Universidade Federal da Bahia Instituto de Ciências da Saúde Departamento de Biomorfologia Disciplina de Histologia II

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1 Universidade Federal da Bahia Instituto de Ciências da Saúde Departamento de Biomorfologia Disciplina de Histologia II ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS 1º SEMESTRE *** RELAÇÃO DAS LÂMINAS*** Aluno: Turma prática: Colaboradores: Ana Luiza Vilar Guedes Daniel Carvalho Felipe Renê Garcia Gustavo Andrade Tedesqui Igor Teixeira Brito Júlio César de Oliveira Leal Marcella Flores Priscila Fonseca L. Jorge Rachel Oliveira Santos Haine Ramon Campos Nascimento Rodrigo Castro Guimarães Sávio Pastor Tássia Joana Carvalho Lopes Thaynã Souto S. de Santana Vinicius Oliveira Novais Orientação: Prof. Márcio Cajazeira Aguiar Profa. Maria Isabela G. Campos

2 1) MICROSCOPIA E TÉCNICA HISTOLÓGICA BÁSICA 2 Microscópio Óptico (M.O.) - Partes 1. pé 2. braço 3. tubo ou canhão 4. revólver 5. platina 6. charriot 7. parafusos para ajuste macro e/ou micrométrico do foco Óptica Sistema de aumento: - oculares (10x) - objetivas (4x, 10x, 40x, 100x) Sistema de iluminação: - espelho - condensador - diafragma - filtro Observações: 1. A imagem proporcionada pelo M.O. é aumentada, virtual e invertida em relação ao objeto examinado. 2. Calcula-se o aumento da imagem obtida ao M.O. multiplicando-se o valor do aumento da ocular pelo valor do aumento da objetiva. 3. Campo microscópico é a área da preparação que se está observando ao M.O. Quanto maior o aumento da imagem, menor é a abrangência do campo. 4. Em virtude do último item, sempre se inicia a observação ao M.O. com uma combinação de lentes que proporcione o menor aumento, a fim de se ter uma visão panorâmica da região que se quer observar com maior aumento. Manejo do Microscópio 1. Acender a lâmpada do sistema de iluminação. 2. Abrir totalmente o diafragma e colocar o sistema condensador - diafragma na posição mais elevada, pois é aquela que permite melhor iluminação. 3. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de menor aumento (4X). 4. Tomar a lâmina com a lamínula para cima e colocá-la na platina, prendendo-a com os grampos. 5. Movimentar o charriot, fazendo com que o preparado fique em baixo da objetiva. 6. Com o parafuso macrométrico, elevar a platina ao máximo, observando que a objetiva não toque na lamínula, pois poderá quebrá-la. 7. Focalizar a preparação para a obtenção de uma imagem nítida, movimentando o parafuso macrométrico e abaixando a platina até que se possa visualizar a imagem. 8. Aperfeiçoar o foco com o parafuso micrométrico. 9. Colocar a região do preparado que se quer ver com maior aumento bem no centro do campo visual da lente. 10. Movimentar o revólver, colocando em posição a objetiva de 10X (aumento médio). 11. Repetir o procedimento do item Para focalizar a nova imagem, repetir o procedimento do item Repetir o item Repetir o item Colocar a objetiva de 40X (maior aumento) em posição e repetir os itens 6, 7 e A objetiva de 100X é chamada de imersão e seu uso será explicado posteriormente.

3 OBSERVAÇÕES IMPORTANTES: 1. A maior parte de nossos microscópios possuem lentes parafocais. Isto significa que, uma vez obtido o foco com a objetiva de menor aumento, basta girar o revólver, colocar a objetiva 10X em posição e acertar o foco apenas com o parafuso micrométrico. 2. Procede-se da mesma forma, ao focalizar a objetiva 40X, desde que a imagem esteja em foco com a objetiva 10X. 3 TÉCNICA PARA OBTENÇÃO DE LÂMINAS (preparados histológicos permanentes) 1. Colheita do material - é a obtenção da peça, por biópsia ou necropsia. 2. Fixação - o tratamento assim denominado visa impedir a destruição das células por suas próprias enzimas (autólise) ou bactérias. Este tratamento é feito imediatamente após a retirada do material (biópsia), ou até antes (fixação por perfusão do animal). A fixação visa ainda endurecer os tecidos, tornando-os mais resistentes e favoráveis às etapas subsequentes da técnica histológica. Resumindo, pode-se dizer que a fixação é o tratamento da peça histológica a fim de que possamos observar ao microscópio os componentes teciduais, com a morfologia e a composição química semelhantes às existentes no ser vivo. A fixação pode ser feita por processos físicos ou químicos. A fixação química, mais usada em Histologia, é feita por fixadores que podem ser simples ou compostos. Como exemplo de fixador simples temos o formol e, de composto, citamos o líquido de Bouin (uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético). 3. Desidratação - visa retirar a água dos tecidos, a fim de permitir a impregnação da peça com parafina. Para isto, a peça é submetida a banhos sucessivos em álcoois de teor crescente (ex.: álcool a 70%, 80%, 90% e 100%). 4. Diafanização - visa impregnar a peça com um solvente de parafina. O mais usado é o xilol. 5. Impregnação pela parafina fundida - tem a finalidade de permitir a obtenção de cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio. Para isso os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60 C, no interior da estufa. Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dando-lhes, depois de solidificada, certa dureza. 6. Inclusão - é a passagem da peça que estava na estufa para um recipiente retangular (forma) contendo parafina fundida que, depois de solidificada à temperatura ambiente, dá origem ao chamado bloco de parafina. A inclusão pode também ser feita com celoidina, gelatina ou resina epóxi, sendo estas últimas usadas para microscopia eletrônica. 7. Microtomia - é a etapa em que se obtém delgadas fatias de peças incluídas na parafina, através de um aparelho chamado micrótomo, que possui navalha de aço. A espessura dos cortes geralmente varia de 5 a 10 µm (micrômetros). (1 µm = 0,001 mm) 8. Extensão - os cortes provenientes da microtomia são enrrugados. Para desfazer estas rugas, são esticados num banho de água a 58 C, e pescados com uma lâmina. Leva-se então, à estufa a 37 C, por 2 horas, para que se dê a colagem do corte à lâmina. 9. Coloração - tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros. Para realizá-la, são observados 3 itens:

4 4 a) Eliminação da parafina - por meio de banhos sucessivos em xilol, benzol ou toluol. b) Hidratação - é executada quando o corante utilizado é solúvel em água. Deve ser gradativa, com álcoois de teor decrescente, para evitar o rompimento dos tecidos. c) Coloração - os corantes são compostos químicos com determinados radicais ácidos ou básicos que possuem cor e apresentam afinidade de combinação com estruturas básicas ou ácidas dos tecidos. Rotineiramente, usa-se hematoxilina, corante básico que se liga aos radicais ácidos dos tecidos, e eosina, corante ácido que tem afinidade por radicais básicos dos tecidos. Os componentes que se combinam com corantes ácidos são chamados acidófilos e os componentes que se combinam com corantes básicos são chamados basófilos. Por exemplo, os núcleos das células, onde predominam substâncias ácidas (DNA), são basófilos, ou seja, coram-se pela hematoxilina (corante básico de cor roxa); por sua vez, o citoplasma, onde predominam substâncias básicas (proteínas estruturais), é acidófilo, corando-se pela eosina (corante ácido de cor rosa). 10. Desidratação - visa retirar a água, quando os corantes utilizados forem soluções aquosas, a fim de permitir perfeita visualização dos tecidos, pois a água possui índice de refração diferente do vidro, e ainda prevenir a difusão dos corantes. Para isto usam-se banhos em álcoois de teor crescente. 11. Diafanização - a diafanização é feita com xilol, a fim de tornar os cortes perfeitamente transparentes. 12. Montagem - é a etapa final da técnica histológica, e consiste na colagem da lamínula sobre o corte, com bálsamo do Canadá, que é solúvel em xilol e insolúvel em água. A lamínula impede que haja hidratação do corte pela umidade do ar ambiente, permitindo então que estas lâminas se mantenham estáveis por tempo indefinido. Após a montagem, levam-se as lâminas à estufa para secagem do bálsamo do Canadá.

5 2) TECIDOS EPITELIAIS DE REVESTIMENTO E GLANDULAR 5 LÂMINA M6 Epitélio cilíndrico simples e Glândula exócrina tubulosa simples (junção reto-anal, HE) A mucosa do reto é revestida por células cilíndricas absortivas, pois apresenta uma única camada de células, e estas possuem forma e núcleo alongados (40x). Este epitélio pode também ser chamado de colunar ou prismático simples. Observar que estas células epiteliais são polarizadas (40x), possuindo seus núcleos no pólo basal que é o pólo nutritivo da célula. Abaixo desse epitélio existe a lâmina própria ou córion constituído por tecido conjuntivo frouxo. Na lâmina própria são observadas inúmeras glândulas exócrinas tubulares retas. Cada glândula tem uma única luz tubular reta, dentro da qual os produtos de secreção são liberados (observar que neste espécime a luz das glândulas pode estar obliterada). Cada glândula é um tubo circundado de tecido conjuntivo, que desemboca no epitélio de revestimento. Dentre as células epiteliais que constituem esta glândula, destacam-se as células caliciformes, cuja porção apical do citoplasma não é corada e os núcleos se localizam na porção basal (40x). Nesta preparação as glândulas aparecem em cortes longitudinais (semelhantes a um dedo de luva) e em cortes transversais (aspecto circular). Ainda nesta lâmina, observa-se o epitélio estratificado pavimentoso não queratinizado. Neste existem várias camadas celulares, as células epiteliais justapostas à lâmina basal são cilíndricas ou cúbicas e constituem a camada germinativa ou basal. Acima desta, as camadas intermediárias são formadas por células poligonais ou poliédricas que vão se tornando mais achatadas ao se aproximarem da superfície. Finalmente, as células achatadas da camada mais superficial caracterizam o epitélio denominado pavimentoso. A superfície deste epitélio não está revestida por queratina, por esse motivo é considerado não queratinizado (40x). Lâmina M6 Epitélio simples pavimentoso (junção reto/anal, HE) O tecido conjuntivo apresenta vasos sanguíneos que estão preenchidos por hemácias. Esta estrutura está limitada por uma camada única de células epiteliais com núcleo achatado, ou seja, um epitélio pavimentoso simples, que nos vasos é denominado de endotélio (40x).

6 6 Lâmina J1 Epitélio estratificado pavimentoso queratinizado (pele / nervo periférico, HE) Observa-se um epitélio estratificado, ou seja, várias camadas que recebem nomenclatura específica. Na camada basal as células apresentam morfologia cúbica ou cilíndrica e têm a função germinativa. Em seguida, na camada espinhosa as células assumem forma poligonal com núcleo central. As células pavimentosas mais superficiais constituem a camada granulosa e apresentam grânulos basófilos em seu citoplasma (40x). Externamente, pode-se observar uma espessa camada de material acidófilo e filamentoso, constituída de queratina e denominada camada córnea. LÂMINA C1 - Glândula exócrina túbulo-acinosa composta (glândula mista, HE) Esta glândula é constituída por unidades secretoras em forma de ácinos ou túbulos, por isso é classificada como túbulo-acinosa. Essas unidades secretoras drenam para um sistema de ramificado de ductos, sendo por isso chamada de composta. As unidades secretoras podem ser serosas ou mucosas. As unidades serosas são constituídas por células piramidais, basófilas, com núcleo arredondado localizado no pólo basal, enquanto as unidades mucosas são formadas por células piramidais de citoplasma claro e núcleo achatado no pólo basal (40x). Os ductos excretores apresentam luz ampla e são constituídos por células epiteliais cúbicas ou cilíndricas. Quanto maior o diâmetro do ducto, mais altas são suas células e maior o número de camadas que apresentam. Observar a presença de septos de tecido conjuntivo entre os lóbulos glandulares (4x). QUESTÕES: 1. O que é lâmina basal? 2. Qual a importância da camada basal no epitélio? 3. Dentre as lâminas observadas, justifique a presença da queratina apenas na lâmina de pele. 4. Definir lâmina própria. Qual a sua importância em relação ao epitélio? 5. Qual a diferença entre estroma e parênquima? 6. Diferencie as formas de secreção glandular. 7. Quanto à origem, qual a relação entre epitélio de revestimento e o epitélio glandular?

7 3) TECIDO CONJUNTIVO PROPRIAMENTE DITO E TECIDO ADIPOSO 7 LÂMINA B1 Fibras elásticas (pele, orceína) Para adequada visualização das fibras elásticas o preparado foi corado aqui com orceína. Notar a presença de fibras delgadas, ramificadas e de coloração púrpura. As fibras podem se apresentar em cortes longitudinais ou em cortes transversais (40x). Além disso, nesta lâmina de pele, encontram-se fibras colágenas coradas mais fracamente e mais espessas do que as elásticas, além de pequenos capilares menos conservados. LÂMINA B2 Fibras reticulares (fígado, prata) Essa lâmina de fígado foi corada por sais de prata (impregnação argêntica), evidenciando em negro as fibras reticulares. As outras estruturas não podem ser bem diferenciadas. Observar que elas formam uma rede delicada e emaranhada que sustenta o parênquima hepático e é mais densa na cápsula e nos espaços-porta. Essas fibras podem ser vistas em corte longitudinal ou transversal (40x). LÂMINA B3 Fibras colágenas (pele, HE) A derme da pele fica adjacente à epiderme e é dividida em 2 zonas: derme papilar, mais superficial e delgada, e derme reticular, mais profunda e extensa (4x). A derme papilar, imediatamente abaixo da epiderme, é constituída de tecido conjuntivo frouxo, sem predominância de componentes, e no qual as fibras colágenas se dispõem em filamentos finos acidófilos, dando ao tecido um aspecto delicado e homogêneo. As células mais comuns são os fibroblastos, identificados pelos núcleos basófilos e alongados (40x). Na derme reticular há predominância das fibras colágenas que se organizam em feixes grossos acidófilos dispostos em todas as direções, por isso esse tecido é denominado de denso não modelado. Este tecido é menos celularizado e tem um aspecto mais grosseiro se for comparado ao conjuntivo frouxo da derme papilar. As células mais freqüentes também são os fibroblastos. É importante ressaltar que as fibras elásticas também estão presentes neste tecido conjuntivo, apesar de não serem

8 8 identificadas nos preparados de pele corados com HE. Abaixo da derme reticular, encontra-se a hipoderme constituída, sobretudo de tecido adiposo unilocular (4x). LÂMINA B4 Tecido conjuntivo denso modelado (tendão, HE) Observa-se na lâmina um tecido conjuntivo cujo componente predominante são as fibras colágenas, daí a sua classificação como denso. Essas fibras são acidófilas e estão dispostas em feixes paralelos. Esta organização deve-se a resposta do tecido às trações exercidas sobre ele. Note que o longo eixo das fibras acompanha o longo eixo dos núcleos dos fibroblastos que se encontram corados pela hematoxilina. A morfologia desses núcleos pode variar de ovóide (células ativas) a alongada (células pouco ativas), sendo neste caso classificado como fibrócito (40x). QUESTÕES: 1- Diferencie ultra-estruturalmente o fibrócito do fibroblasto ativo. 2- Qual a função das fibras elásticas na derme da pele? 3- Qual a diferença funcional entre derme papilar e reticular? 4- Qual a função das fibras reticulares e cite 2 outros órgãos onde podem ser encontradas.

9 4) TECIDO CARTILAGINOSO E ÓSSEO 9 LÂMINA E1 Cartilagem hialina (HE) Esta lâmina possui vários cortes de cartilagem hialina (4x). Cada corte é envolvido pelo pericôndrio, no qual observam-se os condroblastos. Adjacente ao pericôndrio, observa-se a matriz cartilaginosa basófila, contendo condrócitos no interior de lacunas (40x). Estes não preenchem totalmente a lacuna devido à retração que sofrem durante a preparação histológica. Notar também os grupos isógenos localizados principalmente no centro da matriz cartilaginosa. Circundando os condrócitos existe uma zona estreita e bem basófila, denominada impropriamente de cápsula. A matriz territorial é diferenciada da matriz interterritorial pelo fato da primeira se apresentar com maior basofilia e estar circundando condrócitos de um mesmo grupo isógeno. LÂMINA E3 Fibrocartilagem (HE) Possuindo características intermediárias entre a cartilagem hialina e o tecido conjuntivo denso, a fibrocartilagem apresenta feixes de fibras colágenas, acidófilas, orientadas na direção das tensões funcionais e substância fundamental escassa exceto próximo às lacunas, onde há maior quantidade de proteoglicanas (região mais basófila). Os condrócitos estão dispersos na matriz, no interior das lacunas e se apresentam isoladamente ou em raros grupos isógenos (40x). Nesse tecido não há pericôndrio. LÂMINA D1- Osso (desmineralizado, HE) A técnica de desmineralização permite somente a visualização da parte orgânica do osso. Neste corte observam-se inúmeras trabéculas de osso esponjoso, delimitando espaços que estão preenchidos pela medula óssea. Sua matriz de aspecto acidófilo comporta inúmeras lacunas com células de morfologia amendoada denominadas de osteócitos. Os osteoblastos e os osteoclastos, células transitórias, não podem ser vistos nessa lâmina. Notar a presença dos sistemas de Havers com lamelas concêntricas ao redor do canal de Havers.

10 10 Ainda nesta lâmina é possível observar o tecido adiposo unilocular que constitui a medula óssea amarela. Os adipócitos são células grandes, esféricas que apresentam os núcleos achatados na periferia, devido à presença de uma única gotícula lipídica, dissolvida durante o processamento histológico (40x). Entre as células existe um tecido conjuntivo frouxo vascularizado, porém só é possível visualizar os vasos maiores contendo hemácia acidófilas (40x). QUESTÕES: 1. Conceitue grupos isógenos. 2. Diferencie a fibrocartilagem do tecido conjuntivo denso. 3. Defina matriz osteóide.

11 5) TECIDO MUSCULAR 11 LÂMINA H1 Músculo esquelético (Língua, HE) Subjacente ao tecido conjuntivo observa-se o tecido muscular esquelético. As fibras musculares estão envolvidas por uma bainha de tecido conjuntivo, o endomísio que é de difícil visualização, enquanto que o perimísio, mais visível, reveste cada feixe de fibras (10X). Cabe notar a presença de amplos espaços endomisiais devido à retração do tecido durante o preparo histológico. Em corte longitudinal, observam-se células alongadas, cilíndricas, não ramificadas, multinucleadas e com estriações transversais que aparecem como linhas escuras e claras intercaladas, características da organização das miofibrilas (40X). Em corte transversal, as mesmas assumem um formato poliédrico com núcleos periféricos. LÂMINA H2 Músculo cardíaco (HE) Neste tecido o músculo pode ser observado em 2 cortes: longitudinal e transversal (10X). No primeiro, as fibras musculares se dispõem em uma rede resultante de anastomoses irregulares, apresentam um ou dois núcleos ovóides, estriações transversais e discos intercalares, (40X). Em corte transversal, percebe-se a morfologia irregular das fibras com núcleos esféricos centralmente localizados. Pode-se observar também a presença de tecido conjuntivo intensamente vascularizado. LÂMINA H3 Músculo liso (HE) Neste corte de músculo liso, as fibras musculares aparecem tanto cortadas longitudinalmente quanto transversalmente (10X). Em cortes longitudinais, percebe-se o formato fusiforme da fibra muscular lisa com núcleo único e central, sem a presença de estrias transversais. Em cortes transversais, as células musculares lisas apresentam-se como estruturas circulares ou poligonais com núcleo central. A depender da região onde a célula foi cortada, o núcleo pode apresentar diâmetros variados ou mesmo não ser observado. QUESTÕES: 1. Cite 2 locais onde pode ser encontrado o músculo liso 2. Porque são observadas as estriações transversais nas fibras musculares esqueléticas? 3. No que consistem os discos intercalares do músculo cardíaco?

12 6) TECIDO NERVOSO 12 LÂMINA I2 Cérebro (HE) É importante ressaltar a diferença entre as células da neuroglia e os corpos celulares dos neurônios. Nos neurônios nota-se o corpo celular, contendo núcleo esférico, grande e claro com nucléolo evidente. As células da neuroglia possuem núcleo pequeno e bem corado. Na superfície do córtex cerebral observa-se a presença de um tecido conjuntivo muito vascularizado revestido por células achatadas. Essa camada constitui a meninge mais interna a pia-máter. Note a presença de um ventrículo revestido por uma camada de células ependimárias com morfologia cúbica achatada, citoplasma pouco corado e presença de cílios que proporcionam o movimento do LCR. No interior do ventrículo observa-se o plexo coróide constituído por dobras da pia-máter (tecido conjuntivo frouxo) revestidas por células ependimárias produtoras do LCR, que se apresentam com aspecto globoso, citoplasma acidófilo e núcleo basófilo (40x). LÂMINA I1 Cerebelo (HE) Nesta lâmina pode-se observar córtex cerebelar (substância cinzenta) que forma uma série de pregas profundas sustentadas por uma medula central de substância branca (4x). O córtex cerebelar é constituídos por 3 camadas descritas a seguir. A camada molecular é a mais externa e composta por numerosas fibras amielínicas (acidófilas), alguns núcleos de células da glia (menores e basófilos) e alguns núcleos de neurônios (maiores e mais claros, com nucléolo bem evidente) (40X). Abaixo, encontra-se a camada de células de Purkinje, constituída por neurônios de pericários grandes dispostos em uma fileira única. Estas células apresentam dendritos ramificados que se estendem para a camada molecular. Entre a camada de Purkinje e a substância branca, observa-se a camada granular, rica em células granulosas, que são os menores neurônios do corpo humano. O córtex cerebelar é sustentado por uma medula central de substância branca que é formada por fibras mielínicas (acidófilas) e células da glia. Notar que acima da camada molecular, aparece a pia-máter. LÂMINA J1 Nervo periférico (HE)

13 LÂMINA J1 Nervo periférico (HE) 13 Os feixes nervosos cortados longitudinalmente se caracterizam pelo trajeto ondulado das fibras nervosas acidófilas, não sendo possível diferenciá-las das fibras colágenas do endoneuro. Observam-se ainda núcleos de células de Schwann (mais ovóides) e núcleos de fibroblastos (mais basófilos e achatados). Em volta de cada feixe nervoso, nota-se a presença de uma bainha de várias camadas de células justapostas, o perineuro. Nos feixes nervosos cortados transversalmente, o perineuro também é visível. Nesse corte, os axônios são vistos como pontos acidófilos irregulares podendo ou não estar circundado por uma área clara (referente à bainha de mielina perdida durante o processamento histológico) e mais externamente por um pequeno anel acidófilo (referente ao limite citoplasmático da célula de Schwann). QUESTÕES: 1. Qual o significado do aspecto ondulado das fibras nervosas cortadas longitudinalmente? 2. No que consiste o LCR e qual a sua função? 3. Porque os neurônios apresentam nucléolo evidente?