(54) Título: COMPOSIÇÕES PARA A SUB- (57) Resumo: "COMPOSIÇÕES PARA A SUB-REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CCR5 E MÉTODOS PARA SEU USO".

Transcrição

1 (11) (21) PI A (22) Data de Depósito: 17/05/2004 (43) Data de Publicação: 01/08/2006 República Federativa do Brasil (RPI 1856) Ministério do Desenvolvimento, Indústria e do Comércio Exterior Instituto Nacional da Propriedade Industrial (51) Int. C1 7.: A61 K 31/355 A61K 31/35 A61K 31/33 A61 K 31/345 A61K 31/17 A61 K 31/385 A61K 31/70 (54) Título: COMPOSIÇÕES PARA A SUB- (57) Resumo: "COMPOSIÇÕES PARA A SUB-REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CCR5 E MÉTODOS PARA SEU USO". A presente REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CCR5 E invenção refere-se à sub-regulação da expressão do receptor CCR5 de MÉTODOS PARA SEU USO superfície através da manipulação do ciclo celular em linfócitos ativados pela administração de uma composição que interrompe a fase G1 do ciclo (30) Prioridade Unionista: 16/05/2003 US 60/ celular, desta forma reduzindo os sítios receptores para a entrada de HIV em células T, e, assim, os efeitos do HIV. Além disto, é descrita uma (71) Depositante(s): University Of Maryland Biotechnology Institute composição que inclui um agente de interrupção da fase G1 e um agente (US) antiviral, onde a combinação aumenta de forma sinérgica a atividade do agente antiviral. (72) Inventor(es): Redfield, Robert, R., Amoroso, Anthony, Davis, Charles, E., Heredia, Alonsa (74) Procurador: Magnus Aspeby e Claudio Marcelo Szabas (86) Pedido Internacional: PCT US2004/ de 17/05/2004 (87) Publicação Internacional: WO 2005/ de 06/01/ dr PBMC #1 PBMC #2 PBMC #3 PBMC #4 Lit Sem RAPA RAPA 0,01 nm E RAPA 0,1 nm RAPA 1 nm 0 RAPA 10 nm a RAPA 100 nm

2 ÍrCP g~9-e. Y',"Ç 1/50 jp_r ao'ové-o-z, COMPOSIÇÕES PARA A SUB-REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE CCR5 E MÉTODOS PARA SEU USO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 5 Campo da Invenção A presente invenção refere-se genericamente à subregulação da expressão de CCR5, e mais particularmente, a composições compreendendo pelo menos um agente de interrupção da fase G1 que exibe sub-regulação da expressão 10 do receptor CCR5 de superfície, para tratar doenças humanas nas quais os receptores CCR5 atuam de forma adversa. Antecedentes da Técnica Relativa O vírus da imunodeficiência humana (HIV) tem sido apontado como a causa principal da doença do sistema 15 imunológico lentamente degenerativa chamada de síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). Existem pelo menos dois tipos de HIV distintos: HIV-1 e HIV-2. Em humanos, a replicação do HIV ocorre predominantemente em populações de linfócitos T CD4, e a infecção com HIV leva à depleção 20 deste tipo de célula e eventualmente à incompetência imunológica, a infecções oportunistas, disfunções neurológicas, crescimento neoplástico, e em última análise à morte. O HIV é um retrovírus membro da família dos 25 lentivírus. Retrovírus são pequenos vírus envelopados que contêm um RNA genômico de fita simples, e se replica por meio de um intermediário de DNA produzido por uma transcriptase reversa codificada pelo vírus, que é uma DNA polimerase dependente de RNA.

3 2/50 A partícula viral do HIV compreende um núcleo viral, composto em parte de proteínas capsidiais, em conjunto com o RNA genômico virai e as enzimas necessárias aos eventos de replicação iniciais. A proteína miristilada gag forma 5 uma cápsula externa em torno do núcleo viral, a qual é, por sua vez, circundada por um envelope de membrana lipídica derivado da membrana da célula infectada. As glicoproteínas da superfície do envelope do HIV são sintetizadas como um precursor protéico único de kilodaltons, o qual é clivado por uma protease celular durante a gemulação viral em duas glicoproteínas, gp41 e gp120. A gp41 é uma glicoproteína transmembrana e a gp120 é uma glicoproteína extracelular que permanece não covalentemente associada à gp41, possivelmente em uma forma --15 trimérica ou multimérica. O HIV é direcionado para células CD4 porque uma proteína (CD4) de superfície de célula CD4 atua como receptor celular para o vírus HIV-1. A entrada viral nas células depende da gp120 ligar-se a moléculas receptoras de 20 CD4 celulares, o que explica o tropismo do HIV para células CD4, enquanto que a gp41 ancora o complexo glicoprotéico do envelope na membrana viral. O CCR5 serve como co-receptor para a infecção de células CD4 por cepas de HIV-1 não indutoras de sincício (NSI). 25 A expressão do receptor CCR5 em células T é dependente do estado de ativação das células. Linfócitos em repouso não expressam CCR5, no entanto, por ativação, o CCR5 é expresso. A importância do CCR5 para a transmissão inicial do HIV-1 é enfatizada pelo fato de que indivíduos 30 que não expressam CCR5 (o genótipo homozigoto CCR5-á32)

4 3/50 usualmente são resistentes a infecção (Liu, et al., 1996). Em adição, estudos recentes mostram que a densidade da superfície celular está correlacionada com a progressão da doença em indivíduos infectados (Lin, et al., 2002). 5 Descobriu-se que outros distúrbios e a progressão dos efeitos estão relacionados à expressão do receptor CCR5. Por exemplo, a rejeição a aloenxerto ocorre como resultado do extravasamento do recipiente de células mononucleares para o aloenxerto, um processo que é mediado pela expressão lo de CCR5 nas células mononucleares infiltrantes. Estudos sobre asma que utilizam modelos murinos de doença alérgica das vias aéreas mostraram que o CCR5 provavelmente representa um papel importante em inflamações das vias aéreas. Além disto, a artrite rematóide é caracterizada pela infiltração da membrana sinovial com células mononucleares e o CCR5 parece ter uma atuação devido aos altos níveis de expressão de CCR5 encontrados em linfócitos infiltrados. É interessante que células mononucleares presentes nas placas desmielinizantes ativas 20 características de indivíduos sofrendo de esclerose múltipla também mostrem altos níveis de expressão de CCR5. Desta forma, seria vantajoso se identificar compostos que reduzam ou inibam a expressão dos receptores de superfície CCR5 em células mononucleares, e administrar-se 25 tais compostos para tratar distúrbios relacionados à expressão de receptores de superfície CCR5. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à sub-regulação da expressão do receptor CCR5 de superfície através da 30 manipulação do ciclo celular em linfócitos ativados pela

5 administração de uma composição que interrompe a fase G1 do ciclo celular, pelo que é rompida a resposta de um linfócito à IL-2 (através de IL-2R) que governa a transição da fase G1 para a fase S, bem como a progressão até a fase 5 S. A redução da expressão de CCR5 reduz os sítios receptores para entrada do HIV nas células T, e assim, os efeitos da progressão do HIV. Em um aspecto, a presente invenção refere-se à supressão da transcrição de CCR5, de forma a reduzir a lo expressão de receptores CCR5 de superfície, desta forma provocando um acúmulo de quimiocinas ao nível celular. 'Este acúmulo de quimiocinas é devido ao número reduzido de receptores CCR5 de superfície para a captação de quimiocina/ligante Em_um outro aspecto, a presente inven ção refere-se à supressão da transcrição de CCR5, de forma a reduzir a expressão de receptores CCR5 de superfície, provocando desta forma um número reduzido de receptores de superfície para a ligação da gp120 de HIV, o que, por sua vez, evita 20 ou reduz a replicação do HIV. Em um outro aspecto, a. presente invenção refere-se a composições que inibem a entrada viral de HIV mediada por CCR5 pela redução do número de receptores CCR5 de superfície expressos em células mononucleares incluindo, 25 mas não se limitando a, células T, células T ativadas e macrófagos. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo um agente de interrupção da fase G1 que retarda a entrada na fase S em um ciclo celular de 30 célula mononuclear, em que o agente de interrupção da fase

6 Gi rompe os sinais que ocorrem após a ligação de IL-2 ao receptor de IL-2 (IL-2R) na superfície celular e, desta forma, suprime a expressão de CCR5 que é dependente da sinalização por meio do receptor de IL-2. 5 Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para inibir a entrada viral mediada por CCR5, a saber, a sub-regulação da expressão da proteína CCR5 pela droga imunomoduladora rapamicina (RAPA). RAPA, um macrolídeo bacteriano que está atualmente aprovado para o 10 tratamento de rejeição a transplante renal, exerce uma atividade citostática em células T pelo rompimento d eventos moleculares resultantes da ligação de IL-2 ao receptor de 11-2 (Sehgal, S.N., 1998). O agente modulador de ciclo celular Gi pode incluir 1 15_qualquer composto que interrompa ou prolongue a fase Gi no ciclo celular de células mononucleares, por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, butirato de sódio, afidicolina, hidroxiuréia (HU), olomoucina, roscovitina, tocoferóis, incluindo alfa-tocoferol, beta-tocoferol, D- 20 alfa-tocoferol, delta-tocoferol, gama-tocoferol, tocotrienóis, rapamicina (RAPA) e análogos funcionais ou derivados destes. As composições da presente invenção podem compreender adicionalmente pelo menos um agente antiviral. O agente 25 antiviral pode incluir aualauer agente aue iniba a entrada de um vírus infeccioso em uma célula ou a replicacão deste na célula, e especificamente retrovírus, tais como o vírus HIV. Os agentes antivirais incluem, mas não se limitam a, inibidores de nucieosideo RT, inibidores/antaaonistas de

7 CCR5, inibidores de entrada viral e seus análogos funcionais. Assim, em um aspecto as composições e métodos da presente invenção compreendem adicionalmente uma quantidade 5 terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente antiviral, incluindo, mas não se limitando a: inibidores de nucleosídeo RT, tais como zidovudina (ZDV, AZT), lamivudina (3TC), estavudina (d4t), didanosina (ddl), zalcitabina (ddc), abacavir (ABC), emirivine (FTC), tenofovir (TDF), 10 delaviradine (DLV), efavirenz (EFV), nevirapina (NVP), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), indinavir (IDV), nelfinavir (NFV), amprenavir (APV), lopinavir (LPV), atazanavir, combivir (ZDV/3TC), kaletra (RTV/LPV), trizivir (ZDV/3TC/ABC); inibidores/antagonistas de CCR5, tais como 15 SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857, anticorpos monoclonais; inibidores de entrada virai, tais como Fuzeon (T-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK- 220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857; e análogos ou 20 equivalentes funcionais destes. Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para aumentar a eficácia de TAK-779 e reduzir o número de receptores CCR5 de superfície em uma célula T ativada, o método compreendendo: 25 - a administração de uma composição compreendendo: a) TAK-779 em uma quantidade determinada como efetiva para antagonizar os receptores CCR5 e b) um agente de interrupção de fase Gl em uma quantidade efetiva para reduzir a expressão de CCR5, pelo que a inclusão do agente 30 de interrupção da fase G1 na composição aumenta a eficácia

8 7/50 do TAK-779. Preferivelmente, o agente de interrupção da fase Gl é RAPA ou HU e a eficácia é aumentada sinergicamente. Em ainda um outro aspecto, a presente invenção 5 refere-se a um método para combater uma infecção viral em que o receptor CCR5 de superfície representa um papel adverso, que compreende: - a administração a um paciente de uma composição compreendendo uma quantidade efetiva de um composto que 10 interrompe da fase G1 para reduzir a expressão de receptores CCR5 de superfície. Em ainda um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para manter o controle viral durável de HIV, o método compreendendo: 15 - a administração de pelo menos um agente antiviral e um composto que interrompe a fase Gi em uma quantidade terapeuticamente efetiva para reduzir a expressão de receptores CCR5, reduzindo desta forma a ligação da gp120 de HIV. 20 O agente antiviral pode ser qualquer inibidor da entrada de HIV, tal como TAK-799 ou SCH-C, ambos os quais bloqueiam a ligação viral aos receptores CCR5. Mostrou-se que a resistência viral a estas moléculas antagonistas de CCR5 resulta de uma utilização mais eficiente do CCR5 pelo 25 vírus (Trkola et al., 2002). O fato dos vírus HIV-1 serem resistentes a bloqueadores de CCR5, ainda assim dependentes dos receptores CCR5, sugere que uma redução em CCR5 irá interferir no crescimento e emergência de variantes resistentes do vírus, aumentando desta forma a durabilidade 30 antiviral da terapia com inibidor de entrada.

9 8/50 Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um método terapêutico para reduzir os efeitos e replicação do HIV em um indivíduo infectado com HIV, o método compreendendo a administração de um agente de interrupção 5 da fase G1 em combinação com o antagonista de CCR5 TAK-779 para aumentar a eficácia do TAK-779 e uma redução da expressão de CCR5. Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a um método para prevenir HIV em um indivíduo 10 potencialmente exposto ao HIV, o método compreendendo: - a administração ao indivíduo de pelo menos um composto de interrupção da fase G1 em uma quantidade efetiva para reduzir a transcrição de receptores CCR5 de superfície, inibindo desta forma a entrada viral de HIV no 15 indivíduo. Outras características e vantagens da invenção ficarão claras a partir da descrição detalhada, desenhos e reivindicações a seguir. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 20 A Figura 1 mostra o efeito da RAPA sobre a proliferação de PBMCs e a redução da proliferação foi perceptível a valores maiores que 1 nm de RAPA. As Figuras 2A-D mostram a efetividade da RAPA em subregular a expressão de CCR5 em células T e monócitos; a 25 Figura 2A mostra a detecção específica da expressão de CCR5 de superfície em células CD4 + T, de um doador normal, mas não em células CDV. T de um indivíduo homozigoto para a mutação A32 no gene de CCR5; a Figura 2B mostra a subregulação da expressão de CCR5 de superfície em células 30 CD4 + T por RAPA em PBMCs que foram cultivadas por 7 dias na

10 9/50 presença de IL-2 e RAPA e então ensaiadas para níveis de CCR5, onde a expressão de CCR5 em linfócitos CD4 + T é mostrada como uma linha sólida, e a fluorescência devida ao isotipo IgG de controle é mostrada como uma linha 5 tracejada; a Figura 2C mostra a inibição da transcrição de mrna de CCR5 em PBMCs por RAPA. O RNA total foi isolado de PBMCs que foram cultivadas na presença de IL-2 e RAPA por 7 dias (células do mesmo experimento mostrado em 2B). Quantidades equivalentes de RNA foram submetidas a RT-PCR 10 utilizando pares de iniciadores para a amplificação do mrna de CCR5 (Superior) e RNA ribossômico 18S (Inferior); a Figura 2D mostra que RAPA sub-regula a expressão de CCR5 de superfície celular na maturação de monócitos que foram cultivados por 5 dias na presença de RPMI 20/10% ABRS e 15 RAPA, que foram duplamente imuno-rotulados para CD14 e CCR5. As alterações na expressão de CCR5 de superfície foram examinadas em células ativadas por CD14. O perfil de imunofluorescência obtido com o anti-ccr5 mab 182 (linha sólida) é comparado com o do isotipo IgG2b de controle 20 (linha tracejada). Os resultados em 2B e 2C são representativos dos dados obtidos em PBMCs de cinco doadores diferentes. Os resultados em 2D são representativos de perfis similares obtidos em três doadores diferentes. 25 As Figuras 3A e 3B mostram que a RAPA aumenta os níveis de quimiocina p extracelular em culturas de PBMC. A Figura 3A mostra os resultados de PBMCs doadoras que foram cultivadas na presença de IL-2 e RAPA por 10 dias, momento em que os sobrenadantes foram avaliados para o teor de 30 quimiocina p por ELISA e as células foram rotuladas para a

11 10/50 expressão de CCR5. A percentagem de linfócitos CD4 expressando CCR5 a cada concentração de RAPA é indicada. Os resultados mostrados em dois doadores são representativos de quatro experimentos utilizando quatro 5 diferentes doadores. * P < 0,01; #, P < 0,05, em comparação com controle não tratado pelo teste t de Student; a Figura 3B mostra o efeito da RAPA sobre os níveis extracelulares de MIP-1(3 em culturas de PBMCs isentas de CCR5. Os níveis de proteína MIP-113 na presença 10 e ausência de RAPA foram determinados em sobrenadantes de PBMCs de um doador normal estimuladas com IL-2 e de um doador homozigoto para a mutação 632 no gene de CCR5. Os valores foram obtidos no dia 10 de cultura e são médias ± DP de poços duplicados. 15_ A Figura 4 mostra a inibição por RAPA da replicação de HIV-1 em PBMCs, e que a atividade antiviral em HIV-1 R5 é maior que em HIV-1 X4. A Figura 4A mostra os resultados de um a replicação em um período de teste de sete dias em que PBMCs tratadas com RAPA foram infectadas com HIV-1 IIIb 20 ou HIV-1 ADA. As células infectadas foram cultivadas na presença da droga RAPA por 7 dias, tempo em que a replicação do vírus foi determinada por p24 e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT. Os resultados (média ± DP de poços triplicados) são representativos de 25 sete experimentos independentes, cada um em células de um doador diferente; a Figura 4B mostra os efeitos sobre estoques de PBMCs tratados com DNAse infectadas com HIV-1 IIIb e HIV-1 ADA quando tratados com ou sem RAPA 100 nm. As seqüências de DNA de HIV-1 foram amplificadas por PCR em 30 lisados celulares preparados 24 horas após a infecção. Os

12 11/50 produtos amplificados por PCR foram detectados com uma sonda radioativa. "+" indica a presença de RAPA na cultura de PBMC antes e após a infecção; "-" indica sem tratamento com RAPA. A amplificação de seqüências de f3-actina 5 indicaram alguma quantidade de DNA celular entre os diferentes lisados celulares (dados não mostrados). significa controle negativo de PCR; a Figura 4C mostra a atividade antiviral de baixas concentrações de RAPA quando investigada em um painel de cepas R5 de HIV-1. A 10 proliferação celular foi ensaiada em células não infectadas do mesmo doador cultivadas sob as mesmas condições. Os resultados (média ± DP de poços triplicados) são representativos de três experimentos independentes, cada um em diferentes células doadoras. 15 _ A Figura 5 mostra_que a RAPA inibe a replicação de HIV-1 em MDMs. Monócitos purificados foram cultivados por 5 dias na presença de RAPA. No dia 5, as células foram infectadas com HIV-1 ADA e cultivadas na presença de RAPA por mais 14 dias. Nos dias 7, 10 e 14 após a infecção, o 20 crescimento viral foi determinado pelo ensaio RT. No dia 14, a viabilidade celular foi determinada por MTT. Os resultados (média ± DP) são representativos de dados obtidos em três experimentos independentes, cada um utilizando células de um doador diferente. 25 A Figura 6 mostra que a RAPA aumenta a atividade antiviral do antagonista de CCR5 TAK-779. PBMCs que foram cultivadas na ausência ou presença de RAPA (1, 10 e 100 nm) por 7 dias foram infectadas com HIV-1 ADA na presença de TAK-779 0,1 nm. As células infectadas foram cultivadas na 30 presença de RAPA e TAK-779 0,1 nm. NO dia 7 após a NC

13 12/50 infecção, a produção de vírus foi determinada pelo ensaio p24 no sobrenadante da cultura. Note-se a escala logarítmica no eixo y. Os dados representam médias ± DP de poços triplicados. São mostrados os resultados 5 representativos obtidos em um de três experimentos independentes. A Figura 7 mostra que a HU aumenta a atividade antiviral do antagonista de CCR5 TAK-779. PBMCs que foram cultivadas na ausência ou presença de HU por 7 dias foram 10 infectadas com HIV-1 ADA na presença ou ausência de TAK No dia 7 após a infecção, a produção de vírus foi determinada pelo ensaio p24 no sobrenadante da cultura. As Figuras 8A-B mostram a efetividade da HU em subregular a expressão de CCR5 em células T e monócitos; a 15 Figura 8A mostra a sub-regulação da expressão de CCR5 de superfície em células CD4 + T por HU em PBMCs que foram cultivadas por 7 dias na presença de IL-2 e HU e então ensaiadas para os níveis de CCR5, onde a expressão de CCR5 em linfócitos CD4 + T é mostrada como uma linha sólida, e a 20 fluorescência devida ao isotipo IgG de controle é mostrada como uma linha tracejada; a Figura 8B mostra a inibição da transcrição de mrna de CCR5 em PBMCs por HU. O RNA total foi isolado de PBMCs que foram cultivadas na presença de LI-2 e HU por 7 dias (células do mesmo experimento mostrado 25 em 8A). Quantidades equivalentes de RNA foram submetidas a RT-PCR utilizando pares de iniciadores específicos para a amplificação de mrna de CCR5 (Superior) e RNA ribossômico 18S (Inferior). A Figura 9 mostra alterações na linha de base de mrna 30 de CCR5 como uma medida da expressão de CCR5. Os valores

14 13/50 são normalizados para o gene constitutivo celular de beta actina. São observadas diferenças a partir da linha de base (dia O) em escala log. Os pontos no tempo testados foram os dias 7, 14 e 28 em RAPA e então os dias 42, 2 5 semanas após a descontinuação da RAPA. DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES PREFERIDAS Método para o tratamento de uma infecção viral inclui aqui tratamento "profilático" ou tratamento "terapêutico". Um tratamento "profilático" é um tratamento administrado a 10 um indivíduo que não apresenta sinais de uma doença ou que apresenta sinais iniciais da doença, para o propósito de reduzir o risco do desenvolvimento da patologia associada à doença. O termo "terapêutico" conforme utilizado aqui, 15_ significa um tratamento administrado a um indivíduo que apresenta sinais da patologia, para o propósito de reduzir ou eliminar estes sinais. O termo "quantidade terapeuticamente efetiva", conforme utilizado aqui, significa uma quantidade do 20 composto que é suficiente para prover um efeito benéfico ao indivíduo ao qual o composto é administrado. Um efeito benéfico significa tornar o vírus incompetente para replicação, inibição da replicação viral, inibição da infecção de uma outra célula hospedeira, ou aumento da 25 contagem de célula CD4 T, por exemplo. O termo "uma célula viralmente afetada", conforme utilizado aqui, significa uma célula na qual o vírus está presente e é infecciosa ou potencialmente infecciosa e inclui células epiteliais, células do sistema nervoso,

15 linfócitos T (ativados ou em repouso), macrófagos, monócitos, células dendríticas tissulares ou semelhantes. O termo "equivalente funcional", conforme utilizado aqui, significa que o agente apresenta algumas ou todas as 5 atividades biológicas do composto correspondente. O termo "análogo funcional", conforme utilizado aqui, significa compostos derivados de um composto parental particular por substituição direta que não resulte em uma perda substancial (por exemplo, mais de 100x) da atividade lo biológica do composto parental, onde tais substituições são modificações bem conhecidas dos especialistas na técnica, por exemplo, esterificação, substituição de hidrogênio por halogênio, substituição de alcoxi por alquil, substituição de alquil por alcoxi, etc. 15 A Invenção: Compostos de interrupção da fase G1 As composições da presente invenção podem incluir qualquer agente de interrupção da fase G1 que interrompa, retarde ou prolongue a atividade do ciclo celular na fase 20 G1 e/ou interface Gl-S de células mononucleares e reduza a expressão de CCR5. Preferivelmente, o agente de interrupção da fase G1 rompe a resposta de um linfócito a IL-2 (através de IL-2R) que governa a transição da fase G1 para a fase S, bem como a progressão através da fase S. 25 Os agentes de interrupção da fase G1 podem incluir, não se limitando a, butirato de sódio, afidicolina, hidroxiuréia (HU), olomoucina, roscovitina, tocoferóis, tocotrienóis, rapamicina (RAPA) e/ou análogos funcionais destes. Preferivelmente, a composição compreende 30 rapamicina a qual inibe a resposta de célula T a IL-2, a

16 15/50 substância que se orienta para células T já ativada pelo TCR para progredir através da fase Gl. A rapamicina, desta forma, interrompe a célula na transição Gl-S. Mais preferivelmente, a composição compreende uma quantidade 5 efetiva de RAPA para romper a resposta de um linfócito a IL-2 (através de IL-2R) que governa a transição da fase gi para a fase S, provocando desta forma a redução da expressão de CCR5 e concomitantemente reduzindo os sítios receptores para a entrada de HIV. 10 A presente invenção emprega um dos compostos de interrupção da fase G1 identificados acima para a administração a um indivíduo sofrendo de uma infecção virai, onde o composto prolonga a fase G1 do ciclo celular de um linfócito ativado, inibindo desta forma a expressão 15 dos receptores_ccr5 e reduzindo os sítios de ligação para os ligantes de gp120 do HIV. Composições Farmacêuticas A presente invenção provê composições compreendendo pelo menos um composto de interrupção da fase G1 e 20 opcionalmente pelo menos um agente antiviral, bem como métodos para a prevenção, tratamento e/ou redução dos efeitos do HIV. Os métodos compreendem a administração das ditas composições compreendendo o composto de interrupção da fase G1 e opcionalmente agentes antivirais, onde os dois 25 compostos podem ser administrados separadamente, simultaneamente, concorrentemente ou seqüencialmente. Derivados e Sais Farmaceuticamente Aceitáveis O termo "derivado farmaceuticamente aceitável" é utilizado para indicar qualquer sal, éster ou sal de tal 30 éster farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável de

17 16 /50 um composto de acordo com a invenção, ou qualquer composto que, por administração a um receptor, é capaz de prover (direta ou indiretamente) um ou mais dos compostos de acordo com a invenção, ou um metabólito ou resíduo 5 antiviralmente ativo destes. Ésteres preferidos dos compostos de interrupção da fase G1 da invenção incluem ésteres de ácido carboxílico nos quais a parte não carbonil do grupamento éster é selecionada de cadeia alquílica reta ou ramificada, por 3.0 exemplo, n-propil, t-butil, n-butil, alcoxialquil (por exemplo, metoximetil), aralquil (por exemplo, benzil), ariloxialquil (por exemplo, fenoximetil), aril (por exemplo, fenil opcionalmente substituído por halogênio, alquil C1-4 ou alcoxi C1-4 ou amino); ésteres sulfonato tais 15 =MD _ alquil- ou aralquilsulfonil (por exemplo, metanosulfonil); ésteres de amino adição (por exemplo, L- valil ou L-isoleucil); e ésteres mono, di ou trifosfato. Os ésteres fosfato podem ser adicionalmente esterificados por, por exemplo, um álcool C 1 _ 20 ou um derivado reativo 20 deste, ou por um 2,3-diacilglicerol C2.4. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, sem limitação, sais de ácidos carboxílicos orgânicos tais como ácidos acético, lático, tartárico, málico, isotiônico, lactobiônico, p-aminobenzóico e succínico; ácidos 25 sulfônicos orgânicos tais como ácidos, metanosulfônico, etanosulfônico, benzenosulfônico e p-toluenosulfônico e sais de adição ácidos inorgânicos tais como ácidos clorídrico, sulfúrico fosfórico e sulfúrico. 30

18 Compostos Antivirais Em um aspecto, as composições e métodos da presente invenção compreendendo adicionalmente uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos um agente antiviral, 5 incluindo, mas não se limitando a, inibidores de nucleosídeo RT, inibidores/antagonistas de CCR5, inibidores de entrada viral e análogos funcionais destes. Preferivelmente, o agente antiviral compreende inibidores do nucleosídeo RT tais como zidovudina (ZDV, 10 AZT), lamivudina (3TC), estavudina (d4t), didanosina (ddl), zalcitabina (ddc), abacavir (ABC), emirivine (FTC), tenofovir (TDF), delaviradine (DLV), efavirenz (EFV), nevirapina (NVP), saquinavir (SQV), ritonavir (RTV), indinavir (IDV), nelfinavir (NFV), amprenavir (APV), 15 lopinavir (LPV),, atazanavir, combivir (ZDV/3TC), kaletra (RTV/LPV), trizivir (ZDV/3TC/ABC); inibidores/antagonistas de CCR5, tais como SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857, anticorpos monoclonais; inibidores de entrada viral, tais como Fuzeon 20 (T-20), NB-2, NB-64, T-649, T-1249, SCH-C, SCH-D, PRO 140, TAK 779, TAK-220, análogos de RANTES, AK602, UK-427, 857; e análogos funcionais destes. Terapia Antiviral Embora o tratamento atual com terapia antiretroviral 25 (ARV) cause a supressão da replicação do HIV e resulte no aumento da função imunológica, este é limitado pelos altos custos, toxidez e dificuldades de adesão. Além disto, a probabilidade de se obter um controle de longo prazo da infecção por HIV com terapia antiretroviral apenas parece 30 muito improvável. Até o momento, a terapia antiretroviral

19 18/50 mostrou-se insuficiente para erradicar completamente o HIV de indivíduos infectados e não existe qualquer dado real de que a quantidade de vírus residual se reduza com o tempo com terapia antiretroviral típica. Além disto, após a 5 interrupção da terapia antiretroviral, a carga viral pode voltar para níveis mais altos que as cargas virais antes do tratamento (Davey, 1999; Dybul et al, 2002 e 2001). A terapia antiretroviral requer adesão rígida aos regimes de dosagem complexos. A taxa de falha virológica io durante um período de 6 meses foi demonstrada como sendo de até 60% em pacientes que não podem atingir uma adesão maior que 95%. A combinação de efeitos colaterais múltiplos associados com a terapia antiretroviral e a disponibilidade deste tratamento a apenas 1 em 20 das estimadas 33 milhões 15 de pessoas _infectadas em todo o mundo motivaram a reconsideração das estratégias atuais para se atingir o objetivo da terapia contra o HIV. Além disto, a terapia contra HIV é atualmente vista como um processo perene. Por esta razão, é crucial o 20 desenvolvimento de tratamentos efetivos que possam ser administrados com sucesso por longos períodos de tempo para a supressão de retrovírus, e em particular, a prevenção e/ou inibição de HIV. Além disto, é desejável eliminar-se, ou pelo menos se minimizar, a citotoxidez associada com a 25 administração de agentes antivirais determinados como sendo efetivos. É em geral reconhecido que a toxidez de um agente antiviral pode ser evitada ou pelo menos minimizada pela administração de uma dose reduzida do agente antiviral; no entanto, reconhece-se também que a

20 19 / 5 O efetividade de um agente antiviral em geral é reduzida conforme a dose é reduzida. Desta forma, uma realização da presente invenção provê a redução da dose de agentes antivirais enquanto que 5 mantendo ou reduzindo a carga viral pela utilização de terapia cíclica e introdução de agentes do ciclo celular G1 da presente invenção a um regime de dosagem para um indivíduo infectado com HIV. Especificamente, a utilização de compostos de interrupção da fase G1 em combinação com 10 agentes antivirais se mostrou promissora em manter a supressão viral em um programa de dosagem de terapia de ciclo. Pela utilização de 50% menos medicação, mostrou-se uma redução dos efeitos colaterais associados com a utilização de antiretroviral e a adesão mostrou-se 15._ aumentada.. O outro impacto óbvio é no custo total de medicamentos, o que irá facilitar a expansão destas drogas por todo o mundo desenvolvido. Desta forma, em uma realização da presente invenção, é empregada terapia cíclica como uma abordagem alternativa 20 desenvolvida para aumentar a atividade de agentes antivirais, reduzir o custo e toxidez da droga. Além disto, uma vez que um componente das composições da presente invenção é direcionado para o maquinário celular do hospedeiro, em vez de para o vírus, os presentes 25 inventores supõem que a resistência viral a esta combinação de drogas essencialmente não ocorrerá. Um regime de terapia antiviral cíclica pode ser realizada por cerca de 12 semanas e então é adicionado ou substituído um composto de interrupção da fase G1 por 30 quatro semanas. Se a carga viral permanece baixa ou

21 20/50 aproximadamente constante, os ciclos podem ser alterados para reduzir o período de tempo de cada ciclo. O período de tempo para o consumo das drogas antivirais pode ser reduzido, se aumentado com um composto de interrupção da 5 fase Gl. Além disto, pode ser introduzido um período de tempo que não inclui quaisquer drogas antivirais e apenas um composto de interrupção da fase Gi. Este período de tempo em que não são consumidos agentes antivirais pelo indivíduo, provê ao sistema biológico do indivíduo tempo 10 suficiente para se recompor ou compensar os efeitos tóxicos do composto antiviral. Além disto, as composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados para tratar infecções virais por HIV pela redução da carga viral e replicação do vírus 15 pela redução dos sítios de ligação para os ligantes da gp120. As doses a serem administradas são variáveis de acordo com o agente de interrupção da fase Gl, o agente antiviral, o período de tratamento, freqüência de 20 administração, o hospedeiro, e a natureza e severidade da infecção. A dose pode ser determinada por um especialista na técnica sem a necessidade de experimentações excessivas. As composições da invenção são administradas em doses de concentrações substancialmente não tóxicas, de maneira a 25 se assegurar a liberação de uma unidade de dosagem suficiente da presente combinação no paciente para prover a inibição desejada do vírus HIV. A dosagem real administrada será determinada por fatores físicos e fisiológicos tais como idade, peso corporal, severidade da 30 condição, e/ou histórico clínico do paciente. Os

22 componentes antivirais ativos idealmente são administrados de maneira a se obter concentrações plasmáticas in vivo de um agente antiviral de cerca de 0,01 pm a cerca de 100 pm, mais preferivelmente de cerca de 0,1 a 10 pm, e mais 5 preferivelmente de cerca de 1-5 pm, e um agente de interrupção da fase G1 de cerca de 1 pm a 25 pm, mais preferivelmente de cerca de 2-20 pm, e mais preferivelmente de cerca de 5-10 pm. Por exemplo, no tratamento de pacientes HIV positivos 10 e aidéticos, os métodos da presente invenção podem utilizar composições para prover de cerca de 0, mg/kg de peso corporal/dia de um agente antiviral, mais preferivelmente de cerca de 0,1-200 mg/kg de peso corporal/dia, e mais preferivelmente 1,50 mg/kg de peso corporal/dia; e de cerca de 0, mg/kg de peso corporal/dia de um agente de interrupção da fase Gl, mais preferivelmente de cerca de 0, mg/kg de peso corporal/dia, ou mais preferivelmente de cerca de 0,5-50 mg/kg de peso corporal/dia. Dosagens unitárias particulares de um agente 20 de interrupção da fase G1 e um agente antiviral da presente invenção incluem quantidades de 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg e 1000 mg, por exemplo, formuladas separadamente ou em conjunto conforme discutido abaixo. Deve ser entendido, entretanto, que os níveis de 25 dosagem que se desviam das faixas providas podem também ser adequados no tratamento de uma dada infecção viral. A eficácia terapêutica dos compostos de interrupção da fase G1 pode ser determinada por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou experimentos 30 animais, por exemplo, determinando-se a LD 50 (a dose letal

23 22/50 para 50% da população) e a ED 50 (dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A razão de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser expresso como a razão LD 50 /ED 50. São preferidos 5 compostos que exibem índices terapêuticos altos. Os dados obtidos dos ensaios de cultura celular e estudos em animais podem ser utilizados para a formulação de uma variedade de dosagens para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos fica preferivelmente dentro de uma faixa de 10 concentrações circulantes que inclui a ED 50 com pouca ou nenhuma toxidez. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada. Para cada composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente efetiva pode _ser estimada inicialmente a partir dos ensaios de cultura celular. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para se obter uma faixa de concentração plasmática circulante que inclui a IC 50 (isto é, a concentração do composto de teste que obtém uma inibição dos sintomas 20 metade da máxima) conforme determinada na cultura celular. Tais informações podem ser utilizadas para se determinar de forma mais precisa as doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta performance. 25 A dose desejada é preferivelmente apresentada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais sub-doses administradas a intervalos apropriados durante o dia. Estas sub-doses podem ser administradas na forma de dosagem unitária, por exemplo, contendo 0,01 a 1000 mg, 30 preferivelmente 1 mg a 50 mg, dependendo do número de sub-

24 23/50 doses, do composto de interrupção da fase G1 por forma de dosagem unitária. Enquanto sendo possível o composto de interrupção da fase G1 específico e agente antiviral serem administrados 5 individualmente, seqüencialmente ou simultaneamente, é preferível que sejam apresentados juntos, combinados em uma composição farmacêutica. As composições da presente invenção podem compreender os ingredientes discutidos acima, em conjunto com um ou 10 mais veículos aceitáveis destes e opcionalmente outros agentes terapêuticos. Cada veículo deve ser "farmaceuticamente aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não causem qualquer dano ao indivíduo. 15 A presente invenção provê um método para o tratamento ou profilaxia de uma infecção viral tal como infecções por retrovírus, a qual pode ser tratada ou prevenida de acordo com a invenção, incluindo infecções retrovirais humanas tais como a com o vírus da imunodeficiência humana. Os 20 compostos de interrupção da fase G1 específicos, composições e métodos de acordo com a invenção são especificamente utilizados para o tratamento de AIDS e condições HIV positivas relacionadas. Os compostos da presente invenção são úteis também para o tratamento de 25 infecções ou doenças assintomáticas em humanos causadas por ou associadas a retrovírus humanos. As composições terapêuticas de acordo com a presente invenção podem ser empregadas em combinação com outros agentes terapêuticos para o tratamento de infecções virais 30 que são efetivos para o tratamento de infecções virais ou

25 24/50 condições associadas tais como agentes imunomoduladores tais como timosina, inibidores de ribonucleotídeo redutase tais como 2-acetilpiridina-5-[(2-cloroanilino)tiocarbonilltiocarbonilhidrazona, interferons tais como alfa- 5 interferon, 1-beta-D-arabinofuranosil-5-(1-propinil)uracil, ribavirina e ácido fosfonofórmico. Rotas de Administração As composições de acordo com a presente invenção 10 podem ser administradas para terapia por qualquer rota adequada incluindo oral, retal, nasal, tópica (incluindo transdérmica, bucal e sublingual), vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Deve ser observado que a rota preferida irá 15 variar com a condição e idade do receptor, a natureza da infecção e do ingrediente atiço escolhido, As formulações farmacêuticas da presente invenção incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, tópica (incluindo transdérmica, bucal e sublingual), 20 vaginal ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). As formulações podem convenientemente ser apresentadas na forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica farmacêutica. 25 Tais métodos incluem a etapa de associar o composto de interrupção da fase G1 e opcionalmente um agente antiviral com o veículo. O veículo opcionalmente compreende um ou mais ingredientes assessórios. Em geral, as formulações são preparadas associando-se uniformemente e intimamente os 30 ingredientes separados com os veículos líquidos ou veículos

26 sólidos finamente divididos ou ambos, e então se necessário dar uma forma ou produto. As composições adequadas para administração transdérmica podem ser apresentadas como emplastros 5 individuais adaptados para permanecer em contato íntimo com a epiderme do receptor por um período de tempo prolongado. Tais emplastros contêm adequadamente o composto de interrupção da fase G1 e opcionalmente um agente antiviral tal como um antagonista de CCRS: 1) em uma solução aquosa io opcionalmente tamponada; ou 2) dissolvidos e/ou dispersos em um adesivo; ou 3) dispersos em um polímero. As formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades individuais tais como cápsulas, sachês ou tabletes, cada um contendo uma_quantidade predeterminada dos ingredientes; como pós ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso; ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou uma emulsão líquida água-em-óleo. Um tablete pode ser cbtido pela compressão ou 20 moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes assessórios. Os tabletes comprimidos podem ser preparados por compressão em uma máquina adequada do composto de interrupção da fase G1 e agente antiviral em uma forma de fluxo livre tal como uni pó ou grânulos, opcionalmente 25 misturados com um li.gante (por exemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulose), lubrificantes, diluentes inertes, preservativos, desintegrantes tensoativos (por exemplo, glicolato de amido sódico, povidona reticulada, carboximetilcelulose sádica reticulada) ou agente 30 dispersante. Tabletes moldados podem ser obtidos moldando-

27 26/50 se em uma máquina adequada uma mistura do composto pulverizado umedecido com um diluente liquido inerte. Os tabletes podem ser opcionalmente revestidos ou entalhados e podem ser formulados de tal forma a prover liberação lenta 5 ou controlada de um ou mais dos ingredientes utilizados, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para prover o perfil de liberação desejado. Os tabletes podem ser opcionalmente providos com um revestimento entérico para prover a liberação em partes do J.o aparelho digestivo outras que não o estômago. Formulações adequadas para administração tópica à boca incluem pastilhas compreendendo um ou mais compostos de interrupção da fase G1 e opcionalmente um agente antiviral em uma base flavorizante, usualmente sacarose ou 15 goma arábica; pastilhas compreendendo um ou mais dos ingredientes em uma base inerte tal como gelatina e glicerina, ou sacarose e goma arábica; e líquidos para limpeza bucal compreendendo um ou mais dos ingredientes em um veículo líquido adequado. 20 Formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada compreendendo, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato. Formulações adequadas para administração vaginal 25 podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações em spray contendo, em adição aos um ou mais compostos da presente invenção, veículos conhecidos na técnica como apropriados. Formulações adequadas para administração parenteral 30 incluem soluções injetáveis estéreis isotônicas aquosas e

28 27/50 não aquosas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor de destino; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de 5 suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes selados de dose unitária ou dose múltipla, por exemplo, ampolas e frascos, e podem ser armazenadas em condições de liofilização requerendo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para 10 injeção, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões injetáveis extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e tabletes estéreis dos tipos previamente descritos. Para um indivíduo perinatal, a combinação de drogas 15 da presente invenção pode ser, por exemplo, administrada oralmente após 36 semanas de gravidez e continuada até o parto. Intervenções em torno do tempo do final da gravidez e do parto (quando a maioria das transmissões acredita-se ocorrerem) são mais eficazes. 20 Adicionalmente às composições descritas previamente, os compostos podem também ser formulados como preparações "depot". Tais formulações de longa ação podem ser administradas por implante (por exemplo, subcutaneamente ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Desta 25 forma, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou em resinas de troca jônica, ou como derivados esparsamente solúveis, por exemplo, como um sal esparsamente solúvel. 30 Outros sistemas de liberação adequados incluem micro-

29 28/50 esferas que oferecem a possibilidade de liberação local não invasiva da droga por um período de tempo prolongado. O composto terapêutico administrado é lentamente liberado a partir destas micro-esferas e absorvidas pelas células 5 tissulares circunvizinhas (por exemplo, células endoteliais). As composições podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador, o qual pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o 10 ingrediente ativo. O pacote pode, por exemplo, compreender uma folha metálica ou plástica, tal como um pacote "blister". O pacote ou dispositivo dispensador pode ser acompanhado por instruções para a administração. Agentes de ciclo celular G1 adequados podem ser 15 utilizados em estratégias de tratamento de HIV que permitam que a supressão viral continuada seja mantida com menor dependência de terapias antiretrovirais (ARV) de combinações. O objetivo atual de uma ARV é obter a supressão viral tão baixa quanto possível pelo maior 20 período de tempo possível. A necessidade de dosagens menos freqüentes ou uma quantidade reduzida de ARV para controlar a supressão viral, focalizam diretamente os problemas, citados abaixo, associados com o alcance dos objetivos atuais da terapia antiretroviral, incluindo: Os regimes atuais de HAART são incômodos e complicados e requerem tolerância sustentada e adesão estrita a 3 ou mais drogas. 2. Firme adesão de longo prazo pode ser impossível para a maioria dos pacientes.

30 29/50 3. Tolerância de longo prazo ao acúmulo de toxidez medicamentosa pode ser impossível para a maioria dos pacientes. 4. As diretrizes dos tratamentos atuais para 5 infecção por HIV recomendam um início relativamente tardio de HAART tendo em vista a incapacidade de erradicar a infecção apenas com HAART e o risco de efeitos colaterais relacionados à droga, incluindo síndromes 10 metabólicas sérias. 5. Alguns pacientes que não foram tratados até estágios tardios da doença apresentarão um nível de carga viral alto, o que poderia aumentar o risco de transmissão e provocar um problema de 15 saúde pública. 6. Por último, a vasta maioria das pessoas infectadas com HIV no mundo não tem acesso às drogas antiretrovirais devido principalmente ao custo. 20 Pela incorporação de agentes de interrupção da fase Gi nas abordagens terapêuticas com o foco alterado no sentido a se manter o controle viral a longo prazo, com regimes menos complexos, menos tóxicos e mais disponíveis, que possam ser aplicáveis em todo o mundo. A presente 25 invenção, que tem por objetivo reduzir a expressão de receptores CCR5 em células T ativadas por meio do ciclo celular de Gi, pode ser utilizada com sucesso para manter a supressão viral em infecção crônica com HIV-1 sem a necessidade de terapia contínua com drogas antiretrovirais 30 múltiplas. Estes resultados têm um impacto positivo sobre

31 30/50 o custo, efeitos colaterais e disponibilidade da terapia contra HIV. A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a seguir que não devem ser entendidos como 5 absolutamente limitantes. A prática da presente invenção irá empregar, a não ser que indicado de outra forma, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de células, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e 10 imunologia, as quais estão dentro do conhecimento da técnica. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2a ed., editado pela Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); 15 "DNA Cloning", volumes I e II (D.N. Glover ed., 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed., 1984); Mullis et al. patente US n ; "Nucleic Acid Hybridization" (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); "Transcription And Translation" (B.D. Hames & S.J. Higgins 20 eds. 1984); "Culture Of Animal Cells" (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); "Immobilized Cells And Enzymes" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); a obra, "Methods In Enzymology" (Academic Press, Inc., N.Y.); "Gene Transfer Vectors For Mammalian 25 Cells" (J.H. Miller e M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); "Methods In Enzymology", vols. 154 e 155 (Wu et a/. eds.), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology" (Mayer e Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, volumes 30 I-IV (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds., 1986);

32 31/50 _ 15 "Manipulating the Mouse Embryo" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). EXEMPLOS Métodos e Materiais 5 Cultura Celular e Citometria de Fluxo: Culturas de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) e macrófagos derivados de monócito (MDMs) foram realizadas em doadores normais conforme descrito (Poli, 1993; Perno, 1993). As PBMCs foram mantidas na presença de unidades/mi de rhil-2 (Roche Molecular Biochemicals). A viabilidade celular foi determinada por rotulagem com azul de Trypan ou pelo ensaio MTT (Roche Molecular Biochemicals). RAPA foi adquirida da Calbiochem. O antagonista de CCR5, TAK-779 foi obtido do Programa de Pesquisa e Reagentes de Referência sobre AIDS do National Institutes of Health (Rockville, MD). A expressão de CCR5 de superfície foi determinada em PBMCs cultivadas na presença de IL-2 por 7-10 dias. A 20 marcação foi realizada como descrito (Lane, 1999), mas utilizando-se CCR5 mab 182 (R & D Systems). A marcação de fundo foi determinada pela adição de um isotipo equiparável de controle (IgG2b, R & D Systems) no lugar do anti-ccr5 mab. Os dados foram obtidos pela utilização de um 25 citômetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences) e analisados pela utilização de FLOWJO (Tree Star, São Carlos, CA). Os níveis das quimiocinas p MIP-la, mip-1p e RANTES foram determinados em sobrenadantes de cultura pela 3o utilização de kits ELISA (R & D Systems).