OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE CARRAGENANA OBTIDA DE Kappaphycus alvarezii ATRAVÉS DA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA

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1 OTIMIZAÇÃO DA EXTRAÇÃO DE CARRAGENANA OBTIDA DE Kappaphycus alvarezii ATRAVÉS DA METODOLOGIA DE SUPERFÍCIE DE RESPOSTA Vanessa Webber 1, Sabrina M. de Carvalho 1, Tamara de S. Jorge 1, Paulo J. Ogliari 1, Pedro L. M. Barreto 1 * 1 Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC, Centro de Ciências Agrárias - CCA, Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos CAL, Florianópolis- SC * barreto@cca.ufsc.br Metodologia de superfície de resposta (RSM) com planejamento composto central (CCD) composto de dois fatores e cinco níveis foi utilizada para obtenção das condições ótimas de extração de carragenana obtida da alga marinha Kappaphycus alvarezii. Os efeitos da temperatura e do tempo de extração foram determinados. As respostas analisadas foram rendimento da extração (%) e força do gel (g. cm -2 ) a 10ºC. Os resultados mostraram que os modelos de regressão gerados representam adequadamente a variação dos dados. A temperatura de extração teve efeito altamente significativo sobre a força do gel e sobre o rendimento da extração. O tempo de extração não teve efeito algum sobre a força do gel. Através destas superfícies, a condição satisfatória de 70ºC por 5h foi estabelecida para extração de carragenana de K. alvarezii de maior rendimento e maior força do gel. Palavras-chave: Carragenana, Kappaphycus alvarezii, metodologia de superfície de resposta, reologia, ficocolóide. Optimization of the extraction of carrageenan obtained from Kappaphycus alvarezii through the response surface methodology Response surface methodology (RSM) with a 2-factor, 5-level central composite design (CCD) was conducted to ascertain the optimum carrageenan extraction conditions from the seaweed Kappaphycus alvarezii. The effects of temperature and time were determined. The responses included extraction yield (%) and gel strength (g. cm -2 ) at 10ºC. The results showed that the generated regression models adequately explained the data variation. The extraction temperature had a highly significant effect on gel strength and extraction yield. The extraction time hadn t any effect on gel strength. Through this surface, the satisfactory conditions of 70ºC for 5h was established for extraction of carrageenan from K. alvarezii with great yield and gel strength. Keywords: Carrageenan, Kappaphycus alvarezii, response surface methodology, rheology, phycocolloid. Introdução Carragenana é um polissacarídeo de alto peso molecular que compreende repetidas unidade de galactose e 3,6-anidrogalactose unidas por ligações glicosídicas α(1-3) e β(1-4) (Imeson, 2000). Juntamente com alginatos e agares, as carragenanas são parte de um grupo de substâncias biopoliméricas complexas denominadas ficocolóides. Estes polímeros naturais possuem habilidade de formar géis termoreversíveis ou soluções viscosas quando adicionados a soluções salinas e, por isso, são tradicionalmente utilizados como agente gelificante, estabilizante e emulsificante em vários produtos alimentícios, fármacos e cosméticos. A indústria de alimentos é responsável pelo uso de 70 a 80% da produção mundial de carragenana, sendo grande parte desta quantia destinada a laticínios e produtos cárneos (Imeson, 2000; Lahaye, 2001; Van de Velde et al., 2002; Prado- Fernández et al., 2003; Hilliou et al., 2006). Carragenanas são galactanas naturais extraídas de algas vermelhas (Rhodophyceae). Kappaphycus alvarezii é uma alga de ótimo valor comercial, cultivada principalmente no extremo oriente como

2 matéria-prima para a produção de κ-carragenana (Estevez et al., 2004). Atualmente vem sido estudada através de cultivos experimentais a implantação da produção desta alga exótica no litoral brasileiro (Paula et al., 1999; Bulboa et al., 2007). Geralmente o polissacarídeo é extraído com água quente, neutra ou alcalina de algas nativas ou tratadas com álcalis. Trabalhos anteriores sobre extratos de algas nativas obtidos com água quente mostraram que K. alvarezii é composta principalmente de κ-carragenana (na verdade uma carragenana híbrida κ/ι com pequenas quantidades de ι-estrutura) e menores quantidades de seu precursor biológico, µ-carragenana (Estevez et al., 2004). Até então, os métodos usados para extração de carragenana de diferentes algas marinhas variam em diversos estudos. Este estudo tem como objetivo elucidar as condições ótimas para extração aquosa de carragenana da alga natural de K. alvarezii, linhagem tetrasporofítica marrom (sem tratamento alcalino prévio), usando Metodologia de Superfície de Resposta (RSM). Experimental Material e Reagentes As amostras das algas Kappaphycus alvarezii, linhagem tetrasporofítica marrom, foram obtidas do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), cultivadas em cultivo experimental na região norte da ilha de Florianópolis. As algas foram coletadas em 19/03/2009, secas ao ar e protegidas da chuva por quatro dias e, após, secas em estufa a 60ºC por 48 horas antes do início da extração. As extrações foram realizadas no Laboratório de Reologia e Polímeros, Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos do Centro de Ciências Agrárias da UFSC. No processo de extração foram utilizados becker de 1000 ml e um banho de temperatura controlada. A filtração foi realizada em sistema a vácuo composto por um funil de Büchner com diâmetro de 12 cm e um kitassato de 1000 ml. Foi utilizado como filtro papel filtro qualitativo. O processo de secagem foi efetuado por atomização com Mini Spray-Dryer B-290 (BÜCHI). Extração da carragenena Após serem secas por 48h em estufa a 60ºC, as algas (10 g) foram lavadas em água da torneira e em seqüência com água destilada e então, embebidas em água destilada (800 ml) por 1h. Depois as algas foram trituradas com processador de alimentos até a obtenção de uma pasta. A mistura resultante foi levada a banho-maria variando os parâmetros de tempo e temperatura conforme o planejamento estatístico. Após, a mistura foi filtrada para separação da carragenana em água (filtrado) do resíduo (basicamente celulose). A solução resultante foi seca por atomização em Mini Spray-Dryer B-290 (BÜCHI) para obtenção do pó de carragenana. Rendimento da carragenana extraída

3 O rendimento de carragenana foi calculado utilizando a equação 1: y carragenana = (P / AS). 100% (Equação 1) Onde y carragenana é o rendimento da carragenana (%), P é a quantidade de carragenana extraída em gramas e AS é a quantidade de alga seca (~10 g) utilizada na extração. Preparação dos géis da carragenana extraída A carragenana extraída da alga Kappaphycus alvarezii foi dispersa em água destilada, até a concentração final de 1,5% (p/p) a temperatura de 80ºC (sob refluxo), sob agitação contínua e então, colocada em moldes plásticos cilíndricos com raio de 2 cm. Os moldes foram mantidos sob refrigeração (8ºC ± 2ºC) por pelo menos 12h antes das análises. Determinação da força do gel A força do gel foi determinada em texturômetro Stevens-LFRA (Model TA-1000, Inglaterra). A solução de carragenana, preparada como descrito anteriormente, foi mantida na temperatura de 10ºC ± 2ºC até o momento da análise. Uma sonda cilíndrica com 5 mm de diâmetro teve uma penetração de 20 mm no gel de carragenana e a velocidade de 2mm/s foi utilizada na penetração. A força do gel (g.cm -2 ) nesta temperatura é a força máxima fornecida para romper o gel. Delineamento experimental da otimização A metodologia de superfície de resposta (RSM) foi utilizada para determinar a condição ótima para a extração de carragenana de K. alvarezii. O planejamento composto central (CCD) com duas variáveis independentes foi empregado. As variáveis escolhidas como independentes foram: temperatura (ºC, X 1 ) e tempo de extração (h, X 2 ). A otimização foi realizada utilizando cinco níveis que foram escolhidos baseados em estudos prévios (Tabela 1). Tabela 1 Níveis codificados das duas variáveis empregadas para extração de carragenana no planejamento composto central Níveis Variáveis -1, , Tempo de Extração (h) X 2 2, , Temperatura de Extração ( C) X 1 31, ,28427 alfa =+/-1,414 para k=2 (2 variáveis independentes) O planejamento completo consistiu de 13 experimentos, incluindo quatro fatoriais (níveis -1 e +1), quatro axiais (níveis ±α) e cinco replicatas no ponto central. Os experimentos no ponto central do planejamento foram realizados para se estimar o erro puro. O rendimento de extração (%) e a força do gel (g) são variáveis importantes para a produção de carragenana. Estas duas respostas foram selecionadas como varáveis dependentes. Todos os experimentos foram realizados em ordem aleatória para minimizar o efeito de variações inexplicáveis das respostas, devido a erros sistemáticos. Análises estatísticas

4 Os dados experimentais dos diferentes tratamentos foram analisados utilizando análise de regressão múltipla usando o programa Statistica. O ajuste foi feito em um modelo de 2ª ordem para cada resposta. Este modelo pode ser expresso com variáveis codificadas (X 1, X 2 ) como a seguinte equação: Y= B 0 + B 1 X 1 + B 2 X 2 + B 11 X B 22 X B 12 X 1 X 2 + ε (Equação 2) Onde Y representa a resposta observada, B 0 representa o termo constante para os parâmetros da equação, B i representa os termos lineares, B ii representam os termos quadráticos para uma única variável, B ij representam os termos de interação (i =1,2; e j= 1,2), e ε representa o erro aleatório. Os coeficientes de regressão para os termos lineares, quadráticos e de interação foram determinados usando regressão linear múltipla. A significância de cada coeficiente de regressão foi julgada estatisticamente pelo cálculo da estatística F e do seu correspondente valor p. A análise de variância (ANOVA) foi aplicada para validar o modelo pelo teste do ajuste (goodness-of-fit). Os coeficientes de regressão foram usados então para determinar o modelo de 2ª ordem. Após o ajuste do modelo de 2ª ordem, as condições de extração ótimas foram obtidas. O gráfico da superfície de resposta foi feito usando o programa Statistica representando uma função das duas variáveis independentes. Resultados e Discussão Otimização da extração de carragenana Desenvolvimento do modelo de superfície de resposta Os valores obtidos para o rendimento e força do gel são mostrados natabela 2. Tabela 2 Variáveis, níveis e respostas do rendimento e força do gel baseadas na temperatura e tempo de extração de carragenana Variáveis Níveis Respostas Temperatura Tempo Rendimento Força do Gel X 1 X 2 ( C) (h) (%) (g/cm 2 ) ,23 34, ,65 93, ,88 37, ,57 105, , ,16 23, , ,67 82, ,59 0-1,41 19,17 112, ,41 0 1,41 23,93 119, ,79 80, ,23 115, ,64 75, ,09 81, ,94 99,94 Para compor o modelo foram utilizados somente os coeficientes de regressão múltipla para as variáveis independentes significativas para o teste F (p 0,05). Considerando a resposta Y 1 (rendimento da extração) foram significativos os coeficientes correspondentes ao efeito linear da temperatura (p = 0,005262) e do tempo (p = 0,048162). Os coeficientes quadráticos

5 correspondentes a cada uma das duas variáveis independentes e o coeficiente de interação entre estas duas variáveis não foram significativos pelo teste F (p>0,05). Considerando a variável dependente Y 2 (força do gel) apenas os coeficientes referentes ao efeito linear de temperatura (p = 0,002836) e ao efeito quadrático da temperatura (p = 0,007903) foram significativos, portanto, o tempo não demonstrou interferir no resultado da força do gel e não foi utilizado como variável independente na construção da equação que representa o modelo para Y 2. Através dos coeficientes significativos para a estatística F (p 0,05) foram desenvolvidas as equações do modelo de superfície de resposta, mostradas na Tabela 3. Tabela 3 Modelo de superfície de resposta para carragenana extraída de K. alvarezii Resposta Modelo R 2 Rendimento da extração Y 1 = -5,79 + 0,31T + 3,17t 0,78 Força do gel Y 2 = -203,21 + 8,67T - 0,06T 2 0,79 T (tem peratura de extração), t (tempo de extração) Os coeficientes de determinação (R 2 ) para Y 1 e Y 2 foram 0,78 e 0,79 respectivamente, indicando boa qualidade de ajuste dos modelos. Uma representação gráfica da qualidade dos modelos pode ser vista nas Figuras 1A e 1B, 2A e 2B. Os valores preditos (ŷ) em relação valores experimentais (y) encontrados mostraram que os modelos se adaptam bem aos dados (Figura 1A e 2A). Os gráficos dos resíduos (y-ŷ) mostraram valores baixos e não existe nenhum ponto considerado como valor discrepante (maiores do +/- 3) (Figura 1B e 2B). Através destes dados pode-se assumir que os modelos estão bem ajustados. A B Figura 1 (A) Gráfico dos valores preditos pelos observados do rendimento da extração. (B) Gráfico dos resíduos pelos valores preditos para o rendimento da extração em carragenana de K. alvarezii.

6 A B Figura 2 (A) Gráfico dos valores preditos pelos observados para a força do gel. (B) Gráfico dos resíduos pelos valores preditos para a força do gel da carragenana de K. alvarezii. Análise de variância As análises de variância (ANOVA) foram realizadas para avaliar a significância da equação do modelo polinomial quadrático. Qualquer termo no modelo com um grande valor-f e um valor-p pequeno indicaria maior efeito significativo sobre a variável resposta respectiva. A Tabela 4 mostra a ANOVA dos modelos que explanam a resposta das variáveis dependentes. Tabela 4 Análise de variância para o modelo de superfície de resposta do rendimento da extração e força do gel. Rendimento da extração Fonte de variação Soma de quadrados Graus de Liberdade Quadrado médio F Cal c p -valor Regressão* 429, ,81 8,7 6,47E-03 Resíduos 68,99 7 9,86 Falta de ajuste 28,48 3 9,49 0,9 0, Erro Puro 40, ,13 Total 498,08 12 Força do gel Fonte de variação Soma de quadrados Graus de Liberdade Quadrado médio F Cal c p -valor Regressão* 9833, ,66 7,2 1,12E-02 Resíduos 1921, ,46 Falta de ajuste 770, ,75 0,89 0, Erro Puro 1150, ,74 Total 12164,05 12 * Significativo para nível de significância de 0,05 A regressão foi significativa para ambas as respostas e a falta de ajuste não foi significativa. Portanto os dois modelos explicam adequadamente a variação das respostas. Gráficos de superfície de resposta As Figuras 3 e 4 mostram a função resposta estimada e os efeitos das variáveis independentes (temperatura e tempo) sobre as variáveis dependentes (rendimento da extração e força do gel). O rendimento da extração aumenta com o aumento da temperatura e com o tempo de extração (Figura 3). A temperatura teve maior efeito no aumento do rendimento da extração.

7 Figura 3 Superfície de Resposta mostrando o efeito da temperatura e do tempo de extração sobre o rendimento. O efeito das variáveis independentes sobre a força do gel é mostrado na Figura 4. O fator temperatura de extração teve grande influência sobre a força do gel. A força do gel foi maior em temperatura de aproximadamente 70ºC, sendo que em temperaturas maiores que esta, pode ter ocorrido degradação da carragenana. O tempo de extração não influenciou na propriedade de força do gel. Figura 4 Superfície de Resposta mostrando o efeito da temperatura e do tempo de extração sobre a força do gel. Comparando os resultados obtidos com trabalhos anteriores, o rendimento da extração se aproxima aos dados obtidos por Hayashi et al. (2007) (21-35%) que também utilizou a extração a quente de carragenana de K. alvarezii. A força do gel variou de 23 a 119 g cm -2. Os resultados foram menores do que os encontrados por Hayashi et al. (2007) que utilizou géis preparados em soluções salinas, o que aumenta o poder de gelificação da carragenana. Porém, nossos resultados foram maiores que os

8 encontrados por Freile-Pelegrín et al. (2006) e Freile-Pelegrín e Robledo (2008), os quais utilizaram extração alcalina e nenhum sal na preparação da amostra e obtiveram géis de carragenana fracos (< 50g cm -2 ) utilizando Eucheuma isiforme de diferentes regiões. Conclusões A temperatura de extração teve efeito altamente significante sobre a força do gel e sobre o rendimento. O tempo de extração não teve efeito sobre a força do gel. A variável independente temperatura foi considerada a mais importante no conjunto das respostas analisadas. Os modelos foram desenvolvidos e analisados estatisticamente demonstrando que são adequados para a otimização do processo de extração de carragenana de K. alvarezii pelo procedimento realizado. Através destas superfícies, a condição satisfatória de 74ºC e 5h foi encontrada para extração de carragenana de K. alvarezii com melhor combinação dos resultados de rendimento (33%) e força do gel (109,69 g. cm -2 ). Referências Bibliográficas 1. A. P. Imeson. Carrageenan. In G. O. Phillips; P. A. Williams (Eds), Handbook of hydrocolloids. Woodhead Publishing Ltda, Cambridge, 2000, M. Lahaye J. Appl. Phycol. 2001, 13, F. Van de Velde; S. H. Knutsen; A. I. Usov; H. S. Rollema; A. S. Cerezo Trends Food Sci. Technol. 2002, 13, J. Prado-Fernández; J. A. Rodríguez-Vásquez; E. Tojo; J. M. Andrade Anal. Chim. Acta 2003, 480, L. Hilliou; F. D. S. Larotonda; P. Abreu; A. M. Ramos; A. M. Sereno; M. P. Gonçalves Biomol. Eng. 2006, 23, J. M. Estevez; M. Ciancia; A. S. Cerezo Carbohydr. Res. 2004, 339, E. J. Paula; R. T. L. Pereira; M. Ohno J. Appl. Phycol. 1999, 11, C. R. Bulboa; E. J. Paula; F. Chow J. Appl. Phycol. 2007, 19, L. Hayashi; E. C. Oliveira; G. Bleicher-Lhonneur; P. Boulenguer; R. T. L. Pereira; R. Von Seckendorff; V. T. Shimoda; A. Leflamand; P. Vallée; A. T. Critchley J. Appl. Phycol. 2007, 19, Y. Freile-Pelegrín; D. Robledo; J. A. Azamar Bot. Mar. 2006, 49, Y. Freile-Pelegrín; D. Robledo J. Appl. Phycol. 2008, 20, STATSOFT, INC. (2004). STATISTICA (data analysis software system), version. www. statsoft.com

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