EFEITO DA ASSEPSIA COM HIPOCLORITO DE SÓDIO NA INCIDÊNCIA DE FUNGOS E BACTÉRIAS EM SEMENTES DE TRIGO (Triticum aestivum L.)

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1 1 EFEITO DA ASSEPSIA COM HIPOCLORITO DE SÓDIO NA INCIDÊNCIA DE FUNGOS E BACTÉRIAS EM SEMENTES DE TRIGO (Triticum aestivum L.) PARIS, Francisco, César 1 ; FÁVERO, Larissa 1 ; POLETTO, Keli Olivia 2 ; RONCAGLIO, Ediane Basegio 3 ; PERUSSOLO, Analize Fátima 4 ; SEXTO, Paloma Alves da Silva 5 ; SCOLARI, Lidinara Castelli 6. palomasexto@ideau.com.br Resumo: O trigo (Triticum aestivum L.) é uma cultura amplamente difundida no mundo. Sendo considerado um alimento básico por possuir inúmeros derivados oriundos de sua industrialização. Este estudo visou avaliar o efeito da assepsia com a utilização de hipoclorito de sódio (NAClO), em diferentes concentrações e tempos de imersão das sementes no produto, bem como a identificação dos fungos e bactérias presentes nas sementes de trigo cultivadas em meio de cultura. A pesquisa foi realizada no Laboratório de Fitopatologia da Empresa Seeds, Passo Fundo- RS. As sementes foram imersas em hipoclorito de sódio, nas concentrações 10, 20 e 30 ml por períodos de 5, 10 e 15 minutos. Após a imersão, as sementes foram lavadas em água destilada e acondicionadas em gerbox contendo o meio de cultura BSA (Batata-sacarose-ágar). A identificação dos microrganismos foi realizada após sete dias de incubação. Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo programa estatístico CoStat e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5 % de significância. Os fungos encontrados pertencem a sete gêneros, sendo eles: Alternaria spp., Aspergillus sp., Bipolaris sp., Drechslera sp., Fusarium sp., Nigrospora sp., Penicillium sp.. Detectou-se a presença do gênero de bactérias Pectobacterium spp., com incidência de 100% em todos os tratamentos, já entre os fungos observou-se a maior presença do fungo de armazenamento Penicillium sp., com 26, 8% de incidência nas sementes. Verificou-se que a assepsia foi significante na eliminação de fungos de armazenamento, sendo que a concentração e o tempo não tiveram influência em relação a quantidade de fungos eliminados. 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

2 2 Palavras chave: patógenos, desinfestação, meio de cultura. Abstract: Wheat (Triticum aestivum L.) is a widespread culture in the world. Being considered a food staple for having numerous derivatives coming from industrialization. This study aimed to evaluate the effect of the utilization of asepsis with sodium hypochlorite (NAClO) at different concentrations and times of immersion of seeds in the product and the identification of bacteria and fungi present in the wheat seeds cultivated in the culture medium. The survey was conducted in the laboratory of plant pathology Company Seeds, Passo Fundo - RS. The seeds were immersed in sodium hypochlorite at concentrations of 10, 20 and 30 ml for periods of 5, 10 and 15 minutes. After soaking, the seeds were rinsed in distilled water and placed on germination boxes containing BSA culture medium (potato sucrose agar). The identity of the microorganisms was carried out after seven days of incubation. Data were subjected to analysis of variance by CoStat statistical program and the average were compared by Tukey test at 5 % significance. The fungi found belong to seven genera, namely. Detected the presence of the genus. Alternaria spp., Aspergillus sp., Bipolaris sp., Drechslera sp., Fusarium sp., Nigrospora sp., Penicillium sp..detected the presence of the bacteria genus Pectobacterium spp., With an incidence of 100% in all treatments, already among the fungi there was a greater presence of the fungus Penicillium sp 26, 8% storage.,focusing on seeds. It was found that asepsis is significant in eliminating storage fungi, present on the outside of the seed, and the concentration and time had no influence on the amount of fungi eliminated. Key words: pathogens, decontamination, culture medium. 1 Introdução O trigo (Triticum aestivum L.) é uma cultura amplamente difundida no mundo. Sendo considerado um alimento básico por possuir inúmeros derivados oriundos de sua industrialização. Dessa forma, as sementes de trigo assumem papel relevante e sua qualidade se torna fundamental no processo de produção. As sementes constituem-se num dos mais eficientes agentes de disseminação e no abrigo mais seguro à sobrevivência de patógenos (REIS & CASA, 1998). Diante desse aspecto, as sementes de trigo são frequentemente colonizadas por microrganismos patogênicos, entre eles fungos e bactérias. Estes são responsáveis por perdas consideráveis no rendimento e produtividade, como também na redução da qualidade fisiológica das sementes (BRZEZINSKI et al., 2012 apud KOBAYASTI & PIRES, 2011). 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

3 3 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade De acordo com Reis & Casa (1998), os principais fungos associados às sementes de trigo são Alternaria spp., Bipolaris sorokiniana, Drechslera triticci repentis, Fusarium graminearum, Septoria nodorum. Dentre as bactérias infestantes destacam-se Pseudomonas syringae pv. syringae, Xanthomonas campestris pv. undulosa e Pectobacterium spp. É de fundamental importância identificar os organismos patogênicos presentes nas sementes, pois eles podem comprometer a germinação e as demais atividades fisiológicas da semente. Os patógenos também podem infectar a plântula, ocasionando doenças, diversos danos e consequentemente perdas na produtividade do trigo. Dentre os agentes patogênicos, os fungos englobam o maior número de espécies associadas às sementes, seguido pelas bactérias. A maioria dos fungos fitopatogênicos podem ser transmitidos pelas sementes de seus hospedeiros (BRASIL, 2009). Os fungos são organismos absortivos, eucarióticos, heterotróficos e desenvolvem um filamento microscópio difuso, ramificado e tubular denominado de hifa. Um micélio é constituído por um grupo de hifas e frequentemente visíveis a olho nu que corresponde ao corpo vegetativo ou talo do fungo. Eles se reproduzem sexuada ou assexuadamente por meio de esporos (TRIGIANO et al., 2010). Os agrupamentos com base nas características morfológicas, como tipo de frutificação, tamanho, forma, cor dos esporos, são importantes para a identificação de fungos. Os fungos necrotróficos sobrevivem nas sementes, tanto na forma de micélio dormente como infestandoas. Quanto maior é a incidência desses patógenos nas sementes, maiores serão os focos no campo (MENTEN, 1995). A presença de fungos nas sementes pode reduzir a capacidade germinativa de um lote, como também ocasionar problemas na interpretação dos resultados de testes de germinação, conduzidos em condições de laboratório (CASTELLANI et al., 1996). A contaminação na cultura pelas bactérias pode ocorrer no período de maturação da semente, quando o inóculo produzido sobre as folhas ou outras partes da planta atinge a sua

4 4 superfície, por meio de respingos de chuva, água de irrigação, vento e insetos. Também pode ocorrer durante as operações de colheita, transporte e beneficiamento. A semente infectada pode ou não apresentar sintomas, porém na maioria das vezes não apresenta (BRASIL, 2009). Em razão desses aspectos, buscam-se alternativas por meio da assepsia das sementes, como uma possível forma de eliminação de fungos e bactérias patogênicas. Estes são responsáveis por perdas no rendimento e produtividade como também na redução da qualidade fisiológica das sementes. Contudo, recomenda-se a utilização de produtos químicos para a desinfestação superficial de contaminantes de material vegetal, assim como no controle de organismos patogênicos. Dentre os produtos utilizados, destaca-se o hipoclorito de sódio (NaClO) na concentração de 1% por um período de 3 minutos (AMORIN et al., 2011; BRASIL, 2009). Observou-se na literatura que a assepsia de sementes é utilizada em diversos estudos. No entanto, existe grande variabilidade quanto ao efeito, em virtude do agente químico, da concentração da solução e do tempo de imersão da semente na solução. A desinfestação é uma prática de limpeza realizada na semente, com o intuito de eliminar microrganismos que encontram-se aderidos a essas sementes (REIS & CASA, 1998). Desse modo, recomenda-se para a realização de assepsia das sementes, a utilização de produtos, entre eles o hipoclorito de sódio (NaClO) na 28 concentração de 1%, durante 3 minutos para desinfestação superficial de contaminantes de material vegetal, assim como no controle de organismos patogênicos (AMORIN et al., 2011; BRASIL, 2009). O hipoclorito de sódio (NaClO) é um desinfetante largamente utilizado. É uma solução aquosa alcalina com 10% de cloro ativo e cerca de g/l de soda residual, de coloração amarela e odor característico, produzido pela reação entre o cloro gás e uma solução de hidróxido de sódio (TORRES et al.,1998). 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

5 5 No entanto, existe grande variabilidade quanto ao efeito da assepsia. Esse efeito dependerá do tipo do agente químico utilizado, da concentração da solução e do tempo de imersão das sementes no produto (ZORATO et al., 2001). O isolamento direto consiste em transferir o material infectado para um meio de cultura. Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente que permite o crescimento de microrganismos ou células vegetais, denominado de meio de cultura (PELCZAR JUNIOR et al.,1997). O tipo do meio de cultura utilizado dependerá de alguns fatores como origem do material a ser analisado, a espécie que se imagina estar presente na amostra e as necessidades nutricionais dos microrganismos (AMORIN et al., 2011). Conforme Alfenas & Mafia (2007), o meio de cultura batata-sacarose-ágar (BSA) é utilizado no cultivo de fungos e bactérias em geral. Esse meio pode ser adquirido pronto ou preparado de acordo com os componentes e quantidades especificados (Tabela 1). Tabela 1. Componentes do meio batata-sacarose-ágar (BSA). Componente Extrato de batata (200 g) Sacarose Ágar Água destilada Quantidade 500 ml 20 g 20 g 1000 ml 2 Material e Métodos 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade O estudo foi realizado no Laboratório de Sementes e Pesquisa Agrícola, Seeds, localizado no município de Passo Fundo, RS.

6 6 As sementes de trigo utilizadas para a experimentação foram da variedade TBIO Pioneiro, provenientes da safra O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial (4x3), com 4 repetições cada. Sendo os tratamentos assim constituídos: quatro concentrações (0, 10, 20 e 30 mililitros) de NaClO e três tempos (5, 10 e 15 minutos) de imersão na solução de NaClO (Tabela 2). Tabela 2. Tratamentos utilizados para imersão das sementes de trigo em hipoclorito de sódio, nas concentrações em ml (mililitros) e tempo em min (minutos). Tratamento Concentração (ml) Tempo (min) T1 0 5 T T T T T T T T T T T Para a realização dos testes de concentração do produto e tempo de imersão na solução foram utilizadas sementes, divididas em 12 tratamentos com 4 repetições de 25 sementes cada. As subamostras foram imersas no NaClO e em 10 ml de água destilada de acordo com a concentração e o tempo estipulado para cada tratamento. 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

7 7 Em seguida, as sementes foram submetidas a três enxágues com água destilada para eliminar resíduos do produto. Após o término da assepsia, realizou-se o isolamento das mesmas em caixas de acrílico tipo gerbox, previamente esterilizadas com álcool 70%, contento o meio de cultura BSA (batata-sacarose-ágar). As sementes permaneceram durante sete dias em câmara de crescimento a 25 ±2 C, com fotoperíodo de 12 horas (lâmpada fluorescente), a fim de dar condições ideais para desencadear o desenvolvimento dos fungos e bactérias. Decorridos os sete dias, realizou-se a avaliação e identificação dos fungos e bactérias com base nas características morfológicas, como tipo de frutificação, tamanho, forma, cor dos esporos, seguindo como padrão o Manual de análise sanitária de sementes (BRASIL, 2009). Essa análise contou com o auxílio de microscópio estereoscópio e óptico. Quando necessário, foram feitas lâminas para confirmação dos resultad Essa análise contou com o auxílio de microscópio estereoscópio e óptico. Quando necessário, foram feitas lâminas para confirmação dos resultados. As sementes que apresentaram fungos e bactérias foram quantificadas e os valores expressos em forma de porcentagem. Após o levantamento dos dados, os mesmos foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas através do teste de Tukey a 5% de significância. Foi utilizado o programa estatístico CoStat para verificar se o efeito da assepsia foi significante e se a concentração do NaClO e o tempo de imersão tiveram relação na influência dos fungos e bactérias presentes nas sementes de trigo. 3 Resultados e Discussão 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade Os resultados demonstram que os tratamentos sem hipoclorito T1, T2 e T3, não eliminaram os fungos presentes nas sementes. Quando submetidos ao teste Tukey a 5% de

8 8 significância, observou-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos. Em contrapartida, os tratamentos do T4 ao T12, que continham NaClO, não diferiram estatisticamente entre si, porém diferiram significativamente dos tratamentos T1, T2, e T3 em virtude da menor ocorrência de fungos (Tabela 3). Tabela 3. Percentual de sementes de trigo contaminadas por fungos em cada tratamento. Tratamento Descrição % de Sementes Contaminadas T1 0 ml de NaClO, 5 min 100 a* T2 0 ml de NaClO, 10 min 96 a T3 0 ml de NaClO, 15 min 100 a T4 10 ml de NaClO, 5 min 32 b T5 10 ml de NaClO, 10 min 37 b T6 10 ml de NaClO, 15 min 41 b T7 20 ml de NaClO, 5 min 31 b T8 20 ml de NaClO, 10 min 34 b T9 20 ml de NaClO, 15 min 41 b T10 30 ml de NaClO, 5 min 43 b T11 30 ml de NaClO, 10 min 27 b T12 30 ml de NaClO, 15 min 30 b *Letras iguais não diferem entre si estatisticamente, pelo Teste de Tukey a 5% de significância. Os fungos encontrados pertencem a sete gêneros, sendo eles: Alternaria spp., Aspergillus sp., Bipolaris sp., Drechslera sp., Fusarium sp., Nigrospora sp., Penicillium sp.. Detectou-se a presença do gênero de bactérias Pectobacterium spp., com incidência de 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

9 9 100% em todos os tratamentos, já entre os fungos verificou-se a maior presença do fungo de armazenamento Penicillium sp., com 26,8% de incidência nas sementes. Observou-se que a assepsia é significante na eliminação de fungos de armazenamento, presentes na parte externa da semente, sendo que a concentração e o tempo não tiveram influência em relação à quantidade de fungos eliminados. Da mesma forma Tambosi & Renner (2010), ressaltam que o hipoclorito de sódio tem grande potencial antimicrobiano, no qual penetra na parece celular dos microrganismos, desativando uma enzima essencial a sobrevivência. Nesse sentido, Muniz et al. (2007), em seus trabalhos verificaram que a ação do NaClO foi acentuada na redução da incidência de fungos, indicando que os mesmos se encontravam localizados na parte externa da semente. Coutinho et al. (2000), ressalta que uma das principais formas de associação em sementes é devido ao fato desses patógenos se localizarem nos tecidos externos, e o tratamento de sementes com hipoclorito de sódio apresenta eficiência na redução dos microrganismos associados superficialmente às mesmas. 4 Conclusão O hipoclorito de sódio é o desinfetante de uso mais difundido nos laboratórios de sementes e fitopatologia, em função dos efeitos positivos na assepsia das sementes. Porém, teve efeito somente aos fungos de armazenamento que encontraram-se aderidos externamente nas sementes de trigo, devido ao fato do produto não conseguir penetrar no interior da semente. Analisando os resultados apresentados no trabalho, concluiu-se que a assepsia com o uso de hipoclorito de sódio foi eficaz nas doses utilizadas a partir de 10 ml e 5 minutos de imersão na solução. O aumento da dose de hipoclorito e do tempo de imersão não 1 Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

10 10 apresentaram resultados que diferem estatisticamente das menores doses e tempos utilizados. Referências bibliográficas ALFENAS, A. C.; MAFIA, R. G. Métodos em Fitopatologia. Viçosa: Editora UFV, AMORIN, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A. Manual de Fitopatologia: princípios e conceitos. 4. ed. Piracicaba: Agronômica Ceres, BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Manual de Análise Sanitária de Sementes. Brasília: Mapa/ACS, BRZEZINSKI, C. R. et al. Análise sanitária de sementes de trigo Disponível em: < Acesso em: 08 abr CASTELLANI, E. D.; SILVA, A.; MODESTO, B.; AGUIAR, I. B. Influência do tratamento químico de fungos e na germinação de sementes de Bauhinia variegata L. var. Variegata. Revista Brasileira de Sementes. Brasília, v.18,n.1, p COUTINHO, W. M.; PEREIRA, L. A. A.; MACHADO, J. C.; FREITAS-SILVA, O. ; PENA, R. C. M.; MAGALHÃES, F.H.L. Efeitos de hipoclorito de sódio na germinação de conídios de alguns fungos transmitidos por sementes. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v.25, n.3, 2000, p Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

11 11 MENTEN, J. O. M. Patógenos em sementes. São Paulo: Ciba Agro, MUNIZ, M. F. B.; MELO E SILVA, L.; BLUME, E. Influência da assepsia e do substrato na qualidade de sementes e mudas de espécies florestais. Revista Brasileira de Sementes. Brasília, vol 29, nº 1, 2007, p PELCZAR JUNIOR, M. J. ; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2.ed. São Paulo: Pearson Makron Books, REIS, E. M.; CASA, R. T. Patologia de sementes de cereais de inverno. Passo Fundo: Aldeia Norte Editora, TAMBOSI, G.; RENNER, G. D. D. Avaliação de métodos de esterilização, concentração de ágar e composição de meio de cultura para propagação in vitro de Pimpinella anisum (Linn.) Apiaceae. Semina: Ciências biológicas e da saúde. Londrina, v. 31, n.2, 2010, p TORRES, A. C. et al. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa,1998. TRIGIANO, R. N.; WINDHAM, M. T.; WINDHAN. A. S. Fitopatologia: conceitos e exercícios de laboratório. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

12 12 ZORATO, M. D. F.; HOMECHIN, M.; HENNING, A.S. Efeitos da assepsia superficial com diferentes agentes químicos na incidência de microrganismos em sementes de soja. Revista Brasileira de Sementes. Brasília, vol. 23, nº 1, 2001,p Acadêmicos do Curso de Agronomia da Faculdade Fitossanidade da Faculdade

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