GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA

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1 PRÁTICA GINECOLOGIA E OBSTETRÍCIA Suplemento Rev N.º 21 Maio 2007 Preservação da fertilidade da mulher - Perspectivas actuais Teresa Almeida Santos 1,2, Raquel Brito 2 e João Ramalho-Santos 3,4 1 Clínica Universitária de Genética da Faculdade de Medicina de Coimbra. 2 Serviço de Genética Médica e Reprodução Humana dos Hospitais de Universidade de Coimbra. 3 Centro de Neurociências e Biologia Celular de Coimbra (CNC). 4 Departamento de Zoologia da Faculdade de Ciências e Tecnologia de Universidade de Coimbra. Os ovários são órgãos pares, situados de cada lado do útero, tendo uma forma oval achatada, com 3 a 5 cm na sua maior dimensão. É neles que se processa a ovogénese. Os ovários têm também uma função endócrina, produzindo estrogénios e progesterona que sincronizam a actividade do tracto genital e da glândula mamária com o ciclo menstrual. No ovário identifica-se uma zona periférica designada córtex e uma central denominada medula. No córtex há numerosos folículos em diversos estádios de desenvolvimento, bem como folículos pós-ovulatórios, chamados corpus luteum e corpus albicans (o segundo formado por regressão do primeiro). Figura 1 Esquema do ovário humano mostrando os diferentes estádios do desenvolvimento do ovócito. in Atlas de Reproducción Assistida SERONO No ovário de uma mulher jovem os folículos primordiais são os mais numerosos constituindo a população a partir da qual uma coorte inicia o processo de maturação. O folículo primordial é composto por um ovócito primário envolvido por uma camada de células foliculares achatadas. O ovócito primário tem, aproximadamente, 25 µm de diâmetro, apresentando um núcleo volumoso e um citoplasma relativamente reduzido em relação ao volume total da célula. Quando estimulado pelas hormonas hipofisárias o folículo primordial aumenta de volume e transforma-se num folículo primário. Neste, o ovócito já tem maiores dimensões, e as células foliculares aumentam o seu tamanho e número originando as células da granulosa, algumas das quais, após a ovulação se mantêm ligadas ao ovócito formando o cumulus ophorus. Entre o ovócito e as células foliculares desenvolve-se uma membrana glicoproteica denominada zona pelúcida.

2 Os folículos primários desenvolvem-se e originam os folículos secundários, que se encontram localizados mais profundamente no córtex ovárico. O córtex de um ovário humano apresenta um número finito de células germinativas primordiais, o qual vai decrescendo ao longo da vida da mulher, como consequência das ovulações e da atrésia (Fig.2). No momento do nascimento, o número de ovócitos primários é de cerca de dois milhões, tendo a população de células germinativas atingido um máximo de sete milhões a meio da gestação. Por altura da menarca existem apenas folículos (1). A perda de folículos aumenta consideravelmente por volta dos 37,5 anos, existindo, nessa altura, cerca de 1000 folículos. Inicia-se, então um decréscimo da função endócrina, começando a mulher a entrar no climatério (2). Associada a este processo ocorre também uma redução da qualidade ovocitária que poderá estar associada a uma disfunção mitocondrial (3). A data exacta da menopausa é determinada, quer pela quantidade inicial de células germinativas, quer pela sua deplecção ao longo da vida. No mundo ocidental a idade média em que ocorre a menopausa situa-se nos 51 anos (2). 2 Figura 2 Zona cortical do ovário humano (320X).Coloração com hematoxilina-eosina. Nas mulheres submetidas a tratamentos de quimioterapia e/ou radioterapia por doença neoplásica pode surgir uma menopausa precoce, dado que estes tratamentos afectam as células em divisão, comprometendo assim, a gametogénese e mesmo a função endócrina do ovário. Este efeito gonadotóxico tem particular importância na medida em que a sobrevida das mulheres após estas tarapêuticas tem tido um aumento significativo nos últimos anos, particularmente nas pacientes mais jovens (4). Usando um modelo matemático estimou-se que uma redução de 90% da população de células germinativas que ocorra por volta dos 14 anos, origina falência ovárica precoce permanente (menopausa) por volta dos 27 anos de idade (2). A criopreservação de espermatozóides é uma realidade actualmente e não envolve tecnologias muito complexas. Porém, a preservação de gâmetas femininos implica grandes dificuldades de índole diversa, nomeadamente na sua obtenção e na conservação a longo prazo. É absolutamente necessário discutir com os doentes oncológicos as opções disponíveis em termos de fertilidade e de possibilidades reprodutivas futuras. Esta realidade é particularmente importante nas mulheres jovens com cancro da mama, antes de proceder a quimioterapia. Acresce que se verifica em todo o mundo desenvolvido uma tendência generalizada para adiar o casamento e protelar a primeira gravidez, o que torna esta situação mais premente já que, se não forem tomadas medidas para preservar a fertilidade antes de iniciar o tratamento, a lesão ovárica e a subsequente menopausa prematura poderão impedir uma gravidez no futuro. 1 - Estratégias para a Preservação da Fertilidade Existem actualmente três métodos possíveis para a preservação da fertilidade nas pacientes portadoras de neoplasias em risco de falência ovárica permanente: 1) Criopreservação de Embriões; 2) Criopreservação de Ovócitos; 3) Criopreservação de Tecido Ovárico. O processo de criopreservação requer, primeiramente a escolha do crioprotector ideal em consonância com um protocolo de congelação e descongelação adaptados às células que se pretende criopreservar. No caso dos gâmetas femininos, o maior problema reside na formação de cristais de gelo intracelular capazes de originar lesões que podem levar à lise da célula. Outra dificuldade advém da toxicidade dos crioprotectores utilizados e consequentemente o tempo de exposição das células aos mesmos Criopreservação de Embriões Em 1985 foi descrito o primeiro caso, na espécie humana, de um nascimento após transferência de embriões congelados (5). Actualmente esta técnica encontra-se amplamente difundida e com elevadas taxas de sucesso. As pacientes portadoras de doenças

3 oncológicas podem recorrer à estimulação ovárica e à punção folicular e posterior inseminação por Fecundação in vitro (FIV) ou por Microinjecção de espematozóides (ICSI) antes de iniciar a terapêutica ou durante um intervalo nos tratamentos (6). Infelizmente esta técnica não é aplicável a todas as doentes com cancro sendo, por exemplo, inadequada em raparigas antes da puberdade e pouco aceitável para mulheres solteiras que não desejem o uso de esperma de um dador. Para além disto, todo o processo de estimulação hormonal pode necessitar de algumas semanas, podendo representar um atraso considerável nos tratamento oncológicos. Acresce que, nas doentes com tumores hormono-sensíveis (ex: cancro da mama), a exposição a níveis elevados de estrogénios pode ter um efeito deletério Criopreservação de Ovócitos A criopreservação de ovócitos é, teoricamente, uma alternativa interessante ao congelamento de embriões. No entanto, apesar de os resultados terem sido bastante animadores em animais (7;8), o processo de congelação de ovócitos humanos tem-se revelado pouco eficaz e até mesmo frustrante. As taxas de sobrevivência e fecundação pós-descongelação descritas são muito variáveis apresentando valores que oscilam entre os 25 e os 69% (9;10). Por outro lado, tal como na criopreservação de embriões, também é imprescindível a estimulação hormonal dos ovários. A criopreservação de ovócitos maduros é uma técnica bastante complexa, muito mais exigente do que a dos embriões, uma vez que os gâmetas femininos são muito sensíveis a modificações de temperatura e apresentam deficiente capacidade de recuperação de lesões citoplasmáticas (11;12). Os ovócitos humanos podem ser criopreservados no estádio de Metafase II ou de Vesícula Germinativa (Profase I) Ovócitos Maduros (Metafase II) Os ovócitos maduros encontram-se em metafase II. Nesta fase, a célula está altamente organizada exibindo A B Figura 2 Ovócitos humanos maduros (MetafaseII). A) Ovócito rodeado pelas células do cumulus; B) Ovócito depois de desnudado sendo evidentes a zona pelúcida e o primeiro globo polar localizado no espaço perivitelino. uma zona pelúcida, um fuso acromático e grânulos corticais (Fig.2). Qualquer dano que ocorra em alguma destas estruturas poderá produzir efeitos negativos na viabilidade e funcionalidade da célula após a descongelação. Na metafase II os cromossomas do ovócito encontramse alinhados ao longo dos microtúbulos do fuso acromático os quais são sensíveis à temperatura e às soluções crioprotectoras. Os microtúbulos são responsáveis pela separação das cromátides-irmãs que ocorre na 2ª divisão da meiose. Assim, qualquer alteração nestas estruturas pode levar a processos de não-disjunção e, consequentemente, a um risco aumentado de aneuploidias ou poliploidias (13;14;15). A criopreservação de ovócitos maduros apresenta-se como uma opção bastante atractiva no campo da Reprodução Medicamente Assistida. No entanto, as taxas de viabilidade e fecundação pós-congelação são bastante variáveis assim como as gravidezes documentadas (16;17;18). Estes resultados poderão estar intimamente relacionados com as lesões resultantes dos processos de congelação/descongelação, dada a elevada sensibilidade destas células. As principais alterações associadas à congelação/descongelação podem afectar diferentes sistemas celulares sendo exemplos a ruptura na membrana citoplasmática do ovócito, alterações na configuração do fuso acromático e, consequentemente, alterações nos cromossomas (19). As variações nas taxas de sobrevivência dos ovócitos descongelados estão relacionadas com factores morfológicos e biofísicos. A presença de cumulus oophorus parece desempenhar um papel muito importante na protecção do ovócito contra os efeitos adversos dos crioprotectores e da temperatura. O principal factor biofísico que afecta a taxa de sobrevivência pós-congelação é a formação de gelo intra-celular que pode 3

4 levar à lise da célula (20). Ultimamente, têm sido descritos protocolos que incluem o uso de elevadas concentrações de sacarose juntamente com 1,2-propanodiol. Os protocolos mais antigos referenciavam concentrações da ordem de 0,1M/L de sacarose, não se tendo revelado eficazes no processo de desidratação do ovócito pré-congelação e consequentemente, originando gelo intracelular. Efectivamente, concentrações mais elevadas de sacarose (0,3M/L) parecem ser as ideais para atingir os níveis de desidratação que impedem a formação de gelo intracelular (21). Com estas concentrações são alcançadas taxas elevadas de sobrevivência pós-congelação (74% vs 35%) e de fecundação. Ficam no entanto por explicar as baixas taxas de implantação obtidas (17,18) Ovócitos Imaturos - Vesícula Germinativa Uma alternativa à congelação de ovócitos em metafase II parece ser a utilização de ovócitos em fase de vesícula germinativa (VG). Os ovócitos nesta fase de VG já apresentam o seu tamanho máximo (Fig.3) e a cromatina encontra-se em diplóteno da Profase I e, como tal, não existe fuso acromático. Mas, ao contrário dos gâmetas que sofreram maturação in vivo e se encontram em MII, os ovócitos colhidos naquele Figura 3 Ovócito em Profase I. Observe-se a presença da Vesícula Germinativa. estádio requerem um período de maturação in vitro pós-descongelação, prévio ao processo de fecundação. O processo de maturação in vitro de ovócitos imaturos foi inicialmente descrito em animais tendo-se verificado que ovócitos imaturos de coelho removidos do ovário apresentavam a capacidade de atingirem espontaneamente um estado de maturação in vitro (21). Já em 1965 foram obtidos resultados semelhantes na espécie humana (22). Esta técnica é muitas vezes utilizada na tentativa de amadurecimento ( rescue technique ) de ovócitos imaturos colhidos para fecundação in vitro (FIV). No entanto, na maioria dos casos estes ovócitos foram previamente desnudados (isolados das células da granulosa) para uma melhor visualização do seu estado de maturação e, consequentemente, são colocados em cultura sem o seu invólucro natural. Vários estudos revelaram que esta técnica induz a formação de ovócitos com potencial de fecundação reduzido podendo pensar-se que estes ovócitos imaturos terão à partida alterações do processo de 4

5 maturação já que, apesar de terem sido submetidos a elevados níveis exógenos de gonadotrofinas in vivo, estas células não tiveram capacidade de amadurecer, será então pouco provável que in vitro a maturação ocorra de forma fisiológica. O recurso à utilização de ovócitos imaturos retirados de folículos que não tenham sofrido qualquer tipo de estimulação hormonal poderá ser uma alternativa a considerar (23). No entanto, os processos de maturação in vitro ainda requerem optimização ao nível da constituição ideal dos meios de maturação e da melhor técnica de fecundação a utilizar (fecundação in vitro vs microinjecção de espermatozóides). Assim, o uso destas células envolve dois problemas: um relacionado com a congelação em si, o outro com a maturação Criopreservação de Tecido Ovárico A criopreservação de tecido do córtex ovárico parece ser uma aposta bastante promissora para a preservação da fertilidade da mulher (24). As amostras de tecido do córtex podem ser colhidas da paciente em qualquer fase do ciclo menstrual, através de laparoscopia. O córtex do ovário alberga uma enorme quantidade de folículos primordiais que por serem pequenos e pouco diferenciados, desprovidos de zona pelúcida e de células da granulosa, apresentam uma maior tolerância à criopreservação e posterior descongelação. O tecido ovárico depois de descongelado deverá repor a função endócrina e a fertilidade. Desta forma poderão ser evitados inúmeros problemas éticos e morais. Também é de realçar que nesta técnica não é necessária qualquer estimulação hormonal, nem ocorre o atraso consequente no início da terapêutica anti-neoplásica (Fig.4). Existe, no entanto, um risco potencial: a possibilidade de criopreservar tecido ovárico com células neoplásicas. É por isso premente efectuar, por rotina, uma avaliação histológica dos fragmentos do tecido colhido antes de realizar a criopreservação. A criopreservação de tecido ovárico começou por ser realizada em ratinhos, ratazanas e hamsters (25;26;27) e após descongelação o tecido ovárico foi agrafado sob a pele dos animais o que originou gravidezes e descendência. Nestas circunstâncias o crioprotector utilizado foi o glicerol. Mais tarde, em carneiros e utilizando o dimetilsulfóxido (DMSO) como crioprotector, em conjugação com a técnica de slow-freezing, o transplante do tecido pós-congelação resultou em actividade cíclica dos ovários e em gravidezes, estando documentado o nascimento de um carneiro vivo (28). Desde então, têm sido descritos vários casos de sucesso em diferentes espécies animais, incluindo um primata não humano, embora neste caso o implante de tecido tenha sido feito sem congelação (29). Os primeiros casos descritos de criopreservação de tecido ovárico na espécie humana remontam ao ano de 1996 (30;31). 2 Exposição aos Crioprotectores Figura 4 Estratégias para preservar a fertilidade feminina após terapia anti-neoplásica A primeira etapa em qualquer protocolo de criopreservação é tentar atingir um equilíbrio entre as células e o crioprotector. Todos os crioprotectores apresentam características comuns nomeadamente o facto de serem completamente miscíveis em água e a capacidade de facilmente serem incorporados pelas mem- 5

6 branas celulares. Existe uma enorme variedade de crioprotectores, sendo a sua principal função proteger as células dos efeitos da exposição ao frio, estabilizando a estrutura celular e evitando a formação de cristais de gelo intracelular, principais causadores de danos na célula. O factor que mais influencia a resposta da célula à congelação é a relação entre a área de superfície da célula e o volume da mesma. Isto é, quanto maior a célula, mais lento deve ser o arrefecimento no processo de congelação (Tabela I). 3 Directrizes Clínicas para a Criopreservação de Tecido Ovárico 6 Devido ao crescente interesse que se tem verificado na criopreservação de tecido ovárico é necessário que sejam traçadas directrizes clínicas relativas aos diferentes procedimentos. A criopreservação de tecido ovárico deve ser realizada como procedimento laboratorial, a título experimental, tendo em consideração os aspectos mencionados nas directrizes internacionais (32;33;34). As pacientes devem ser informadas acerca das opções que existem para a preservação da sua fertilidade e devem ser devidamente orientadas e aconselhadas acerca do aspecto experimental do procedimento em questão (33). A criopreservação de tecido ovárico só deverá ser oferecida a mulheres que estejam em risco perder a sua fertilidade e que apresentem um Material Tecido Ovárico Ovócito Imaturo(VG) Ovócito Maturo(MII) Disponibilidade Inumeros; Sempre presentes Escassos; Apenas nos folículos antrais Escassos Obtenção Fácil (biópsia) Punção ovocitária Punção ovocitária Tamanho (µm) <50 µm Células Suporte Fase Nuclear Poucas; Pequenas Profase I; Membrana nuclear µm (depende espécie) Muitas corona/cumulus VG: Membrana nuclear µm (depende espécie) Muitas corona/cumulus Metafase II; sem membrana nuclear Zona Não Sim Sim Grânulos Corticais Não Centrais Periféricos Lípidos Intracelulares Poucos Podem ser abundantes Podem ser abundantes Taxa Metabólica Baixa Baixa Baixa Superfície / Volume Alta Baixa Baixa Tabela I Comparação de características que influenciam a criosensibilidade e a adequabilidade para o crio-armazenamento entre ovócitos em diferente estádios de desenvolvimento. (Adaptado de Shaw et al.,) prognóstico favorável pós-terapia oncológica Desafios na Criopreservação de Tecido Ovárico A criopreservação de tecido ovárico e possível transplante apresenta-se como uma alternativa promissora para a preservação da fertilidade em mulheres com doença neoplásica. No entanto, é necessário acautelar determinadas questões como a isquémia (por deficiente neovascularização do tecido) e o possível risco de transmissão de células neoplásicas. Referências Bibliográficas: 1. Lobo RA (2003) Early ovarian ageing: a hypothesis. Hum. Reprod. 18: Faddy, M.J., Gosden, R.G., Gougeon, A., Richardson SJ, Nelson JF. (1992) Accelarated disappearance of ovarian follicles in mid-life: implications for forecasting menopause. Hum. Reprod. 7: Almeida Santos T (2003) Esterilidade ovocitária Contribuição para o diagnóstico etiológico da ausência de fecundação in vitro e definição de uma nova classe de esterilidade - Tese de Doutoramento. Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra 4. Boring, C.C., Squires, T.S., Tong, T. and Montgomery, S. (1994) cancer statistics. CA Cancer J. Clin., 44: Mohr LR, Trounson AO. (1985) Cryopreservation of human embryos. Ann N Y Acad Sci., 442: Brown JR, Modell E, Obasaju M, King YK. (1996) Natural cycle invitro fertilization with embryo cryopreservation prior to chemotherapy for carcinoma of the breast. Hum Reprod. 11: Whittingham DG. (1977) Fertilization in vitro and development to term of unfertilized mouse oocytes previously stored at -196 degrees C. J Reprod Fertil; 49: Fuku E, Kojima T, Shioya Y, Marcus GJ, Downey BR. (1992) In

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