Avaliação de Bacillus spp. no controle da flor preta do morangueiro, sob condições de laboratório e casa-de-vegetação

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1 Avaliação de Bacillus spp. no controle da flor preta do morangueiro, sob condições de laboratório e casa-de-vegetação Valdionei Giassi 1 ; Katia Cristina Kupper 2 ; Camila Kiritani 3 ; Isabel Cristina Sousa 4 ; Edypol Guilherme Batista 5 1 Biólogo pesquisador do Centro de Pesquisa Mokiti Okada (CPMO) valdionei.giassi@cpmo.org.br; 2 Pesquisadora do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC katia_kupper@hotmail.com; 3 Bióloga do Centro de Pesquisa Mokiti Okada microbiologia@cpmo.org.br; 4 Química do Centro de Pesquisa Mokiti Okada química@cpmo.org.br; 5 Estagiário do Centro de Pesquisa Mokiti Okada edypol_0@hotmail.com RESUMO A Flor Preta, causada por Colletotrichum acutatum, é uma das principais doenças do morangueiro. Os sintomas mais marcantes são manchas escuras e irregulares em frutos, folhas e flores. O controle da doença é feito por fungicidas que nem sempre se mostram eficientes. Assim, a busca por alternativas de controle se faz necessária e o uso de Bacillus spp. se mostra como técnica promissora. Este trabalho teve por objetivo avaliar diferentes isolados de Bacillus spp. no controle da flor-preta, sob condições de laboratório e de casa-de-vegetação. In vitro, avaliou-se a atividade antagônica e o efeito de substâncias antifúngicas termoestáveis sobre a germinação e o desenvolvimento micelial do patógeno, observando-se que todos os isolados de Bacillus spp. afetaram o crescimento da colônia do fungo, sendo que, cinco deles apresentaram inibições entre 32 e 34%, inibindo de 50 a 53% o crescimento da colônia do fungo e afetaram a germinação de conídios entre 86 a 97%. Dos 11 isolados bacterianos submetidos a condições de casa-devegetação, apenas 2 não diferiram do controle, sendo que o isolado CPMO 3 apresentou 5,4% enquanto o tratamento químico 26,99% de flores com sintomas da flor preta diferindo significativamente entre os tratamentos. Palavras chaves: Controle biológico, cultivo pareado, germinação, substâncias antifúngicas INTRODUÇÃO A flor preta do morangueiro (Fragaria xananassa Duch.), causada por Colletotrichum acutatum, ocasiona sérios problemas em todas as regiões de cultivo, sendo limitante para a cultura em virtude de sua natureza devastadora, podendo causar danos durante todo o ciclo, com perdas de até 50% da produção (Almeida et al., 2009). O método mais utilizado para seu controle é o uso de fungicidas, que nem sempre são eficazes, levando a graves problemas, como o surgimento de linhagens do fungo resistentes aos princípios ativos utilizados (Tanaka et al., 1997; Ghini & Kimati, 2000). Pesquisas buscam desenvolver novas técnicas de controle desta doença, entre elas, o controle biológico que se destacada pelo baixo custo e por não acarretar problemas ao ambiente. A utilização de microrganismos antagônicos, como algumas espécies de Bacillus vem se destacando no controle de doenças do filoplano de plantas (Kupper et al. 2009; Batista Júnior et al., 2002). Diante do exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar isolados de Bacillus spp. no controle da flor preta do morangueiro, sob condições de laboratório e de casa-de-vegetação. MATERIAIS E MÉTODOS Os Bacillus spp. utilizados nesse trabalho foram isolados a partir de folhas e frutos do morango proveniente de propriedade particular, localizada em Atibaia SP; e folhas de café de cultivo espontâneo, totalizando 16 isolados. O fungo C. acutatum foi isolado de flores do morango com os sintomas da flor preta. Influência do cultivo pareado de isolados de Bacillus spp. no crescimento micelial de C. acutatum Para avaliar o potencial antagônico dos isolados de Bacillus spp. sobre o crescimento micelial do C. acutatum, foi utilizado o método de cultura pareada em placa de Petri com meio BDA (Fuga et al., 2011; Dennis

2 & Webster, 1971). Para isso foram retirados discos de 5 mm de diâmetro, contendo meio e colônias do fungo com sete dias de idade e, colocados no centro de placas de Petri com o mesmo meio. Uma alçada de cada isolado de Bacillus spp. foi colocada a 3 cm de distância da colônia do fitopatógeno. Adotou-se um delineamento inteiramente casualizado com 4 repetições, sendo o controle composto somente pelo cultivo do fungo isento do antagonista. Após isto, as culturas foram incubadas em BOD a 25 C, com fotoperíodo de 12 horas. As avaliações ocorreram quando o fungo da placa controle atingiu as bordas da placa, determinando-se a medição da colônia do fitopatógeno, com o auxílio de paquímetro digital. Foi determinada a porcentagem de inibição da colônia de C. acutatum pela fórmula: %Inibição=[(cre.mic.tes.-cre.mic.trat.)-cres.mic.test.]x100 cre. mic. tes.= crescimento micelial testemunha cre. mic. trat.= crescimento micelial tratamento. Efeito de Bacillus spp. na germinação de conídios de C. acutatum Foram coletadas suspensões de células da bactéria e do fungo obtendo-se assim, colônias ativas. Adicionou-se 10 L da suspensão de cada isolado de Bacillus spp. (1 x 10 6 ufc/ml) e de suspensão de conídios do patógeno (1 x 10 4 esporos/ml) em áreas demarcadas na lâmina, preparadas com meio ágar-água. Para o tratamento testemunha foram colocadas gotas de água salina destilada e esterilizada no lugar dos Agentes de Controle Biológico (ACBS). Depois as mesmas foram colocadas no interior de placas de Petri esterilizadas, contendo algodão embebido em água esterilizada. As culturas foram incubadas em B.O.D., no escuro a 25ºC por 12 horas (Kupper et al., 2009). Ao término desse período, a cada repetição foi adicionado 10µL de azul lático a fim de inibir o desenvolvimento do patógeno e de qualquer outro microrganismo e, posteriormente, foi determinado o número de conídios germinados e não germinados. Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado, tendo cada tratamento 6 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5 % (SISVAR). Influência de metabólitos termoestáveis sobre o crescimento micelial de C. acutatum Inicialmente foi preparado um caldo bacteriano de acordo com Kupper et al. (2009), colônias de bactérias foram transferidas em Erlenmeyers com capacidade para 250 ml, contendo 50 ml do meio batata dextrose autoclavado (120 C e 1 atm) por 15 minutos. Após a incubação em condições de laboratório por 48 horas sob agitação constante, amostras de 10 ml de cada caldo fermentado foi transferida para Erlenmeyers, contendo 90 ml do meio BDA, que foram esterilizados em autoclave (120 C e 1 atm) por 20 minutos. O meio autoclavado foi vertido em placas de Petri (20 ml cada) e após a solidificação, foram colocados no centro de cada placa um disco de 5 mm de diâmetro de C. acutatum mais meio de cultura. As testemunhas foram constituídas de placas contendo meio de cultura sem metabólito. O efeito do metabólito foi avaliado através da medição do diâmetro da colônia de C. acutatum, quando o fungo da placa controle atingiu a borda da placa. Usou-se delineamento inteiramente casualizado com 5 repetições e os dados submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 %. Efeito de metabólitos termoestáveis, produzidos por Bacillus spp., na germinação de C. acutatum Para avaliar o efeito da produção de metabólitos na germinação do fitopatógeno, utilizou-se um delineamento inteiramente casualizado com 6 repetições por tratamento. Foram retirados 1000 µl de caldo bacteriano autoclavado, isolados, e acrescentado em tubo de diluição com 1000 µl de uma suspensão do fitopatógeno (1x10 4 conídios/ml). O tratamento controle constitui-se apenas de 1000 µl da suspensão e 1000 µl de solução salina. Retirou-se uma alíquota de 20 µl que foi depositada em áreas previamente demarcadas em lâminas com meio Ágar-Água e submetidas à incubação por 14 horas no escuro a 25 C. Em seguida, foi realizada a contagem de conídios germinados e não germinados (Kupper et al., 2009; Furlani et al., 2007). Os dados

3 foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade. Ensaio em Casa de Vegetação O experimento foi realizado em casa de vegetação no período de maio a setembro de Sendo conduzidos em vasos plásticos com capacidade de 2 kg os quais foram preenchidos com 45,75% solo argiloso 45,75%, solo arenoso 0,5%, bokashi e 8% capim picado. Cada vaso recebeu uma muda de morango, cultivar Camarosa. O experimento contou com 13 tratamentos: 11 isolados de Bacillus spp que melhor se destacaram na etapa in vitro, um tratamento químico (TEBUCONAZOL 200g/l i.a) e um controle (água). Para a produção das suspensões dos isolados de Bacillus spp, colônias de cada ACB foi multiplicada em Erlenmeyers (dois frascos para cada agente de controle biológico), com capacidade para 125 ml, contendo 50 ml de meio batata-dextrose, agitados a 120 rpm em temperatura ambiente por 48 horas. Os antagonistas (1x10 7 células/ml), o químico (TEBUCONAZOL 200g/l i.a) e a testemunha (água) foram aplicados semanalmente por meio de pulverizador manual, sendo aplicado o volume de calda suficiente para atingir o ponto de escorrimento. As aplicações dos tratamentos foram realizadas semanalmente no período da tarde. No início da fase de florescimento, as plantas foram pulverizadas com uma suspensão de 10 4 conídios/ml do fungo C. acutatum e submetidas à câmera umida para a germinação dos conídios. As avaliações da incidência da flor preta foram efetuadas ao longo do ciclo da cultura (Gouvea et al., 2009). Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado com quatro repetiçôes por tratamento, e os resultados submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5%. RESULTADOS E DISCUSSÃO Influência do cultivo pareado de isolados de Bacillus spp. no crescimento de C. acutatum do morango Todos os isolados de Bacillus spp. apresentaram antagonismo ao crescimento micelial do fungo, sendo os dois melhores o BM16 e o BM24 com 36,6% e 38,4% de antagonismo quando comparado ao controle. O mesmo ocorreu com Kupper et al. (2003) quando todos apresentaram potencial de antagonismo sem sobreposição de colônia. Furlani et al. (2007) e Costa (2001) também obtiveram resultados satisfatórios na inibição do crescimento micelial do fitopatógeno com isolados de Bacillus spp. utilizando a técnica do cultivo pareado. Efeito de Bacillus spp. na germinação de C. acutatum do morango Nos testes em laboratório verificou-se que, com exceção dos ACBs BM001, BM14 e BM 25 que estimularam a germinação, os outros agentes afetaram a germinação dos conídios do fitopatógeno, porém os que apresentaram uma porcentagem de inibição melhor em relação ao controle foram os agentes de controle biológico: BM18, CPMO3, CPMO4, CPMO5 E CPMO6, com 68,17%, 70,29%, 81,30%, 73,87% e 79,05%. Kupper et al. (2009) observaram que suspensões de células de três isolados de Bacillus spp. e de três isolados de Trichoderma spp., somente dois não inibiram a germinação do fitopatógeno. Em outro estudo sobre o efeito de dois isolados de B. subtilis na inibição da germinação do C. acutatum (Costa, 2001) verificou que os agentes de controle biológico inibiram a germinação de conídios do patógeno e foram capazes de produzir metabólitos em quantidade suficiente para inibir o desenvolvimento do fungo. Influência de metabólitos termoestáveis sobre o crescimento micelial de C. acutatum Cinco dos dezesseis isolados de Bacillus spp. apresentaram inibição do crescimento micelial do fitopatógeno acima de 50%, em relação ao controle, o que revela que mesmo depois de autoclavado os metabólitos mostraram-se estáveis e mantiveram suas atividades. Em estudo semelhante, Kupper et al. (2003) mostrou que dos 60 isolados de Bacillus subtilis, apenas dois não obtiveram sucesso, tornando-o um organismo atraente para estudos de controle biológico. Efeito de metabólitos termoestáveis na germinação do C. acutatum

4 Dos 16 isolados estudados, apenas dois não inibiram a germinação dos conídios. O ACB que melhor teve resultado obteve 97,01% de inibição. Realizando estudo semelhante, Kupper et al. (2009), utilizou 6 isolados, sendo que apenas um deles não produziu metabólitos tóxicos termoestáveis capazes de inibir a germinação do C. acutatum. Ensaio em Casa de Vegetação Dos onze isolados de Bacillus spp. 9 obtiveram resultados superiores ao tratamento controle correspondendo 5,4 a 26,4% de número de flores com sintomas da doença e o tratamento químico 27% enquanto que o tratamento controle apresentou 45,42%, sendo que o Bacillus spp. correspondente ao tratamento CPMO3 apresentou níveis significativos de controle quando comparado ao tratamento químico, conforme apresentado na Figura 1. Avaliando-se o efeito de diferentes fungicidas no controle da Flor-preta do morango Kososki et al.(2001) observaram que os melhores tratamentos foram os que apresentaram apenas 40% das flores doentes. Concluindo que o controle químico, isoladamente, pode não ser um método eficiente para o manejo da flor-preta, indicando a necessidade de investigação de outras estratégias de controle da antracnose do morangueiro. Assim o uso de Bacillus spp. pode ser uma alternativa para a substituição do uso de fungicidas químicos no controle da flor preta do morangueiro. Agradecimentos A Fundação Mokiti Okada pelo apoio e financiamento do experimento, a Drª Katia C. Kupper pela orientação no decorrer do experimento e a todos que de alguma forma contribuiram. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ALMEIDA, T. F.; CAMARGO, M.; PANIZZI, R. de. Efeito de extratos de plantas medicinais no controle de Colletotrichum acutatum, agente causal da flor preta do morangueiro. Summa Phytopatholoica. Botucatu, v. 35, n. 3, p , BATISTA JÚNIOR, C.B., ALBINO, U.B., MARTINES, A.M., SARIDAKIS, D.P., MATSUMOTO, L.S., AVANZI, M.A., ANDRADE, G.; Efeito fungistático de Bacillus thuringiensis e de outras bactérias sobre alguns fungos fitopatógenos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 37, n. 8, p , COSTA, F.; Efeito de agentes de controle biológico sobre C. acutatum, agente causal da flor-preta do morangueiro. Trabalho (Graduação em Agronomia). Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, 2001, 45p. DENNIS, C., WEBSTER, J.; Antagonistic properties of species groups of Trichoderma III. Hyphal interactions. Transactions of the British Mycological Society 57: FUGA, C.A.G., GONÇALVES, D.C., CUNHA, W.V.; Inibição do crescimento micelial de Colletotrichum gloesporioides por Bacillus ssp. "in vitro". Revista do Núcleo Interdisciplinar de Pesquisa e Extensão, v. 1, n. 8, p , FURLANI, A.C.F.A., CAMARGO, M., PANIZZI, R.C., PEREIRA, C.F.; Atividade de células, filtrado e autoclavado de Bacillus ssp. como bioagentes de controle de Colletotrichum acutatum. Científica, Jaboticabal, v35, n2, p , GHIMI, R., KIMATI, H.; Resistência de fungos a fungicidas. Jaguariúna. Embrapa Meio Ambiente, GOUVEA, A., KUHN, O.J., MAZARO, S.M., MAY-DE MIO, L.L., DESCHAMPS, C., BIASI, L.A., FONSECA, V.C.; Controle de doenças foliares e de flores e qualidade póscolheita do morangueiro tratado com Saccharomyces cerevisiae. Horticultura Brasileira, v27, n4, p , Figura 1- Porcentagem de flores com sintomas da flor preta, letras iguais na coluna não diferem estatísticamente pelo teste de Tukey 5% de probabilidade. Conclusões Nas condições estudadas o Bacillus spp CPMO3 se mostrou eficiente no controle da flor preta do morangueiro em casa de vegetação. Entretanto ensaio a campo será necessário para comprovar sua eficiência. KOSOSKI, R.M., FURLANETTO, C., TOMITA, C.K.; Efeito de fungicidas em Colletotrichum acutatum e controle da antracnose do morangueiro. Fitopatol. bras. v26 n3 Brasília KUPPER, K.C., BELLOTTE, J.A.M., GOES, A.; Controle alternativo de Colletotrichum acutatum agente causal da queda prematuro dos frutos cítricos. Revista Brasileira de Fruticultura, v.31, n.4, Jaboticabal, KUPPER, K.C., GIMENES-FERNANDES, N., GOES, A.; Controle biológico de Colletotrichum acutatum, agente causal da queda prematura dos frutos cítricos. Fitopatologia Brasileira 28:

5 TANAKA M.A.S.; PASSOS F.A.; BETTI J.A.; Resistência de Colletotrichum fragariae e C. acutatum ao benomyl na cultura do morango no Estado de São Paulo. Scientia Agricola 54: