nosso modelo, ou seja, satisfazendo a condição imposta pela equação 2.4, a população de equilíbrio para este caso pode ser expressa por: Previsão analítica das CT Nosso modelo inicia-se com uma única célula tronco, e como vimos que esta população celular com 0 mutações funciona como um reservatório celular, para este caso a população de equilíbrio nos fornece.

35 35 A tabela de parâmetros dos compartimentos celulares que usamos no nosso modelo tem como base os valores adotados em [5]. Tabela 2.4 Valores dos parâmetros referentes aos três compartimentos celulares CT, CSD e CE. CT CSD CE 0,0092 0, , , , ,0115 0,001 0,001 0,006 0,0065 0,001 1, 2 e 3 0,0092 0, , , , ,0115 0,001 0,001 0,006 0,0065 0,001 0,0092 0, , ,00 0, ,0115 0,001 0,00 0,006 0,0065 0,00 Com o auxílio da equação 2.22 e da tabela 2.4, obtemos as populações de equilíbrio das CT com 1, 2, 3 e 4 mutações, cujos valores estão na tabela 2.5, para um tecido com mutação. Tabela Cálculo analítico das populações de CT(%). A figura 2.2 ilustra a população de CT num tecido virtualmente saudável e outro num tecido com mutações através dos dados da simulação computacional do nosso modelo.

36 Número de células 36 3 CT Tecido saudável CT Tecido com mutação x x x x x10 6 iterações Figura 2.2- Evolução das CT num tecido saudável e num tecido com mutação Através da figura 2.2, verificamos que os resultados obtidos são compatíveis com os resultados previstos analiticamente, validando assim nosso modelo para as CT. Através da simulação computacional do modelo, para as CSDs foi obtida a população de 485 células no tecido saudável e 1043 naquele com mutações acumuladas. Já para as CEs estes valores correspondem a 8939 e células, respectivamente. Para os demais compartimentos celulares CSD e CE as figuras 2.3 e 2.4 mostram a evolução temporal destas populações que também concordam com os resultados analíticos obtidos no nosso grupo de pesquisa e abordados em [17].

37 Número de células Número de células 37 CSD Tecido saudável CSD Tecido com mutação x x x x x10 6 iterações Figura População de CSD: tecido saudável comparado com o tecido com mutações CE Tecido saudável CE Tecido com mutação x x x x x10 6 iterações Figura População de CE: tecido saudável comparado com o tecido com mutações Podemos concluir, a partir da simulação realizada para um tecido saudável, que os resultados encontrados estão compatíveis com as principais

38 38 referências utilizadas. Em Ashkenazi et al. [5] e neste trabalho, para um tecido saudável, a população de células-tronco corresponde a 0,01% da população total de células. Confirmou-se que uma única célula-tronco gerou uma população de aproximadamente 9500 células.

39 39 3 SEQUÊNCIAS DE MUTAÇÕES Estudos mostram que as células normais, ao adquirirem um acúmulo sequencial de mutações, podem transformar-se em células cancerígenas [3, 5, 18]. Assim como Ashkenazi et al [5], foi agregado ao modelo proposto neste trabalho a aquisição sequencial de mutações admitindo que uma determinada mutação altera uma específica taxa da dinâmica celular. Nesse contexto a ordem na qual a mutação ocorre interfere na dinâmica do crescimento populacional bem como na taxa de crescimento do tumor. Neste capítulo apresentaremos os quatro tipos de mutações consideradas no modelo, suas características e as possíveis sequências de mutação que podem ser formadas. Mutação A: este tipo de mutação faz com que a célula seja capaz de induzir a angiogênese. Conforme abordado no capítulo 2 as células são suscetíveis a determinadas ações relacionadas com a vida celular, dentre elas, - morte, divisão celular, diferenciação. É importante salientar que o tipo de mutação A não provoca alterações nas taxas das ações celulares citadas anteriormente. Mutação D: relacionada com a evasão à morte programada, este tipo de mutação tem a capacidade de diminuir a taxa de mortalidade das células. A tabela 3.1 evidencia os valores das taxas de mortalidade de cada compartimento celular e a nova taxa após a aquisição da mutação D. Tabela Taxas de mortalidade de cada tipo celular antes e depois da aquisição da mutação do tipo D. Células CT CSD CE Taxas Sem mutação 0, ,001 0,0065 Com mutação 0, , ,0055 Fonte: [5, 17] (com adaptações)

40 40 Mutação I: tem como característica o aumento da taxa de mutação das células. Conhecida como instabilidade genética, é considerada por Hanahan e Weinberg [3] essencial para o desenvolvimento da neoplasia. A tabela 3.2 evidencia os valores das taxas de mutação de cada compartimento celular e a nova taxa após a aquisição da mutação I. Tabela Taxas de mutação de cada tipo celular antes e depois da aquisição da mutação do tipo I. Células CT CSD CE Taxas Sem mutação 0, ,0 0,0 Com mutação 0,01 0,01 0,01 Fonte: [5, 17] (com adaptações) Mutação R: proporciona um aumento na taxa de divisão celular. Como em nosso modelo consideramos que as células tronco podem sofrer divisão simétrica,, e assimétrica,, a tabela (3.3) descreve as taxas referentes a estas divisões, e, assim como seus respectivos valores após a ocorrência da mutação R. Tabela Taxas de mitose de cada tipo celular antes e depois da aquisição da mutação do tipo R. Células CT CT CSD CE Taxas Sem mutação 0, ,0092 0,0115 0,0060 Com mutação 0, , ,0207 0,0065 No nosso modelo, diferentemente dos trabalhos anteriores do grupo de pesquisa [16, 17 e 24], analisamos o comportamento da população celular quando consideramos a hipótese deste tipo de mutação alterar o padrão de autorrenovação das CT considerado como normal.

41 41 A tabela 3.4 mostra todas as possíveis sequências que podem ser formadas usando os quatro tipos de mutações,,, e, considerados neste trabalho. Vale lembrar que a mutação referente à instabilidade genética, não pode ser a última a ocorrer, uma vez que não poderia mais alterar o valor da taxa de mutação sendo que as mesmas tornam-se iguais a zero, por ter chegado no limite de mutação. Tabela Tipos de sequências 1ª mutação 2ª mutação 3ª mutação 4ª mutação Sequência A D I R ADIR A I D R AIDR A I R D AIRD A R I D ARID D A I R DAIR D I A R DIAR D I R A DIRA D R I A DRIA R A I D RAID R I A D RIAD R I D A RIDA R D I A RDIA I A D R IADR I A R D IARD I D A R IDAR I D R A IDRA I R A D IRAD I R D A IRDA No próximo capítulo vamos analisar os efeitos que a aquisição das mutações apresentadas, em diferentes sequências, pode ter sobre o crescimento de uma população. Trabalhos recentes, tais como, Ashkenazi [5], Gualberto-Leite [16], Domingues [17] e Spencer [18] mostraram que as