UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E VETERINÁRIA

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1 UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E VETERINÁRIA CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA, MORFOLÓGICA E QUÍMICA DE QUIMIOTIPOS DE OCIMUM GRATISSIMUML LINEU JULIANA SANTOS VIANNA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS BRASÍLIA/DF MARÇO/2009

2 UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA, MORFOLÓGICA E QUÍMICA DE QUIMIOTIPOS DE OCIMUM GRATISSIMUM LINEU JULIANA SANTOS VIANNA ORIENTADOR: JEAN KLEBER DE ABREU MATTOS CO-ORIENTADOR: ROBERTO FONTES VIEIRA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS PUBLICAÇÃO: 322/09 BRASÍLIA/DF MARÇO DE 2009 ii

3 UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA CARACTERIZAÇÃO ANATÔMICA, MORFOLÓGICA E QUÍMICA DE QUIMIOTIPOS DE OCIMUM GRATISSIMUM LINEU JULIANA SANTOS VIANNA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS NA ÁREA DE PRODUÇÃO VEGETAL. ROBERTO FONTES VIEIRA, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. (CO-ORIENTADOR) rvieira@cenargen.embrapa.br CPF: APROVADA POR: JEAN KLEBER DE ABREU MATTOS, UnB (ORIENTADOR) jeankleber@yahoo.com.br CPF: DALVA GRACIANO RIBEIRO, UnB (EXAMINADOR EXTERNO) graciano@unb.br CPF: JOSÉ RICARDO PEIXOTO, UnB (EXAMINADOR INTERNO) Peixoto@unb.br CPF: BRASÍLIA/DF, 26 DE MARÇO DE 2009 iii

4 FICHA CATALOGRÁFICA Vianna, Juliana Santos Caracterização anatômica, morfológica e química de quimiotipos de Ocimum gratissimum Lineu / Juliana Santos Vianna; orientação de Jean Kleber de Abreu Mattos. Brasília, p.: il. Dissertação de Mestrado (M) Universidade de Brasília/ Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Ocimum gratissimum. 2. Anatomia. 3. Compostos químicos. 4.Plantas Medicinais. I Abreu Mattos,J.K. II.Doutor. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA VIANNA, J.S. Caracterização anatômica, morfológica e química de quimiotipos de Ocimum gratissimum Lineu. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2009, 78 p. Dissertação de Mestrado. CESSÃO DE DIREITOS NOME DO AUTOR: Juliana Santos Vianna TÍTULO DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO: Caracterização anatômica, morfológica e química de quimiotipos de Ocimum gratissimum Lineu. GRAU: Mestre ANO: 2009 É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta dissertação de mestrado e para emprestar ou vender tais cópias somente com propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e nenhuma parte desta dissertação de mestrado pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor. Juliana Santos Vianna CPF: juliana@vianna021@yahoo.com.br iv

5 Dedicatória À Deus À Minha Família Ao Meu Amor Aos Meus Amigos v

6 AGRADECIMENTOS À Deus, pelo presente divino que é a vida; Ao curso de Pós-Graduação em Ciências Agrárias da Universidade de Brasília/UnB pela oportunidade de realização deste curso; À Embrapa Cenargen e ao Laboratório de Anatomia Vegetal da Universidade de Brasília por me cederem espaço físico para a realização deste trabalho; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pela concessão de bolsa de estudo; Ao Professor Dr. Jean Kleber de Abreu Mattos, pela orientação, ensinamentos, amizade e companheirismo; Ao Dr. Roberto Fontes Vieira pela co-orientação e direcionamento na condução do trabalho; À professora Dr a. Dalva Graciano Ribeiro, pela grande ajuda e contribuição na minha formação acadêmica, sempre com muita paciência; Ao Mestre Djalma Barbosa da Silva, pelo direcionamento na condução do trabalho; À professora Ph.D. Connie McManus, pela contribuição estatística; Ao professor Dr. Antônio Xavier de Campos, por todos os ensinamentos e dedicação; Ao professor Dr. José Ricardo Peixoto, pelas sugestões e conversas; Aos professores, secretários e servidores da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da UnB, pelas aulas, apoio e troca de idéias; vi

7 À minha mãe, por seu desprendimento pessoal e devoção; Ao meu pai, pelo incentivo e ajuda; Ao Edison, por seu companheirismo, conselhos e dedicação ao longo desses anos. Por seu apoio diante de algumas das decisões cruciais na minha vida. Por sua crença em minha capacidade, especialmente quando as coisas ficavam complicadas, garantiu a minha persistência. Agradeço a seus pais por você existir e pelo carinho e torcida que dedicam a mim. Aos meus grandes amigos: Dudu, Érica, Francine, Ivan, Marcão, Patrícia e Raíssa, que só pela existência me deixam feliz; A todas as pessoas que não foram mencionadas, mas que de uma forma ou de outra, contribuíram para a concretização deste trabalho. vii

8 ÍNDICE Páginas INTRODUÇÃO GERAL... 1 OBJETIVOS... 2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 3 CAPÍTULO I... 4 RESUMO... 5 ABSTRACT... 6 INTRODUÇÃO... 7 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 8 Plantas medicinais... 8 Família Lamiaceae... 8 Gênero Ocimum... 9 Descrição Botânica de Ocimum gratissimum METODOLOGIA Procedimentos Gerais Arquitetura Foliar Cortes Transversais Testes Histoquímicos RESULTADOS E DISCUSSÃO Arquitetura Foliar Pecíolo Lâmina foliar Testes histoquímicos CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CAPÍTULO II RESUMO ABSTRACT REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Ocimum gratissimum Óleo essencial Usos e aplicações do óleo essencial de O. gratissimum SPME - SOLID PHASE MICRO-EXTRATION METODOLOGIA Coleta e preparo das amostras Microextração em fase sólida Extração por hidrodestilação Cromatografia em Fase Gasosa Dados Meteorológicos Análise estatística RESULTADOS E DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANEXO ANEXO viii

9 ÍNDICE DE TABELAS CAPÍTULO I Tabela 1.1. Características morfológicas da folha de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol Tabela 1.2. Características anatômicas do pecíolo de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol Tabela 1.3. Características anatômicas da folha de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol Tabela 1.4. Resultado dos testes histoquímicos em folha e pecíolo de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol...35 CAPÍTULO II Tabela Quadrados médios e análise de variância das áreas dos picos dos cromatogramas proporcionais a concentração de eugenol e geraniol obtidos por microextração (SPME) em folhas frescas e secas em relação às variáveis dia e horário...59 Tabela Médias das áreas dos picos dos cromatogramas proporcionais a concentração de eugenol e geraniol obtidos por microextração (SPME) em folhas frescas e secas de O. gratissimum quimiotipo eugenol e geraniol, colhido nos horários de 8h, 11:30h, 15h e 09:30h, 13h, 16:30h, respectivamente, em Brasília, DF Tabela Médias das áreas dos picos dos cromatogramas proporcionais a concentração de eugenol e geraniol obtidos por microextração (SPME) em folhas frescas e secas de O. gratissimum quimiotipos eugenol e geraniol, nos dias 30 e 31/10/08 e 18, 19, 20 e 21/11/08, em Brasília, DF...62 Tabela Dados meteorológicos obtidos nos dias e horários de coleta Tabela Análise de variância dos fatores umidade relativa do ar, temperatura e radiação solar em O. gratissimum quimiotipo eugenol e em O. gratissimum quimiotipo geraniol Tabela Correlação entre umidade relativa do ar, temperatura, radiação solar e a área do pico do cromatograma referente às amostras de folhas frescas e secas Tabela Média da área do pico (calculada em 100g de peso seco) do componente eugenol em O. gratissimum quimiotipo eugenol e do componente geraniol em O. gratissimum quimiotipo geraniol na colheita realizada no dia 20/11/08 usando os métodos de hidrodestilação em aparelhos de Clevenger e SPME ix

10 ÍNDICE DE FIGURA CAPÍTULO I Figura Coleção de plantas medicinais da vitrine tecnológica da Embrapa Sede/Brasília-DF Figura Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo eugenol Figura Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo geraniol...18 Figura Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo timol Figura Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo eugenol...24 Figura Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo geraniol...25 Figura Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo timol Figura Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo eugenol...31 Figura Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo geraniol Figura Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo timol...33 Figura Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo eugenol Figura Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo geraniol Figura Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo timol Figura Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo eugenol Figura Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quiomiotipo geraniol Figura Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo timol...41 CAPÍTULO II Figura Cromatogramas obtidos por SPME em O.gratissimum quimiotipo eugenol..63 Figura Cromatogramas obtidos por SPME em O.gratissimum quimiotipo geraniol..64 x

11 INTRODUÇÃO GERAL O estudo das plantas medicinais brasileiras concentrou-se principalmente na área química e este estudo foi realizado, em sua grande maioria, por cientistas estrangeiros (Matos, 1990). O mesmo autor ainda afirma que, das centenas das espécies medicinais existentes, apenas 5%, aproximadamente, tem sido objeto de pesquisa. O gênero Ocimum (Lamiaceae) é uma importante fonte de muitos óleos essenciais, sendo usado na medicina popular de praticamente todos os continentes (Alburqueque & Andrade, 1998; Simon et al., 1999; Sobti & Pushpangadan, 1982 e Vieira & Simon, 2000). A alfavaca (Ocimum gratissimum) é um arbusto lenhoso, que pode chegar a mais de 1,5 m de altura, apresentando flores e frutículos dispostos em numerosas inflorescências eretas típicas do gênero. É originária da África e subespontânea em todo o Brasil (Cerri,1995). É comum a ocorrência de hibridação e poliploidização, e por isso tem-se criado confusão nas classificações taxonômicas dificultando o entendimento das relações genéticas entre as diversas cultivares. Para dificultar um pouco mais a taxonomia deste gênero, ocorrem muitas variedades botânicas, cultivares e tipos químicos dentro das espécies e que podem não se diferenciar morfologicamente (Simon et al., 1999). A composição química dos óleos essenciais varia conforme o quimiotipo de Ocimum gratissimum. A ocorrência de quimiotipos é freqüente em plantas ricas em óleos voláteis (Ramos, 2004). A composição do óleo não é só influenciada pelo genótipo, mas também pelas práticas culturais, como hora de corte, idade da planta, além de fatores ambientais, tal como temperatura, umidade relativa, irradiação e fotoperíodo (Bruneton, 1991). Guenter, (1943) já havia descrito dois quimiotipos de Ocimum gratissimum, quais sejam: eugenol e timol. O tipo timol foi cultivado em Dabakala (Costa do Marfim) com rendimento de óleo essencial de 0,6 % e o teor de timol variando de 23 a 44 %. O tipo eugenol, completamente diferente continha esse composto variando de 55 a 89%, com rendimento de 0,1%. Já Charles & Simon, (1992) verificaram que de 50 constituintes identificados, o principal foi o geraniol (83,7 88,8 %). Devido a presença desta nova substância, os autores propuseram que tratava-se de um novo quimiotipo, com óleo essencial rico em geraniol. 1

12 Espera-se que as características anatômicas, morfológicas e químicas estudadas neste trabalho, possam fornecer subsídios que contribuam para melhor conhecimento da espécie O. gratissimum. No capítulo I é apresentada a caracterização morfológica e anatômica de 3 quimiotipos de Ocimum gratissimum: eugenol, geraniol e timol. O capítulo II refere-se à análise química de 2 quimiotipos de Ocimum gratissimum: eugenol e geraniol. OBJETIVOS Caracterizar e diferenciar morfológica, anatômica e quimicamente diferentes quimiotipos de Ocimum gratissimum e fornecer subsídios que contribuam para o melhor conhecimento desta espécie. 2

13 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALBUQUERQUE, U. P., ANDRADE, L.H.C. Etnobotánica del Género Ocimum L. (Lamiaceae) en las comunidades afrobrasileñas. An. Jard. Bot. Mad., v.56, n.1, p , BRUNETON, J. Elementos de fitoquimica y de farmacognosia. Zaragoza/ESP: Editorial Acribia, p. CERRI, C. Ervas companheiras de viagem. Rev. Globo Rural, n.121, p.43-1, CHARLES, D.J., SIMON, J.E. A new geraniol chemotype of Ocimum gratissimum L. J. Essent. Oil Res., v.4, p.231-4, GUENTER, E. The essential oil: individual essential oils of the plants family Labiatae. New York: D. Von Nostrand, v.3, 777p. MATOS, J.K.A. Plantas medicinais: aspectos agronômicos. Brasília: Ed. do Autor, p. RAMOS, F. Extração de óleos Essenciais. Penso logo sou Phallic Mushroom Creations, Acessado em SIMON, J.E., MORALES, M.R., PHIPPEN, W.B., VIEIRA, R.F., HAO, Z. Basil: a source of aroma compounds and a popular culinary and ornamental herb. In: JANICK, J. New crops and new uses: biodiversity and agricultural sustainability. Alexandria: ASHS Press, p SOBTI, S.N., PUSHPANGADAN, P. Studies in the Genus Ocimum: cytogenetics, breeding and prodction of new strains of economic importance. In: ATAL, C.K., KAPUR, B.M. (Ed) Cultivation and utilization of aromatic plants. Jammu- Tawi: Regional Laboratory Council of Scientific and Industrial Research, v.3, 606p. VIEIRA, R.F., SIMON, J.E. Chemical characterization of basil (Ocimum spp.) found in the markets and used in traditional medicine in Brazil. Econ. Bot., v.54, p ,

14 CAPÍTULO I Caracterização anatômica e morfológica de três quimiotipos de Ocimum gratissimum.

15 RESUMO O objetivo deste trabalho foi caracterizar e diferenciar anatômica e morfologicamente três quimiotipos de Ocimum gratissimum: eugenol, geraniol e timol e fornecer subsídios que contribuam para melhorar o conhecimento do gênero Ocimum. As plantas foram coletadas dos acessos da coleção de plantas medicinais da vitrine tecnológica da Embrapa Sede, Brasília-DF, Brasil. A coleção de O. gratissimum conta com 12 clones de cada quimiotipo, dos quais foram escolhidos aleatoriamente 3 indivíduos para amostragem de folhas para análise anatômica e morfológica. Foram utilizadas folhas padronizadas, do terceiro nó. Os quimiotipos de O. gratissimum estudados apresentaram diferenças nas características morfológicas analisadas e na anatomia do pecíolo e da folha. Os pecíolos e folhas dos quimiotipos Eugenol e Timol tiveram mais semelhanças quando comparado com o quimiotipo Geraniol. Em Geraniol, a folha é mais desenvolvida, há uma maior ocorrência de tricomas tectores quando comparado com os outros dois quimiotipos. Os quimiotipos Geraniol e Timol possuem raras reentrâncias, diferentemente do quimiotipo Eugenol que apresentam estas em abundância. Os quimiotipos de O. gratissimum estudados apresentaram a mesma resposta para os diversos reagentes no teste histoquímico, diferindo apenas com o reagente Cloreto de Ferro III que deu reação positiva no pecíolo do quimiotipo Eugenol e negativo nos pecíolos. Palavras chaves: Ocimum gratissimum, eugenol, timol, geraniol, anatomia, morfologia. 5

16 ABSTRACT The aim of the present work was to describe and compare the anatomy and the morphology of three chemotypes of Ocimum gratissimum as eugenol geraniol and thymol ando to offer information to improve the knowledge of the genus Ocimum. Plants were collected in the gardens of the Embrapa-Tecnological Exhibition in Brasília- Brazil. The collection of Ocimum gratissimum have 12 clones of each chemotype. We picked samples randomly from only three accesses. For morphologic and anatomical analysis leaves were collected as a pattern from the thirty knot. The chemotypes showed morphological and anatomical differences mainly in the petiole and in the leaf sheet.the petioles and leaves from chemotypes eugenol and thymol were more similar one to each other than geraniol type for petioles and leaves. In the geraniol type leaves were more developed and presented more simple trichomes when compared to the others. The chemotypes geraniol and thymol presented rare concavities compared to the eugenol type where the concavities were abundant. In general the chemotypes studied presented the same reaction to the reagents tested exception to iron chloride III which reacted positive only in eugenol-type petiole. Key words: Ocimum gratissimum, eugenol, timol, geraniol, anatomy, morphology. 6

17 INTRODUÇÃO Sendo um país de grande extensão territorial e condições climáticas favoráveis, o Brasil possui uma grande biodiversidade vegetal onde se insere uma grande diversidade de plantas com propriedades terapêuticas, conseqüentemente, de grande utilidade à população. Entre as principais famílias botânicas representantes de plantas medicinais está a Lamiaceae (= Labiatae), pertencente à Ordem Tubiflorae. No gênero Ocimum é comum a ocorrência de hibridação e poliploidização, e por isso tem-se criado confusão nas classificações taxonômicas dificultando o entendimento das relações genéticas entre as diversas cultivares. O gênero Ocimum compreende plantas ricas em óleos essenciais destinados às indústrias para produção de fármacos, perfumes e cosméticos. Os óleos essenciais de O. gratissimum podem ser classificados em três grupos químicos: eugenol, geraniol e timol. A espécie Ocimum gratissimum Lineu, conhecida como alfavaca, alfavaca-cravo ou alfavacão, é um subarbusto aromático, originário da África e subespontâneo em todo o território brasileiro (Lorenzi & Matos, 2002). As folhas e flores da alfavaca são utilizadas na forma de infusão, decocção ou em preparação de xaropes, como carminativos, estimulantes, sudoríficos, febrífugos, diuréticos, sendo recomendados nas tosses e bronquites. Os seus componentes químicos tornam-na utilizável como anti-séptico e antifúngico, apresentando ação contra alguns fungos tais como Aspergillus sp, dermatófitos e Trichoderma sp e bactérias como Staphylococcus sp. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar e diferenciar anatômica e morfologicamente três quimiotipos da espécie Ocimum gratissimum: eugenol, geraniol e timol. 7

18 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Plantas medicinais Pode-se dividir a história do uso de plantas medicinais e aromáticas pelo homem em quatro períodos: o da Antiguidade; outro das civilizações clássicas dos gregos e romanos; um terceiro da idade Média, que inclui as grandes explorações e o colonialismo; e a dos tempos modernos (Giacometti, 1989). O uso de plantas medicinais na atualidade pode ser dividido em duas partes: a primeira que é feita de maneira empírica pela população de uma maneira geral e uma segunda que é realizada com base em trabalhos científicos onde se procura conhecer as classes de substâncias produzidas pelas plantas e o efeito que exercem sobre o organismo humano. Atualmente, poucas plantas medicinais são estudadas de acordo com protocolos modernos (Lapa et al., 1999). A validação prévia de uma planta como medicamento passa pela etapa de estudos botânicos (relacionados à identificação do material em estudo), a farmacêutica, os ensaios biológicos pré-clínicos e a clínica (Lapa et al., 1999). De acordo com Oliveira et al. (1999) e Farias (2001), a verificação da autenticidade de uma amostra vegetal é dada pelos parâmetros de identidade botânica; as descrições macro e microscópicas são fundamentais para a análise de amostras pulverizadas, que é bastante complexa; nesse caso, estruturas microscópicas características e diferenciais permitem as análises preliminares, que devem ser complementadas com análises químicas. Família Lamiaceae Entre as principais famílias botânicas representantes de plantas medicinais está a Lamiaceae (= Labiatae), que é uma das maiores famílias de Angiospermas, na qual existe uma incerteza quanto ao número de gêneros e espécies. Em Hedge (1992), a Lamiaceae é composta por 200 gêneros e cerca de espécies; em Hay & Waterman (1993), a família compreende cerca de 200 gêneros e a espécies; em Souza & Lorenzi (2005), atribui-se 300 gêneros e espécies; já em Royal Botanic Garden (2008), são 240 gêneros e espécies. No National Genetic Resources Program/Germplasm Resources Information Network ARS-GRIN estão catalogados 163 gêneros e espécies. 8

19 A Família Lamiaceae é representada por diversas plantas medicinais e condimentares, tais como, erva cidreira (Hyptis sp.), alfazema (Lavandula sp.), cordãode-frade (Leonotis sp.), Macaé (Leonurus sp.), cordão-de-são-francisco (Leucas sp.), malvão (Marrubium sp.), paracari (Marsypianthes sp.), erva-cidreira (Melissa sp.), hortelã (Mentha sp.), alfavaca (Ocimum sp.), orégano (Origanum sp.), boldo (Plectranthus sp.), alecrim (Rosmarinus sp.), sálvia (Salvia sp.) e tomilho ( Thymus sp.) (Lorenzi & Matos, 2002). A grande importância econômica da família Lamiaceae se deve principalmente aos óleos essenciais produzidos nos pêlos ou tricomas glandulares (Fahn, 1979). Tricomas glandulares são estruturas secretoras freqüentemente presentes nas Lamiaceae que secretam óleos essenciais, variando o número de células secretoras, o comprimento da célula peduncular, a quantidade do óleo secretado, a densidade e seu arranjo na epiderme (Metcalfe & Chalk, 1983). São encontrados basicamente dois tipos de pêlos glandulares nesta família: os peltados e os capitados. Em geral, cada tipo de tricoma glandular apresenta uma célula basal, situada na epiderme, suportando um pedúnculo ou colo, com 1-3 células, e uma célula apical, quando são tricomas glandulares capitados, ou 4-10 células no ápice quando se trata de tricomas glandulares peltados (Hay & Waterman, 1993). Werker et al. (1985) estudaram a estrutura anatômica dos tricomas secretores de algumas espécies de Lamiaceae e verificaram que os tricomas peltados e capitados diferem na morfologia, início e duração da atividade secretora, modo de secreção e tipo de material secretado. Gênero Ocimum O gênero Ocimum compreende plantas ricas em óleos essenciais destinados às indústrias para produção de fármacos, perfumes e cosméticos. Os óleos essenciais de O. gratissimum podem ser classificados em três grupos químicos: eugenol, geraniol e timol. É comum a ocorrência de hibridação e poliploidização, e por isso tem-se criado confusão nas classificações taxonômicas dificultando o entendimento das relações genéticas entre as diversas cultivares. Para dificultar um pouco mais a taxonomia deste gênero, ocorrem muitas variedades botânicas, cultivares e tipos químicos dentro das espécies e que podem não se diferenciar morfologicamente (Simon, 1999). 9

20 Segundo Darrah (1974/1980), métodos como a análise dos estômatos e a análise do número de cromossomos têm-se mostrado inconsistentes na classificação dessas plantas. O autor sugere um outro método mais eficiente, porém, ainda longe do ideal para se identificar as espécies: a classificação química. Esse tipo de classificação leva em consideração o tipo de óleo presente em cada planta. Os tricomas glandulares ocorrem nas duas faces da folha nos representantes do gênero Ocimum, sendo que o número de tricomas glandulares, por unidade de área, é diferente entre as superfícies abaxial e adaxial e ainda, entre as porções apical, mediana e basal da folha Hay & Waterman (1993). Segundo Bosabalidis & Tsekos (1984), no gênero Ocimum é comum a ocorrência de 4 células constituindo o ápice ou cabeça do tricoma. Descrição Botânica de Ocimum gratissimum Sulistiarini (1999) descreve o alfavacão (Ocimum gratissimum), como uma planta perene com altura variando de 1 a 3 m, caule ereto com secção de redonda a quadrangular, bem ramificado, lenhoso na base, freqüentemente com a periderme soltando em faixas. Folhas opostas; pecíolo 2 a 4,5 cm de comprimento, delgado, pubescente; limbo elíptico ou ovalado, 1,5 a 16 cm x 1 a 8,5 cm, membranoso, base cuneada, inteiro, margem crenado-serreada. Inflorescência em verticilos arrumados num rácemo de 5 a 30 cm de comprimento, 6 a 10 flores em cada verticilo, pequenas, hermafroditas; 4 estames, declinados, em 2 pares, insertos no tubo da corola; ovário superior, 2 carpelos bicelulados. Frutos consistindo de quatro núculas inclusas no cálice persistente cada uma com uma semente (lábio inferior junto à boca do cálice do fruto). 10

21 METODOLOGIA Procedimentos Gerais Foram estudados 3 (três) quimiotipos de O. gratissimum: eugenol, geraniol e timol, coletados dos acessos da coleção de plantas medicinais da vitrine tecnológica da Embrapa Sede, Brasília-DF, Brasil (Figura 1.1). A coleção de O. gratissimum conta com 12 clones de cada quimiotipo, dos quais foram escolhidos aleatoriamente 3 indivíduos para amostragem de folhas para análise anatômica e morfológica. Foram utilizadas folhas padronizadas, do terceiro nó, que foram separadas em três lotes. O primeiro destinado a testes histoquímicos, o segundo utilizado para a confecção de lâminas histológicas, e o terceiro para estudo do padrão de venação foliar. Todos os lotes foram fixados em FAA 70% e armazenados em álcool 70%. A análise anatômica foi realizada no laboratório de Anatomia Vegetal, da Universidade de Brasília (UnB), no período de agosto a outubro de As observações e ilustrações foram feitas em fotomicroscópio Olympus e em microscópio Zeiss equipado com câmara digital. Arquitetura Foliar Para estudo da venação foliar, as folhas passaram pelo processo de diafanização, que consiste em tratar amostras biológicas de modo a torná-las semitransparentes. Seguiu-se a metodologia de Shobe & Lersten, 1967, com modificações. As folhas, fixadas em FAA 70%, foram acondicionadas em água e lavadas com sabão de coco; em seguida lavadas em água destilada, por 1(uma) hora. Depois, o material ficou imerso 24 (vinte e quatro) horas no hidróxido de sódio 20%, com trocas a cada 2 horas. Após este período, as folhas foram lavadas várias vezes, com água destilada, até a remoção completa do hidróxido de sódio. Posteriormente o material ficou submerso em hipoclorito de sódio 10% até clarificar, então as folhas foram lavadas em água destilada até a remoção do hipoclorito, e seguiram para a desidratação etanólica crescente, de 70, 90 e 100%, passando 1 (uma) hora em cada série. As folhas foram coradas com safranina-etanólica 1% (1:1), durante 1 (um) minuto, em seguida, passadas em acetato-etanol 1:1, e em acetato 100%. As folhas foram montadas em resina sintética (Paiva, et al., 2006). Para a descrição da arquitetura foliar foi utilizado Hickey 1973 e

22 1.1A 1.1B 1.1C Figura Coleção de plantas medicinais da vitrine tecnológica da Embrapa Sede/Brasília-DF. 1.1A). Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.1B). Ocimum gratissimum quimiotipo Geraniol. 1.1C). Ocimum gratissimum quimiotipo Timol.

23 Cortes Transversais Para a obtenção de cortes finos foi utilizado o micrótomo de mão e os cortes realizados foram transferidos para um recipiente contendo água destilada. O clareamento dos cortes foi feito utilizando solução de hipoclorito de sódio comercial a 10% por 15 (quinze) minutos e hipoclorito de sódio a 50% por 10 (dez) minutos. Com o fim da fase de clareamento, os cortes foram transferidos em seguida para outro recipiente com água destilada e enxaguados abundantemente. O corante utilizado para evidenciar as estruturas celulares foi o azul de alcian/safranina (4:1), por 20 segundos. Após a coloração, os cortes foram transferidos para outro recipiente com água destilada e enxaguados até a retirada do excesso do corante. Em seguida os cortes foram colocados em álcool 50% por 1 (um) minuto e depois passados em álcool comercial. Logo após, os cortes passaram por uma seqüência de acetato de butila (3;1, 1;1, 1:3 e acetato de butila puro), nesta ordem. As lâminas foram montadas e fixadas com resina sintética ( Paiva, et al., 2006). Foram montadas 3 (três) lâminas com (3) três cortes em cada, servindo como repetição. O estudo das estruturas foi realizado em microscópio óptico. Testes Histoquímicos Para os testes histoquímicos foram feitos cortes utilizando o micrótomo de mão. Os cortes foram submetidos a reagentes específicos: Vermelho de Rutênio (Johansen, 1940) para evidenciar as pectinas. Os cortes foram transferidos para o vidro relógio, onde foi colocado o reagente vermelho de rutênio a 1000 p.p.m, durante 10 (dez) minutos. Em seguida os cortes foram lavados com água destilada. As lâminas foram montadas com glicerina 1/1. Sudan IV (Jensen, 1962) para a evidenciação de compostos de natureza lipídica. Os cortes foram colocados em vidro relógio, onde foi adicionado o reagente Sudan IV, por 30 (trinta) minutos. O vidro relógio foi coberto para evitar a evaporação do reagente. Em seguida os cortes foram lavados em etanol a 90%. As lâminas foram montadas com glicerina 1/1. Ácido Tânico/ Cloreto de Ferro III (Pizzolato & Lillie, 1973) foram utilizados para a identificação das mucilagens. Os cortes foram colocados em vidro relógio, onde foi adicionado Ácido Tânico a 5%, durante 10 (dez) minutos. Em seguida os cortes foram lavados com água destilada. Após a lavagem com água destilada, os cortes foram 13

24 colocados em solução de Cloreto de Ferro III a 3 %, por 1 minuto, e depois lavados com água destilada. As lâminas foram montadas com glicerina 1/1. Cloreto de Ferro III (Johansen, 1940) para a detecção de fenóis simples. Os cortes foram colocados em vidro relógio, onde foi adicionado Cloreto de Ferro III, durante 30 (trinta) minutos. Em seguida os cortes foram lavados com água destilada. As lâminas foram montadas com glicerina 1/1. 14

25 RESULTADOS E DISCUSSÃO Arquitetura Foliar As folhas do quimiotipo Eugenol são pecioladas, simples, inteiras de textura cartácea com tricomas tectores multicelulares recobrindo todo o limbo. As folhas não apresentam glândulas no limbo, têm ápice acuminado, margens dentadas serradas com base e ápice convexos. A forma é ovalada com base acunheada. As folhas são peninérveas, camptódromas do tipo eucamptódroma e com nervura primária de orientação reta e de tamanho robusto. Sete pares de nervuras secundárias originam-se alternadamente divergindo gradualmente em ângulos agudos (menores que 45º). A variação na divergência dos ângulos é aproximadamente uniforme. A espessura das nervuras secundárias é moderada e seus cursos são retos. As nervuras intersecundárias são simples. As nervuras terciárias originam-se em ângulos predominantemente retos por toda a folha com padrão reticulado ortogonal e arranjo predominantemente alternado. Em relação à nervura primária, as nervuras terciárias apresentam ângulo oblíquo constante. As nervuras quaternárias podem ser distinguidas. Possuem tamanho fino em comparação com as nervuras de ordens inferiores com curso ortogonal. As folhas não possuem vênulas. As aréolas possuem desenvolvimento incompleto, arranjo orientado, forma quadrangular e tamanho grande. Os detalhes da folha de O. gratissimum quimiotipo Eugenol podem ser observados na Figura 1.2, onde constam detalhes da lâmina foliar, das aréolas, da margem da folha, da nervura principal e das nervuras secundárias. A lâmina foliar do quimiotipo Geraniol é simétrica e tem forma ovalada estreita, com ápice e base agudos, sendo a base decorrente. O eixo básico de orientação da folha é apical. A margem é revoluta na face abaxial e apresenta serrações convexas, as quais possuem sinus em curva. O pecíolo é alado. O tipo de venação é pinado craspedódromo simples. A nervura primária segue um curso reto. As nervuras secundárias têm ângulo de divergência agudo moderado, em torno de 50, curso uniformemente curvado e possuem ramificações de ordem secundária, formam áreas intercostais. As nervuras terciárias apresentam-se aleatoriamente reticuladas e seu arranjo é fechado, sendo a distância entre elas menor que 0,5cm. As aréolas são incompletamente fechadas, o que nos permite observar tamanhos e formas anômalas. Encontram-se em arranjo aleatório. As terminações vasculares podem ser simples ou ramificadas uma ou duas vezes. A venação última marginal é curva. 15

26 Os detalhes da folha de O. gratissimum quimiotipo Geraniol podem ser observados na Figura 1.3, onde constam detalhes da lâmina foliar, das aréolas, da margem da folha, da nervura principal e das nervuras secundárias. As folhas do quimiotipo Timol são pecioladas, simples, pilosas e de textura cartácea. As folhas têm suas formas laminares simétricas com base assimétrica, o limbo tem o formato elíptico. O ápice é acuminado, a margem é crenada, a base é de formato decorrente e não apresenta glândulas foliares. As folhas são peninérveas, craspedódromas e com nervura primária de orientação reta. As nervuras secundárias originam alternadamente em ângulos agudos. As veias terciárias originam em ângulos retos, partindo de uma nervura secundária a outra secundária ou primária, o que formam arcos maiores. As nervuras de quarta ordem são regulares poligonais reticuladas e não formam aréolas. Os detalhes da folha de O. gratissimum quimiotipo Timol podem ser observados na Figura 1.4, onde constam detalhes da lâmina foliar, das aréolas, da margem da folha, da nervura principal e das nervuras secundárias. A Tabela 1.1. mostra as principais características morfológicas da folha dos quimiotipos de O. gratissimum. O quimiotipo Eugenol possui margens dentadas serradas, base e ápice convexos, arranjo alternado, venação camptódroma e formato ovalado. O quimiotipo Geraniol possui margem revoluta com serrações convexas, base e ápice agudos, arranjo fechado, venação craspedódroma e formato ovalado estreito. Já o quimiotipo Timol possui margem crenada, base aguda, ápice acuminado, arranjo alternado, venação craspedódroma e formato elíptico. Observa-se que a morfologia das folhas nos diversos quimiotipos de O. gratissimum foram diferentes em diversos parâmetros analisados. Labra et al (2004) descreveram as características morfológicas de nove acessos de Ocimum basilicum, registrando dois acessos de folha pequena, seis acessos de folhas medianas e uma de folha grande, sendo que sete dos acessos apresentaram folhas de limbo ovalado e duas de limbo lanceolado. Os formatos dos limbos encontrados na maioria dos acessos estudados por Labra et al. (2004) foram os mesmos apresentados em O. gratissimum quimiotipos eugenol e geraniol, diferindo apenas em relação ao formato do limbo elíptico apresentado pelo O. gratissimum quimiotipo timol. 16

27 1.2A 1.2B 1.2C 1.2D Figura 1.2 Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.2A). Vista geral da lâmina foliar. 1.2B). Detalhe das aréolas com desenvolvimento incompleto, arranjo orientado e forma quadrangular. 1.2C). Margem da folha do tipo dentada serrada com base e ápice convexos. 1.2D). Detalhe da nervura principal e das nervuras secundárias. Nota-se os ângulos agudos, espessura moderada e curso reto.

28 1.3A 1.3B 1.3C 1.3D Figura 1.3 Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo Geraniol. 1.3A). Vista geral da lâmina foliar com forma ovada estreita, base e ápice agudos. 1.3B). Detalhe das aréolas incompletamente fechadas, com arranjo aleatório. 1.3C). Margem da folha do tipo revoluta com serrações convexas com sinus em curva. 1.3D). Detalhe da nervura principal e das nervuras secundárias com ângulo de divergência agudo e curso curvado.

29 1.4A 1.4B 1.4C 1.4D Figura 1.4 Arquitetura Foliar de Ocimum gratissimum quimiotipo Timol. 1.4A). Lâmina foliar com formato elíptico, perinérveas, craspedódromas. 1.4B). Detalhe das aréolas. 1.4C). Margem da folha do tipo crenada. 1.4D). Nervura principal e nervuras secundárias alternas em ângulo agudo.

30 Tabela 1.1. Características morfológicas da folha de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol. Eugenol Geraniol Timol Margens Revoluta com Dentadas serrações serradas convexas Crenada Base Convexo Agudo Agudo Ápice Convexo Agudo Acuminado Arranjo Alternado Fechado Alternado Peninérveas, Pinado camptódromas Peninérveas, Venação craspedódromo do tipo craspedódromas simples eucamptódroma Formato do limbo Ovalada Ovalada Estreita Elíptica Pecíolo O pecíolo em secção transversal exibe contorno semi-cilíndrico, exceto no quimiotipo Geraniol que na face adaxial apresenta saliências (Figura 1.6A). No quimiotipo Eugenol o pecíolo tem estrutura primária com início de crescimento secundário (Figura 1.5A). A epiderme é uniestratificada recoberta por cutícula delgada; esta se diferencia em células epidérmicas comuns retangulares com conteúdo citoplasmático não identificado, tricomas tectores unisseriados e pluricelulares além de tricomas glandulares (Figuras 1.5B e 1.5D). Os quimiotipos Timol e Geraniol apresentam os mesmos tipos celulares, entretanto, no quimiotipo Geraniol a cutícula é mais delgada e os tricomas em maior quantidade. O córtex do quimiotipo Eugenol (Figura 1.5C) é preenchido por até dez camadas de colênquima anelar (3-10), seguido pelo parênquima fundamental, formado por células isodiamétricas contendo grãos de amido e cristais prismáticos variando de cinco a oito camadas (5-8). Na última camada do córtex as células são justapostas e contêm amido, constituindo a bainha amilífera. O quimiotipo Timol (Figura 1.7C) difere apenas quanto ao número de camadas do colênquima anelar que varia de duas a seis (2-6) e do parênquima com seis a nove camadas (6-9). O quimiotipo Geraniol (Figura 1.6C e 1.6E) difere de ambos por apresentar na face adaxial duas a três (2-3) camadas de colênquima angular interrompidas nas laterais onde ocorrem duas a três (2-3) camadas de pequenas células isodiamétricas de parênquima clorofiliano com grandes espaços intercelulares, e 20

31 na face abaxial está presente novamente colênquima angular e em alguns locais colênquima anelar seguido de quatro a nove camadas de tecido parenquimático (4-9), e por não apresentar bainha amilífera. Na região central do quimiotipo Eugenol se encontra o tecido vascular em forma de arco aberto interrompido (Figura 1.5A). Nas extremidades do arco na face adaxial ocorrem seis traços foliares. O arranjo do sistema vascular é colateral. Fibras envolvem o floema primário com cinco a dez camadas (5-10), onde podemos identificar os elementos de tubo crivado e células companheiras, e o floema secundário já se diferenciando (Figura 1.5E). Nessa região visualizam-se células contendo cristais. Os quimiotipos Timol e Geraniol apresentam a mesma configuração diferindo apenas quanto ao número de camadas. No quimiotipo Timol (Figura 1.7B e 1.7C) variam de quatro a onze (4-11) e no quimiotipo Geraniol (Figura 1.6B) de seis a dez camadas (6-10). O câmbio vascular está presente no interior dos feixes vasculares no quimiotipo Eugenol (Figura 1.5 E), e em alguns locais notam-se até cinco camadas de células cambiais se diferenciando (até 5), com formato achatadas radialmente. No quimiotipo Timol ocorrem de duas a seis (2-6) de formato irregular, enquanto no quimiotipo Geraniol uma a duas camadas de forma também irregular. No quimiotipo Eugenol encontra-se xilema secundário com vaso variando de dois a cinco (2-5) e resquícios de xilema primário envolto por células parenquimáticas. No quimiotipo Timol podemos distinguir os vasos de metaxilema e protoxilema de dois a três. Já o quimiotipo Geraniol diferem de ambas, a região cambial é menos desenvolvida assim como a formação de tecidos secundários, que apresentam células maiores com paredes mais finas, um a três vasos de metaxilema (1-3) e dois a quatro de protoxilema (2-4). No quimiotipo Eugenol, a medula está constituída por células parenquimáticas de formato isodiamétricas constituindo espaços intercelulares triangulares. Essas células contêm cristais e grãos de amido. Os quimiotipos Timol e Geraniol diferem por apresentar maior quantidade de cristais e grãos de amido. Observa-se que a anatomia do pecíolo nos diversos quimiotipos de O. gratissimum foram diferentes em vários parâmetros analisados. As principais características que diferenciam o quimiotipo Geraniol dos outros dois quimiotipos são: o formato do pecíolo mais achatado, a maior ocorrência de tricomas tectores e glandulares, e a maior faixa de ausência de colênquima na lateral do pecíolo. A maioria 21

32 dos parâmetros analisados difere quanto ao número de camadas nos três quimiotipos de O. gratissimum. As características anatômicas do pecíolo dos três quimiotipos de O. gratissimum podem ser visualizadas na Tabela 1.2. Os detalhes do pecíolo de O. gratissimum quimiotipos Eugenol, Geraniol e Timol podem ser observados nas Figuras 1.5, 1.6 e 1.7, respectivamente. Lâmina foliar. Em corte transversal a lâmina foliar do quimiotipo Eugenol é linear com reentrâncias em ambas as faces, sendo mais freqüentes na face abaxial. Na região entre a nervura principal e o bordo, nota-se que a epiderme na face adaxial possui células de maiores dimensões que na face abaxial. Os quimiotipos Geraniol e Timol diferem do anterior por apresentarem células de maiores dimensões e raras reentrâncias na face adaxial. No quimiotipo Eugenol a epiderme unisseriada está recoberta por uma delgada cutícula (Figura 1.8A). Na face adaxial está constituída por células epidérmicas comuns, estômatos, tricomas tectores unisseriados pluricelulares e glandulares. As folhas são anfiestomáticas com cavidades subestomáticas, os estômatos estão situados no mesmo nível das demais células epidérmicas. Os tricomas tectores são unisseriados geralmente bicelulares, curtos, largos e pontiagudos, raros tricelulares (Figuras 1.8A e 1.8C). Os tricomas glandulares são de dois tipos. Um ocorre no mesmo nível das demais células epidérmicas com uma célula basal, pedúnculo e uma célula apical; o outro ocorre nas reentrâncias, apresentando duas células basais, pedúnculo e duas células apicais, ambos recobertos por cutícula. Na face abaxial, ocorre maior número de tricomas tectores, apresentando até cinco células e geralmente com duas células basais, são raros os bicelulares. Já no quimiotipo Timol a cutícula é mais espessa, na face adaxial são raros os tricomas tectores e glandulares; na face abaxial ocorrem somente tricomas tectores bicelulares e os dois tipos de glandulares (Figuras 1.10A e 1.10B). No quimiotipo Geraniol (Figuras 1.9A e 1.9B) na face adaxial além dos tricomas descritos ocorrem tricomas longos com até sete células, algumas colapsadas e tricoma glandular com uma única célula apical, diferindo dos demais. 22

33 Tabela 1.2. Características anatômicas do pecíolo de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol. O. gratissimum quimiotipo Eugenol O. gratissimum quimiotipo Geraniol O. gratissimum quimiotipo Timol Formato Semicilíndrico Semicilíndrico Semicilíndrico Cutícula Delgada Delgada Delgada Felogênio Ausente Ausente Ausente Epiderme Córtex Floema Primário Tipos celulares Tricomas tectores e glandulares Tricomas tectores e glandulares Tricomas tectores e glandulares Células comuns 1 camada 1 camada 1 camada Estômatos Ausente Estômato com cripta estomática Ausente Estratificação Uniestratificada Uniestratificada Uniestratificada Conteúdo citoplasmático Não identificado Cristais e grãos de amido Cristais e grãos de amido Parênquima 5-8 camadas (fundamental) 4-9 camadas (fundamental) 6-9 camadas (fundamental) Colênquima 3-7 camadas (Anelar) 2-6 camadas (Anelar) 2-6 camadas (Anelar) Conteúdo citoplasmático Grãos de amido e cristais prismáticos Grãos de amido e cristais prismáticos Grãos de amido e cristais prismáticos Número de camadas Conteúdo citoplasmático Cristais prismáticos e ráfides Cristais prismáticos e ráfides Cristais prismáticos e ráfides Observações Feixes vasculares isolados Feixes vasculares isolados Feixes vasculares isolados Câmbio Número de camadas 3-5 (desuniforme) 1-2 (desuniforme) 2-6 (desuniforme) vascular Formato das células Achatadas radialmente Forma variada Forma variada Xilema Primário Medula Metaxilema Protoxilema Tecido que envolve Parenquimático axial Parenquimático axial Parenquimático axial Conteúdo citoplasmático Ausente Poucos cristais e ráfides Ausente Número de camadas Conteúdo citoplasmático Cristais e grãos de amido Cristais, ráfides e grãos de amido Cristais e grãos de amido Formato das células Arredondadas Arredondadas Arredondadas

34 1.5A 1.5B 1.5C 1.5D 1.5E Figura 1.5 Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.5A). Visão geral do pecíolo com contorno semi-cilíndrico. 1.5B). Detalhe da epiderme com tricomas tectores unisseriados, pluricelulares e tricomas glandulares, colênquima anelar e parênquima clorofiliano. 1.5C). Detalhe da lateral do pecíolo com tricomas glandulares. Nota-se ausência de colênquima somente nessa região. 1.5D). Detalhe dos tricomas glandulares. 1.5E). Detalhe do sistema vascular em arco aberto.

35 1.6A 1.6B 1.6C 1.6D 1.6E Figura 1.6 Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Geraniol. 1.6A). Visão geral do pecíolo com contorno semi-cilíndrico. 1.6B). Detalhe da epiderme com tricomas tectores unisseriados pluricelulares. 1.6C). Detalhe da lateral do pecíolo com tricomas glandulares. Nota-se ausência de colênquima somente nessa região. 1.6D). Sistema vascular em arco aberto com crescimento secundário e medula parenquimática. 1.6E). Detalhe dos tricomas glandulares na região lateral do pecíolo.

36 1.7A 1.7B 1.7C 1.7D Figura 1.7 Corte transversal do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Timol. 1.7A). Visão geral do pecíolo com contorno semi-cilíndrico. 1.7B). Detalhe da epiderme com raros tricomas tectores. 1.7C). Detalhe da lateral do pecíolo com tricomas glandulares. Nota-se ausência de colênquima somente nessa região. 1.7D). Sistema vascular em arco aberto com crescimento secundário e medula parenquimática.

37 O mesofilo possui organização dorsiventral (Figura 1.8A). O parênquima paliçádico apresenta geralmente duas camadas de células, as quais se tornam arredondadas próximas aos feixes vasculares de menor calibre. O parênquima lacunoso é constituído de células de tamanhos e formas irregulares. Cristais podem ser encontrados no parênquima paliçádico e no parênquima lacunoso. Na região do bordo, as células da epiderme bem como as do parênquima clorofiliano são isodiamétricas (Figura 1.8C). No quimiotipo Timol (Figura 1.10A) no parênquima lacunoso as células são lobadas e a quantidade de cristais é maior. O quimiotipo Geraniol (Figura 1.9A) difere de ambos pela única camada de parênquima paliçádico, maior quantidade de cristais além de amido em ambos os tecidos. Segundo (Martins et al., 2008) a folha de O. gratissimum foi caracterizada como dorsiventral e anfihipoestomática, sendo as epidermes adaxial e abaxial uniestratificadas e o parênquima paliçádico constituído por camada única de células, enquanto que o parênquima lacunoso apresentou variações de quatro a seis camadas, diferindo das nossas observações em O. gratissimum quimiotipos eugenol e timol que apresentaram 2 camadas de parênquima paliçadico. Na região entre a nervura principal e o bordo ocorrem feixes vasculares de dois calibres (Figura 1.8B). Os maiores situados na região das nervuras secundárias estão envolvidos por uma camada de células aclorofiladas, alongadas paralelamente à superfície do órgão, a endoderme, sem conteúdo aparente. Ocorre extensão parenquimática da bainha de feixe, uni ou bisseriada para a face adaxial. Na face abaxial o feixe está rodeado por células parenquimáticas isodiamétricas. Não se diferencia parênquima lacunoso. Os feixes de menor calibre são semelhantes, mas não apresentam extensão da bainha de feixe. Essa região é semelhante em todos os quimiotipos estudados. A nervura principal apresenta secção transversal convexo-convexa no quimiotipo Geraniol com saliências na face adaxial nos quimiotipos Timol e Eugenol. As células epidérmicas comuns são menores e alongadas com cutícula mais espessa, além dos tricomas descritos ocorrem na face adaxial longos tricomas com até sete células, algumas células estão colapsadas (Figura 1.8D). O colênquima angular encontra-se em posição sub-epidérmica, com até oito camadas no arco adaxial e três no abaxial. Este tecido também pode ser observado adjacente ao floema, externamente ao feixe vascular. A seguir encontram-se 7 camadas de células isodiamétricas de parênquima fundamental delimitando espaços intercelulares triangulares. O sistema 27

38 vascular central é constituído por feixe colateral, e está organizado na forma de um arco aberto interrompido na região central voltado para a face adaxial, semelhante ao presente no pecíolo, ocorrem três feixes menores também voltados para a face adaxial. Nota-se crescimento secundário. No quimiotipo Timol o sistema vascular apresenta forma côncava com uma pequena saliência na face adaxial, com até 5 camadas de parênquima. O arco é mais fechado, com maior quantidade de elementos de vaso. No quimiotipo Geraniol o sistema vascular apresenta forma convexo-convexa com oito camadas de parênquima com células maiores. O colênquima angular tem na face adaxial até sete camadas e 1-2 na face abaxial. Observa-se que a anatomia da folha nos diversos quimiotipos de O. gratissimum foram diferentes em vários parâmetros analisados. Os quimiotipos Eugenol e Timol possuem maior semelhança quando comparados com o quimiotipo Geraniol. No quimiotipo Geraniol, a folha é mais desenvolvida e há uma maior ocorrência de tricomas tectores quando comparado com os outros dois quimiotipos. Os quimiotipos Geraniol e Timol possuem raras reentrâncias, diferentemente do quimiotipo Eugenol que as apresentam em abundância. Martins et al., 2008, verificaram tricomas tectores pluricelulares e tricomas glandulares captados e peltados na face adaxial e abaxial de folhas de O. gratissimum, corroborando os dados observados nos três quimiotipos abordados no presente trabalho. Costa et al., (2007), estudando Mentha, observou que os estômatos do tipo diacítico estão posicionados no mesmo nível das demais células da epiderme e são encontrados nas duas faces foliares praticamente com o mesmo tamanho, mas em maior densidade na superfície abaxial, enquadrando a folha na classificação de hipoanfiestomática. Tricomas glandulares peltados e capitados foram observados, em Mentha, nas duas faces foliares enquanto a ocorrência de tricomas tectores unicelulares e pluricelulares foi verificada apenas na face adaxial da folha. Em todos os tratamentos a densidade de tricomas glandulares peltados é maior na superfície adaxial, mas os tricomas capitados estão quase sempre em maior número na face abaxial (Costa et al., 2007). Adjuto (2008), estudando cortes anatômicos das folhas de seis acessos de Mentha spp (Labiatae) comercializados em feiras e supermercados, encontrou tricomas não glandulares nos acessos (Mentha sp. x M. x villosa) e (Mentha spicata x M. suaveolens). Os seis acessos de Mentha analisados apresentaram os dois tipos de 28

39 tricomas glandulares: peltado e capitado. O tricoma capitado foi encontrado em maior quantidade em relação ao tricoma peltado, sendo este presente apenas na face abaxial. A epiderme nos seis acessos apresentou-se como unisseriada e o mesofilo é dorsiventral ou bifacial (quando o parênquima paliçadico aparece apenas na porção adaxial). As características anatômicas da folha dos três quimiotipos de O. gratissimum podem ser visualizadas na Tabela 1.3. Os detalhes da folha de quimiotipo Eugenol, Geraniol e Timol podem ser observados nas Figuras 1.8, 1.9 e 1.10, respectivamente. 29

40 Tabela 1.3. Características anatômicas da folha de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol. Cutícula Presente (espessura) O. gratissimum quimiotipo Eugenol O. gratissimum quimiotipo Geraniol O. gratissimum quimiotipo Timol Delgado Delgado Delgado Obs. Mais espessa que geraniol. Epiderme Córtex Floema Primário Nervura principal Tricomas Tricomas glandulares e tectores Tricomas glandulares e tectores Tricomas glandulares e tectores Células epidérmicas comuns Presente Presente Presente Estômatos Presente Presente Presente Estratificação Uniestratificada Uniestratrificada Uniestratificada Conteúdo citoplasmático Grãos de amido Grãos de amido Grãos de amido Parênquima (nº de camadas) 5-7 camadas preenchimento 5-7 camadas preenchimento 5-6 camadas preenchimento Colênquima (nº de camadas) 8-5 camadas angular 1-3 camadas Não observado Parênquima (nº de camadas) 2 de paliçádico e 4-6 lacunoso 1.paliçádico 2 de paliçádico e 2-4 de lacunoso Grãos de amido e cristais prismáticos Grãos de amido e cristais Grãos de amido Conteúdo Citoplasmático prismáticos Nº de camadas 4-7 camadas 3-5 camadas 5-8 camadas Conteúdo citoplasmático Grãos de amido Grãos de amido e cristais prismáticos Grãos de amido Presença de feixes vasculares Observações isoladas Floema Primário Nº de camadas 1-5 camadas 1-3 camadas 1-3 camadas Lâmina foliar Conteúdo citoplasmático Não observado Grãos de amido e cristais prismáticos Grãos de amido Câmbio Vascular Xilema Primário Nervura principal Xilema Primário - Lâmina foliar Medula Nº de camadas 2-4 camadas 2-3 camadas 2-4 camadas Formato de células Achatados radialmente Achatados radialmente Achatados radialmente Metaxilema (nº de camadas) Protoxilema (nº de camadas) Tecido que envolve Parênquima Parênquima Parênquima Conteúdo citoplasmático Poucos grãos de amido Poucos cristais prismáticos Poucos grãos de amido Metaxilema (nº de camadas) Protoxilema (nº de camadas) Tecido que envolve Parênquima Parênquima Parênquima Conteúdo citoplasmático Não observado Não observado Não observado 1. Periférica Presente Presente Presente Nº de camadas Conteúdo citoplasmático Grãos de amido Cristais prismáticos e clorofila Grãos de amido Formato das células Oval Arredondado Arredondado 2. Não periférica Presente Presente Presente Conteúdo citoplasmático Grãos de amido Clorofila, cristais e grãos de amido Grãos de amido Formato das células Arredondado Arredondado Oval

41 1.8B 1.8A 1.8C 1.8D 1.8E Figura Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.8A). Visão geral da lâmina foliar. 1.8B). Detalhe da nervura secundária. Feixe colateral com extensão para a face adaxial e feixes vasculares menores. 1.8C). Bordo. Nota-se tricomas tectores. 1.8D). Detalhe da nervura principal com sistema vascular em arco aberto. 1.8E). Detalhe do feixe vascular em crescimento secundário.

42 1.9A 1.9B 1.9C 1.9D 1.9E Figura 1.9 Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo Geraniol. 1.9A). Visão geral da folha com ocorrência de tricomas em ambas as faces. 1.9B). Detalhe do bordo. 1.9C). Visão geral da nervura principal. 1.9D). Detalhe da nervura principal com feixe vascular em arco aberto. 1.9E). Detalhe do feixe vascular em crescimento secundário com até 5 elementos de vaso.

43 1.10A 1.10B 1.10C 1.10D 1.10E Figura 1.10 Corte transversal da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo Timol. 1.10A). Visão geral da folha. 1.10B). Detalhe do bordo. 1.10C). Visão geral da nervura principal. 1.10D). Detalhe da nervura principal com feixe vascular em arco aberto. 1.10E). Detalhe do feixe vascular em crescimento secundário.

44 Testes histoquímicos Os cortes da lâmina foliar apresentam reação, com mudança em sua coloração, ao entrarem em contato com determinados reagentes. O corante Sudan IV detecta lipídios, cutina e suberina, que recebem uma tonalidade amarelo-alaranjado ou vermelho. O corante Cloreto de Ferro III modificam a coloração de fenóis, que passam a verde escuro, azul ou negro. O corante Vermelho de Rutênio coram as pectinas de rosa. Já o corante Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III torna as mucilagens em compostos escuros, negros. O pecíolo de O. gratissimum quimiotipo Eugenol deu reação positiva para os reagentes: Sudan IV, Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III e Cloreto de Ferro III. O reagente Vermelho de Rutênio não revelou reação. Já os pecíolos de O. gratissimum quimiotipos Geraniol e Timol apresentaram reação positiva para os reagentes: Sudan IV e Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. Os reagentes Cloreto de Ferro III e Vermelho de Rutênio não revelaram reação. As folhas de O. gratissimum quimiotipos Eugenol, Geraniol e Timol apresentaram reação positiva para os reagentes: Sudan IV, Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III e Cloreto de Ferro III. O reagente Vermelho de Rutênio não revelou reação. Os resultados dos testes histoquímicos da folha e do pecíolo de O. gratissimum quimiotipos Eugenol, Geraniol e Timol podem ser visualizados na Tabela 1.4. Os detalhes dos testes histoquímicos dos pecíolos de O. gratissimum quimiotipos Eugenol, Geraniol e Timol podem ser observados nas Figuras 1.11, 1.12 e 1.13, respectivamente. Já os detalhes dos testes histoquímicos das folhas de O. gratissimum quimiotipos Eugenol, Geraniol e Timol podem ser observados, respectivamente, nas Figuras 1.14, 1.15 e

45 Tabela 1.4. Resultado dos testes histoquímicos em folha e pecíolo de O. gratissimum quimiotipos eugenol, geraniol e timol. Reagentes O. gratissimum quimiotipo Eugenol O. gratissimum quimiotipo Geraniol O. gratissimum quimiotipo Timol Pecíolo Folha Pecíolo Folha Pecíolo Folha Vermelho de Rutênio Sudan IV Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III Cloreto de Ferro III + + _ + _ + + Reação positiva para o reagente _ Não houve reação para o reagente 35

46 1.11A 1.11B 1.11C 1.11D 1.11E 1.11F Figura 1.11 Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.11A). Controle. 1.11B). Sudan IV. 1.11C). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.11D). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.11E). Cloreto de Ferro III 1.11F). Cloreto de Ferro III.

47 1.12A 1.12B 1.12C 1.12D 1.12E Figura 1.12 Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Geraniol. 1.12A). Controle. 1.12B). Sudan IV. 1.12C). Sudan IV. 1.12D). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.12E). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III.

48 1.13A 1.13B 13E 1.13C 1.13D Figura 1.13 Testes Histoquímicos do pecíolo de Ocimum gratissimum quimiotipo Timol. 1.13A). Controle. 1.13B). Sudan IV. 1.13C). Sudan IV. 1.13D). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III.

49 1.14A 1.14B 1.14C 1.14D Figura 1.14 Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo Eugenol. 1.14A). Controle. 1.14B). Sudan IV. 1.14C). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.14D). Cloreto de Ferro III.

50 1.15A 1.15B 1.15C 1.15D Figura 1.15 Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quiomiotipo Geraniol. 1.15A). Controle. 1.15B). Sudan IV. 1.15C). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.15D). Cloreto de Ferro III.

51 1.16A 1.16B 1.16C 1.16D 1.16E Figura 1.16 Testes Histoquímicos da folha de Ocimum gratissimum quimiotipo Timol. 1.16A). Controle. 1.16B). Sudan IV. 1.16C). Sudan IV. 1.16D). Ácido Tânico + Cloreto de Ferro III. 1.16E). Cloreto de Ferro III.