UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS CRIOPRESERVAÇÃO DE GAMETAS FEMININOS Kele Amaral Alves Orientadora: Profª Dra. Maria Lúcia Gambarini Goiânia 2011

2 ii KELE AMARAL ALVES CRIOPRESERVAÇÃO DE GAMETAS FEMININOS Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás Nível: Doutorado Área de Concentração: Produção Animal Linha de pesquisa: Biotecnologia e eficiência reprodutiva animal Orientadora Profª. Dra. Maria Lúcia Gambarini UFG Comitê de Orientação Prof. Dr. José Octavio Jacomini UFU Prof. Dr. Benedito Dias de O. Filho UFG GOIÂNIA 2011

3 iii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Morfologia do Ovário Mamífero Foliculogênese Métodos de Criopreservação Criopreservação de Ovócitos Criopreservação de Tecido Ovariano Criopreservação de Folículos Pré-Antrais CONSIDERAÇÕES FINAIS.. 15 REFERÊNCIAS

4 iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Morfologia do parênquima ovariano de mamíferos FIGURA 2 Classificação folicular conforme o grau de evolução FIGURA 3 Comportamento de ovócitos murinos durante diferentes períodos expositivos ao etilenoglicol 2M. A) Antes da exposição. B) Após 30 segundos de exposição. C) Após 7 minutos de exposição. D) Após minutos de exposição... FIGURA 4 Maturação citoplasmática ovocítária relacionada com a migração dos grânulos corticais (GC); (A) distribuição periférica dos GC; (B) disposição cortical; (C) distribuição homogênea dos GC; (D) distribuição anormal ou heterogênea dos GC. Diâmetro médio do ovócito = 80 µm FIGURA 5 Viabilidade de ovócitos após diferentes tratamentos de criopreservação. Os quatro grupos apresentaram resultados similares FIGURA 6 Viabilidade de ovócitos após diferentes tratamentos de criopreservação. Os quatro grupos apresentaram resultados similares FIGURA 7 Análise da viabilidade de folículo pré-antral de cadela após criopreservação e descongelação. Folículo pré-antral não viável em contraste de fase (A) e com núcleo do ovócito (o) marcado por iodeto de propídeo (B). Microscopia de fluorescência... 15

5 v LISTA DE TABELAS TABELA 1 Sobrevivência de ovócitos humanos: Influência do cúmulus oóforus e da concentração de sucrose TABELA 2 Propriedades de vitrificação de alguns químicos utilizados em soluções crioprotetoras; expressados de acordo com a mínima porcentagem de peso e molaridade da substância para formar a solução de vitrificação TABELA 3 Maturação nuclear após cultivo in vitro de ovócitos não não criopreservados (T0) ou submetidos a vitrificação prévia (T1 e T2)... 10

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7 1 INTRODUÇÃO O desempenho de biotécnicas reprodutivas tem grande impacto nos programas de reprodução assistida humana, de animais de alto valor zootécnico e de espécies ameaçadas de extinção. De acordo com BAKHACH (2009) a biotecnologia de criopreservação definida pela manutenção de tecidos em nitrogênio líquido a temperatura criogênica de -196 C promove a paralisação de todas as funções celulares vitais como reações químicas, processos biológicos e físicos intra e extracelulares, mantendo o tecido criopreservado por tempo indeterminado. A Organização de Alimentos e Agricultura das Nações Unidas relata que é necessário usar o maior número possível de animais em cruzamentos, em razão de preservar as reservas genéticas. De fato, este órgão reconhece que a conservação das espécies e raças só é possível através da conservação dos indivíduos, seja mantendo-os em seu habitat natural, em zoológicos e parques ou pela criopreservação de suas células reprodutivas (DEMIRCI et al., 2003). Segundo FAGUNDES et al. (2004), estão sendo realizados vários estudos científicos sobre o uso das técnicas de criopreservação, com o intuito de formar bancos de gametas que poderão ser úteis em pesquisas ou aplicações comerciais. Avanços significantes neste campo tem sido observados devido ao relativo sucesso alcançado com a criopreservação de sêmen, com o uso e implementação de diversos protocolos. Por outro lado, a criopreservação dos gametas femininos de espécies mamíferas estudadas não demonstram a mesma eficiência (WOODS et al., 2004). Os ovócitos possuem vida fértil relativamente curta o que caracteriza um fator limitante na implementação de muitos procedimentos reprodutivos. Desse modo, a congelação de gametas femininos, é indispensável a preservação de genótipos de valor, assim como a utilização dos mesmos em biotecnologias afins (COSTA et al., 2002). Atualmente, os procedimentos de criopreservação para preservação da fertilidade feminina, são os de embriões, de ovócitos e de tecido ovariano. Estes processos podem trazer implicações para a viabilidade do material a ser conservado, como a formação de cristais de gelo e depósitos de sais no interior

8 2 das células, além de danos na membrana plasmática e organelas devido ao declínio abrupto da temperatura e diferenças de pressão osmótica (HOTAMISLIGIL et al., 1996). Com o intuito de proteger as células dos efeitos deletérios da criopreservação são utilizados solventes orgânicos denominados crioprotetores, cujas características principais são: possuir baixo peso molecular e altas solubilidade e permeabilidade plasmática, o que ocasiona em aumento da viscosidade do meio intracelular, diminuindo a formação de cristais e o desequilíbrio hidro-eletrolítico, aumentando a permeabilidade da membrana citoplasmática (PICTON et al., 2002). Entretanto, é importante que se leve em consideração a toxicidade e a associação química entre os crioprotetores, já que ainda não há consenso sobre qual o melhor crioprotetor (STACHECKI & COHEN, 2004). A permeabilidade da membrana plasmática é um fator importante na determinação da tolerância das células a criopreservação, visto que a mesma modula as principais injúrias celulares causadas pela criopreservação (KASAI et al., 2002). Existem vários métodos de criopreservação entre os quais se destacam o congelamento lento e a vitrificação com maior eficiência em gametas femininos. No congelamento lento, as células são expostas a queda de temperatura gradativa com o uso de congelador programável. Na vitrificação por sua vez, os gametas são expostos a temperaturas muito baixas imediatamente após a exposição com o crioprotetor (GALBINSKI et al., 2003). Neste contexto, objetivou-se nesta revisão abordar as diferentes metodologias utilizadas nos processos de criopreservação de gametas femininos assim como os fatores relacionados à sua eficiência.

9 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Morfologia do Ovário Mamífero A forma e tamanho do ovário variam de acordo com a espécie animal e com a fase estral. O ovário é um órgão composto de medula e córtex, onde a medula é a região que concentra tecido conjuntivo denso, inervação e vascularização que atingem o órgão pelo hilo (união entre o ovário e o mesovário). O córtex ovariano contém folículos em diferentes estádios de desenvolvimento, corpos lúteos e/ou albicans (HAFEZ, 1995) (Figura 1). Além dos nutrientes e hormônios provenientes da corrente sanguínea, fatores produzidos pelos diferentes tipos celulares ovarianos contribuem para a formação de um sistema bastante complexo que regula as funções do ovário, ou seja, a produção de gametas e hormônios (LEITÃO et al., 2009). Figura 1 Morfologia do parênquima ovariano de mamíferos. Fonte:

10 4 2.2 Ovogênese e Foliculogênese A ovogênese é caracterizada pela produção de ovogônias a partir de células germinativas primordiais (CGP) e pela proliferação mitótica de células epiteliais internas originadas de uma interação de diversos tipos celulares ainda na fase pré-natal. Este processo inicia-se antes do nascimento e desenvolve-se por meses ou anos nos animais adultos (DERUSSI & LOPES, 2009). O processo que ocorre concomitante à ovogênese denomina-se foliculogênese, onde ocorrem a formação, crescimento e maturação folicular, iniciando com a formação do folículo primordial e terminando com o estádio de folículo maduro, também conhecido como folículo De Graaf ou pré-ovulatório. Neste estádio está formada uma área cheia de fluido, o antro, entre as camadas de células da granulosa que tem como função fornecer substâncias reguladoras derivadas do sangue ou da secreção de células foliculares como gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento e enzimas a fim de proporcionar um ambiente ideal para a manutenção da viabilidade, crescimento e maturação ovocitária (van den HURK & ZHAO 2005; LEITÃO et al., 2009). A associação de cada ovócito a células foliculares, dentro do ovário, possui o potencial de perpetuar a espécie, gerando novos indivíduos (BINELLI et al., 2009). A função do folículo ovariano é proporcionar um ambiente ideal para a manutenção da viabilidade, bem como, o crescimento e maturação do ovócito (GONÇALVES et al., 2001). Sua classificação ocorre de acordo com o grau de evolução em pré-antrais, compreendendo os primordiais, primários e secundários, e em antrais, que contêm uma área preenchida por fluido folicular, denominada antro, e compreendem os folículos terciários (subordinados e dominantes) e préovulatórios (Figura 2). Os folículos pré-ovulatórios apresentam todos os componentes presentes nos terciários, contudo o ovócito apresenta-se maturo e no estádio final de desenvolvimento folicular (FIGUEIREDO et al., 1993). Os folículos pré-antrais representam cerca de 90 a 95% de toda população folicular (MACHADO et al., 2002).

11 5 Figura 2 Classificação folicular conforme o grau de evolução. Fonte: Adaptado de FIGUEIREDO et al. (1993). 2.3 Métodos de Criopreservação A criotecnologia tem o objetivo de minimizar os danos sobre as células nas etapas de criopreservação (KULESHOVA & LOPATA, 2002). Para aplicar um protocolo de criopreservação, é necessário determinar o agente crioprotetor mais indicado, sua concentração, tempo de exposição e método de remoção. Os crioptrotetores são divididos em três grupos: os intracelulares ou permeáveis de baixo peso molecular (glicerol, etilenoglicol, dimetilsulfóxido), os extracelulares ou impermeáveis de baixo peso molecular (sacarose,galactose, treatose, glicose), e os intracelulares impermeáveis de elevado peso molecular (polivinilpirrolidona, polivinil álcool, hialuronato de sódio, albumina sérica bovina) (SHAW & JONES, 2003). Um dos métodos de avaliação da qualidade folicular é testando a integridade da membrana basal, seja utilizando o corante vital azul de trypan (JEWGENOW et al., 1998) ou marcadores fluorescentes que só penetram em células cuja integridade de membrana está prejudicada como o iodeto de propídeo, utilizado por ALVES. (2010), no processo de criopreservação lenta de folículos pré-antrais caninos.

12 6 SANTOS et al. (2006) descreveram que o método de congelação mais utilizado para gametas femininos é o lento, onde as células são expostas a baixas concentrações de crioprotetor, por um período que varia de 20 a 60 minutos, acondicionadas em congelador programável estabilizado a temperatura de -5ºC, seguido de cristalização manual com objeto metálico congelado em nitrogênio líquido e de resfriamento lento (0,5ºC/min) até -32ºC. Posteriormente, procede-se o armazenamento em nitrogênio líquido (-196ºC). Segundo EL-NAGGAR et al. (2006) as células ou tecidos criopreservados devem ser descongelados de forma rápida, a fim de reduzir a ação tóxica dos agentes criopreservantes. PORCU et al. (2000) relataram taxa de sobrevivência dos ovócitos humanos após etapas de congelação lenta/ descongelação de 59%, utilizando o propanodiol na concentração de 1,5M associado a sucrose 0.2 mol/l como crioprotetores intra e extracelulares. Já FABBRI et al. (2001) demonstraram que com o aumento da concentração de sucrose para 0,3 mol/l e expondo os ovócitos aos crioprotetores durante 15 minutos, as taxas de sobrevivência ovocitária alcançam 82% com o mesmo método (Tabela 1). Em adição, VINCENT et al. (1990) relataram que a presença de células do cúmulus nos ovócitos criopreservados pode minimizar a dispersão dos grânulos corticais e prevenir o endurecimento precoce da zona pelúcida, mantendo assim, a capacidade de fertilização destes ovócitos.

13 7 Tabela 1 Sobrevivência de ovócitos humanos: Influência do cúmulus oóforus e da concentração de sucrose. Remoção do cúmulus Parcial Total Total Concentração congelado/ Sobrevivência congelado/ Sobrevivência congelado/ Sobrevivência de sucrose descongelado n (%) descongelado n (%) descongelado n (%) n n n 0, (31) a (39) b (34) c 0, (60) d (58) e (60) f 0, (81) g (83) h (82) i a versus b, d versus e, g versus h = não significante; a versus d, a versus g, d versus g, b versus e, b versus h, e versus h, c versus f, c versus i, f versus i = P<0,001. Fonte: Adaptado de FABBRI et al. (2001) No entanto, além do resfriamento lento causar danos celulares associados ao uso de concentrações menores de crioprotetores, também exige pessoal qualificado, aparelhos caros e maior tempo para realização da técnica (CAO et al., 2009). Em contraponto, a vitrificação é um processo rápido e que não necessita de aparelhos, pois constitui um processo termodinâmico no qual a viscosidade de um fluido é elevada em grande magnitude, conferindo ao mesmo as propriedades mecânicas da matéria sólida (BAUTISTA & KANAGAWA, 1998). A vitrificação é um dos métodos de criopreservação que tem despertado muito interesse dos pesquisadores por eliminar metodologias laboriosas dos métodos convencionais. Entretanto, requer soluções crioprotetoras em concentrações extremamente elevadas, com consequente efeito tóxico (VAJTA, 2000). No esforço para diminuir a toxicidade dos crioprotetores, várias soluções e técnicas foram introduzidas (SHAW & JONES, 2003), conforme citado na tabela 2. Características comuns nesses métodos foram o uso de crioprotetores de baixa toxicidade, a adição de macromoléculas e açúcares na solução e a combinação de dois ou mais tipos de crioprotetores, dos quais pelo menos um deve ser permeável, sendo o etilenoglicol com os melhores resultados (MARTINO et al., 1996).

14 8 Tabela 2 Propriedades de vitrificação de alguns químicos utilizados em soluções crioprotetoras; expressados de acordo com a mínima porcentagem de peso e molar idade da substância para formar a solução de vitrificação. Crioprotetores % Peso Molaridade Permeabilidade? Butilenoglicol 46 (5,1) (3,0) sim Propilenoglicol 44 (5,7) (4,0) sim 1,3 Butanediol 49 (5,4) Dimetilsulfóxido 49 (6,3) (5,0) sim Glicerol 65 (7,1) (5,0) sim 1,3 Propanodiol 57 (7,5) Etilenoglicol 55 (8,9) (6,5) sim Acetamida 61 (10) não Fonte: Adaptado de SHAW & JONES (2003) De acordo com HOTAMISLIGIL et al. (1996), os ovócitos murinos expostos a diferentes concentrações de etilenoglicol, sofrem rápido encolhimento inicial e retornam a seu volume original após 15 minutos (Figura 3), apesar deste fato, durante todo o processo os ovócitos mantêm sua morfologia esférica, o que indica que o etilenoglicol pode ser usado na vitrificação de ovócitos, respeitandose o período necessário para o equilíbrio volumétrico.

15 9 Figura 3 Comportamento de ovócitos murinos durante diferentes períodos expositivos ao etilenoglicol 2M. A) Antes da exposição. B) Após 30 segundos de exposição. C) Após 7 minutos de exposição. D) Após 15 minutos de exposição. Fonte: HOTAMISLIGIL et al. (1996) A associação de etilenoglicol com dimetilsulfóxido, sucrose e polímeros do álcool polivinílico e do poliglicerol denominados ice blockers na vitrificação de ovócitos bovinos não demonstrou taxas eficientes de sobrevivência ovocitária, clivagem e produção de blastocistos (ZHOU et al., 2010). COSTA et al. (2002) vitrificaram ovócitos bovinos com a combinação de etilenoglicol, trealose e polivinilpirrolidona e obtiveram taxas de maturação ovocitária ínfimas após o procedimento de criopreservação, concluindo que esta associação não foi eficaz para a crioproteção de ovócitos bovinos imaturos, desnudos ou não, pela técnica de vitrificação (Tabela 3).

16 10 Tabela 3 Maturação nuclear após cultivo in vitro de ovócitos não criopreservados (T0) ou submetidos a vitrificação prévia (T1 e T2). Tratamento Ovócitos avaliados (n) Maturação nuclear (%) T0 (testemunha) (81,0) T1 (vitrificados) 36 7 (19,0) T2 (desnudos vitrificados) 31 0 (0,00) Fonte: Adaptado de COSTA et al. (2002) 2.4 Criopreservação de Ovócitos Os ovócitos mamíferos removidos de seu ambiente folicular atingem a maturação nuclear espontaneamente e a mesma se refere a habilidade de retomar e completar a meiose, onde ocorrem mudanças nucleares e citoplasmáticas que conferem aos gametas a capacidade de gerar uma nova vida denominada competência do ovócito (DONNISON & PFEFFER, 2004). A competência é progressivamente adquirida durante as diversas fases da foliculogênese (SIRARD et al., 2006), e inclui entre várias alterações a criação da zona pelúcida com posterior arranjo de receptores de espermatozóides e a organização de organelas intracitoplasmáticas como os grânulos corticais (Figura 4), os quais participam da reação cortical de endurecimento da zona pelúcida evitando a polispermia após a fecundação (ARIAS-ÁLVAREZ et al., 2009). Os processos de criopreservação de ovócitos relacionam modificações ovocitárias estruturais com a eficiência das técnicas adotadas relacionadas ou não ao uso de crioprotetores.

17 11 Figura 4 Maturação citoplasmática ovocítária relacionada com a migração dos grânulos corticais (GC); (A) distribuição periférica dos GC; (B) disposição cortical; (C) distribuição homogênea dos GC; (D) distribuição anormal ou heterogênea dos GC. Diâmetro médio do ovócito = 80 µm. Fonte: ARIAS-ÁLVAREZ et al. (2009) Independente do método, a criopreservação de ovócitos ainda não é uma tecnologia bem estabelecida. Os progressos recentes sugerem que os métodos de vitrificação e congelação ultra-rápida podem alcançar o sucesso na criopreservação ovocitária (VAJTA, 2000). Segundo observações de GALBINSKI et al. (2003) os baixos índices de fecundação de ovócitos bovinos após o processo de criopreservação foram provavelmente causados por modificações estruturais na zona pelúcida devido a alterações nos receptores de espermatozóides durante a exposição às soluções de vitrificação. Estas considerações concordam com a relatadas por WOOD et al. (1993) e MODINA et al. (2004) que obtiveram taxas de fecundação reduzidas em ovócitos murinos e bovinos vitrificados relacionadas a alterações na zona pelúcida. Contrariando estes fatos, SRIPUNYA et al.(2010) relatou altas taxas de sobrevivência e fertilização de ovócitos bovinos tanto na criopreservação com ice blockers como na vitrificação convencional (Figura 5). Esta discrepância de resultados pode ser explicada pelos diferentes métodos avaliativos utilizados nos trabalhos.

18 12 Figura 5: Viabilidade de ovócitos após diferentes tratamentos de criopreservação. Os quatro grupos apresentaram resultados similares. Fonte: Adaptado SRIPUNYA et al A adaptação das técnicas de criopreservação de embriões para ovócitos tem tido sucesso limitado. Em 1986, CHEN foi o primeiro a reportar uma gestação humana originada de um ovócito congelado/descongelado. Entretanto pouco mais 100 bebês nasceram de depósitos ovocitários desde então, mantendo as taxas de gestação inaceitavelmente baixas. 2.5 Criopreservação de Tecido Ovariano A criopreservação de ovócitos maduros, em fase de metáfase II ou de vesícula germinativa demonstra resultados desapontadores, devido a problemas observados no endurecimento precoce da zona pelúcida associada a exocitose dos grânulos corticais, impedindo a entrada dos espermatozóides ou problemas com desarranjo dos cromossomos e danos ao citoesqueleto resultam em baixas

19 13 taxas de sobrevivência e fertilização. Neste contexto, a criopreservação do tecido ovariano contendo folículos primordiais surge como uma nova alternativa nas pesquisas de preservação dos gametas femininos (DEMIRCI et al., 2003). Na década de 50, PARKES & SMITH (1953), reportaram taxas de 5% de sobrevivência folicular após processo de criopreservação de tecido ovariano de camundongos utilizando o glicerol como crioprtetor, porém sem controle preciso de queda de temperatura. Por outro lado, CANDY et al. (1995) relataram que o resfriamento lento de fragmentos ovarianos com glicerol proporcionou 20% de sobrevivência ovocitária. De acordo com LUNA et al. (2010) os folículos primários bovinos criopreservados em tecido ovariano são mais resistentes à altas concentrações de etilenoglicol do que os folículos primordiais com relação a alterações no número de células da granulosa, morfologia e viabilidade. Por outro lado, LAMAITA et al.(2005) não notaram diferenças entre número de folículos primordiais e primários no tecido ovariano bovino após congelação/descongelação e TOMAZ et al. (2005) relataram que o tecido ovariano de coelhas preserva melhor os folículos primordiais após o processo de congelação, como demonstra a figura 6. Independente do estágio de desenvolvimento melhor preservado, é importante considerar o grande número de gametas disponíveis nesta população. Figura 6: Fotomicrografia de tecido ovariano criopreservado com presença de vários folículos primordiais.

20 14 Fonte: TOMAZ et al. (2005) O congelamento de tecido cortical ovariano surge como uma possibilidade de preservar não só a função reprodutiva, mas também a capacidade de produção endógena de esteróides sexuais (SILVA, 2006). Na maturação in vitro de ovócitos criopreservados, considera-se que uma vez que o tecido ovariano é descongelado, teoricamente a fertilidade pode ser restaurada, utilizando a maturação e posterior fecundação in vitro (TOMAZ et al.2005). 2.6 Criopreservação de folículos pré-antrais As técnicas de isolamento de folículos pré-antrais proporcionam o acesso a grande número de estruturas que constituem uma fonte de gametas imaturos que estaria destinada a atresia folicular. Porém, de acordo com SANTOS et al. (2006) a manipulação e cultivo imediato deste arsenal de folículos seria impraticável e ressalta a necessidade de se desenvolver técnicas eficientes de conservação dos mesmos. A criopreservação de folículos pré-antrais tem importância capital na constituição de bancos de germoplasma animal, através da conservação dos ovócitos inclusos nos folículos (FIGUEIREDO et al., 2007). A preservação de ovócitos imaturos em folículos pré-antrais é vantajosa, devido ao menor tamanho, menor número de organelas e formação incompleta da pelúcida, tornando-os mais susceptíveis ao congelamento (OKTAY et al. 1998). Além disso, há a vantagem da preservação de um número muito maior que o de células maduras (RUTHERFORD & GOSDEN, 1999). ALVES (2010) isolou e criopreservou folículos pré-antrais caninos e obteve taxas de viabilidade folicular de 28% com etilenoglicol, avaliadas por microscopia de fluorescência (Figura7). Testando diferentes concentrações de etilenoglicol AMORIM et al. (2003) e LIMA et al. (2006) criopreservaram folículos pré-antrais ovinos isolados e felinos in situ, reportaram resultados satisfatórios nas taxas de sobrevivência folicular.

21 15 Figura 7 Análise da viabilidade de folículo pré-antral de cadela após criopreservação e descongelação. Folículo pré-antral não viável em contraste de fase (A) e com núcleo do ovócito (o) marcado por iodeto de propídeo (B). Microscopia de fluorescência. Fonte: ALVES (2010) 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS A preocupação com as mudanças climáticas e perdas ambientais tem aumentado o interesse da comunidade internacional em pesquisas que envolvem técnicas de conservação da biodiversidade ou que propiciem o aumento da produção de alimentos com maior sustentabilidade. A criopreservação de gametas femininos está inserida neste contexto pois, da mesma forma que propicia a preservação de material genético de espécies ameaçadas através de bancos de germoplasma animal, também estimula o aumento da eficiência reprodutiva de animais de alto valor zootécnico. O consenso entre os autores citados nesta revisão dita que as técnicas de criopreservação precisam ser aperfeiçoadas com o intuito de obter melhores taxas de sobrevivência celular e posterior fertilização, mas em nenhum momento condena as técnicas atuais ou denigre seus resultados.

22 16 A sensibilidade do gameta feminino aos processos de congelação/descongelação é evidente, porém os estudos com novas técnicas e novas substâncias crioprotetoras tem apontado um futuro promissor para a biotecnologia de criopreservação de gametas femininos.

23 17 REFERÊNCIAS 1.ALVES, K. A. Isolamento e criopreservação de folículos pré-antrais caninos f. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia. 2.AMORIM, C. A., RONDINA, D., RODRIGUES, A. P. R., COSTA, S. H. F., GONÇALVES, P. B. D., FIGUEIREDO, J. R., GIORGETTI, A. Isolated ovine primordial follicles cryopreserved in different concentrations of ethylene glycol. Theriogenology, v. 60, p , ARIAS-ÁLVAREZ, M., GARCIA-GARCIA, R. M., REBOLLAR, P. G., REVUELTA, L., MILLAN, P., LORENZO, P. L. Influence of metabolic status on oocyte quality and follicular characteristics at different postpartum periods in primiparous rabbit does. Theriogenology, v. 72, p , BAKHACH, J. The cryopreservation of composite tissues: Principles and recent advancement on cryopreservation of different type of tissues. Organogenesis, v. 5, p , BAUTISTA, J. A., KANAGAWA, H. Current status of vitrification of embryos and oocytes in domestic animals: Ethylene glycol as an emerging cryoprotectant of choice. Japanese Journal of Veterinary Research, v. 45, p , BINELLI, M., PORTELA, V. M., MURPHY, B. D. Dinâmica ovariana e eficiência reprodutiva: estado da arte. Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, 18., 2009, Belo Horizonte. Anais... Belo Horizonte: CBRA, CANDY, C. J., WOOD, M. J., WHITTINGHAM, D. G. Follicular development in cryopreserved marmoset ovarian tissue after transplantation. Human Reproduction, v. 10, p , CAO, Y. X., XING, Q., Li, L., CONG, L., ZHANG, Z. G., WEI, Z. L., ZHOU, P. Comparison of survival and embryonic development in human oocytes cryopreserved by slow-freezing and vitrification. Fertility and Sterility, v. 92, p , COSTA, E. P., GUIMARÃES, J. D., TORRES, C. A. A, FAGUNDES, L. M., GIOSO, M. M. Vitrificação de Ovócitos Desnudados ou Não e Previamente Maturados In Vitro. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 31, p , DEMIRCI, B., LORNAGE, J., SALLE, B., POIREL, M. T., GUERIN, J. F., FRANCK, M. The cryopreservation of ovarian tissue: uses and indications in veterinary medicine. Theriogenology, v. 60, n. 6, p , 2003.

24 18 11.DERUSSI, A. A. P., LOPES, M. D. Fisiologia da ovulação, da fertilização e do desenvolvimento embrionário inicial na cadela. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 33, p , DONNISON, M., PFEFFER, P. L. Isolation of Genes Associated with Developmentally Competent Bovine Oocytes and Quantitation of Their Levels During Development. Biology of Reproduction, v. 71, p , EL-NAGGAR, M. M., AL-MASHAT, F. M., ELAYAT, A. A., SIBIANY, A. R., ARDAWI, M. S., BADAWOUD, M. H. Effect of thawing rate and post-thaw culture on the cryopreserved fetal rat islets: functional and morphological correlation. Life Science, v. 78, p , FABBRI, R., PORCU, E., MARSELLA, T., ROCCHETTA, G., VENTUROLI, S., FLAMIGNI, C. Human oocyte cryopreservation: new perspectives regarding oocyte survival. Human Reproduction, v. 16, p , FAGUNDES, L. M., COSTA, E. P., TORRES, C. A. A., AMARAL FILHA, W. S., SILVA, T. O., GIOSO, M. M. Vitrificação de Ovócitos Desnudados ou Não e Previamente Maturados In Vitro. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 33, p , FIGUEIREDO, J. R., HULSHOF, S. C. J., van den HURK, R., ECTORS, F. J., NUSGENS, B., BEVERS, M. M., BECKERS, J. F. Development of a combined new mechanical and enzymatic method for the isolation of intact preantral follicles from fetal, calf and adult bovine ovaries. Theriogenology, v. 40, p , FIGUEIREDO, J. R., CELESTINO, J. J.H., RODRIGUES, A. P. R., SILVA, J. R. V. Importância da biotécnica de MOIFOPA para o estudo da foliculogênese e produção in vitro de embriões em larga escala. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 31, p , GALBINSKI, S., BOS-MIKICH, A., FERRARI, A. N. Viabilidade e Fertilização in vitro de Oócitos Bovinos após Vitrificação. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v. 25, p , GONÇALVES, P. B. D., FIGUEIREDO, J. R., FREITAS, V. J. F. Biotécnicas Aplicadas à Reprodução Animal. 1, ed. São Paulo: Varela, 2001, 340 p. 20.HAFEZ, E. S. E. Reprodução Animal. 6. ed. São Paulo: Manole, 1995, 582 p. 21.HOTAMISLIGIL, S., TONER, M., POWERS, R. D. Changes in Membrane Integrity, Cytoskeletal Structure, and Developmental Potential of Murine Oocytes after Vitrification in Ethylene Glycol. Biology of Reproduction, v. 55, p , JEWGENOW, K., PENFOLD, L. M., MEYER, H. H. D., WILDT, D. E. Viability of small preantral ovarian follicles from domestic cats after cryoprotectant exposure

25 19 and cryopreservation. Journal of Reproduction and Fertility, v. 112, p , KASAI, M., ITO, K., EDASHIGE, K. Morphological appearance of the criopreserved mouse blastocyst as a tool to identify the type of cryoinjury. Human Reproduction, v. 17, p , KULESHOVA, L. L., LOPATA, A. Vitrification can be more favorable than slow cooling. Fertility and Sterility, v. 78, p , LAMAITA, M. R., BAMBIRRA, E. A., CAMARGOS, M. G. R. S., SILVA-FILHO, A. L., REIS, F. M., CAMARGOS, A. F. Histological Evaluation of the Effects of Cryopreservation in Bovine Ovarian Tissue. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, v. 22, p , LEITÃO, C. C. F., BRITO, I. R., FROTA, I. M. A., SILVA, J. R. V. Importância dos fatores de crescimento locais na regulação da foliculogênese ovariana em mamíferos. Acta Scientiae Veterinariae, v. 37, p , LIMA, A. K. F., SILVA, A. R., SANTOS, R. R., SALLES, D. M., EVANGELISTA, A. F., FIGUEIREDO, J. R., SILVA, L. D. M. Cryopreservation of preantral ovarian follicles in situ from domestic cats (Felis catus) using different cryoprotective agents. Theriogenology, v. 66, p , LUNA, H. S., LIJERON, L. A., COSTA, R. N. Influência de diferentes concentrações de etilenoglicol no número de células da granulosa e morfometria de folículos pré-antrais inclusos em tecido ovariano de Bos taurus indicus, Linnaeus, Ciência e Agrotecnologia, v. 34, p , MACHADO, V. P., RODRIGUES, A. P. R., BRASIL, A. F., AMORIM, C. A., MATOS, M. H. T., SANTOS, R. R., FIGUEIREDO, J. R. Isolamento mecânico e enzimático de folículos ovarianos pré-antrais de fetos caprinos. Ciência Animal, v. 12, p , MARTINO, A., SONGSASEN, N., LEIBO, S. P. Development into Blastocysts of Bovine Oocytes Cryopreserved by Ultra-Rapid Cooling. Biology of Reproduction, v. 54, p , MODINA, S., BERETTA, M., LODDE, V., LAURIA, A., LUCIANO, A. M. Cytoplasmic changes and developmental competence of bovine oocytes cryopreserved without cumulus cells. European Journal of Histochemistry, v. 48, p , OKTAY, K., NEWTON, H., AUBARD, Y., SALHA, O., GOSDEN, R.G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertility and Sterility, v. 69, p.1-7, 1998.

26 20 33.PARKES, A.S., SMITH, A. U. Regeneration of Rat Ovarian Tissue Grafted after Exposure to Low Temperatures, 1953, Proceedings Royal Society of London, v. 140, n. 901, p PICTON, H. M., GOSDEN, R. G., LEIBO, S. P. Cryopreservation of oocytes and ovarian tissue. In: Medical, Ethical and Social Aspects of Assisted Reproduction: Current practices and controversies in assisted reproduction, 2002, Geneva. Anais Geneva, Switzerland: World Health Organization, p PORCU, E., FABBRI, R., DAMIANO, G., GIUNCHI, S., FRATTO, R., CIOTTI, P. M., VENTUROLI, S., FLAMIGNI, C. Clinical experience and applications of oocyte cryopreservation. Molecular and Cellular Endocrinology, v. 169, p , ROSSETO, R., LIMA, I. M. T., SARAIVA, M. V. A., LIMA-VERDE, I. B., SALES, E. T., FIGUEIREDO, J. R. Avanços no isolamento e sistemas de cultivo de folículos pré-antrais. Acta Veterinaria Brasilica, v. 5, p , RUTHERFORD, A. J., GOSDEN, R. G. Ovarian tissue cryopreservation: a practical option? Acta Paediatrica, v. 433, p. 8-13, SANTOS, R. R., RODRIGUES, A. P. R., AMORIM, C. A., COSTA, S. H. F., MATOS, M. H. T., SILVA, J. R. V., CELESTINO, J. J. H., MARTINS, F. S., SARAIVA, M. V. A., MELO, M. A. P., FIGUEIREDO, J. R. Teste de toxicidade e criopreservação de folículos pré-antrais ovinos isolados utilizando Glicerol, Etilenoglicol, Dimetilsulfóxido e Propanodiol. Brazilian Journal of Veterinary Research, v. 43, p , SHAW, J. M., JONES, G. M. Terminology associated with vitrification and other cryopreservation procedures for oocytes and embryos. Human Reproduction, v. 9, p , SILVA, A. C. J. S. R. Preservação de fertilidade. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v. 28, p , SIRARD, M. A., RICHARD, F., BLONDIM, P., ROBERT, C. Contribution of the oocyte to embryo quality. Theriogenology, v. 65, p , SRIPUNYA, N., SOMFAI, T., INABA, Y., NAGAI, T., IMAI, K., PARNPAI, R. A comparison of cryotop and solid surface vitrification methods for the cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development, v. 56, p , STACHECKI, J. J., COHEN, J. An overview of oocyte cryopreservation. Reproductive BioMedicine Online, v. 9, p , THOMAZ, B. A. C., BIONDO-SIMÕES, M. L. P., ALMODIN, C. G., MINGHETTI-CAMARA, V. C., CESCHIN, A. P., IOSHII, S. O. Aspectos

27 21 histológicos do ovário de coelhas após criopreservação. Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia, v. 27, p , VAJTA, G. Vitrification of the oocytes and embryos of domestic animals. Animal Reproduction Science, v. 60, p , van den HURK, R., ZHAO, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology, v. 63, p , VINCENT, C., PICKERING, S. J., JOHNSON, M. H. The hardening effect of dimethylsulphoxide on the mouse zona pellucida requires the presence of an oocyte and is associated with a reduction in the number of cortical granules present. Journal of Reproduction and Fertility, v. 89, p , WOODS, E. J., BENSON, J. D., AGCA, Y., CRITSER, K. J. Fundamental cryobiology of reproductive cells and tissues. Cryobiology, v. 48, p , WOOD, M. J., BARROS, C., CANDY, C. J., CARROLL, J., MELENDEZ, J., WHITTINGHAM, D. G. High Rates of Survival and Fertilization of Mouse and Hamster Oocytes after Vitrification in Dimethylsulphoxide. Biology of Reproduction, v. 49, p , ZHOU, X.L.; NAIB, A.AL.; SUN, D.W.; LONERGAN, P. Bovine oocyte vitrification using the Cryotop method: Effect of cumulus cells and vitrification protocol on survival and subsequent development. Cryobiology, v. 61, p , 2010.