AS BACTÉRIAS LÁCTICAS NO CENTRO DOS NOVOS DESAFIOS TECNOLÓGICOS

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1 PESQUISA Bactérias Lácticas AS BACTÉRIAS LÁCTICAS NO CENTRO DOS NOVOS DESAFIOS TECNOLÓGICOS Utiização das bactérias ácticas na atuaidade principa função das bactérias ácticas nos aimentos é a acidificação dos produtos aimentares em um ph próximo de 4, que impede o desenvovimento de bactérias indesejáveis pea produção de ácidos orgânicos, majoritariamente ácidos ácticos. Isso permite que o período de conservação dos produtos fermentados seja muito maior que a dos produtos onde a matéria-prima não seja fermentada. Um dos papéis principais das bactérias ácticas é a higiene. Outro pape é desenvover as propriedades organoépticas dos aimentos fermentados. Por meio da produção de um grande número de enzimas gicoíticas, ipoíticas e proteoíticas, as BL transformam os nutrientes fundamentais dos produtos agricoas em compostos com propriedades organoépticas compexas. Essas atividades bioquímicas permitem às BL modificar pouco a pouco a estrutura e o aroma dos aimentos fermentados e de contribuir para o desenvovimento das suas quaidades gastronômicas. Aém dessas funções de ordem tecnoógica, atribuímos também as BL, que nós ingerimos vivas, atividades probióticas. Dizemos que uma bactéria possui uma atividade probiótica quando, se ingerida viva por um hospedeiro determinado, exerce sobre este um efeito benéfico direto ou indireto (Füer, 80 Biotecnoogia Ciência & Desenvovimento - Encarte Especia Jean-Christophe Piard, Yves Le Loir, Isabee Poquet e Phiippe Langea* Pesquisadores doutores do Institut Nationa de a Recherche Agronomique, Unité de Recherches Laitières et de Génétique Appiquée, Jouy-en-Josas, France. *angea@biotec.jouy.inra.fr Traduzido peos professores doutores Vasco Azevedo e Ana Lúcia Bruniati Godard. Depto de Bioogia Gera/ICB-UFMG 1989). Por exempo, em animais de criação cuja aimentação foi supementada com certas bactérias, estas agem no aumento da taxa de crescimento desses animais. Essa noção já havia sido suscitada por Metchnikof, em Entretanto, ea só despertou interesse há poucos anos e se inscreve no quadro de evoução comportamenta dos consumidores em busca de uma aimentação benéfica à saúde. As indústrias agroaimentares integraram esse novo desafio e assistimos ao aparecimento quase quotidiano de novos produtos, sobretudo ácticos, aos quais são atribuídas quaidades probióticas nem sempre comprovadas. As atividades probióticas na atuaidade Três tipos de atividades probióticas foram estabeecidas cientificamente. A primeira é reacionada à digestibiidade A fermentação áctica constitui uma das formas mais antigas de conservação de produtos oriundos da agricutura ou da indústria agroaimentar. Esse tipo de fermentação está reacionado, em primeiro ugar, com os produtos ácteos (iogurte, queijos, manteiga, creme), mas também com carnes, frios, pão de evedo, chá, sidra, cerveja e vinho (fermentação maoáctica). A fermentação áctica é feita por diversas bactérias chamadas bactérias ácticas (BL) devido à sua atividade principa, que é a conversão dos açúcares do meio em ácido áctico. As espécies bacterianas em questão pertencem a cinco gêneros: Lactococcus, Streptococcus, Lactobacius, Leuconostoc e Pediococcus. São cocos ou bacios grampositivos que possuem uma percentagem em G+C no genoma inferior a 54. Devido a essa caracterização, existe uma controvérsia em se a espécie Bifidobacterium pertence ou não a esse grupo, pois ea possui mais de 55% de G+C no genoma. da actose. Esse açúcar, presente em abundância nos produtos ácticos, pode induzir fenômenos de intoerância nos consumidores que possuam deficiência congênita em actase, a enzima que o degrada. O quadro cínico pode ser traduzido por diarréias, cóicas abdominais ou fatuência. Curiosamente esses sintomas aparecem quando a actose é absorvida do eite, mas são ausentes quando absorvidas do iogurte nas mesmas proporções. Existem duas expicações para o fenômeno: a fora bacteriana do iogurte (Streptococcus thermophius e Lactobacius bugaricus) (1º) supementaria a deficiência em actase do hospedeiro com a sua própria; (2º) estimuaria, na mucosa intestina do hospedeiro, a produção endógena da actase. Uma outra atividade probiótica exercida peas BL é higienizar o tubo digestivo, que hospeda uma fora microbiana abundante, sendo que parte dea pertence ao grupo das bactérias ácticas. Essa fora exerce uma função importante na capacidade do hospedeiro de se defender de contaminações digestivas causadas peas bactérias patogênicas. Assim, a fora endógena do hospedeiro estimuaria as respostas imunitárias e teria uma função de barreira protetora ao ocupar os nichos procurados peos patógenos. Aém de servir de barreira protetora, certas BL mostraram-se capazes de diminuir os sinais cínicos igados a infecções intestinais. Os resutados mais significativos foram obtidos com certos tipos de actobacios e também com os bífidos que se

2 mostraram particuarmente eficazes no tratamento das diarréias do recém-nascido. Enfim, está bem estabeecido que certas inhagens de BL possuem atividades adjuvantes que estimuam a resposta imunitária do hospedeiro contra antígenos. Dos actobacios, a espécie casei mostrouse capaz de estimuar a resposta imunitária das crianças quando vacinadas por via ora contra o rotavírus, vírus responsáve pea diarréia aguda infanti nos países em desenvovimento (Isoauri et a., 1995). Nós veremos que a atividade adjuvante das BL abre caminhos interessantes para apicações na área médica. Outras atividades probióticas para as BL foram propostas, e as mais interessantes são as atividades anticoesteroêmicas e antitumorais. No entanto, mais experiências ainda são necessárias para demonstrar que as BL exercem, de fato, Figura 2. Secreção das proteínas pea via Sec-dependente. Ver texto com a descrição do mecanismo. SS, seqüência sina, Sina P ase, peptídeo sina. Figura 1. Detecção da nucease produzida por cones de Lactococcus actis. O meio de detecção contém DNA, ágar e um corante metacromático básico, o azu de touidina. A interação do DNA com o azu de touidina faz com que o estado nativo do meio seja azu. Em presença da nucease, a degradação do DNA ibera o corante que se fixa sobre o ágar do meio e a cooração torna-se rosa. Os cones azuis expressam, mas não exportam a nucease; o acréscimo de um sina de secreção permite a expressão do fenótipo Nuc + reveado pea aparição de haos rosa em torno das coônias. essas atividades in vivo (Marteau & Rambaud, 1993). Em resumo, existem evidências de que as BL ingeridas vivas e em quantidades importantes (cerca de 10 8 bactérias por grama de aimento fermentado) são capazes de exercer efeitos bioógicos sobre o hospedeiro. Como acabamos de ver, agumas dessas atividades são bem estabeecidas. Outras ainda necessitam de demonstração cara e reprodutíve, como o uso de recursos como os testes de dupo cego e a incusão de um grupo pacebo. A dificudade desse tipo de estudo é que freqüentemente, as inhagens bacterianas presentes nos produtos fermentados são seecionadas por meio de critérios tecnoógicos e não probióticos. Aém disso, as atividades procuradas são, frequentemente de pouca intensidade, ficando difíci evidenciá-as em um ecossistema compexo como o tubo digestivo....e no futuro A partir do acúmuo dessas constatações, vários aboratórios, há aguns anos, tentaram superproduzir moécuas com efeitos probióticos nas BL. Essa perspectiva começou entamente a se tornar reaidade graças aos conhecimentos acumuados nos útimos 15 anos sobre a genética das BL, e, sobretudo, da Lactococcus actis. Muitas técnicas genéticas estabeecidas para essa bactéria foram adaptadas para as outras espécies de BL. Hoje, podemos introduzir DNA em um grande número de BL; foram também desenvovidos instrumentos genéticos de um ampo espectro de hospedeiros (pasmídios, transposons, sistemas de expressão indutíveis, etc.) e a seqüência de genomas de diversas espécies de BL está sendo feito. A idéia é utiizar as BL como veícuo de diversas atividades bioógicas a serem introduzidas no tubo digestivo. Uma dessas poderá ser a de produzir enzimas para supementar deficiências pancreáticas ou vitamínicas para mehorar a saúde do hospedeiro ou oferecerhe um mehor conforto intestina. Essas apicações se situam na área de desenvovimento de produtos de um novo tipo de aimento, o aimento-saúde. Nessa categoria de produtos, as BL não serão somente escohidas peas suas aptidões tecnoógicas, mas também peas suas atividades probióticas. Podemos pensar que, no futuro, um tipo de produto fermentado poderá ter várias versões, segundo o conteúdo das BL adaptadas a diferentes deficiências o que, por exempo, faciitaria a digestão de certos gicídios ou supementariam nutrientes raros, e outros. Uma outra perspectiva particuarmente atraente é utiizar as BL como vacinas vivas (Daugen, 1994). Nesse caso, tentaremos fazer com que as BL produzam antígenos ou peptídeos imunogênicos capazes de induzir uma resposta imunitária contra um certo patógeno. Essa seria uma soução promissora para controar doenças endêmicas causadas por numerosos vírus ou bactérias patogênicas que entram no organismo pea via ora (como, por exempo, água potáve e aimentos) e se desenvovem na mucosa digestiva. A mucosa digestiva é um órgão infóide importante e a indução de imunidade de mucosa permite uma uta precoce contra numerosas infecções. A noção de vacina viva administrada oramente é também atraente no âmbito sócio econômico: essas seriam vacinas de fáci administração e de baixo custo. Esses argumentos incitaram a Organização Mundia de Saúde (OMS) a coocar o desenvovimento desse tipo de vacinas como objetivo prioritário de saúde púbica. Nesse tipo de apicação, as BL constituiriam uma nova categoria de produtos: bactérias-medicamentos. Dos genes às proteínas: pesquisas em andamento Para desenvover essas novas apicações com as BL, as inhas de pesquisa seguiram basicamente os seguintes eixos: Seeção de inhagens de BL É a seeção das inhagens de BL mais adaptadas para as apicações desejadas. Um dos critérios importantes é sua resistência à forte acidez gástrica (~ph 2). Essa Biotecnoogia Ciência & Desenvovimento - Encarte Especia 81

3 Figura 3A. A estrutura das proteínas ancoradas nas bactérias gram-positivas: estas proteínas são sintetizadas sobre a forma de precursor com uma seqüência sina N- termina e uma seqüência de ancoramento C-termina; esta útima tem uma estrutura composta de três partes, de um motivo LPXTGX, de um fragmento transmembrânico e de uma extremidade C-termina com carga, freqüentemente, positiva. resistência ao ácido é variáve de uma espécie para outra, mas podemos fazer adaptações ou modificações genéticas para aumentá-a. Um outro critério é a capacidade de a inhagem se manter por menor ou maior tempo no tubo digestivo; certas BL, como as L. Lactis, transitam dentro do tubo digestivo e são rapidamente evacuadas nas fezes; outras, como certos actobacios, são capazes de coonizar o tubo digestivo. Uma ou outra dessas duas situações pode ser preferida, de acordo com a apicação que pretendemos utiizar. Um útimo critério a ser considerado é o caráter imunoestimuante das inhagens. Nós vimos que certas BL têm uma atividade adjuvante que potenciaiza a resposta imunitária. Mas o níve dessa imunoestimuação varia segundo as inhagens e esse parâmetro deve ser evado em consideração na eaboração de inhagens vacinais. Expressão (indutíve) de genes heteróogos No desenvovimento de aimentossaúde, procuramos identificar enzimas de BL cuja super expressão permitirá induzir efeitos benéficos para o hospedeiro. Neste caso fazemos uma autoconagem ou peo menos conagem semi-homóoga (gene proveniente da mesma espécie ou do mesmo grupo microbiano). No caso de desenvovimento de vacinas vivas o caso é oposto, porque procuramos produzir antígenos virais ou bacterianos. Para estas apicações, nós desenvovemos técnicas para identificação de sinais (chamados promotores) que controam a expressão gênica nas BL. Procuramos promotores ditos indutíveis. Estes possuem uma atividade fraca ou nua mas, quando sobre a ação de um estímuo, iniciam ou aumentam fortemente a expressão do gene que ees controam. As BL presentes dentro do tubo digestivo recebem um grande número de estímuos físico-químicos (temperatura de 37 C, presença de sais biiares, estados sucessivos de carência e abundância nutriciona de acordo com o trânsito do boo aimentar, etc...) e numerosos estudos são feitos no nosso aboratório para caracterizar promotores que respondem a estas variações do meio exterior. Exportação de proteínas heteróogas Se a presença de um promotor ad hoc permite a expressão de um determinado gene, é necessário que, em seguida, o produto desse gene (enzima ou antígeno) seja produzido em um oca que he faciite o contato com o seu substrato ou seu avo. Na maioria dos casos, tentamos que essa enzima ou antígeno produzido seja apresentado no meio externo em sua forma ivre (secreção), ou igada aos enveopes bacterianos (ancorada). Nos dois casos, a proteína recémsintetizada deve ser exportada, ou seja, deve deixar o compartimento citopasmático e ser dirigida para a parede ceuar ou para o meio externo. Essa proteína está sujeita a encontrar vários obstácuos,tais como proteases, que podem degradá-a ainda no citopasma, a necessidade de atravessar a membrana citopasmática e, posteriormente, a parede ceuar. Após essas etapas serem vencidas, a atividade desejada dependerá das moécuas estarem em sua conformação nativa. Nosso aboratório está engajado nos estudos desses mecanismos de exportação, etapa obrigatória para controar a produção de moécuas dotadas de atividades bioógicas nas BL. Para faciitar nosso trabaho, escohemos uma proteína modeo, NUC. Ea é uma nucease de Staphyococcus aureus, enzima esta que degrada ácidos nucêicos e cuja atividade pode ser detectáve por um teste de coorimetria (fig.1). Exporamos esse teste para detectar os cones de BL capazes de expressar e de exportar essa nucease. Expressamos o gene da nucease (nuc) em L. actis ( Le Loir et a, 1994). Quando somente a porção do gene nuc codificando para a enzima madura é expressa, a nucease é produzida no citopasma e os cones recobertos do meio de detecção, aparecem sobre fundo azu (fig.1). Por outro ado, quando a mesma porção de nuc é expressa em fusão com um sina de secreção, a nucease produzida pode ser detectada peo aparecimento de haos rosa em torno das coônias (fig.1). A nucease utiizada nesse experimento é chamada de repórter, pois sua atividade nos permite ocaizar as proteínas exportadas entre uma popuação heterogênea, Figura 3B. O mecanismo de exportação das proteínas ancoradas, ver texto com descrição do mecanismo. CWA, Ce Wa Anchor para a região de ancoramento à parede ceuar. 82 Biotecnoogia Ciência & Desenvovimento - Encarte Especia

4 que contém também proteínas citopasmáticas. Esse sistema repórter é usado no nosso aboratório em diferentes inhas de pesquisa. Pesquisa de sinais de exportação nas BL Em todo o organismo vivo, as proteínas que serão exportadas para fora da céua possuem sinais que indicam ao organismo a sua ocaização fina. Esses sinais podem ser de três tipos, mas todos os tipos são constituídos principamente por aminoácidos hidrofóbicos. Ees são reconhecidos pea maquinaria de secreção ceuar que encaminha a proteína em direção à membrana através da qua ea é transocada (fig.2). O sina hidrofóbico pode ser civado por uma peptidase, sina que tem o efeito de iberar a proteína madura no meio extraceuar (é a secreção mostrada na fig.2) ou ser civado no momento em que a proteína madura é modificada peos ácidos graxos, o que eva à sua associação com a membrana ou, então, ficar inserida dentro da membrana, o que resuta em uma proteína transmembrânica. Para identificar as proteínas de L. actis que possuam um ta sina de exportação, utiizamos as propriedades de nuc como repórter (ver fig.1). Pea construção de uma bibioteca de DNA representativa do genoma bacteriano, construída na extremidade 5 do gene nuc, podemos identificar fragmentos de DNA que codificam sinais de exportação, pois os cones que integrarem esses fragmentos de DNA tornam-se capazes de exportar a nucease e de desenvover, então, haos rosa. Caracterizamos desta maneira um grande número de sinais que permitem a exportação da nucease (Poquet et a., 1998). Caracterização da maquinaria de secreção de L actis Desenvovemos no nosso aboratório um vetor para mutagênese aeatória por transposição, que nos permitiu identificar genes impicados na secreção de proteínas (Maguin et a, 1996). O postuado inicia é que a inserção do transposon nos vários oci do genoma pode gerar cones hiposecretores (caso um gene constitutivo da maquinaria de secreção tenha sido interrompido peo transposon) ou hipersecretores de nucease (no caso onde a inserção do transposon tenha desreguado um gene constituinte ou um coaborador da maquinaria de secreção). Os genes atingidos são em seguida sequenciados para construir, gradativamente, o quebracabeça dos componentes ceuares impicados na secreção das proteínas. Como o genoma da inhagem IL 403 de L. actis foi inteiramente sequenciado no nosso aboratório, procuramos por homoogia, os genes que podem intervir no processo de exportação no sentido mais ampo das suas etapas mais precoces às mais tardias: da conformação e estabiidade da proteína, antes e depois da transocação. Caracterização da maquinaria de ancoramento das proteínas em L. actis Nas bactérias gram-positivas, as proteínas ancoradas à parede são sintetizadas sob a forma de um precursor que possui Figura 4. Os sistemas de expressão (A), de secreção (B) e de ancoramento (C) e a ocaização fina da nucease A dentro da céua. P, promotor; SS, seqüência sina, nuca, porção do gene da nucease especificando a nucease A; CWA, ver Fig. 3B; ter, terminador de transcrição; MCS, Mútipos sítios de conagem destinados à inserção de genes que codificam para peptídios e proteínas desejadas. uma seqüência sina N-termina e um sina de ancoramento C-termina. Este útimo é constituído de cerca de trinta aminoácidos, sendo 20 dees hidrofóbicos, que formam um fragmento transmembrânico. O processo de exportação desse tipo de proteína é quase idêntico ao das proteínas secretadas que possuem um sina que interage com a maquinaria de secreção ceuar. Entretanto, neste caso, a transocação da proteína é incompeta devido ao fato de o fragmento trasmenbrânico C-termina impedir a sua transferência. (fig.3). A útima etapa do processo de exportação é o corte da proteína a níve do motivo LPXTG e a formação de uma igação peptídica entre o C-termina da proteína e um aminoácido do peptídiogicano. O compexo enzimático que faz a hidróise ao níve do motivo LPXTG e sua igação à parede foi denominado de sortase e, por enquanto ainda não foi caracterizado. Com esse objetivo, o mesmo vetor de transposição é utiizado para fazer mutagênese dos cones capazes de ancorar a nucease e então procuramos os transposantes capazes de secretá-a. O sequenciamento dos genes atingidos deve permitir identificar os componentes do sistema de ancoramento das proteínas em L. actis. Esse estudo é importante em vários níveis. Permitirá o domíno da apresentação na superfície das moécuas úteis. Deverá também ter impacto importante na terapia das doenças infecciosas. Por anaogia das estruturas C-terminais das proteínas ancoradas nas bactérias gram positivas, supomos que o mecanismo moecuar de ancoramento das proteínas parietais seja conservado em todas essas bactérias. Entre as proteínas que se ancoram utiizando essa via, agumas são fatores de viruência de bactérias patogênicas como Staphyococcus aureus ou Streptococcus pyogenes. O compexo sortase nas bactérias gram-positivas podem ser um novo avo na uta contra esses patógenos que, nos útimos anos, desenvoveram mecanismos de mutiresistência aos antibióticos. Das proteínas aos aimentos-saúde e vacinas vivas Se a caracterização das maquinarias de exportação das proteínas devem, no futuro, permitir otimizar os sistemas de Biotecnoogia Ciência & Desenvovimento - Encarte Especia 83

5 GÉNETICA DE BACTÉRIAS LÁCTICAS Os trabahos feitos no Brasi com bactérias ácticas são essenciamente apicados à indústria de aimentos e envovem a utiização dessas bactérias em produtos fermentados, principamente aquees derivados do eite. Aguns grupos estão reaizando estudos de taxonomia cássica e moecuar, anáises da diversidade genética entre as espécies isoadas de um mesmo meio ou de meios diferentes, anáises da diversidade das espécies presentes dentro de ecossistemas microbianos que contêm bactérias ácticas (produtos aimentícios fermentados) e o pape desta diversidade dentro do funcionamento dos ecossistemas (manutenção ou desaparecimento das popuações, atividade metabóica, expressão de genes específicos). Mundiamente, os estudos genéticos que utiizam a bioogia moecuar das bactérias ácticas começaram na década de oitenta e resutados importantes começaram a aparecer recentemente. O repasse dessa tecnoogia e o estabeecimento de coaborações com grupos que já estão trabahando nessa tecnoogia é de extremo interesse para o Brasi, sobretudo neste momento em que se discute e se reguamenta, no mundo inteiro, a utiização de microrganismos geneticamente modificados. Com esses objetivos, os professores Vasco Azevedo e Sérgio Costa Oiveira coordenaram um curso sobre Genética de Bactérias Lácticas reaizado entre os dias 14 a 18 de setembro, no Instituto de Ciências Bioógicas da Universidade Federa de Minas Gerais. Contou com o patrocínio e apoio das pós-graduações em Bioquímica e Imunoogia, Genética e Microbioogia e das empresas Pharmacia Biotech, Appied Biosystems Perkin Emer, Gibco BRL Life Technoogies, Nesté Nutrição Infanti, FIEMG e CAPES. Os professores do curso fazem parte da equipe que escreveu este artigo. Todas as Informações sobre esse evento podem ser obtidas na HOME PAGE: bacac. exportação de moécuas úteis, os conhecimentos atuais permitem pensar nas suas apicações. Dentro desse panorama, desenvovemos vetores de expressão, de secreção e de ancoramento ( Le Loir et a, 1998; Piard et a., 1997 a-b). Concebemos esses vetores com cassetes que nos permitem trocá-as entre si, o que possibiita moduar o níve de expressão do gene de interesse e determinar a ocaização fina do seu produto dentro da céua. O esquema do princípio desses vetores está representado na figura 4. Esses vetores são atuamente utiizados para construir inhagens de BL produtoras de antígenos que serão administrados por via ora em modeos animais para caracterizar: (i) o níve de expressão necessário para gerar uma resposta imunitária, (ii) a reação entre a ocaização ceuar do antígeno testado (ocaização citopasmática, na parede ou extraceuar) e a natureza da resposta imune, (iii) o período necessário de permanência do vetor bacteriano no tubo digestivo para induzir uma resposta imune no hospedeiro. Nesse útimo ponto, utiizamos animais com a fora digestiva controada, o que nos permite moduar o tempo de permanência no tubo digestivo da bactéria apresentadora de antígeno. Concusões e perspectivas As práticas aimentares de numerosos grupos de indivíduos os conduzem a ingerir quantidades impressionantes de BL. Essas bactérias absorvidas vivas são capazes de exercer, na mucosa intestina, atividades bioógicas inerentes a eas. A demonstração de um efeito bioógico no hospedeiro é difíci, devido ao fato de o níve basa dessas atividades ser muito baixo. Para remediar esse probema, várias pesquisas foram empreendidas superexpressando certas atividades nessas bactérias para demostrar de maneira absouta os seus efeitos nos hospedeiros. Esse campo de investigação em saúde púbica é fascinante e promissor. Se o interesse atua por produtossaúde é evidente, não devemos esquecer o cima de incerteza que envove o desenvovimento de organismos geneticamente modificados. Devemos priviegiar as vias de autoconagem, que evitam a introdução de DNA estrangeiro. Dentro desse panorama, devemos distinguir os produtos destinados à aimentação, nos quais devemos procurar risco zero para os consumidores, e os produtos oriundos de bactérias vacinais, para as quais o risco de disseminação horizonta deve ser inferior aos riscos de uma popuação exposta a certo patógeno de sofrer com a doença. Neste útimo caso, o desenvovimento de sistemas de confinamento que impeçam a sobrevivência das bactérias no ambiente devem ser procurados. Referências Bibiográficas Dougan G The moecuar basis for the viruence of bacteria pathogens : impications for ora vaccine deveopment. Microbio. 140 : Fuer R Probiotics in man and animas. J. App. Bacterio. 66 : Isoauri E., Joensuu J., Suomaainen H., Luomaa M. et Veskari T Improved immunogenicity of ora DxRRV reassortant rotavirus vaccine by Lactobacius casei GG. Vaccine 13 : Le Loir Y., Gruss A., Ehrich D. et Langea P Direct screening of recombinants in Gram positive bacteria using the secreted Staphyococca nucease as a reporter. J. Bacterio. 176 : Le Loir Y., Gruss A., Ehrich S.D. et Langea P A nine-residue synthetic propeptide enhances secretion efficiency of heteroogous proteins in Lactococcus actis. J. Bacterio. 180 : Maguin E., Prevost H., Ehrich S.D. et Gruss A Efficient insertiona mutagenesis in Lactococci and other Grampositive bacteria. J. 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Queremos também demonstrar o nosso reconhecimento à Dra. Aexandra Gruss peo seu dinamismo e apoio na reaização dos nossos trabahos. 84 Biotecnoogia Ciência & Desenvovimento - Encarte Especia