UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS PÓS-GRADUAÇÃO EM HIGIENE E INSPEÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL

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1 UNIVERSIDADE CASTELO BRANCO INSTITUTO QUALITTAS PÓS-GRADUAÇÃO EM HIGIENE E INSPEÇÃO DE PRODUTOS DE ORIGEM ANIMAL AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DA CARNE MOÍDA DE DUAS REDES DE SUPERMERCADOS DA CIDADE DE LONDRINA- PR Magda Adriana Pesarini Pigarro Mariana Santos Londrina, nov. 2008

2 MAGDA ADRIANA PESARINI PIGARRO MARIANA SANTOS Alunas do curso de Pós-Graduação em Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DA CARNE MOÍDA DE DUAS REDES DE SUPERMERCADOS DA CIDADE DE LONDRINA- PR Trabalho Monográfico de Conclusão de Curso (TCC), apresentado à UCB, como requisito parcial para a obtenção do título de Especialista, sob orientação do Prof. Dr. Eduardo Alexandre Hofstätter Londrina, nov. 2008

3 AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DA CARNE MOÍDA DE DUAS REDES DE SUPERMERCADOS DA CIDADE DE LONDRINA- PR Elaborado por: MAGDA ADRIANA PESARINI PIGARRO MARIANA SANTOS Alunas do curso de Pós-Graduação em Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal Foi analisado e aprovado com grau:... Rio de Janeiro, de de Membro Membro Professor Orientador Presidente Londrina, nov. 2008

4 Dedicamos este trabalho aos nossos familiares, ao nosso professor orientador e a toda equipe do Instituto Qualittas.

5 Agradecimentos A Deus e nossos familiares, especialmente pelas horas de convívio sacrificadas em nome do conhecimento.

6 A situação em Londrina revela-se de severa gravidade. O presente estudo comprova que a população está exposta a risco, sem que nenhuma providência seja tomada.

7 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA PESQUISA DE Salmonella spp Procedimentos Resultados CONTAGEM DE Clostridium perfringens Procedimentos Resultados CONTAGEM DE Staphylococcus aureus Procedimentos Resultados CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES 6.1 Procedimentos Resultados CONTAGEM PADRÃO DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS Procedimentos Resultados DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAL / CONCLUSÃO REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 54

8 PIGARRO, Magda Adriana Pesarini; SANTOS, Mariana. Avaliação microbiológica da carne moída de duas redes de supermercados da cidade de Londrina- PR. ( 59 fls) Trabalho de Conclusão de Curso (Pós-Graduação em Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal) Instituto Qualittas Universidade Castelo Branco, Londrina, Resumo O presente estudo buscou avaliar a qualidade microbiológica da carne moída comercializada em duas das principais redes de supermercados de Londrina-PR. Buscou também informações sobre a qualidade higiênico-sanitária deste produto. Foram adquiridas 8 amostras de carne moída nestas duas redes de supermercados ( A e B), e foram realizadas as seguintes análises: Contagempadrão de microorganismos mesófilos, contagem de S. aureus, contagem de C. perfringens, contagem de coliformes totais e termotolerantes e pesquisa de Salmonella. Os resultados obtidos revelaram que a qualidade microbiológica e as condições higiênico-sanitárias das amostras de carne moída analisadas não foram satisfatórias, e a presença de Salmonella em uma delas poderia ser uma importante causa de intoxicação alimentar. Palavras-Chave: carne moída, análise microbiológica, supermercados.

9 PIGARRO, Magda Adriana Pesarini; SANTOS, Mariana. Microbiological analyses of ground meat of two chains of supermarkets in Londrina- PR. ( 59 fls) Trabalho de Conclusão de Curso (Pós-Graduação em Higiene e Inspeção de Produtos de Origem Animal) Instituto Qualittas Universidade Castelo Branco, Londrina, ABSTRACT The present study aimed to evaluate the microbilogical quality of ground meat commercialized in the main chains of supermarkets in Londrina-PR. It also aimed to evaluate the hygienic-sanitary conditions of this product. Eight samples of ground meat were purchased from two chains of supermarkets and the following analyses were accomplished: standard counting of aerobic mesophils microorganisms, counting of Staphylococcus aureus, counting of Clostridium perfringens, counting of total coliforms, thermotolerant coliforms and Escherichia coli and the occurrence of Salmonella. The obtained results revealed that the microbiological quality of the ground meat samples that were analysed was not satisfactory, and the presence of Salmonella in one of them could be an important cause of food poisoning. Key-words: ground meat, microbiological analyses, supermarkets

10 1. INTRODUÇÃO A carne bovina é um alimento nobre de fundamental importância na alimentação humana, tanto pelo seu valor nutritivo quanto pelo seu valor sensorial. A partir de suas gorduras, proteínas e vitaminas, a carne serve para a produção de energia, produção de novos tecidos orgânicos e para a regulação dos processos fisiológicos. A proteína da carne apresenta alto valor biológico devido à disponibilidade de aminoácidos essenciais, contendo todos os aminoácidos essenciais ao ser humano e apresentando digestibilidade de 95 a 100%. A importância da gordura da carne se deve não somente ao seu aspecto energético, mas também por esta apresentar ácidos graxos essenciais, colesterol e vitaminas lipossolúveis. A carne contém todas as vitaminas lipossolúveis (A, D, E e K), contém as vitaminas do complexo B ( tiamina, nicotinamida, riboflavina, piridoxina, ácido pantotênico, niacina, ácido fólico, biotina e cobalamina), apresentando também pequena quantidade de vitamina C. Todos os minerais estão presentes na carne, principalmente o ferro, o fósforo, o sódio, o magnésio, o potássio e o zinco. Cabe salientar aqui que a carne é uma importante fonte de ferro, sendo que de 40 a 60% deste mineral é altamente absorvível. (FEIJÓ,G.L.D, 2006). Dentre os produtos cárneos, a carne moída é um alimento que se

11 destaca entre os demais, uma vez que é bem aceita pelo consumidor pela sua praticidade e por apresentar preços acessíveis, e poder ser utilizada de diversas maneiras na culinária. De acordo com a Instrução Normativa Nº 83, de 21 de novembro de 2003, entende-se por carne moída o produto cárneo obtido a partir da moagem de massas musculares de carcaças de bovinos, seguido de resfriamento ou congelamento. Por ser amplamente consumida, revela-se de fundamental importância atentarmos para a qualidade higiênico-sanitária da carne, que tem sido alvo de preocupação e destaque, uma vez que uma variedade de perigos microbiológicos poderá ser veiculada pela carne, já que este alimento apresenta características favoráveis ao desenvolvimento microbiano, que pode ocorrer em toda a cadeia produtiva até o consumo. (ALMEIDA, A.C. et. al., 2004).

12 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Avaliações microbiológicas da carne bovina em estabelecimentos comerciais de varejo nos mostram que a contaminação da carne e produtos correlatos existe de norte a sul do país. (BALBANI, A.P.S.; BUTUGAN,O., 2001 ) Apesar de apresentar caraterísticas que fazem dela um produto bastante utilizado, a carne moída apresenta outras características que fazem com que ela seja bastante vulnerável à contaminação. No processo de moagem, temse um grande aumento na superfície de contato do alimento, ficando este, mais exposto à contaminação. Além desse fator, carnes fragmentadas apresentam potencial de óxido-redução positivo, uma vez que este produto está em maior contato com o oxigênio do que a carne compactada. Assim sendo, criam-se condições favoráveis ao desenvolvimento de microrganismos aeróbios ou facultativos. Durante a moagem também pode haver a passagem de resíduos de moagens anteriores para as subseqüentes e, além disso, a carne moída muitas vezes é proveniente de retalhos de carnes que foram muito manipuladas e que permaneceram por longos períodos de tempo em temperatura ambiente.(monteiro, V.J.O. et al, 2007). Assim, muitos surtos de doenças transmitidas por alimentos têm sido relatados ao longo dos anos em decorrência do consumo de carne moída e seus subprodutos, surtos esses que ocasionam prejuízos tanto para a saúde do consumidor, como para a economia, visto que acarretam faltas no trabalho e

13 gastos com medicamentos e hospitais. ((MARCHI,P.G.F., 2006) A contaminação da carne pode ocorrer em qualquer etapa, desde o abate do bovino até o armazenamento e distribuição do produto. A musculatura dos bovinos saudáveis é considerada estéril até o momento em que o animal é abatido. A partir do momento em que ocorre a insensibilização, condições favoráveis à penetração e fixação de microorganismos são criadas. A contaminação poderá ocorrer devido ao contato com a pele, com pelos, patas, conteúdo do trato gastrintestinal, leite do úbere, roupas, mãos dos operários, equipamentos, e também através do ar dos locais onde os procedimentos de abate são realizados, e locais de armazenamento das carcaças. (ROÇA, R.O., 2004). Logo, os procedimentos realizados durante o abate determinam a maior ou menor contaminação das carcaças. Espera-se, então, que os procedimentos tecnológicos e higiênicos adotados sejam eficientes e capazes de controlar ou reduzir a carga microbiana inicial. (BERSOT, L.S. 2004) Na linha de abate, a esfola e a evisceração são as duas etapas tecnológicas que merecem atenção especial, pois é durante esses procedimentos que existe grande risco de contaminação das carcaças. É possível transferir-se microrganismos da faca à corrente sangüínea e daí à musculatura, já que, após a sangria,o coração continua batendo por alguns minutos. Por essa razão, é imprescindível a freqüente desinfecção das

14 ferramentas de trabalho e também das mãos dos operários. Após a contaminação, o número de microrganismos tende a aumentar caso as condições higiênicas de manipulação e estocagem não sejam adequadas. (LUCHIARI, A.F., 2001)). Durante a operação de esfola, onde se faz a remoção do couro, principal barreira mecânica à adesão de microrganismos, ocorre a exposição da superfície externa da carcaça, podendo ocorrer a sua contaminação. Quando ocorrem incisões acidentais da musculatura, os microrganismos podem ser levados ao interior das porções musculares. Ainda durante a esfola, a poeira e os aerossóis provenientes da remoção do couro podem vir a contaminar as mãos dos manipuladores. (BERSOT,L. S., 2004 ). No processo de evisceração, a contaminação pode ocorrer se houver ruptura de porções do trato gastrintestinal, através de cortes acidentais, ou quando há extravasamento de conteúdo fecal pelo reto. Uma outra possibilidade de contaminação durante a evisceração poderia se dar através da migração de microrganismos do lúmen intestinal para a cavidade abdominal após a morte do bovino. (BERSOT, L.S. 2004) Cabe ainda ressaltar que, durante todos estes procedimentos, é importante considerar a possibilidade de contaminação através do ambiente de processamento, tais como paredes, pisos, superfícies de contato, facas, mãos, água e outros.

15 Devemos lembrar ainda que alguns fatores afetam a atividade microbiana na carne, sendo eles classificados como fatores intrínsecos e fatores extrínsecos. Os principais fatores intrínsecos são: a) umidade: a atividade de água (Aw) da carne fresca é geralmente igual ou maior que 0,99, sendo este valor próximo ao ótimo para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos. b) ph: a carne apresenta um ph final entre 5,4 e 5.6, valor este que permite o crescimento de bactérias, fungos e leveduras. c) potencial de óxido-redução: com a conversão do músculo em carne ocorre a redução do potencial de óxidoredução. Altos níveis de potencial de óxido-redução favorecem o desenvolvimento de microrganismos aeróbios. Já os microrganismos anaeróbios têm seu desenvolvimento favorecido por baixos níveis de potencial de óxido-redução. d) disponibilidade de nutrientes: a carne é um ótimo meio de cultura para os microrganismos devido à sua grande disponibilidade de nutrientes. Quanto aos fatores extrínsecos, os mais importantes são: a) temperatura:fator extrínseco que mais afeta o crescimento microbiano.(frança FILHO, A.T. et al, 2006) A maioria dos microrganismos cresce bem em temperaturas entre 15º e 40º C. Através do congelamento podemos destruir ou causar injúria à maioria das bactérias da carne, ocorrendo decréscimo da contagem microbiana. Podemos inibir o crescimento das bactérias patogênicas utilizando temperaturas inferiores a 5º C. b) umidade relativa: este fator está diretamente relacionado com a temperatura de refrigeração, em que a umidade deve ser baixa a fim de que se possa evitar o efeito de suar da carne, o que facilita a deterioração do alimento. Umidade relativa acima de 90% favorece o crescimento

16 bacteriano. c) oxigênio: as bactérias aeróbias e facultativas são predominantemente encontradas na superfície da carne, enquanto que as bactérias facultativas e anaeróbias predominam no interior dos cortes cárneos. d) estado físico da carne: Conforme citado anteriormente, carnes fragmentadas ficam mais expostas à contaminação. Observa-se, em condições naturais, que existe uma interação entre todos estes fatores(silva,e.n.,1999). No entanto, o fator mais importante na prevenção da multiplicação de microrganismos na carne é a utilização de baixas temperaturas. Um método utilizado no controle sanitário dos alimentos é a contagem de bactérias mesófilas. Este método nos fornece informações sobre as condições higiênicas durante o armazenamento e a manipulação dos alimentos. Podemos considerar que uma elevada contagem de mesófilos significa que houve condições para o desenvolvimento desses microrganismos, colocando em risco a saúde dos consumidores, uma vez que todas as bactérias patogênicas de origem alimentar são mesófilas. (COSTA,F.N. et al, 2008) A contaminação da carne por Staphylococcus aureus também representa um risco à saúde pública, uma vez que se as toxinas formadas por esta bactéria forem ingeridas, causarão intoxicação alimentar. Essas toxinas são termorresistentes e também apresentam resistência à ação das enzimas intestinais. Sabe-se que o homem e os animais são reservatórios do Staphylococcus aureus, sendo que apresentam o microrganismo na boca, na cavidade nasal, mãos, pele e trato gastrointestinal. Assim, os manipuladores de alimentos são considerados importantes fontes de contaminação. Sendo assim, a contaminação da carne por este microrganismo nos indica as condições higiênico-sanitárias durante a manipulação do alimento. (MARCHI,P.G.F., 2006)

17 Também indica a utilização de equipamentos e materiais inadequadamente higienizados e contaminação da matéria prima de origem animal. (FRANÇA FILHO, A.T. et al, 2006) Considerando-se as estatísticas de toxiinfecções alimentares, podemos dizer que o gênero Salmonella é um dos microrganismos mais perigosos que podem ser transmitidos pela carne (SOUZA,S.F.,2007). São consideradas patogênicas para o homem a Salmonella typhy, Salmonella paratiphy e Salmonella sendai, sendo estes os agentes etiológicos da febre tifóide e paratifóide e a Salmonella typhimurium, que é um sorotipo que pode acometer tanto os animais como o homem e causar gastroenterites veiculadas por alimentos(marchi,p.g.f.,2006). O período de incubação das gastroenterites causadas pela ingestão de alimentos contaminados pela Salmonella varia, em média, de 12 a 24 horas, sendo os sintomas mais freqüentes diarréia mucosa, podendo apresentar sangue e tenesmo, febre, vômitos, cólicas abdominais. Esse quadro poderá persistir por até 3 a 5 dias. Sabe-se, no entanto, crianças, idosos, e pessoas imunossuprimidas são, em geral, mais susceptíveis, uma vez que a patogenicidade do agente é influenciada pela idade, dose infectante e pelo status imunológico do hospedeiro. No caso de manipuladores de alimentos, devemos considerar que eles podem atuar como transmissores da doença, já que, quando infectados, os seres humanos podem desenvolver a doença ou tornarem-se portadores, podendo transmitir o microorganismo, caso as condições higiênicas do seu trabalho sejam precárias (MARCHI,P.G.F.,2006). Temperaturas de crescimento: Psicrófilos: Crescimento abaixo de 20ºC Mesófilos: Crescimento ótimo entre 20ºC e 45º Termófilos: Crescimento acima de 45ºC

18 Os coliformes são as bactérias que indicam a qualidade higiênicosanitária dos alimentos. São conhecidas mais de vinte espécies pertencentes à família Enterobacteriacea. Compõem o grupo dos coliformes totais. Os coliformes termotolerantes apresentam a capacidade de continuar a fermentação da lactose com produção de gás, quando incubados à temperatura de 45 +/- 0,2 ºC, sendo que cerca de 95 % destas culturas são positivas para Escherichia coli, nessas condições. A Escherichia coli é um dos agentes etiológicos mais comumente envolvidos em surtos de doenças transmitidas por alimentos(magro,g.r. & KLEIN,C.S.,2006). Apesar de existir a possibilidade de a E. coli ser introduzida no alimento através de fontes não fecais, ela é o melhor indicador de contaminação fecal que se conhece até o momento(marchi,p.g.f., 2006). A ocorrência de elevado número de coliformes em carne fresca pode indicar manipulação com deficientes condições de higiene e/ou inadequado armazenamento(mendonça,c.r & GRANADA, G.G., 1999). O Clostridium perfringens também é um microorganismo que apresenta considerável importância em surtos alimentares em todo o mundo. As cepas dos tipos A e C são as mais envolvidas em relatos de contaminação, ocorrendo assim, diferentes quadros de intoxicação alimentar, de acordo com a cepa envolvida. A enterite alimentar na forma clássica é causada pela cepa do tipo A. A enterite necrótica, ou doença de Pigbel, é causada pela cepa do tipo C, e é bem mais grave, apresentando 40% de letalidade. Em casos de intoxicação alimentar por cepas do tipo A, os sintomas mais freqüentes são: diarréia, dores abdominais, febre, náuseas e, raramente, vômitos, sendo que estes sintomas surgem de 8 a 12 horas após a ingestão do alimento contaminado, com duração de 12 a 24 horas. Raramente é fatal, sendo mais comuns os casos brandos de intoxicação.

19 Devemos salientar aqui que a presença de pequenas quantidades do microorganismos na carne não representa, obrigatoriamente, um risco de intoxicação alimentar. Somente quando a contaminação é grande é que se pode dizer que há riscos. Alguns autores afirmam ainda, que a toxina pode ser préformada no alimento mas é inativada pelo ph estomacal, não provocando assim, qualquer sintomatologia. Segundo esses autores, existe a necessidade da formação da toxina no intestino do hospedeiro para que ocorra o surgimento do quadro clínico da doença(barreto, E. S.S., 2001). Os maiores problemas constatados nas duas redes de supermercados onde as amostras foram adquiridas estão relacionados à refrigeração inadequada, às condições higiênico-sanitárias deficientes e prolongados períodos de exposição da carne à temperatura ambiente. A carne moída exige, devido à sua alta perecibilidade, manipulação extremamente higiênica, a fim de que se possa manter a contaminação microbiana em valores tão baixos quanto possível e isto não foi observado em nenhum dos supermercados envolvidos neste estudo.

20 3. PESQUISA DE Salmonella spp. OBJETIVOS E ALCANCE A melhor técnica para detecção de Salmonella em alimentos é um método desenvolvido com a finalidade de garantir a detecção mesmo em situações extremamente desfavoráveis. É o caso de alimentos com uma microbiota competidora muito maior do que a população de Salmonella ou de alimentos em que as salmonelas se encontrem em número muito reduzido e/ou alimentos em que as salmonelas encontram-se injuriadas pelo processo de preservação, como a aplicação de calor, o congelamento ou a secagem, por exemplo. MEIOS DE CULTURA, REAGENTES E MATERIAIS MEIOS DE CULTURA - Água peptonada tamponada (APT); - Caldo Rappaport-Vassiliadis modificado (mrv), - Caldo Rappaport-Vassiliadis R10 ou Caldo - Rappaport-Vassiliadis peptona de soja (RVS); - Ágar xilose lisina Tergitol 4 (XLT4); - Ágar tríplice de açúcar ferro (TSI); - Ágar lisina-ferro (LIA); - Ágar nutriente;

21 - Solução salina 0,85%; - Solução salina 0,85% com 0,6% de formalina. REAGENTES - API 20 E PADRÕES - Salmonella H2S-positiva (Salmonella Derby); - Salmonella H2S-negativa (Salmonella Choleraesuis). MATERIAIS - Colheres esterilizadas, tesouras, pinças, facas, bastões de vidro, pipetas, placas de Petri; - Agulhas e alças de 1 e 10 microlitros para inoculação; - Lâminas de vidro, placas de vidro riscadas com quadrados de uma polegada ou placas de vidro para aglutinação; - Sacos plásticos estéreis para Stomacher 750mL. EQUIPAMENTOS - Equipamentos para homogeneizar/misturar: liquidificador estéril, com acessórios de corte esterilizados, copos de liquidificador ou potes de vidro e adaptadores para os mesmos, ou homogeneizador de amostras (Stomacher); - Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação) a 42ºC ± 0,5ºC;

22 - Banho-maria 48 C-50 C; - Estufa 35ºC ± 2 C; - Balança, capacidade de 2000g, sensibilidade de 0,1 g; - Agitador de tubos do tipo Vortex; - Micropipetas calibradas para volumes 0 a 200 microlitros; Micropipetas calibradas para volumes 500 a 1000 microlitros. 3.1 PROCEDIMENTOS O enriquecimento, a triagem, o plaqueamento e a identificação bioquímica e sorológica, foram acompanhados por culturas controle, na mesma seqüência de análise usada para as amostras. Para esses estágios de análise, foram incluídos 3 controles do método a cada bateria de análise: - uma cultura de Salmonella H2S negativa; - uma cultura de Salmonella H2S positiva; - um controle de meio não inoculado. As culturas controle constituíram-se de sorogrupos não comumente encontrados na região, com a finalidade de facilitar a identificação das amostras isoladas através de comparação e diferenciação dos controles. Para os controles positivos, inoculamos uma alça de 1µL de uma suspensão correspondente ao padrão 0,5 McFarland (medida no colorímetro) ou de uma suspensão com opacidade equivalente à 0,5 de McFarland, de cada cepa separadamente, em 225mL de APT (Água peptonada tamponada). Os controles

23 seguiram os mesmos procedimentos de inoculação e incubação das amostras. Usamos uma alíquota de 225mL de APT para o controle não inoculado. Esse controle seguiu o mesmo procedimento de inoculação e incubação das amostras. CONTROLE DE PROCEDIMENTOS ESPECÍFICOS O Kit bioquímico e os antissoros utilizados para confirmação dos isolados da amostra foram previamente aprovados com controles específicos, para comprovar a validade dos inóculos. PREPARO E ANÁLISE PESAGEM E INOCULAÇÃO a. Pesamos 25g ± 0,5g de carne em um recipiente estéril ou em um saco de coleta Whirl-Pak ou Stomacher. b. Acrescentamos 225mL de APT, homogeneizando por aproximadamente 1 minuto ou misturando bem por agitação, conforme necessário. Como alternativa, as amostras de carne moída poderiam ser homogeneizadas ou misturadas vigorosamente, à mão, para que os grumos se desfaçam. c. Incubamos a 35ºC ± 2 C por 20h-24 h. d. Transferimos 0,5mL ± 0,05mL para tubos contendo 10 ml de caldo de enriquecimento Rapapport. e. Incubamos em banho-maria a 42ºC ± 0,5 C por 18 a 24 h. f. Semeamos em placas de ágar XLT4 e BGS, usando a técnica de estrias. Usamos uma alça de 10 microlitros para cada placa. Não subdividimos as placas; semeamos uma placa inteira de ágar para cada caldo de enriquecimento da

24 amostra. g. Incubamos a 35ºC ± 2 C. h. Após incubação de 18h-24 h, selecionamos as colônias suspeitas. i. Reincubamos todas as placas por mais 18 a 24h. Inicialmente, reavaliamos as placas negativas e selecionamos as colônias. Mantivemos, sob refrigeração, todas as placas das quais tenham sido selecionadas colônias. Caso as colônias suspeitas de Salmonella não se confirmassem, reavaliamos as placas das quais foram retiradas. Quando necessário, recoletamos colônias para confirmação. LEITURA Após o período de incubação recomendado, avaliamos as placas com meios seletivos diferenciais quanto à presença de colônias suspeitas de Salmonella. Selecionamos as colônias que se apresentavam mais isoladas. BPLS - Selecionamos as colônias rosadas e opacas, com uma aparência homogênea, bordas regulares sobre meio avermelhado. Em placas com muitas colônias, selecionamos aquelas que apresentavam coloração bronzeada contra um fundo verde. XLT4 - Selecionamos as colônias negras ou vermelhas, com ou sem centro negro. Selecionamos três colônias de cada placa. Coletamos apenas da superfície e do centro da colônia. Evitamos tocar o ágar porque os meios altamente seletivos suprimem o crescimento de muitos organismos que podem ser viáveis.

25 TESTES BIOQUIMICOS a. Das placas dos meios seletivos, inoculamos com agulha uma colônia, sem retornar à mesma, por picada em profundidade e em estrias no bisel, tubos com ágar TSI e LIA, um após o outro. Inoculamos as cepas controle da mesma maneira que a amostra suspeita. Utilizamos tubos com ágar TSI e LIA sem inóculo para o controle negativo. Incubamos a 35ºC ± 2 C por 24h ± 2h. b. Examinamos os tubos de ágar TSI e LIA e observamos a coloração da base e do bisel, o escurecimento do meio e a presença de gás, indicado pelos bolsões de ar ou por rachaduras no ágar. Observamos também o crescimento nas partes inclinadas, seguindo as estrias de semeadura. Descartamos ou reisolamos qualquer crescimento que apresentasse swarming ou cor avermelhada no bisel do ágar lisina-ferro. Os isolados que apresentavam reações típicas de Salmonella spp., e também os que apresentavam reações sugestivas, mas não típicas de Salmonella spp., foram confirmados por meio da combinação de procedimentos bioquímicos e sorológicos. TESTES SOROLÓGICOS TESTE DE AGLUTINAÇÃO COM ANTÍGENO FLAGELR H A partir do crescimento do tubo de LIA, inoculamos um tubo contendo caldo soja triptona ou caldo triptose e incubamos a 35ºC ± 2 C por uma noite ou até que o crescimento apresentasse densidade aproximada de 3 na escala de McFarland. Retiramos 1mL desse tubo, colocamos em um tubo estéril e acrescentamos 1mL de solução salina contendo 0,6% de formalina.

26 estéreis de 13 mm x 100 mm. Transferimos 2 alíquotas de 1mL cada para 2 tubos de ensaio Acrescentamos o soro polivalente H para Salmonella em um dos tubos. O outro tubo foi usado como controle de auto-aglutinação. Incubamos os 2 tubos em banho-maria a 48ºC-50 C, por uma hora. 3.2 RESULTADOS Expressamos os resultados como: Presença/Ausência de Salmonella spp em 25g " - REDE A1: Ausência - REDE A2: Ausência - REDE A3: Ausência - REDE A4: Ausência - REDE B1: Presença - REDE B2: Ausência - REDE B3: Ausência REDE B4: Ausência

27 4. CONTAGEM DE Clostridium perfringens OBJETIVOS E ALCANCE Há vários meios de cultura disponíveis para a detecção de C. perfringens em alimentos, como o Ágar Shahidi Ferguson Perfringens (SFP), Ágar Triptose Sulfito Ciclocerina (TSC), os quais podem ser utilizados com ou sem gema de ovo. A seletividade desses meios é resultado de um ou mais antibióticos, para inibir diversos anaeróbios e anaeróbios facultativos. Os clostrídios reduzem sulfito a sulfeto, que reage com o ferro e precipita na forma de sulfeto de ferro, produzindo colônias pretas. O ágar TSC e o SFP têm sido os meios mais utilizados para a enumeração de C. perfringens por plaqueamento direto, constituindo-se também numa excelente alternativa para a enumeração de clostrídios sulfito-redutores em geral, conseguindo suprimir o crescimento de praticamente todos os anaeróbios facultativos que acompanham os clostrídios em alimentos. As colônias presuntivas de C. perfringens em ágar TSC devem ser confirmadas por testes bioquímicos. Para a confirmação, são mais recomendadas as características de ausência de motilidade, habilidade de fermentar a lactose e reduzir o nitrato em nitrito. 4.1 PROCEDIMENTOS METODOLOGIA / CONTAGEM Baseia-se na inoculação da amostra ou de uma diluição da mesma em meios de cultura seletivos. Após incubação em anaerobiose, os Clostridium formam colônias negras, devido à reação de redução de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amônio e ferro III, formando um precipitado negro.

28 FERMENTAÇÃO TEMPESTUOSA Baseia-se na verificação da fermentação tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, característica do Clostridium perfringens. Essa fermentação caracteriza-se por formação de coágulo bem definido, com grande formação de gás, durante incubação à temperatura seletiva de 46 ± 1ºC. TESTES CONFIRMATIVOS A confirmação de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas características de: imobilidade, redução de nitratos, produção de ácido e gás a partir da lactose, fermentação da rafinose e liquefação da gelatina. MEIOS DE CULTURA, REAGENTES E MATERIAIS MEIOS DE CULTURA - Solução salina peptonada 0,1%; - Ágar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou Ágar Sahid Ferguson - Perfringens (SFP) base; - Ágar motilidade - nitrato tamponado; - Meio leite com ferro; - Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi); - Meio tioglicolato;

29 - Solução de cicloserina 5%; REAGENTES - Vaspar ou óleo mineral ou parafina líquida; - Gerador de anaerobiose - Anaerobac; - Reagentes para coloração de Gram. PESAGEM E PREPARO DA AMOSTRA Pesamos 25g +/- 0,2 g da amostra; Adicionamos 225mL de solução salina peptonada 0,1% ; Homogeneizamos por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta é a diluição inicial a INOCULAÇÃO EM PLACAS A partir da diluição inicial 10-1, efetuamos mais 2 diluições, alíquotas de 1 ml em placas estéreis e adicionamos cerca de 15mL de ágar TSC ou SFP em temperatura entre 46 e 48ºC. superfície plana. Homogeneizamos cuidadosamente e deixamos solidificar em meio para gerar anaerobiose. Adicionamos uma segunda camada de cerca de 10mL do mesmo

30 INCUBAÇÃO Imediatamente após a solidificação do ágar, incubamos as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 +/- 1ºC por 18 a 24 horas. SELEÇÃO E ISOLAMENTO As colônias típicas de Clostridium sulfito redutores são negras e de tamanho variável de 1 a 3mm no ágar TSC e no ágar SFP. típicas. Selecionamos placas que continham entre 20 e 200 colônias Contamos todas as colônias negras presentes. Esse resultado, multiplicado pela diluição usada, corresponde ao número de Clostridium sulfito redutores presentes em cada grama da amostra em análise. Escolhemos 5 colônias negras e repicamos para tubos com ágar estoque. Incubamos em anaerobiose a 36 +/- 1ºC por no mínimo 24 horas. Paralelamente, repicamos para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida. TESTES CONFIRMATIVOS COLORAÇÃO DE GRAM A partir de cultura pura, preparamos esfregaço e coramos pelo método de Gram. Quando se verificava a presença de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizávamos a prova de fermentação tempestuosa.

31 FERMENTAÇÃO TEMPESTUOSA ( Storm test ) Transferimos 1mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionamos o selo estéril e incubamos a 46 ± 1ºC em banho-maria por 6 horas. Incubávamos por tempo maior (12 a 18 h) quando o controle que deveria ser positivo não apresentava reação claramente positiva. Alternativamente, utilizamos uma suspensão da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfície do ágar estoque com solução salina peptonada 0,1%, transferindo 1mL desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em até 6 horas a 46ºC, com formação de coágulo firme e grande quantidade de gás ( fermentação tempestuosa ). Para as culturas que se apresentaram como C.perfringens na coloração de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentação tempestuosa, realizamos as seguintes provas: PROVA DA MOTILIDADE tamponado. Inoculamos a cultura, com agulha, em ágar motilidade-nitrato Incubamos em anaerobiose a 36 ± 1ºC por 24 horas. longo da linha de inoculação. O Clostridium perfringens é imóvel, com crescimento apenas ao

32 4.2 RESULTADOS CÁLCULO DO NÚMERO DE Clostridium perfringens Consideramos como Clostridium perfringens as colônias que se apresentaram, na coloração de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentação tempestuosa, imóveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 ± 2h, da rafinose em até 72 ± 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 ± 2h. Os dados obtidos foram expressos em UFC/g. - REDE A1: <1x REDE A2: <1x REDE A3: <1x REDE A4: <1x REDE B1: <1x REDE B2: <1x REDE B3: <1x REDE B4: <1x10 1 * Resultados com valores <1x10 1 indicam ausência do grupo de microorganismo pesquisado.

33 5. CONTAGEM DE Staphylococcus aureus OBJETIVOS E ALCANCE A contagem de S. aureus em alimentos pode ser feita com dois objetivos: o primeiro relacionado com a saúde pública, para confirmar o seu envolvimento em surtos de intoxicação alimentar, e o segundo para controle de qualidade higiênico sanitária dos processos de produção de alimentos, condição em que S. aureus serve como indicador de contaminação pós-processo ou das condições de sanificação das superfícies destinadas ao contato com alimentos. Em cada um destes casos, o sucesso das análises depende da seleção de um método adequado tanto ao número de microrganismos presentes na amostra, como às condições de injúria impostas a estas células durante o processamento do alimento. De maneira geral, alimentos envolvidos em surtos apresentam uma grande população de S.aureus, não exigindo métodos particularmente sensíveis, enquanto na enumeração como indicador, o número de células geralmente é reduzido, exigindo métodos mais sensíveis. O ágar ABP pode ser utilizado para o plaqueamento direto de alimentos processados ou in natura, tanto na enumeração com finalidade indicativa como na enumeração com finalidade de saúde pública. 5.1 PROCEDIMENTOS METODOLOGIA / CONTAGEM Baseou-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em ágar Baird-Parker, cuja composição evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presença de telurito de potássio na concentração de 0,01 a 0,05%, em combinação com cloreto de lítio (0,2 a 0,5%) e glicina (0,12 a 1,26%).

34 O Staphylococcus aureus reduz anaeróbia e aerobicamente o telurito de potássio, produzindo colônias negras. O ágar Baird-Parker suplementado com solução de gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, por meio do aparecimento de um halo de transparência e outro de precipitação ao redor da colônia, respectivamente. PROVAS CONFIRMATIVAS PROVA DA COAGULASE Baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase produzida pelo microrganismo. COLORAÇÃO DE GRAM tintoriais do microrganismo. Baseia-se na verificação das características morfológicas e PROVA DA CATALASE Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas. MEIOS DE CULTURA, REAGENTES E MATERIAIS MEIOS DE CULTURA -Ágar Baird-Parker base;

35 -Caldo cérebro-coração (BHI); -Solução salina peptonada 0,1%; -Solução salina 0,85%; REAGENTES -Emulsão de gema de ovo a 50%; -Telurito de potássio 3,5%; -Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA; -Peróxido de hidrogênio 3%; -Reagentes para coloração de Gram. MÉTODO PESAGEM E PREPARO DA AMOSTRA Pesamos 25 +/- 0,2g da amostra; Adicionamos 225mL de solução salina peptonada 0,1%; Homogeneizamos por aproximadamente 60 segundos em stomacher sendo esta, a diluição INOCULAÇÃO A partir da diluição inicial 10-1, efetuamos mais 2 diluições; Inoculamos sobre a superfície seca do ágar Baird-Parker, 0,1mL

36 de cada diluição selecionada; Com o auxílio de alça de Drigalski ou bastão do tipo hockey, espalhamos o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção. Nos casos em que a legislação exige valores menores que 100 UFC/g ou ml, distribuimos em duplicata 1mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4mL, 0,3mL e 0,3mL). INCUBAÇÃO Incubamos as placas invertidas a 36 1ºC por 30 a 48 horas. LEITURA Selecionamos as placas que contenham entre 20 e 200 colônias. Contamos as colônias típicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio. Contamos também colônias atípicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos. atípicas. Registramos separadamente as contagens de colônias típicas e Selecionamos 3 a 5 colônias de cada tipo (T) e/ou (A) e semeamos cada colônia em tubos contendo BHI, para confirmação.

37 Incubamos a 36 +/- 1ºC, por 24 horas. uma diluição. Para a obtenção do número final de UFC/ g, utilizamos apenas (Uma colônia atípica pode tornar-se típica na diluição subseqüente em função da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competição bacteriana). PROVA DA COAGULASE Transferimos 0,3mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3mL de plasma de coelho e incubamos a 36 1ºC por 6 horas. seguir: Verificamos a presença de coágulos, considerando os critérios a Reação negativa: não formação de coágulo; Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado; Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado; Reação 3+ : coágulo grande e organizado; Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprenderá quando o tubo for invertido; Quando a reação de coagulação foi do tipo 3+ e 4+, consideramos a prova positiva para Staphylococcus aureus, e quando a reação de coagulação for negativa, consideramos a prova negativa para Staphylococcus aureus. Quando a reação mostrou-se duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicamos do

38 mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubamos a 36 1ºC por 24 horas, para a realização dos testes complementares. TESTES COMPLEMENTARES confirmativas: A partir da cultura pura em BHI, realizamos as seguintes provas COLORAÇÃO DE GRAM Preparamos esfregaço e corar pelo método de Gram. A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares. PROVA DA CATALASE Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estéreis, retiramos uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferimos para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. Misturamos o inóculo ao peróxido e observamos a reação. -A ausência de borbulhas indica prova negativa para catalase. -A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. O Staphylococcus aureus é catalase positiva.

39 5.2 RESULTADOS Quando o número de colônias confirmadas for igual ao número de colônias selecionadas e repicadas, o resultado será igual à contagem inicial, levando-se em consideração a diluição utilizada. O resultado final será a soma dos resultados de colônias típicas e atípicas confirmadas. Expressamos o resultado como: Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10 y UFC/ g. Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x 10 y UFC/ g. - REDE A1: < 1x REDE A2: 2 x REDE A3: 2 x REDE A4: < 1x REDE B1: 2 x REDE B2: < 1x REDE B3: < 1x REDE B4: 2 x 10 4 * Resultados com valores <1x10 1 indicam ausência do grupo de microorganismo pesquisado.

40 6. CONTAGEM DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES OBJETIVOS E ALCANCE O grupo dos coliformes totais inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram negativos, não esporogênicos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 a 48 horas á 35ºC. O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais encontra-se tanto bactérias originárias do trato gastrointestinal de humanos e outros animais de sangue quente, como também diversos gêneros e espécies de bactérias não entéricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por essa razão, sua enumeração em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal, do que a enumeração de coliformes termotolerantes (fecais) ou E.coli. Porém, sua presença é considerada uma indicação útil de contaminação pós sanitização ou pós-processamento de alimentos. O grupo de coliformes termotolerantes (fecais) pertence à mesma família, porém restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, na faixa de 24 à 45ºC. Atualmente sabe-se que os coliformes termotolerantes incluem pelo menos três gêneros, Escherichia coli, Enterobacter e Klebsiella. Por esse motivo, a presença desses coliformes em alimentos é menos representativa, como indicação da contaminação fecal, do que a enumeração direta de E.coli, porém muito mais significativa do que a presença de coliformes totais. 6.1 PROCEDIMENTOS PROVA PRESUNTIVA Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior

41 contagem das colônias suspeitas. O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de ph que revela a fermentação da lactose pelos microrganismos presentes. A adição de sobrecamada visa a prevenção do crescimento e do espraiamento de colônias na superfície do ágar. PROVA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTAIS A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubação a 36 +/- 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos. PROVA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TERMOTOLERANTES (FECAIS) A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de 45 +/- 0,2ºC, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade deve-se à presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.

42 MEIOS DE CULTURA, EQUIPAMENTOS MEIOS DE CULTURA - Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA); - Caldo verde brilhante bile 2% lactose; - Caldo EC; - Solução salina peptonada 0,1%. EQUIPAMENTOS - Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação). PROCEDIMENTOS PESAGEM E PREPARO DA AMOSTRA Pesamos 25 ± 0,2g ou pipetar 25 ± 0,2mL da amostra; Adicionamos 225mL de solução salina peptonada 0,1%. Homogeneizamos por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta é a diluição PROVA PRESUNTIVA INOCULAÇÃO A partir da diluição inicial (10-1 ), efetuamos as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1%. Em seguida, inoculamos 1mL de

43 cada diluição desejada em placas de Petri esterilizadas. Adicionamos a cada placa cerca de 15mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46ºC - 48ºC em banho-maria. total solidificação do meio. Homogeneizamos cuidadosamente e deixamos em repouso até Adicionamos, sobre cada placa, cerca de 10mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46ºC - 48ºC em banho-maria, formando uma segunda camada de meio, gerando assim, anaerobiose. INCUBAÇÃO Após completa solidificação do meio, incubamos as placas em posição invertida em temperatura de 36 1 C por 18 a 24 horas. LEITURA Selecionamos placas que apresentavam entre 15 e 150 colônias. Contamos as colônias que apresentassem morfologia típica de coliformes, ou seja, colônias róseas, com 0,5 a 2 mm de diâmetro rodeadas ou não por uma zona de precipitação da bile presente no meio. Anotamos os resultados de contagem. Contamos separadamente colônias típicas e atípicas e submeter 3 a 5 colônias, de cada uma, às provas confirmativas.

44 PROVAS CONFIRMATIVAS COLIFORMES TOTAIS INOCULAÇÃO Inoculamos cada uma das colônias típicas e atípicas selecionadas em tubos contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. INCUBAÇÃO Incubamos os tubos a 36 1 C por 24 a 48 horas. LEITURA A presença de coliformes totais era confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. diluição utilizada. Anotamos o resultado obtido para cada colônia, bem como a A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só eram válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentassem resultado negativo eram reincubados por mais 24 horas para confirmação. COLIFORMES TERMOTOLERANTES (FECAIS) INOCULAÇÃO em tubos contendo caldo EC. Inoculamos as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes

45 INCUBAÇÃO Incubamos os tubos a 45 0,2 C, por 24 a 48 horas em banhomaria com agitação. LEITURA A presença de coliformes termotolerantes era confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente; Anotamos o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só seriam válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentaram resultado negativo eram reincubados por mais 24 horas. 6.1 RESULTADOS Expressamos os resultados em UFC/g. COLIFORMES TOTAIS - REDE A1: 2 x REDE A2: 2 x REDE A3: 2 x REDE A4: 1 x REDE B1: 5 x 10 4

46 - REDE B2: < 1 x REDE B3: 2 x REDE B4: 3 x 10 2 COLIFORMES TERMOTOLERANTES (FECAIS) - REDE A1: 2 x REDE A2: < 1 x REDE A3: < 1 x REDE A4: < 1 x REDE B1: 5 x REDE B2: < 1 x 10 - REDE B3: < 1 x REDE B4: < 1 x 10 * Resultados com valores <1x10 1 indicam ausência do grupo de microorganismo pesquisado.

47 7. CONTAGEM PADRÃO DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS OBJETIVOS E ALCANCE O método de contagem de microorganismos em placas é um método geral, que pode ser utilizado tanto para contagens de grandes grupos microbianos, como os aeróbios, os aeróbios psicrófilos, os bolores e leveduras e os clostridios sulfito redutores, como também para a contagem de gêneros e espécies em particular, como Staphilococcus aureus, Clostridium perfringens por exemplo. Essa versatilidade é decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar, quando fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia visível e isolada. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo) e as condições de incubação é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar. A relação das colônias é feita entre o número de colônias e o número de unidades formadoras de colônias (UFC). 7.1 PROCEDIMENTOS FUNDAMENTOS Baseia-se na semeadura da amostra ou de suas diluições em ágar padrão para contagem seguida de incubação em temperatura de 36 1ºC por 48 horas. MEIOS DE CULTURA - Ágar padrão para contagem (PCA); - Solução salina peptonada 0,1%.

48 PROCEDIMENTOS PESAGEM E PREPARO DA AMOSTRA Pesamos 25 +/- 0,2 g ou pipetamos 25 +/- 0,2 ml da amostra; Adicionamos 225 ml de solução salina peptonada 0,1%. Homogeneizamos por aproximadamente 60 segundos em stomacher. Esta é a diluição INOCULAÇÃO EM PLACAS A partir da diluição inicial (10-1 ), efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1%, estéreis. Semeamos 1mL de cada diluição selecionada em placas de Petri Adicionamos cerca de 15 a 20mL de PCA fundido e mantido em banho-maria a 46-48ºC. Homogeneizamos adequadamente o ágar com o inoculo e deixamos solidificar em superfície plana. INCUBAÇÃO Incubamos as placas invertidas a 36 +/- 1 C por 48 horas. LEITURA Segundo o tipo de amostra em análise, realizamos a leitura selecionando as placas de acordo com o seguinte critério, contando todas as colônias presentes: colônias; Produtos em geral: Placas que continham entre 25 e 250 Amostras de água: Placas que continham entre 30 e 300 colônias.

49 7.2 RESULTADOS A partir dos dados obtidos, calculamos o número de microrganismos presentes na amostra em análise. Expressamos o resultado em UFC/g. - REDE A1: > 5,6 x REDE A2: 2 x REDE A3: 3 x REDE A4: 6 x REDE B1: 6 x REDE B2: 3 x REDE B3: 4 x REDE B4: 4 x 10 3 * Todas as amostras acima encontram-se fora dos padrões satisfatórios.

50 8. DISCUSSÃO Este estudo investigou a qualidade higiênico-sanitária da carne moída comercializada no comércio varejista de Londrina, em duas grandes redes de supermercados, sendo aqui designadas como redes A e B. Analisou-se a ocorrência de microrganismos indicadores, a citar, Salmonella, coliformes totais, coliformes termotolerantes, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, e padrão de microrganismos mesófilos. As análises processadas foram realizadas no laboratório SEBRAQ- Serviço Brasileiro de Análises Ambientais, Químicas e Biológicas em Londrina. Os métodos utilizados foram realizados de acordo com a Instrução Normativa nº 62/2203 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Para cada amostra analisada, realizou-se uma descrição detalhada dos procedimentos e resultados, sendo que estes últimos revelaram condições sanitárias insatisfatórias, tornando a carne moída destes estabelecimentos uma fonte potencial de infecções e/ou intoxicações, decorrentes da presença de microrganismos patogênicos ou de seus metabólitos tóxicos. Em todos os supermercados onde as amostras de carne foram adquiridas, não foi possível identificar a temperatura dos balcões de refrigeração onde a carne moída se encontrava. Em alguns deles, os termômetros encontravam-se embaçados, impossibilitando a visualização da temperatura; em outros, estes equipamentos apresentavam-se quebrados ou não funcionavam. Quando os atendentes destes estabelecimentos foram questionados a respeito da temperatura desses balcões, as respostas foram as mais diversas, variando de - 10º C a -20º C. Vale lembrar aqui que se tratavam de balcões de refrigeração e não de congelamento, e que o produto encontrava-se refrigerado e não congelado. Esses dados nos indicam a falta de um controle efetivo da temperatura dos balcões e de manutenção dos termômetros, o que vem a colocar em risco a qualidade dos produtos cárneos aí armazenados, uma vez que,