Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala

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1 BIORREATORES Pesquisa Fotos cedidas pelo autor Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala João Batista Teixeira, Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido Introdução A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como ph, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui- 36 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

2 mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão, combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita, 1994). O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0,22 a 0,44 micras de diâmetro. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros, embora volumes menores como 250 e 500 ml, ou maiores, 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. Entretanto, a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita, 1994). Figura 2. Sistema de biorreator, modelo compacto de 4 pares de frascos, utilizando bomba compressora de ar Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. Inicialmente, os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. Para isso, pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados, principalmente na década de 80, e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. Recentemente, os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células, tecidos, gemas e plântulas, tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Nesse caso, os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro, seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl, 1993; Akita & Takayama, 1994). Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al., 1992; Denchev et al., 1992 e sementes sintéticas (Attree et al., 1994; Onishi et al., 1994). Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos, bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos, além da germinação das sementes sintéticas. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião, gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos, bactérias e células vegetais (Takayama & Akita, 1994). Basicamente, os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo, motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco, bomba compressora de ar, sensores de temperatura, ph e oxigênio (Takayama & Akita, 1994). O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura, bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. Os frascos podem ser feitos de vidro, aço inoxidável, policarbonato, polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 C durante 15 a 30 minutos. Freqüentemente, o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta, por onde circula água com temperatura pre-determinada, para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita, 1994). A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas, sendo a Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas, embriões e plantas. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita, 1994). Biorreatores tipo aerador agitador ( aeration agitation bioreactor ) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr,1972; Preil et al., 1988). A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que, para haver uma boa homogeneização do meio, é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas, o que, regra geral, causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo, principalmente em hastes e gemas. Biorreator tipo tambor rotatório ( roller drum bioreactor ) Nesse tipo de biorreator, o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos, que servem não apenas de apoio, mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. Nesse tipo de biorreator, o dano mecânico é mínimo e é adequado ao Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro

3 biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células, tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo, o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio ( oxygen permeable membrane aerator bioreactor ) Figura 3. Detalhe dos frascos do biorreator, com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. Entretanto, o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al., 1983). Biorreator tipo filtro rotatório ( spin filter biorreactor ) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central, por onde o meio de cultura é descarregado (Styer, 1985). Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização, bem como pela aeração do material em cultivo. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al., 1986). Biorreator tipo borbulhamento ( air driven bioreactor ) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. A homogeneização do meio, bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha ( bubble column bioreactor ) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima, o biorreator é do tipo coluna de bolha. Esses modelos de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares, bulbos, cormos e tubérculos (Takayama & Misawa, 1981; Takayama et al, 1991). Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão, por Takayama & Misawa (1981). Biorreator do tipo levantamento de ar ( air lift bioreactor ) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Esse modelo apresenta bons resultados, uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al, 1989). A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. Biorreator do tipo fase gasosa ( gaseous phase bioreactor ) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. O meio de cultura, pulverizado sobre o material em cultivo é, em seguida, drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama, 1984). Esse tipo de O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio, que pode ser de teflon, silicone, policarbonato ou polipropileno, através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico, uma vez que não há nenhum tipo de agitação, entretanto, a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al, 1994). Biorreator do tipo sobre-aeração ( overlay aeration bioreactor ) Nesse modelo, a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. Eventualmente, esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al., 1987). Esse modelo apresenta deficiência na aeração, o que pode comprometer o crescimento, sobretudo, de células e tecidos. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente, com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio, o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos, órgãos e plântulas. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado, a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios, que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Visando a eliminar ou a minimizar 38 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

4 Figura 4. Hastes de abacaxi, em cultivo, em biorreator de imersão temporária, em meio de multiplicação esse problema, foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al., 1993). Nesse tipo de biorreator, o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Em seguida, o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos, um superior e um inferior, conectados entre si por um tubo. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado, no superior. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. Quando todo o meio passa para o compartimento superior, ocorre borbulhamento e aeração do Figura 5. Mudas alongadas de abacaxi, após a multiplicação e alongamento em biorreator de imersão temporária, prontas para serem aclimatadas meio em contato com o material em cultivo. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Após um período preestabelecido, a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada, o que, por gravidade, faz com que o meio retorne ao compartimento inferior, permanecendo aí até que o ciclo recomece. O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção, mas mantendo as mesmas características de funcionamento, dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA (Teisson et al., 1995). O sistema RITA vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais, com diferentes tipos de explantes, apresentando resultados muito bons (Alvard et al., 1993; Teisson et al., 1995; Etienne et al., 1997; Cabasson et al., 1997; Etienne et al., 1999). Na realidade, o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). Segundo Harris & Mason (1983), Steward et al. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se tratava de deficiência de oxigenação do meio de cultura. Visando a contornar esse problema, delinearam e construíram um equipamento que foi denominado auxophyton, o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda, de tal forma que, em determinado momento, os segmentos de raiz eram expostos ao ar e, no momento seguinte, submersos no meio líquido, conseguindo, com isso, um aumento da matéria fresca de 38,1 mg em meio gelificado para 98,6 mg em meio líquido, no auxophyton. Posteriormente, um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983), para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer, apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. (1952). Nesse equipamento, o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados, de tal forma que, em certa posição, o explante se encontrava submerso e, em outra posição, não submerso. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo, por 28 dias, em meio gelificado com agar. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária, a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. Em 1985, Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária, que consistia de uma grande câmara de cultura, a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório, esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. Nesse sistema, o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. Após esse período, o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. Esse procedimento era repetido a cada semana. Pouco tempo depois, Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária, no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado, com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. Simonton et al. (1991) desenvolve- Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro

5 c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo, o que é determinado pela extensão das tubulações, bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido; d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz, fotoperíodo e temperatura; e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. Figura 6. Plantas aclimatadas de abacaxi, multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação, no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo, de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura, alguns problemas foram identificados, como o uso de um frasco relativamente grande, de difícil manuseio, além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. (1999) para gemas de abacaxi. Esse sistema utiliza dois frascos, sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. Entretanto, não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica, em termos gerais, são equipamentos: a) complexos, do ponto de vista de montagem e funcionamento; b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua, não permitindo versatilidade no seu uso, por ex., transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa; c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização, carga, descarga e troca do meio de cultura. Por sua vez, os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção, montagem e funcionamento. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI, para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al., (1993) e Lorenzo et al. (1998), que permite uma grande versatilidade de uso. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos, os quais podem variar em tamanho, formato, constituição, tipo de tampa, transparência, etc.; b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides, temporizadores, fonte de ar comprimido, filtros de ar, fluxômetro, conexões metálicas, mangueiras de silicone, etc.) podem ser de fácil aquisição ou feitura; f) no regime de imersão contínua, o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário, cujo período pode ser definido pelo temporizador. Para isso, são necessários pequenos ajustes no equipamento; g) o equipamento permite fazer, ainda, uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio, nitrogênio e gás carbônico; h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões, quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. Nos primeiros ensaios, o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas, sob regime de imersão temporária. Em ambos os casos, os resultados preliminares foram excelentes. No momento, estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi, em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. Por ser um equipamento recémdesenvolvido, várias modificações estão sendo introduzidas no sistema, como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos, como células e gemas, além de propiciar uma 40 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

6 melhora no funcionamento, bem como no uso e economia da fonte luminosa. Alguns exemplos de uso podem ser enumerados para esse sistema de cultivo em meio líquido, de forma semi-automática: cultivo de células embriogênicas e não embriogênicas, embriões somáticos de diferentes espécies, gemas axilares e apicais para fins de multibrotação, microestacas de várias espécies para fins de crescimento e multiplicação das hastes caulinares, cultivo de raiz para experimentos diversos, incluindo a produção de metabólitos secundários, além de outras aplicações, como a germinação de embrião zigótico in vitro, em alta quantidade e em condições totalmente assépticas. Referência Bibliográfica Akita, M & Takayama, S. Stimulation of potato (Solanum tuberosum L. ) tuberization by semicontinous liquid medium surface level control. Plant Cell Rep. 13: , 1994; Alvard, D.; Cote, F. & Teisson, C. Comparison of methods of liquid medium culture for banana micropropagation. Plant Cell, Tiss. and Org. 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