LUCIANA DOS SANTOS MEDEIROS

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1 1 UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA DOUTORADO EM MEDICINA VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CLÍNICA VETERINÁRIA E REPRODUÇÃO ANIMAL LUCIANA DOS SANTOS MEDEIROS ANÁLISE DE CUSTO-EFETIVIDADE DE PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA NITERÓI 2013

2 2 LUCIANA DOS SANTOS MEDEIROS ANÁLISE DE CUSTO-EFETIVIDADE DE PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal. ORIENTADOR: PROF. DR. WALTER LILENBAUM NITERÓI 2013

3 3 LUCIANA DOS SANTOS MEDEIROS ANÁLISE DE CUSTO-EFETIVIDADE DE PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Clínica e Reprodução Animal. BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Walter Lilenbaum Universidade Federal Fluminense Profª. Dr.ª Miliane Moreira Soares de Souza Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Prof. Dr. Wagner Lopes Soares Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Prof. Dr. Flabio Ribeiro de Araújo Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Profª. Dr.ª Ana Maria Reis Ferreira Universidade Federal Fluminense NITERÓI 2013

4 4 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Walter Lilenbaum, pelo profissionalismo, dedicação e orientação. Obrigada pelos ensinamentos e motivação. À Prof a Dra Ana Maria Reis Ferreira, coordenadora de nosso programa. Aos cientistas e amigos que constituem a equipe do Laboratório de Bacteriologia Veterinária da UFF, em especial Drª Carla Dray Marassi. Aos amigos da Universidade Federal do Acre UFAC pelo incentivo e oportunidades, em especial aos companheiros de trabalho e Professores do Curso de Medicina Veterinária Dr. Henrique Jorge de Freitas, Drª. Soraia Figueiredo de Souza, Srª Sandra Lira, Dr. Raimundo Cláudio Gomes Maciel, MSc. Sara Lucena de Amorim, Drª Vânia Maria França Ribeiro e MSc Leonardo Kohara Melchior e Dr. Francisco Glauco. À toda minha família, em especial meus pais José André de Medeiros Sobrinho e Elizabeth dos Santos Medeiros, minhas irmãs Aline dos Santos Medeiros e Amanda dos Santos Medeiros, e minhas avós Antônia e Guiomar, meus alicerces, fonte de amor, inspiração e determinação. Obrigada por me incentivarem a continuar no caminho da contínua busca por conhecimento.

5 5 Ao Yuri Karaccas de Carvalho por me incentivar e contribuir de maneira inestimável na etapa final deste trabalho, sempre determinado, amigo e companheiro. Aos meus cunhados Leonardo e Pedro, pela amizade, incentivo e palavras duras nos momentos necessários. Ao Breno Vasconcelos por compartilhar de momentos importantes que me permitiram iniciar na vida científica, obrigada pelos anos de amizade e bom humor. Às amigas que me acompanharam nessa empreitada, em especial Mariana Côrtes Bruno, Suzana Leite, Luciana Cardoso dos Santos e Mariana Valdieiro. A Deus, força maior nos momentos difíceis. Ao CNPq, CAPES e FAPERJ pelo apoio financeiro. A todos que de alguma forma contribuíram neste trabalho.

6 6 RESUMO Em diversos países, a tuberculose bovina, causada por Mycobacterium bovis, é um problema econômico e de saúde pública. Mundialmente, são implementados programas de erradicação da enfermidade com políticas baseadas em testes tuberculínicos e abate dos animais reativos, porém pouco se sabe sobre os custos e a efetividade das políticas de erradicação. O presente estudo avaliou a relação de custo-efetividade dos protocolos de diagnóstico da tuberculose bovina empregados em um rebanho naturalmente infectado. Os custos para a realização dos testes foram obtidos diretamente pela equipe de pesquisa do Laboratório de Bacteriologia Veterinária de acordo com o protocolo de diagnóstico estabelecida no projeto. Após o estabelecimento dos custos dos protocolos diagnósticos atuais (somente testes tuberculínicos) e de novos protocolos que incluam o uso do ELISA MPB70/MPB83 e gama-interferon (IFN) na prática laboratorial, foi estimado para cada protocolo a relação de custo-efetividade (C/Ef). Adicionalmente foi calculado o incremento entre os custos (I-C) e o incremento entre a efetividade dos protocolos (I-Ef) possibilitando também a análise da razão incremental de cada protocolo (I-C/I-Ef). O mesmo procedimento de análise econômica foi realizado para a confirmação do diagnóstico post-mortem. Após realização da análise de custo-efetividade (C/I) dos protocolos diagnósticos observou-se que o Teste Cervical Comparativo (C/Ef= 8,92), quando utilizado isoladamente, é a escolha diagnóstica melhor custo-efetiva para um rebanho naturalmente infectado. Entretanto nesta análise não se levou em consideração a possível permanência de animais recentemente infectados e animais anérgicos no rebanho. A realização do cálculo da análise custo-efetividade dos protocolos confirmatórios de diagnóstico post-mortem demonstrou que a histopatologia (C/Ef= 24,74) associada ao Teste Cervical Simples e Teste Cervical Comparativo foi a escolha melhor custo-efetiva para os animais do rebanho estudado. Palavras-chave: Tuberculose bovina, diagnóstico, custo-efetividade

7 7 ABSTRACT In many countries, bovine tuberculosis, caused by Mycobacterium bovis, is an economic and public health problem. Programs to eradicate the disease are globally implemented with policies based on tuberculin testing and slaughter of reactive animals. However, little is known about the costs and the effectiveness of eradication policies. This study evaluated the cost-effectiveness of diagnostic protocols for bovine tuberculosis diagnosis employed in a naturally infected herd. Costs for the tests were obtained by the research team of the Laboratory of Veterinary Bacteriology according to diagnosis protocols established on the project. After the establishment of the costs on current diagnostic protocols (only tuberculin tests), and on the new protocols that includes the use of ELISA MPB70/MPB83 and gamma interferon test (IFN) in laboratories, the costeffectiveness (C/Ef) was estimated for each protocol. Additionally, we have calculated the increment between costs (I-C) and the increment between the effectiveness of the strategies (I-Ef), which also enables the incremental ratio analysis of each method (I-C / I-Ef). The same procedure of economic analysis was performed to confirm the post-mortem diagnosis. After cost-effectiveness (C/Ef) analysis of the diagnostic protocols, the Cervical Comparative Test (C / Ef = 8.92) showed the best C/Ef when used alone. This choice is a more costeffective diagnostic for a naturally infected herd. However, this analysis does not take into consideration the possible permanence of recently infected animals and anergic animals in the herd. The cost-effectiveness analysis of confirmatory methods for post-mortem diagnosis showed that histopathology (C/Ef = 24.74) associated with Cervical Simple Test and Cervical Comparative Test was the most cost-effective choice for the studied animals. Keywords: Bovine tuberculosis, diagnosis, cost-effectiveness

8 8 LISTA DE TABELAS TABELA 1 - TABELA 2 - TABELA 3 - TABELA 4 - TABELA 5 - Tabela 1 - Componentes de custo referentes aos testes de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e de plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.51 Tabela 2 - Custos totais e unitários dos protocolos de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e de plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.53 Tabela 3 - Sensibilidade e especificidade dos protocolos de diagnóstico da tuberculose bovina aplicados em bovinos e amostras de tecido, de soro e de plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.54 Tabela 4 - Resultados das análises de custo-efetividade dos protocolos empregados no diagnóstico da tuberculose bovina em 50 bovinos provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.55 Tabela 5 - Resultados das análises de custo-efetividade na confirmação post-mortem do diagnóstico da tuberculose bovina em amostras de tecidos de 25 bovinos provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.56

9 9 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 - FIGURA 2 - FIGURA 3 - FIGURA 4 - FIGURA 5 - FIGURA 6 - Figura 1 - Progressão da resposta imune de bovinos infectados com Mycobacterium bovis. Adaptado de Pollock e Neill, Uso autorizado pelo autor. p.17 Figura 2 - Associação entre protocolos diretos e indiretos para detectar animais infectados e posterior confirmação e tipificação das amostras bacterianas. p.18 Figura 3 - Plano de custo-efetividade. A, B, C e D são exemplos de novas intervenções. Adaptado de Vanni e colaboradores (2009). p.50 Figura 4 - Custo em reais (R$) dos componentes referentes aos testes de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.52 Figura 5 - Custo unitário em reais (R$) dos protocolos de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. p.50 Figura 6 - Matriz com representação de resultados possíveis no plano de custo-efetividade. p.64

10 10 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO. p FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA. p DOENÇA p RESPOSTA IMUNE p DIAGNÓSTICO p Testes tuberculínicos intradérmicos p Testes in vitro com base na imunidade celular p Pesquisa de anticorpos p Métodos diretos de evidenciação do agente p Isolamento bacteriano p Diagnóstico molecular p Histopatologia p ESTRATÉGIA DO PROGRAMA DE ERRADICAÇÃO DA TUBERCULOSE BOVINA NO BRASIL p Métodos diagnósticos empregados no PNCEBT p Novas perspectivas no diagnóstico da tuberculose bovina p ASPECTOS ECONÔMICOS DOS PROGRAMAS DE ERRADICAÇÃO DA TUBERCULOSE BOVINA p AVALIAÇÃO DOS CUSTOS DE PROGRAMAS DE ERRADICAÇÃO DE ENFERMIDADES ANIMAIS p.34

11 CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DOS CUSTOS p PRINCIPAIS TIPOS DE AVALIAÇÂO ECONÔMICA EM SAÚDE ANIMAL p OBJETIVOS. p OBJETIVO GERAL p OBJETIVOS ESPECÍFICOS p MATERIAL E MÉTODOS. p MODELO DO ESTUDO p POPULAÇÃO DE REFERÊNCIA p POPULAÇÃO DO ESTUDO p SELEÇÃO DOS ANIMAIS p Critérios de inclusão p Critérios de exclusão p PERÍODO DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO p OPERACIONALIZAÇÃO DO ESTUDO p AVALIAÇÃO ECONÔMICA p Estimação dos Custos p Análise de custo-efetividade p RESULTADOS. p CUSTO DOS TESTES DE DIAGNÓSTICO p DESEMPENHO DOS PROTOCOLOS EMPREGADOS NO DIAGNÓSTICO DA TUBERCULOSE BOVINA p ANÁLISE DE CUSTO-EFETIVIDADE DOS PROTOCOLOS DE DIAGNÓSTICO p DISCUSSÃO. p CONCLUSÕES. p OBRAS CONSULTADAS. p.70

12 12 1. INTRODUÇÃO. A tuberculose bovina é uma doença determinada pela bactéria Mycobacterium bovis, um bacilo álcool-ácido resistente, que pode acometer diversas espécies de animais silvestres, domésticos e humanos, comprovando a relevância desta zoonose (MÜLLER et al., 2013). Em bovinos, a forma mais frequente da doença é a pulmonar, embora possa ocorrer a forma intestinal em bezerros por meio de ingestão de leite contaminado (BIFFA et al., 2012). A infecção humana determinada por M. bovis pode ocorrer pela via aerógena, ingestão de leite infectado ou com menor frequência, pelo contato com mucosas e pele lesionada (VORDERMEIER et al., 2012). A doença causada por M. bovis é clínica, radiológica e patologicamente indistinguível daquela determinada por M. tuberculosis (ALLIX-BÉGUEC et al., 2010). Contudo, diferentemente da tuberculose característica em humanos, a apresentação extrapulmonar é frequente, principalmente devido à via de infecção oral relacionada à ingestão de leite cru e seus derivados. Entretanto, em países desenvolvidos a infecção oral é menos frequente devido ao consumo de leite e subprodutos pasteurizados (KATALE et al., 2012). Devido à importância em medicina veterinária e seu impacto na saúde humana, a tuberculose bovina é uma doença que demanda atenção por parte de programas de saúde animal de diversos países. No Brasil, a tuberculose bovina vem sendo alvo de intensa campanha de erradicação por meio de um programa nacional. De acordo com o Programa Nacional de Controle e

13 13 Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), que foi instituído em 2001, o controle da enfermidade baseia-se no método de teste-e-abate. Todavia, um dos maiores complicadores para o sucesso do plano de controle diz respeito às limitações do método de diagnóstico preconizado, que apresentam problemas quanto ao padrão de sensibilidade e especificidade (WATERS et al., 2011). Em parte, essas limitações nos protocolos de diagnóstico por intradermoreação são decorrentes das distintas respostas imunológicas que animais infectados apresentam no decorrer da doença. Com base neste desafio, novas abordagens e protocolos diagnósticos ante-mortem e post-mostem foram desenvolvidos para possibilitar o controle e erradicação da tuberculose bovina. Testes como dosagem de Interferon-Gama (IFN), ELISA para pesquisa de anticorpos anti-m.bovis, Reação em cadeia da polimerase (PCR), histopatologia, cultura e isolamento têm sido utilizados em uma estratégia multidisciplinar de diagnóstico da doença (MARASSI et al., 2013). Entretanto, apesar das vantagens e desvantagens dos protocolos já relatados, não há menção em relação ao custo-efetividade quando utilizados no Brasil e existe a necessidade de validação dos métodos que ainda não são utilizados no país. Os protocolos de diagnóstico da enfermidade geram custos ao programa de erradicação, que necessitam quantificação e posterior análise econômica. Adicionalmente aos custos decorrentes do processo de diagnóstico e controle da enfermidade a ocorrência de surtos de tuberculose bovina pode levar a perdas produtivas decorrentes a perda de credibilidade dos produtores envolvidos e restrições na exportação do País. Neste sentido, adicionalmente ao aspecto zoonótico, pretendeu-se discorrer sobre os aspectos financeiros relacionados à utilização de distintos protocolos diagnósticos da tuberculose bovina. As avaliações foram baseadas nas respostas imunológicas dos animais infectados por M. bovis e os custos decorrentes dos testes de diagnóstico a fim fornecer dados concretos para a escolha de um método de diagnóstico mais custo-efetivo.

14 14 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA DOENÇA Mycobacterium bovis, agente da tuberculose bovina, é membro do complexo Mycobacterium tuberculosis (MTB) que inclui as espécies M. tuberculosis, M. africanum, M. canetii, M. bovis, M. microti e M. caprae (DE LA RUA- DOMENECH et al., 2006). Apesar de um alto nível de similaridade genética entre essas espécies, as diferenças genéticas parecem estar concentradas na capacidade patogênica em relação à restrição ao hospedeiro (PIERCY et al., 2007). A maioria das demais espécies de micobactérias existe principalmente como saprófitos ambientais e estão distribuídas amplamente no solo, poeira e água. Algumas dessas espécies são agentes patogênicos oportunistas para humanos e animais, com capacidade para causar a doença local ou mesmo sistêmica quando se instalam em indivíduos imunocomprometidos (THOEN et al., 2009; MÜULLER et al., 2013). No gado bovino, as lesões da tuberculose são com maior freqüência encontradas nos órgãos ricos em tecido reticuloendotelial, em particular os pulmões e gânglios linfáticos associados, e no fígado (CORNER, 1994, FIRDESSA et al., 2012). Em um estudo realizado em gado bovino natural ou experimentalmente infectado foi demonstrado que as lesões são mais frequentemente observadas nas vias respiratórias inferiores. No entanto, em

15 15 um número significativo de casos, as vias respiratórias e tecidos associados superiores também podem apresentar lesões (RODGERS et al., 2007). Embora os tubérculos não sejam considerados lesões clássicas da tuberculose bovina (TB), a presença destes leva aos sinais clínicos da doença, que estão diretamente associados a sua distribuição e quantidade (DE LA RUA- DOMENECH et al., 2006) RESPOSTA IMUNE Após a infecção do animal por M. bovis, há uma interação inicial entre os macrófagos alveolares e micobactérias, que definirá os eventos posteriores e decidirá as conseqüências da exposição aos bacilos (POLLOCK e NEILL, 2002; ZUÑIGA et al., 2012). Está bem estabelecido que M. bovis leva á uma reação do tipo hipersensibilidade tardia e que o reconhecimento dos antígenos de micobactérias pelos linfócitos T é sugerido como a principal resposta imune à tuberculose. A resposta de hipersensibilidade tardia é avaliada como um indicador de uma resposta imune mediada por células que é consequência da infecção por Mycobacterium sp. (POLLOCK et al.; WELSH et al., 2005). No gado bovino, os linfócitos T são as primeiras células envolvidas na reação à tuberculose, demonstrando a importância da imunidade mediada por células (IMC) na tuberculose bovina (POLLOCK et al., 2005). As células CD 4, CD 8 e T são as subpopulações dos linfócitos T envolvidas no controle da doença (BUDDLE et al., 2005; POLLOCK et al., 2005; PLATTNER et al., 2009). Os estudos da dinâmica de linfócitos na circulação sanguínea do gado bovino experimentalmente infectado por M. bovis revelaram participação sequencial das subpopulações dos linfócitos T (BUDDLE et al., 2005). Em um primeiro momento o predomínio é da célula T, seguida pela célula CD 4, e posteriormente uma participação mais destacada da célula CD 8 (POLLOCK et al., 2005). A população de células CD 4 de linfócitos T realiza a maior contribuição na imunidade adquirida contra tuberculose, produzindo IFN. Os linfócitos T CD 8 mediam seus efeitos pela produção de citocinas como IFN e também apresentam atividades citotóxicas, que controlam a replicação

16 16 micobacteriana. As células T, que estão presentes em grandes quantidades nos jovens ruminantes, conseguem reconhecer antígenos micobacterianos não proteicos, assim como os proteicos (WATERS et al., 2011). Como uma parte da imunidade contra micobactérias, o desenvolvimento de resposta do linfócito T auxiliar tipo 1 (Th1) é considerado essencial para ativar as rotas de macrófagos por meio da produção das citocinas como o IFN (WELSH et al.; BUDDLE et al., 2005; WATERS et al., 2011). Sabe-se que anticorpos são produzidos por células B nas etapas avançadas da tuberculose bovina (POLLOCK E NEILL, 2002). Este fato foi posteriormente reforçado (WELSH et al., 2005) pela demonstração da modificação da resposta imunológica celular para humoral em todos os animais tuberculosos analisados. Inicialmente os animais desenvolveram forte resposta celular, que claramente diminuiu com a progressão da doença, e houve o aumento da resposta humoral baseada em anticorpos IgG1. Contudo, a resposta humoral não pareceu ser capaz de controlar a infecção, a progressão da enfermidade ou o aumento da carga bacteriana. Foi ainda demostrado que o gado bovino experimentalmente infectado também pode ter uma resposta de anticorpos prematura, com a detecção de anticorpos específicos IgM e IgG, utilizando antígenos já reconhecidos (WATERS et al., 2006). A progressão da doença pode explicar a anergia de alguns bovinos infectados aos testes intradérmicos baseados na IMC (figura 1). A ausência da resposta celular nos animais infectados ocorre particularmente quando a carga bacteriana é alta (WATERS et al., 2010). É importante ressaltar que os animais anérgicos possuem resposta imune, entretanto está direcionada a outros antígenos, não predominantes nos testes tuberculínicos.

17 Resposta Imune ANERGIA 17 Tempo de infecção Figura 1 - Progressão da resposta imune de bovinos infectados com Mycobacterium bovis. Adaptado de Pollock e Neill, Uso autorizado pelo autor DIAGNÓSTICO Em uma estratégia de controle e erradicação da tuberculose bovina os testes de diagnóstico devem ser utilizados tanto ante-mortem quanto post-mortem, com a finalidade de detectar a doença no rebanho e eliminar animais infectados, além de confirmar e identificar o agente etiológico, contribuindo para o seu conhecimento epidemiológico. De acordo com o que se pretende identificar, os testes podem ser classificados em indiretos quando mensuram a resposta imune do animal a um estímulo antigênico conhecido, ou diretos quando têm por alvo a evidenciação do agente etiológico. A associação entre métodos diretos e indiretos permite alcançar o objetivo de diagnosticar animais infectados e posterior identificação das amostras bacterianas obtidas (Figura 2).

18 18 Figura 2 - Associação entre métodos diretos e indiretos de diagnóstico para detectar animais infectados e posterior confirmação e tipificação das amostras bacterianas. De acordo com a abrangente revisão de Schiller e colaboradores (2010), vários dos países que alcançaram a erradicação da tuberculose bovina com sucesso basearam seus programas no diagnóstico do rebanho, como os testes intradérmicos e o IFN, ao invés do diagnóstico individual. Porém, os mesmos autores previram novas estratégias de erradicação, reforçados por sistemas de controle mais direcionados e testes complementares que também tenham alta acurácia em nível individual. Esta tendência a novas estratégias e desenvolvimento de novos e melhores protocolos de diagnóstico também beneficia o controle da tuberculose humana, como já ocorreu para três ferramentas desenvolvidas em bovinos e posteriormente utilizadas em humanos: a vacinação com a cepa atenuada de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guerin, o uso da tuberculina para diagnóstico in vivo e a mensuração in vitro de IFN como biomarcador de infecção (WATERS et al., 2011).

19 Testes tuberculínicos intradérmicos A tuberculinização, ou testes tuberculínicos intradérmicos, são os testes indiretos mais empregados para diagnosticar a tuberculose no gado bovino, tendo sido utilizados por mais de 100 anos (MONAGHAN et al., 1994; SCHILLER et al., 2010; GOOD e DUIGNAN, 2011). De acordo com o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, estes testes são recomendados como diagnóstico oficial no Brasil (BRASIL, 2006). O teste conhecido como teste cervical simples (TCS) consiste da injeção de um derivado protéico purificado (PPD) originário de M. bovis (bovppd). Quando realizado paralelamente à injeção de PPD originária de M. avium (avppd), o teste é conhecido como teste cervical comparativo (TCC). O TCS consiste na injeção intradérmica, no terço médio da região cervical, de 0,1 ml de PPD bovino (cepa AN5 ou Valée). A leitura é conduzida após 72 horas com um cutímetro, com base na avaliação da reação de hipersensibilidade no local da inoculação. No TCC, a inoculação é realizada com 0,1 ml de ambos os PPDs: bovppd e avppd (Amostra D4) via injeção intradérmica, mantendo uma distância de 15 a 20 cm entre ambas as inoculações; sendo o avppd inoculado cranialmente ao bovppd. Após 72 horas de inoculação, o animal é considerado positivo quando a reação ao bovppd é maior que 4,0 mm comparado com a reação ao avppd (BRASIL, 2006). Animais infectados por M. avium, M. tuberculosis, M. avium paratuberculosis, Nocardia farcinius ou outras micobactérias podem ser reativos ao PPD bovino, conduzindo a resultados falso-positivos. Como as micobactérias compartilham diversos antígenos, estas reações cruzadas podem ser facilmente esperadas, o que reduz a especificidade do teste. Desta forma, o TCC é realizado com a finalidade de reduzir a ocorrência de tais reações cruzadas, embora não elimine todas as reações não específicas (BRASIL, 2006). Apesar do amplo uso, os relatos de sensibilidade da tuberculinização variam de 68-95%, enquanto a especificidade (para TCC) varia de 96-99%. O desempenho dos testes tuberculínicos pode variar devido às diferenças nas

20 20 doses de tuberculinas, sítio de aplicação, preparações do PPD e esquemas de interpretação (MONAGHAN et al., 1994; SCHILLER et al., 2010). Outra desvantagem a ser considerada poderia ser a necessidade de duas visitas à propriedade em um prazo de 72 horas, que gera um diagnóstico mais caro e laborioso (MARASSI et al., 2013). Existem limitações decorrentes de falhas de inoculação das tuberculinas, sítio de aplicação, variações na interpretação do resultado dos testes e possibilidade de fraudes devido ao tempo entre a inoculação e leitura do teste. Com frequência seu uso como uma única ferramenta para o diagnóstico da tuberculose bovina não detecta todos os animais infectados (LIEBANA et al., 2008), não permitindo a eliminação completa de fontes de infecção do rebanho, devido, principalmente, à ocorrência de animais anérgicos que não reagem aos testes tuberculínicos. De acordo com uma modelagem computacional feita por Conlan e colaboradores (2012) foi estimado que em média 50% dos surtos recorrentes na Grã-Bretanha podem ser atribuídos a falha nos testes tuberculínicos. Assim, a melhoria dos testes tuberculínicos e a inclusão de novas ferramentas diagnósticas possivelmente reduziria a reincidência da doença em nível de rebanho devido ao diagnóstico e eliminação de animais anérgicos Testes in vitro com base na imunidade celular Está bem estabelecido que a resposta imunológica das infecções micobacterianas é predominantemente do tipo mediado por células, pelo menos em seus primeiros estágios. Portanto, as técnicas de diagnóstico devem ser baseadas preferencialmente na medição das respostas dos linfócitos T (WATERS et al., 2011). As limitações dos testes tuberculínicos intradérmicos levaram ao desenvolvimento de outros testes indiretos de diagnóstico. Wood e colaboradores (1990) desenvolveram um teste rápido (24 horas) para a tuberculose bovina de análise celular in vitro, baseado na detecção de Interferon-gama (IFN), que é liberado em resposta a antígenos específicos em uma cultura de sangue total. A produção dos anticorpos monoclonais

21 21 específicos permitiu o desenvolvimento do Teste de detecção da citocina interferon-gama in vitro (WOOD et al., 1990). Em uma revisão feita por De La Rua Domenech e colaboradores (2006), a sensibilidade do IFN variou entre 73 e 100% e a especificidade entre 85 a 99,6%, devido a variações nos protocolos. IFN também pode identificar animais negativos aos testes tuberculínicos, uma vez que detecta animais infectados nas etapas iniciais da infecção (GORMLEY et al., 2006; MARASSI et al., 2013). Cagiola e colaboradores (2004) relataram especificidade maior que a dos testes tuberculínicos intradérmicos, variando de 97,3% a 98,6%. No Brasil Marassi e colaboradores (2010; 2013) compararam IFN ao teste de tuberculinização intradérmica em condições de campo e demonstraram que a sensibilidade do IFN foi maior que a do teste cutâneo. O uso do IFN requer somente uma manipulação do animal e, uma vez que a estimulação dos linfócitos é realizada in vitro, em contraste com as provas de tuberculinização, não é necessário esperar 60 ou 90 dias para repetir o teste, mesmo quando os resultados forem inconclusivos. Na realidade, este teste pode ser repetido quantas vezes forem necessárias, a qualquer intervalo de tempo, uma vez que o animal não é inoculado com PPD (WATERS et al., 2011). A interpretação dos resultados é baseada nos valores numéricos, o que torna este teste mais objetivo que as reações de hipersensibilidade mensuradas na pele do animal. Adicionalmente ao seu uso como um teste de diagnóstico, o IFN também pode ser usado como teste confirmatório. Originalmente havia sido recomendado não realizar o IFN por 60 dias após a condução dos testes tuberculínicos intradérmicos (POLLOCK et al., 2005), devido ao efeito anamnésico que poderia ocorrer. No entanto em uma revisão de Rangen e colaboradores (2009) os resultados do IFN não foram infuenciados pela utilização dos testes tuberculínicos em bovinos. Em um recente trabalho desenvolvido no Brasil (MARASSI et al., 2010), não houve diferença na confiabilidade do IFN comparado aos outros padrões do mesmo estudo, sugerindo que o teste pode ser utilizado como ferramenta confirmatória em animais testados pela intradermorreação sete ou 21 dias após a inoculação do

22 22 PPD. As diferenças nos resultados entre autores podem ser devido às condições variáveis nas quais os estudos foram realizados (PALMER et al., 2006), incluindo a natureza e estágio da infecção, o número de bovinos, protocolos de tuberculinização e os critérios de interpretação dos diferentes protocolos testados (GORMLEY et al., 2006). É conjeturado que as maiores desvantagens do uso do IFN são a necessidade de processar as amostras em laboratórios adequadamente equipados e o alto custo unitário do teste, que é maior do que o custo dos testes cutâneos (MARASSI et al., 2010) Pesquisa de anticorpos Está bem estabelecido que o gado bovino infectado por Mycobacterium bovis desenvolve como primeira resposta imunológica a imunidade mediada por células (WELSH et al., 2005; POLLOCK et al., 2005; BUDDLE et al., 2009), e que os testes sorológicos são menos eficientes para identificar o gado bovino nos primeiros estágios da infecção de tuberculose, quando os níveis de anticorpos são baixos (BUDDLE et al., 2009). Silva (2001) informou sobre o aumento da sensibilidade proporcionalmente ao número e a distribuição das lesões encontradas nos exames anatomopatológicos, sugerindo que a sensibilidade do ELISA depende do tempo e da gravidade da infecção do rebanho. No entanto, há várias vantagens para o uso de métodos sorológicos como ELISA para o diagnóstico da tuberculose bovina. Esses testes requerem somente uma manipulação dos animais e somente uma visita do veterinário à fazenda. A amostragem sanguínea pode ser repetida com a frequência necessária sem alterar o estado imune do animal. A interpretação é baseada nos valores numéricos e é mais objetiva que a observação da reação de hipersensibilidade na pele do animal (LILENBAUM et al., 2001). A técnica de ELISA indireto mede a ligação de anticorpos específicos a um antígeno. Para diagnosticar o gado bovino infectado por M. bovis os antígenos geralmente

23 23 empregados são o PPD ou antígenos purificados de M. bovis, isolados ou associados (SILVA, 2001; WATERS et al., 2006; MARASSI et al., 2013). Considerando os antígenos purificados, o complexo Ag85 representa a maior parte das proteínas secretadas. Contudo, os anticorpos dirigidos contra este antígeno talvez estejam presentes também em indivíduos não infectados (WIKER, 2009), levando a resultados falso-positivos. Foi sugerido que a MPB70 e a proteína altamente homóloga MPB83 estejam envolvidas na ligação de M. bovis com proteínas da célula hospedeira (WIKER, 2009) e que apresentam os antígenos dominantes para as respostas imunológicas em animais infectados (WATERS et al., 2006; WIKER, 2009). MPB70 e MPB83 são proteínas micobacterianas homólogas secretadas em uma limitada distribuição de espécies. Essas proteínas têm atraído muita atenção porque são expressas em alta concentração em M. bovis e minimamente expressas in vitro em M. tuberculosis, e provavelmente também in vivo (WIKER et al., 1998; WIKER, 2009). Foi demonstrado o potencial de diagnóstico dessas proteínas e que a maioria dos anticorpos monoclonais identifica os determinantes antigênicos compartilhados nessas moléculas e que os epítopos lineares de MPB70 foram os grandes alvos de anticorpos após a imunização com preparados protéicos e durante a infecção com M. bovis (WIKER et al., 1998; WIKER, 2009). Embora as análises sorológicas não possam ser consideradas como a primeira escolha em método de diagnóstico, muitos pesquisadores descrevem os objetivos estratégicos de seu uso (DE LA RUA-DOMENECH, 2006; SILVA, 2001; LILENBAUM e FONSECA, 2006; WATERS et al., 2010). A estratégia é baseada na existência dos animais anérgicos (SILVA, 2001; WATERS et al., 2010) e no aumento dos anticorpos nas etapas mais avançadas da doença (POLLOCK e NEILL, 2002; WELSH et al., 2005). Em estudos a campo no Brasil, Lilenbaum e Fonseca (2006) identificaram vacas tuberculosas usando ELISA em 18 rebanhos incluídos em um programa de controle da tuberculose, e confirmaram a infecção mediante o isolamento de M. bovis das lesões do pulmão. Neste caso, o ELISA foi empregado como um teste de diagnóstico complementar e melhorou o controle da tuberculose mediante a identificação

24 24 das vacas anérgicas. Em outro recente estudo no Brasil com um rebanho naturalmente infectado, o ELISA, empregando antígenos de captura MPB70 e MPB83, também foi capaz de identificar animais anérgicos, eliminando fontes de infecção que não seriam diagnosticadas pelos testes tuberculínicos intradérmicos empregados (MARASSI et al., 2011) Métodos diretos de evidenciação do agente Isolamento bacteriano A evolução dos métodos diretos de diagnóstico ocorreu intimamente relacionada com as características microbiológicas e ecológicas peculiares do bacilo da tuberculose. Micobactérias são bactérias de crescimento lento, bacilos aeróbios estritos, caracterizados pela ausência de cápsulas ou flagelos, são delgados, curvos a retos, imóveis, medindo 0,2 a 6 m x 1,0 a 10,0 m (EISENSTADT e HALL, 1995) e, de acordo com Ghosh e colaboradores (2009), algumas espécies podem formar esporos. Dentre os métodos diretos, a baciloscopia é o mais rápido comparado com outros métodos diretos, porém a visualização dos bacilos álcool-ácido resistentes (BAAR) não é capaz de discriminar entre membros da família Mycobacteriaceae, ou entre membros do gênero Mycobacteria e outros organismos que dividem esta característica tintorial (EISENSTAFT e HALL, 1995). Além disso, este método carece de sensibilidade e só pode revelar a presença de BAAR quando as concentrações são maiores que 10 4 bactérias por mililitro (WARDS et al., 1995). Devido a sua sensibilidade baixa, que leva a resultados falso-negativos, associado às dificuldades em se obter esputo dos animais, o exame direto não é empregado rotineiramente como um método de diagnóstico para a tuberculose bovina in vivo, sendo mais utilizado como diagnóstico confirmatório post-mortem. É importante enfatizar que para tuberculose bovina o exame direto não confirma uma infecção por M. bovis, sendo apenas sugestivo pela observação do bacilo álcool ácido resistente.

25 25 As técnicas de cultivo bacteriológico usadas nos laboratórios veterinários para isolar M. bovis diferem das utilizadas nos laboratórios médicos, principalmente porque as cepas de M. bovis crescem mal ou não crescem no meio com glicerol usado para o cultivo de M. tuberculosis. Por este motivo os meios que contenham piruvato de sódio ao invés de glicerol são usados para o isolamento de M. bovis (OIE, 2008). Embora seja aceito em geral que as micobactérias cresçam mais rapidamente no meio líquido, tem sido raramente observado que algumas amostras bacterianas micobacterianas aparecem exclusivamente em meio sólido (SALFINGER e PFYFFER, 1994). O gênero Mycobacterium é altamente exigente com respeito a sua necessidade de nutrientes, enquanto outros microrganismos se multiplicam mais fácil e mais rapidamente. As amostras coletadas do esputo, do leite ou lesões tissulares suspeitas devem ser submetidas aos métodos de descontaminação para eliminar tais microrganismos competitivos. O prétratamento, ou descontaminação, das amostras é requerido pelo acréscimo de hidróxido de sódio, ácido sulfúrico, cloreto de hexadecilpiridínio, ácido oxálico ou compostos de amônia quaternária. O efeito tóxico da descontaminação pode afetar a viabilidade micobacteriana, interferindo nos resultados do cultivo (EISENSTADT e HALL, 1995; AMBROSIO et al., 2008; CORNER et al., 2012). O tempo necessário para a visualização das colônias de M. bovis pode durar até oito semanas, e os padrões de crescimento característico e morfologia colonial podem apenas prover um diagnóstico presuntivo de M. bovis. No entanto, cada cepa isolada precisa ser confirmada (WARDS et al., 1995; OIE, 2008). Os ensaios bioquímicos requerem de duas a quatro semanas adicionais depois do crescimento das colônias de micobactérias no meio de cultura (SALFINGER e PFYFFER, 1994; OIE, 2008; CORNER et al., 2012). Apesar do isolamento de M. bovis ser o método ideal para a comprovação da infecção, a dificuldade de obter amostras representativas dos animais vivos, o tempo gasto com o pré-tratamento, o lento crescimento e o tempo adicional para a identificação bioquímica representam importantes limitações do método.

26 Diagnóstico molecular As técnicas moleculares representam a mais rápida opção de diagnóstico direto da tuberculose bovina. Nos últimos anos, notou-se uma ampla melhoria e os avanços na caracterização molecular também forneceram novas ferramentas para aprimorar o conhecimento da epidemiologia do M. bovis. Diversas técnicas de biologia molecular que têm sido desenvolvidas para a detecção de micobactérias em amostras clínicas, com base na amplificação de DNA. Os testes podem ser utilizados no escarro, leite, sangue, swab nasal e outros tecidos com a vantagem de detectar com rapidez bacilos não viáveis. (NEONAKIS et al., 2008; FIGUEIREDO et al., 2010; 2012; FURLANETO et al., 2012; ZUMARRAGA et al., 2012; ZARDEN et al., 2013). Entretanto, as desvantagens das técnicas moleculares são a ausência de padronização para uso em maior escala e ausência de um protocolo aprovado para uso oficial. As duas técnicas de diagnóstico moleculares mais importantes para a tuberculose bovina, devido à capacidade de responder a questões epidemiológicas importantes, são a reação em cadeia da polimerase (PCR), e tipagem de cepas pelo DNA. Testes de PCR para M. bovis foram melhorados por meio de recentes avanços na tecnologia PCR, mas ainda são dependentes da sensibilidade dos métodos de cultura, e em algumas situações são suscetíveis a dar falsos resultados positivos e negativos. Assim, a PCR normalmente não substitui a necessidade de cultura, mas é utilizada para proporcionar resultados preliminares rápidos (COLLINS, 2011). Adicionalmente ao seu uso em amostras clínicas, a PCR também pode ser uma importante ferramenta para confirmar rapidamente como M. bovis as colônias bacterianas isoladas por cultura ao invés das usuais demoradas provas bioquímicas (FIGUEIREDO et al., 2010; MEDEIROS et al., 2012a). Apesar de as técnicas atuais de tipagem fornecerem informações para fins epidemiológicos, métodos mais sensíveis e padronizados tendem a se tornar disponíveis em um futuro próximo (COLLINS, 2011).

27 Histopatologia Os exames histopatológicos seriam uma alternativa rápida, prática e barata, porém existe a limitação da necessidade de coletar corretamente amostras post-mortem (CORNER, 1994; LIEBANA, et al., 2008; FRÁGUAS et al., 2008), além da existência de lesões paucibacilares (LIEBANA et al., 2008; MEDEIROS et al., 2012a), levando a resultados falso-negativos. Em um rebanho naturalmente infectado, Medeiros e colaboradores (2012b) empregaram a histopatologia como método diagnóstico post-mortem. De acordo com a histopatologia 33,4% dos animais foram positivos, 45,8% inconclusivos e 20,8% foram negativos. As amostras classificadas como inconclusivas foram provenientes de animais IFN positivo, sinalizando infecção recente. Neste estudo, os animais negativos na histopatologia foram identificados por IFN, enquanto no ELISA apresentaram resultados negativos. Este fato confirmou que as respostas imunes foram diferentes em animais com infecções recentes quando comparadas a animais com infecções avançadas, o que suporta a identifcação entre os animais cronicamente ou recentemente infectados. A abordagem multidisciplinar foi obrigatória para a interpretação das várias ferramentas que são freqüentemente empregadas para o diagnóstico da TB e, principalmente, para identificar todos os animais infectados em um rebanho. Assim, adicionalmente ao diagnóstico da enfermidade, os exames histológicos também fornecem informações sobre o estágio da resposta imune do hospedeiro (POLLOCK et al., 2005) ESTRATÉGIA DO PROGRAMA DE ERRADICAÇÃO DA TUBERCULOSE BOVINA NO BRASIL No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) iniciou, no ano 2000, o processo de elaboração de uma proposta de programa para o controle da brucelose e da tuberculose animal. Após a instituição do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), em 2001, ficou evidente a falta de informação sobre a situação

28 28 epidemiológica da tuberculose bovina no âmbito nacional. Apesar da ocorrência da doença, há carência de dados oficiais a respeito da prevalência atual da tuberculose bovina no Brasil (BRASIL, 2008). Desde o início da execução do PNCEBT no Brasil, poucos estudos informaram a prevalência da doença, variando de 0,007% a 8,66% entre Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Rio Grande do Norte e Mato Grosso (POLETTO et al., 2004; BAPTISTA et al., 2004; OLIVEIRA et al., 2007; FURLANETTO et al., 2012). Contudo, estes dados foram obtidos usando diferentes protocolos diagnósticos e representam algumas regiões em particular, não podendo ser considerados para o contexto nacional. É importante ter em mente a diversidade e o enorme tamanho do rebanho brasileiro, que compreende aproximadamente 200 milhões de bovinos (IBGE, 2011). Ao constituir o PNCEBT, para atingir o objetivo de eliminação progressiva de focos, o MAPA optou por um programa voluntário de certificação de rebanhos livres, garantindo-se a isonomia deste conceito. Neste caso, a adesão dos produtores ao programa depende dos estímulos e restrições aos quais são expostos. A estratégia deste programa consiste em um conjunto de medidas sanitárias compulsórias, associadas a ações de adesão voluntária visando à certificação da propriedade como livre ou monitorada da enfermidade. Assim, a partir do momento que os produtores aderem voluntariamente ao programa, devem cumprir com a legislação no que concerne ao sacrifício de animais positivos aos testes tuberculínicos empregados como diagnóstico da tuberculose bovina (BRASIL, 2006) Métodos diagnósticos empregados no PNCEBT As técnicas de cultivo bacteriológico, de histopatologia e técnicas moleculares são citadas como métodos de diagnóstico direto da tuberculose bovina, por meio da evidenciação do agente. Entretanto, apesar da reconhecida importância dos métodos diretos, o diagnóstico alérgico-cutâneo com PPD é o instrumento básico para o programa de controle. Os métodos de diagnóstico

29 29 indiretos reconhecidos como oficiais são os testes tuberculínicos que empregam PPD bovino e PPD aviário em provas de intradermoreação. No PNCEBT, a prova de rotina para diagnóstico da tuberculose bovina em gado de leite é o teste cervical simples (TCS). O teste da prega ano-caudal pode ser utilizado como prova de triagem exclusivamente em gado de corte, e o teste cervical comparativo (TCC) é a prova confirmatória para animais reagentes ao teste da prega ano-caudal ou ao teste cervical simples. Todavia, o TCC também pode ser empregado como única prova diagnóstica em rebanhos com histórico de reações inespecíficas. Estes testes são aplicados em situações específicas, previamente ao trânsito de animais destinados à reprodução, feiras e exposições, para monitoramento e certificação de propriedades. Os testes tuberculínicos colocam o diagnóstico da tuberculose no Brasil em sintonia com os padrões internacionais, e em particular, com as recomendações do Código Zoossanitário Internacional da OIE (BRASIL, 2006). Entretanto, o MAPA pretende atualizar os métodos de diagnóstico à medida que novos e melhores testes forem surgindo (BRASIL, 2006) Novas perspectivas no diagnóstico da tuberculose bovina A estratégia dos programas de controle e erradicação da tuberculose bovina em diversas partes do mundo empregou de maneira eficiente os testes de diagnóstico baseados nas reações de hipersensibilidade à tuberculina. Entretanto, após o emprego da metodologia de teste-e-abate dos animais positivos, uma nova realidade epidemiológica se apresenta. Embora a tuberculose ainda exista como importante infecção, a prevalência nas áreas sob o controle dos programas de erradicação é atualmente baixa. O conceito de erradicação para tuberculose bovina pela OIE permite que se tenham áreas com baixíssima prevalência, entre 0,1% e 0,2% dos rebanhos no país reativos aos testes tuberculínicos. Entretanto esta baixa prevalência deve estar inserida dentro do contexto de um plano de controle da enfermidade para que se alcance o status de erradicação. Este fato pode ser decorrente não somente pela existência de reservatórios silvestres, mas também por limitações técnicas

30 30 dos métodos de diagnóstico (THOEN et al. 2009; SCHILLER et al., 2010). Embora animais silvestres tenham sido implicados na transmissão da tuberculose bovina em outros países esta situação epidemiológica não foi observada no Brasil. Neste sentido, a atual situação epidemiológica da tuberculose bovina exige uma abordagem mais refinada de identificação de animais infectados. Além da esperada incorporação de novas tecnologias e dos testes atualmente disponíveis às tradicionais campanhas de erradicação, também se espera que sejam levados em consideração os diferentes aspectos epidemiológicos (SCHILLER et al., 2010; WATERS et al., 2012), fator crucial para o alcance da erradicação. Em diversos trabalhos publicados pode ser percebido que nenhum método diagnóstico utilizado isoladamente é capaz de diagnosticar todos os bovinos infectados por M. bovis (POLLOCK et al., 2005; LILENBAUM e FONSECA, 2006; FRÁGUAS et al., 2008; BUDDLE et al., 2009; SCHILLER et al., 2010; ALVAREZ et al., 2012; MARASSI et al., 2013; ZARDEN et al., 2013). Entretanto, independente dos índices de sensibilidade e especificidade dos testes, deve-se perceber a valiosa contribuição da utilização dos métodos de diagnóstico na identificação do rebanho infectado, permitindo interferir com apropriadas medidas de manejo, diagnóstico e vigilância. A análise dos métodos de diagnóstico usualmente empregados nos permite observar a limitação e a necessidade de uma abordagem multidisciplinar da doença, e muitas vezes em múltiplas etapas, levando em consideração as distintas respostas imunológicas que o animal pode apresentar individualmente (MEDEIROS et al., 2010, MARASSI et al., 2013). Os métodos de diagnóstico disponíveis foram desenvolvidos com base no atual conhecimento da doença em bovinos, porém os mecanismos de patogênese de M. bovis ainda não estão completamente esclarecidos, bem como o total entendimento sobre as respostas imunológicas dos animais ao bacilo (POLLOCK e NEILL, 2002; POLLOCK et al., 2005; WATERS et al., 2011; MARASSI et al., 2013). Neste sentido, o diagnóstico da tuberculose bovina não é um assunto completamente definido e são necessárias futuras

31 31 investigações sobre a microbiologia do agente e imunopatologia da doença em bovinos infectados ASPECTOS ECONÔMICOS DOS PROGRAMAS DE ERRADICAÇÃO DA TUBERCULOSE BOVINA Em uma sociedade moderna existe a preocupação em avaliar a necessidade do uso de recursos humanos e financeiros no desenvolvimento da agricultura e pecuária. Em diversos casos, para promover o desenvolvimento agropecuário, são instituídos programas oficiais de controle e erradicação de enfermidades dos animais. Porém apesar da instituição dos programas de sanidade animal em caráter nacional, normalmente não existe uma avaliação econômica prévia relatando os impactos das doenças e os custos relacionados à sua erradicação. Em 2004, o Departamento para Ambiente Alimento e Assuntos Rurais da Inglaterra (DEFRA, 2011) solicitou uma avaliação econômica do impacto da tuberculose bovina no país após perceber o aumento da enfermidade nos dez anos anteriores, mesmo na presença de um Programa de Erradicação da Tuberculose Bovina (BENNETT e COOKE, 2006). Um fator que tem a maior influência sobre a eficácia econômica dos programas de erradicação é a prevalência inicial da doença, devido ao peso financeiro dos pagamentos de compensação para o abate dos animais infectados (BERNUÉS et al., 1997). No caso de um aumento da prevalência, espera-se que os custos com o programa também aumentem. Avaliando os surtos na Inglaterra, Bennet e Cooke (2006) chegaram à conclusão que existem aparentemente quatro principais custos oficiais associados a um surto de tuberculose bovina e seu controle: teste, isolamento, abate e restrições de movimento animal. Neste contexto, com o intuito de diminuir os gastos do setor oficial com o programa, o governo inglês instituiu um teste pré-movimento para tuberculose bovina no qual parte dos custos é assumida pelos fazendeiros (BENNET, 2009). Já que se espera o cumprimento do objetivo de erradicação da enfermidade para um longo prazo

32 32 (DEFRA, 2011), os custos relacionados ao programa foram compartilhados entre o setor público e privado. No México, as perdas econômicas devido à presença de tuberculose bovina podem ser calculadas na ordem de 450 milhões de dólares até o ano de 1996, como conseqüência das limitações na exportação de gado para os EUA (ENRÍQUEZ-CRUZ et al., 2010). Nos EUA, a campanha de erradicação iniciada em 1917, baseada no teste e abate de animais reativos, foi considerada tanto um sucesso em saúde quanto do ponto de vista econômico. O custo total das perdas produtivas causadas pela tuberculose bovina foi proporcional à prevalência da infecção da enfermidade no gado americano. Logo, o sucesso econômico do programa pode ser observado pela progressiva diminuição na ocorrência da enfermidade em animais domésticos e selvagens e diminuição dos custos com o controle da enfermidade no decorrer do programa. Os custos ao comércio internacional do país, causados pela tuberculose bovina não foram estimados. Entretanto, as perdas na produtividade representaram um custo direto ao produtor e as perdas no comércio internacional representaram perda de mercado para outros países (GILSDORF et al., 2006). Na Austrália o Programa de controle da Brucelose e Tuberculose teve início na década de 1930, a princípio baseada em mecanismos de vigilância em abatedouros. A partir da década de 1940 a pasteurização do leite e o uso os testes tuberculínicos para diagnóstico da tuberculose bovina foram disseminados no país. Entretanto somente a partir da década de 1970 um programa nacional de erradicação foi iniciado. Por meio de um programa de teste-e-abate de animais reativos, a tuberculose bovina foi erradicada em A erradicação da enfermidade forneceu recompensas financeiras importantes para o rebanho de corte norte australiano, aumentando a eficiência no manejo do gado e na produtividade das propriedades (TURNER, 2011). Apesar dos resultados positivos nos EUA e Austrália, segundo Bernués e colaboradores (1997) os programas de controle da brucelose e tuberculose aplicados na Espanha apresentaram relação custo-benefício negativa. O programa de brucelose foi economicamente eficiente ao longo de um período

33 33 de tempo suficientemente longo, mas o programa de tuberculose bovina não apresentou os mesmos resultados. No entanto, apesar da eficiência econômica dos programas não ter sido favorável, deve se considerar os benefícios da prevenção da tuberculose bovina em humanos. Neste caso particular a prevenção da zoonose e os custos associados ao diagnóstico e tratamento da doença em humanos não foi considerada na análise. Em alguns casos, sabendo-se dos grandes custos de um programa, a eficiência econômica dos programas de erradicação de enfermidades animais é questionada. Porém o fato de uma avaliação econômica obter um resultado desfavorável não significa que o programa não deva ser instituído, pois os benefícios relacionados à prevenção de doenças zoonóticas em uma comunidade normalmente não são considerados (BERNUÉS et al., 1997; SMITH e CLIFTON-HADLY, 2008; TORGENSON, 2009). São questionáveis os termos econômicos relacionados ao controle da tuberculose bovina, já que atualmente não há a transmissão significativa a humanos. Este questionamento deve-se ao fato da tuberculose bovina ter aumentado nos últimos anos, enquanto que a tuberculose zoonótica manteve os níveis de ocorrência estagnados (TORGENSON, 2008). Outros autores respondem a este questionamento, já que o teste-e-abate juntamente com a vigilância é parte da razão para que a doença não seja mais reportada em humanos em países nos quais existam programas de erradicação implementados. A remoção dos animais em um estágio recente de infecção é importante para controlar a prevalência da doença no rebanho nacional evidenciando a natureza esporádica da infecção em humanos por M. bovis (GORDON, 2008; SMITH e CLIFTON-HADLY, 2008). Complementar e tão importante quanto o aspecto zoonótico é o impacto que a enfermidade pode gerar na economia familiar, já que em pequenos rebanhos a identificação e eliminação de animais infectados inviabiliza a atividade econômica da família. Logo se faz necessário diminuir a frequência da enfermidade no rebanho nacional já que no Censo Agropecuário de 2006 foi identificado que 84,36% dos estabelecimentos rurais brasileiros são estabelecimentos da agricultura familiar.

34 AVALIAÇÃO DOS CUSTOS DE PROGRAMAS DE ERRADICAÇÃO DE ENFERMIDADES ANIMAIS A avaliação econômica dos programas de erradicação está baseada primariamente na identificação dos custos relacionados à erradicação ou controle de uma enfermidade. O custo de uma intervenção, como um teste de diagnóstico, tem como condição fundamental para sua composição a perspectiva/ponto de vista do estudo e a identificação do efeito da intervenção na mudança do estado de saúde. A abrangência dessas condições significa a inclusão ou exclusão dos recursos identificados, estimados e valorados (SANCHO, 2008). Neste sentido, quantitativamente, os custos e as consequências das alternativas diagnósticas variam em função da perspectiva adotada, que pode refletir uma visão da sociedade, dos serviços públicos ou do paciente (VANNI et al., 2009). As diferenças entre os diversos métodos de estimação de custos podem estar ligadas às características regionais de cada estudo, as quais afetam os cálculos de custos (SEGALA e SILVA, 2007). No que se refere à incorporação ou não dos custos em uma análise de custo efetividade a disponibilidade de dados é um fator importante a ser considerado (SANCHO, 2008). Os custos de um programa de erradicação compreendem o pagamento dos profissionais do serviço oficial e equipamentos envolvidos nas operações diárias do programa, custos de recursos laboratoriais e de compensação aos proprietários de animais condenados. Adicionalmente existem os custos do produtor, como uso da força de trabalho no manejo dos animais, assim como perdas na produção de carne e leite devido ao estresse do manejo (GILSDORF et al., 2006). Custos com treinamento e suporte técnico não são normalmente computados (SOHN et al., 2009). É importante enfatizar o custo relacionado aos testes dentro de um programa de erradicação da tuberculose bovina, já que, após o abate de animais reativos ao teste, este é o segundo maior contribuinte nos custos totais de um surto (BENNETT e COOKE, 2006). O uso do tempo de trabalho dos funcionários das propriedades para separar os animais e a ajuda com os

35 35 procedimentos de teste foi identificado pelos produtores como a maior parte dos custos de teste (BENNETT, 2009). Porém o valor do teste por animal vai variar com o número de animais testados por fazenda. É esperado que quanto maior o número de animais testados menor seja o custo individual do teste diagnóstico (BENNETT e COOKE, 2006; BENNETT, 2009) CLASSIFICAÇÃO E CARACTERÍSTICAS BÁSICAS DOS CUSTOS Os custos são normalmente medidos em uma unidade monetária e usualmente classificados em três categorias: diretos, indiretos e intangíveis (VANNI et al., 2009). Os custos diretos estão diretamente relacionados aos recursos oriundos da intervenção (testes diagnósticos, abate de animais reativos, despesas com salários); já os custos indiretos não estão diretamente relacionados à intervenção (perdas econômicas dos produtos de origem animal e outros gastos com programas de controle e mitigação da doença em questão). Os custos intangíveis são os de difícil valoração, como por exemplo, o custo do sofrimento associado à doença. Entretanto, apesar da conhecida classificação, a determinação das perdas econômicas devido a doenças ainda não foi estabelecida de forma padrão de estimação destas perdas nos poucos estudos publicados (MORAES et al., 2006; VANNI et al., 2009; IFAH, 2012). Em relação à quantidade de um produto produzido, os custos podem ser classificados como fixos e variáveis. Custos fixos não variam com a quantidade de produção em um curto período de tempo, como salários, aluguel e equipamentos. Estes custos variam mais com o tempo do que com a quantidade de produto produzido. Já os custos variáveis variam com o nível de produção e são passíveis de alteração em curto prazo. Esse custo modifica-se proporcionalmente ao volume produzido e que, somado ao custo fixo, constituise no custo total de um determinado serviço ou produto (BRASIL, 2009). No caso do diagnóstico de uma enfermidade, como a tuberculose bovina, é esperado que o custo unitário do diagnóstico individual diminua à medida que mais indivíduos são testados, já que os custos fixos permanecerão similares,

36 36 até um determinado ponto, mesmo quando exista o processamento de mais amostras. Os custos de produtividade são associados com a perda ou diminuição da habilidade para o trabalho e os referentes à morte. Como a perda da produtividade é um custo de difícil mensuração, em vista da complexidade de sua composição esta é usualmente excluída de uma avaliação econômica (SANCHO, 2008) PRINCIPAIS TIPOS DE AVALIAÇÂO ECONÔMICA EM SAÚDE ANIMAL Em paralelo aos estudos de custo para diagnóstico e controle de enfermidades animais, observa-se um incremento dos estudos relacionados à identificação do custo-benefício e custo-efetividade na área de medicina veterinária (VAN ASSELDONK et al., 2005; SOHN et al., 2009; ALY et al., 2012; BOKLUND et al., 2013). No que diz respeito aos métodos de diagnóstico, ambas a relações são cruciais para tomada de decisões em programas de prevenção e erradicação de enfermidades e para o possível tratamento ou execução de sacrifício animal. Uma distinção primordial entre as análises custo-benefício e custoefetividade reside na tipologia dos projetos/programas a serem avaliados, uma vez que a primeira é uma prática consagrada nas avaliações de projetos de investimento de capital, que necessariamente relaciona os benefícios aos custos em termos monetários. Já a análise custo-efetividade é mais indicada em projetos sociais ou governamentais, que prestam serviços complexos que envolvem vidas humanas dimensão ética, demandando uma relação qualitativa dos benefícios em virtude dos custos quantitativos (WANDERLEY, 2005). Os estudos de análise de custo-benefício ao serem difundidos e cada vez mais manuseados por uma gama de gestores traz como necessidade não somente uma evidência econômica, mas a transferência apropriada dos resultados das avaliações econômicas para uma dada realidade. Neste sentido muito se discute sobre a validade do uso de métodos estatísticos na

37 37 generalização dos resultados para diferentes realidades dos estudos observados, já que os componentes dos custos variam de acordo com localização geográfica, questão demográfico/epidemiológica, interpretação da equipe de pesquisa e tempo (SANCHO, 2008; SOHN et al., 2009). O uso da generalização e dados secundários para estimar custos em saúde animal tem sido amplamente utilizado, entretanto foi enfatizada a necessidade de se utilizar dados reais de fazendas afetadas para que sejam efetivamente avaliados os custos de todos os processos de teste, isolamento e abate da tuberculose bovina no decorrer do tempo (BENNETT e COOKE, 2006). Com o intuito de evitar variações e minimizar estimativas, todos os custos calculados, de equipamentos de laboratório, reagentes químicos, materiais de consumo e salários da equipe devem ser estimados para o ano que o estudo foi desenvolvido. Isto evita uma discordância que possa ser causada por quando um diagnóstico alternativo é proposto (SOHN et al., 2009). Na análise custo-benefício, todos os custos incorridos e benefícios resultantes são expressos em unidades monetárias. Esta análise pode ser utilizada para comparar tratamentos para diferentes indicações clínicas. Ao final da análise a intervenção em que o benefício é maior que o custo define uma alternativa vantajosa pela visão econômica. Já a análise custo-efetividade mensura o custo em unidades monetárias divididas por uma unidade não monetária, chamada unidade natural, como sequelas evitadas. A análise de custo-efetividade é a melhor opção quando comparamos duas ou mais intervenções para um mesmo desfecho em saúde (ARAÚJO e VESPA, 2008), como no caso do diagnóstico da tuberculose bovina. A análise de custo-efetividade é apropriada quando o objetivo da avaliação é comparar estratégias alternativas que estão associadas com diferentes custos e efetividades. A proposta de uma análise de custoefetividade é identificar qual a intervenção que irá promover um maior impacto na saúde com o menor custo unitário. Neste sentido um teste custo-efetivo não significa necessariamente um teste mais barato (SOHN et al., 2009). De modo geral, a análise deve ser elaborada tendo como referência uma alternativa que

38 38 sirva como um padrão. Na prática é desejável que o padrão represente um protocolo já vigente ou um fármaco padronizado (SECOLI et al., 2010). Entender as metodologias dos estudos de custo-efetividade é um fator crítico para proceder a um julgamento adequado sobre o custo e custoefetividade dos testes diagnósticos avaliados. As diferenças entre as metodologias de cálculo custo, e consequentemente do custo-efetividade, são consequência da logística de coleta e interpretação de dados (SOHN, 2009). Esta variação nas metodologias de estimação de custos para estudos de custo efetividade pode ser observada na abrangente revisão de Sohn (2009) que detalha como os custos dos sistemas diagnósticos da tuberculose humana foram avaliados, demonstrando que cada equipe de pesquisa identifica os custos da maneira que achar mais relevante. O olhar econômico possibilita o aprimoramento das técnicas diagnósticas ou elaboração de novos métodos, justificados pelo benefício ao animal/consumidor. Entretanto determinar os custos de surtos reais de tuberculose e seu diagnóstico não é um processo padronizado e como no caso do estudo de Bennett e Cooke (2006), muitas vezes é baseado em revisão de literatura e reuniões com fazendeiros e especialistas após a ocorrência e controle de surtos. Foi sugerido um modelo estocástico bioeconômico para determinar o melhor programa de vigilância de tuberculose bovina baseado no custoeficiência. Após a avaliação de seis protocolos de detecção, o esquema baseado na vigilância de lesões de carcaças obteve o melhor resultado na atual prevalência de tuberculose bovina na Holanda. Apesar da inspeção em abatedouro apresentar melhores resultados neste modelo específico, os custos de testes e abates irão depender da prevalência da doença, e a escolha do método irá depender dos objetivos e metas do programa de controle e erradicação (VAN ASSELDONK et al., 2005). Entretanto, apesar de diversos estudos sobre a validade e eficácia dos métodos de diagnóstico da tuberculose bovina (MONAGHAN et al., 1994; SCHILLER et al., 2010; WATERS et al., 2011; MARASSI, 2013), são escassos os dados referentes aos custos do seu diagnóstico, e até o presente momento

39 39 não existem estudos sobre custo-efetividade para esta enfermidade no Brasil. Após mais de dez anos de implementação de um Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose no Brasil faz-se necessária uma avaliação econômica do uso de testes de diagnóstico utilizados em um surto de tuberculose bovina em uma fazenda, e os custos associados ao diagnóstico de animais naturalmente infectados.

40 40 3. OBJETIVOS OBJETIVO GERAL Avaliar relação a custo-efetividade de testes diretos e indiretos para o diagnóstico da tuberculose bovina utilizados isoladamente ou associados a outros testes, compondo diferentes protocolos em um rebanho naturalmente infectado com a finalidade de melhorar a eficiência do Plano Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose Bovina OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Identificar os principais fatores relacionados aos custos dos protocolos de diagnóstico em um rebanho naturalmente infectado por M. bovis. 2) Calcular os custos dos testes de diagnóstico ante-mortem da tuberculose bovina. 3) Calcular a relação custo-efetividade de protocolos de diagnóstico da tuberculose bovina ante-mortem. 4) Calcular os custos dos testes confirmatórios da tuberculose bovina post-mortem. 5) Calcular a relação custo-efetividade de protocolos de diagnóstico da tuberculose bovina post-mortem.

41 41 6) Identificar por meio da análise custo-efetividade um protocolo economicamente mais custo/efetivo de diagnóstico da tuberculose bovina em um rebanho naturalmente infectado

42 42 4. MATERIAL E MÉTODOS MODELO DO ESTUDO Estudo observacional analítico transversal POPULAÇÃO DE REFERÊNCIA Bovinos com suspeita de tuberculose bovina pertencentes a um rebanho naturalmente infectado no estado do Rio de Janeiro, Brasil POPULAÇÃO DO ESTUDO Um rebanho leiteiro compreendendo 274 vacas mestiças foi estudado. De acordo com a determinação oficial, todos os animais eram testados regularmente uma vez por ano pelo teste cervical simples (TCS). Para a formação do rebanho, foram adquiridas 32 vacas provenientes de diversos outros rebanhos. Seis meses após a aquisição das mesmas foi realizado o TCS em todos os animais do rebanho. Dentre as 274 vacas, 21 vacas apresentaram reatividade ao teste e foram mantidas em quarentena por 90 dias à espera de testes confirmatórios. Após 90 dias, o teste cervical comparativo (TCC) foi realizado em todos os animais do rebanho. Nesta ocasião as

43 43 primeiras 21 vacas que foram previamente reativas pelo TCS foram confirmadas como infectadas, além de outras 11 vacas também identificadas como reativas, totalizando 32 vacas reativas aos testes intradérmicos. Entre os 242 animais negativos aos testes intradérmicos foram selecionadas randomicamente 18 vacas para realização dos testes in vitro. As amostras de soro e sangue dos animais do positivos e negativos aos testes tuberculínicos (totalizando 50 amostras) foram submetidas ao IFN e ELISA conforme descrito por Medeiros (2009) e Marassi e colaboradores (2013). Os animais considerados positivos a pelo menos um dos testes empregados ante-mortem foram selecionados para o abate para coleta de amostras de tecidos, a fim de realizar a cultura bacteriológica. Por questões econômicas, o proprietário da fazenda não autorizou o abate dos animais considerados negativos nos três protocolos de diagnóstico empregados. Desta forma, foram abatidos 34 animais, sendo 32 animais reativos aos testes tuberculínicos, um animal reativo somente ao IFN e um animal reativo somente ao ELISA. Os fragmentos de linfonodos subescapulares e de pulmão dos 34 animais abatidos foram processados como uma única amostra por animal, totalizando 34 amostras enviadas para diagnóstico bacteriológico. Foram enviadas para o exame histopatológico 34 amostras, entretanto 10 amostras não estavam viáveis para processamento, logo apenas 24 amostras foram submetidas ao exame histopatológico. O status do rebanho foi confirmado com a identificação de 16 animais positivos na cultura e nove animais positivos na histopatologia. Os resultados sugeriram que nenhum dos atuais métodos de diagnóstico para tuberculose possibilitou a identificação de todos os animais infectados (MEDEIROS et al., 2012b; MARASSI et al., 2013).

44 SELEÇÃO DOS ANIMAIS Critérios de inclusão a) Bovinos cujo resultado em ao menos um teste diagnóstico ante-mortem empregado no estudo tenham resultado positivo. b) Bovinos com resultado negativo aos testes tuberculínicos e positivos aos testes sorológicos. c) Bovinos cujo resultado em ao menos um teste diagnóstico post-mortem empregado no estudo tenham resultado positivo Critérios de exclusão a) Resultados de testes de diagnóstico não disponíveis ou duvidosos PERÍODO DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO Os dados de campo e laboratório foram coletados pela equipe de pesquisa do Laboratório de Bacteriologia da Universidade Federal Fluminense entre os anos de 2006 e Os dados de campo são referentes aos procedimentos diagnósticos de tuberculinização: Teste Cervical Simples e Teste Cervical Comparativo. Os dados laboratoriais coletados foram referentes aos procedimentos de cultura de amostras de pulmão e linfonodos submetidas à descontaminação no Laboratório de Micobactérias da Universidade Federal do Rio de Janeiro; amostras de soro e sangue submetidas aos exames de ELISA e IFN no laboratório de Imunologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro; e amostras submetidas à histopatologia no Laboratório de Anatomia Patológica da Universidade Federal Fluminense.

45 OPERACIONALIZAÇÃO DO ESTUDO O presente estudo fez parte de um estudo prévio (MEDEIROS, 2009; MARASSI et al., 2010; MEDEIROS et al., 2012b; MARASSI et al., 2013) realizado pelo Laboratório de Bacteriologia da Universidade Federal Fluminense com o objetivo de avaliar a utilização de cada método de diagnóstico da tuberculose bovina em um rebanho naturalmente infectado. No estudo prévio, os dados laboratoriais dos bovinos com suspeita de tuberculose bovina foram introduzidos em um banco de dados Excel. A intervenção para interromper a transmissão do agente foi prioridade no controle da infecção. Baseado no fato de que um só método não é capaz de identificar todos os animais infectados por M. bovis em um rebanho, foram realizados distintos protocolos diagnósticos em um rebanho naturalmente infectado, e uma abordagem multidisciplinar baseada em análises bacteriológicas, imunológicas e moleculares demonstrou ser a mais efetiva no diagnóstico de animais infectados (MARASSI et al., 2013). Foram considerados diferentes estratégias na realização dos testes de diagnóstico: quando aplicados isoladamente, em conjunto com ferramentas complementares e/ou ferramentas confirmatórias com um enfoque multidisciplinar considerando as distintas aplicações ante-mortem e post-mortem. Os testes de diagnóstico já foram realizados em um rebanho bovino naturalmente infectado, e seus resultados descritos (MARASSI et al., 2013). Utilizando as informações armazenadas pelo grupo em um banco de dados primários, foram considerados nove protocolos de diagnóstico de acordo com sua aplicabilidade: 1. TCS (triagem); 2. TCS + TCC (triagem + teste confirmatório); (Conforme recomendação do MAPA); 3. TCC (diagnóstico isolado); 4. TCC + IFN (diagnóstico + teste confirmatório); 5. IFN (diagnóstico isolado);

46 46 6. ELISA (diagnóstico isolado); 7. IFN + ELISA (diagnóstico + ferramenta complementar); 8. TCC +ELISA (diagnóstico + ferramenta complementar); 9. TCS + TCC (triagem + teste confirmatório); (Conforme recomendação do MAPA) + Cultura (diagnóstico confirmatório post-mortem); 10. TCS + TCC (triagem + teste confirmatório); (Conforme recomendação do MAPA) + Histopatologia (diagnóstico confirmatório post-mortem). Para a análise custo-efetividade, o custo total de cada protocolo foi calculado. Os custos para a realização dos testes (reagentes específicos e utensílios, como pipetas e tubos) e relacionados aos equipamentos de proteção pessoal (luvas, máscaras, óculos de proteção e jalecos) foram obtidos diretamente pela equipe de pesquisa do Laboratório de Bacteriologia Veterinária de acordo com a prática de diagnóstico estabelecida no projeto (MEDEIROS, 2009; MARASSI et al., 2010; MEDEIROS et al., 2012b; MARASSI et al., 2013), em fornecedores do Rio de Janeiro e São Paulo e em revisão de literatura AVALIAÇÃO ECONÔMICA Um modelo de decisão analítica foi desenvolvido no software Excel 2010 para estimar e comparar a relação de custo-efetividade de estratégias atualmente recomendadas (somente testes tuberculínicos) e de novas estratégias que incluam o uso do ELISA e IFN na rotina laboratorial. Adicionalmente, foi comparado o custo efetividade de dois protocolos de confirmação da infecção do rebanho pelo diagnóstico post-mortem por cultura bacteriológica e histopatologia. As novas estratégias foram propostas de acordo com as diferentes respostas imunes de bovinos infectados apresentadas na primeira etapa deste estudo. A taxa de custo-efetividade foi avaliada por caso de tuberculose bovina corretamente diagnosticada e por casos incorretamente diagnosticados. Todas as probabilidades de cada variável diagnóstica, como as probabilidades de

47 47 resultados falso-positivo e falso-negativo, foram consideradas para os cálculos de Sensibilidade e Especificidade Estimação dos custos Os custos relacionados à realização dos testes foram obtidos para o período do estudo diretamente a partir de literatura científica, fontes oficiais e dos dados do laboratório de Bacteriologia Veterinária da UFF, do Laboratório de Micobactérias da UFRJ e do Laboratório de Anatomia Patológica da UFF. Para o cálculo da mão-de-obra foi determinado que a propriedade possuía três empregados fixos com custo de salários, encargos sociais e alimentação (OIAGEN et al., 2006). Para os testes tuberculínicos os custos referentes ao transporte incluíram o gasto com combustível e depreciação de um veículo de transporte utilitário para um percurso de 400Km, referentes à duas visitas (UFV, 2006). Estão incluídos nos exames e materiais a compra do PPD aviário, pistola para aplicação do derivado, luvas, isopor, gelo reciclável, prancheta, canetas, tabelas impressas para identificação dos animais, lâminas para tricotomia, cutímetro e lenços de papel. Os custos com assistência veterinária estão associados ao pagamento de duas visitas técnicas (dados fornecidos pelo setor Administrativo da Fazenda). Para realização do IFN os custos referentes ao transporte incluíram o gasto com combustível e depreciação de um veículo de transporte utilitário para um percurso de 200Km, referentes a uma visita. Estão incluídos nos materiais usados a campo os tubos de vácuo com heparina, seringas, agulhas, isopor, gelo reciclável, prancheta, canetas, tabelas impressas para identificação dos animais, lenços de papel. Estão incluídos nos materiais usados no laboratório a compra do KIT diagnóstico IFN Bovigam, ponteiras, reagentes, placas e tubos de acordo com protocolo descrito por Medeiros (2009). Os custos com assistência veterinária estão associados com o pagamento de uma visita técnica. Custos dos serviços incluem um técnico de laboratório III durante uma semana (BRASIL, 2006). Os custos da desvalorização dos

48 48 equipamentos utilizados no laboratório incluem os custos de utilização da estufa, centrífuga, geladeira, freezer e leitora de ELISA (BRASIL, 1998). Os custos referentes à realização de dois ELISAs: MPB 70 e MBP 83, considerados como um só método para este estudo, foram referentes ao transporte e incluíram o gasto com combustível e depreciação de um veículo de transporte utilitário para um percurso de 200 km, referentes a uma visita. Estão incluídos nos materiais usados a campo os tubos de vácuo sem anticoagulante, seringas, agulhas, isopor, gelo reciclável, prancheta, canetas, tabelas impressas para identificação dos animais, lenços de papel. Estão incluídos nos materiais usados no laboratório placas de poliestileno de 96 poços, ponteiras, reagentes e tubos de acordo com protocolo descrito por Marassi et al (2011). Os custos com assistência veterinária estão associados com o pagamento de uma visita técnica. Custos dos serviços incluem um técnico de laboratório nível III durante uma semana (BRASIL, 2006). Os custos da desvalorização dos equipamentos utilizados no laboratório incluem os custos de utilização da estufa, centrífuga, geladeira, freezer e leitora de ELISA (BRASIL, 1998). Custos associados à realização da cultura foram referentes ao transporte e incluíram o gasto com combustível e depreciação de um veículo de transporte utilitário para um percurso de 200 km, referentes a uma visita. Estão incluídos nos materiais usados a campo o recipiente isotérmico, recipientes para armazenamento das amostras, gelo reciclável, prancheta, canetas, tabelas impressas para identificação dos animais, lenços de papel, avental, luvas, máscara, óculos e materiais para necrópsia. Estão incluídos nos materiais usados no laboratório os meios de cultura, descontaminantes, ponteiras e reagentes de acordo com protocolo descrito por Medeiros (2009). Os custos com assistência veterinária estão associados com o pagamento de uma visita técnica. Custos dos serviços incluem um técnico de laboratório nível III durante um mês. Os custos da desvalorização dos equipamentos utilizados no laboratório incluem os custos de utilização da estufa, centrífuga, cabines de segurança, geladeira e freezer (BRASIL, 1998).

49 49 Custos associados à realização da histopatologia convencional (coloração Hematoxilina Eosina) de foram referentes ao transporte incluíram o gasto com combustível e depreciação de um veículo de transporte utilitário para um percurso de 200Km, referentes à uma visita. Estão incluídos nos materiais usados a campo recipiente isotérmico, recipientes para armazenamento das amostras, prancheta, canetas, tabelas impressas para identificação dos animais, lenços de papel, avental, luvas, máscara, óculos e materiais para necropsia, formol 10%. Estão incluídos nos materiais usados no laboratório o álcool, cassete, xilol, lâminas, lamínulas, parafina histológica e corantes histológicos de acordo com protocolo descrito por Medeiros et al. (2012b). Os custos com assistência veterinária estão associados com o pagamento de uma visita técnica. Custos dos serviços de um técnico de laboratório III durante duas semanas e leitura das lâminas proferidas pelo Patologista (BRASIL, 2006). Os custos da desvalorização dos equipamentos utilizados no laboratório, que incluem os custos de utilização da estufa, microscópio óptico, banho-maria, destilador de água, geladeira e micrótomo (BRASIL, 1998). O custo total associado a cada estratégia para realização dos testes foi estimado somados os custos fixos e variáveis. Após computar o custo total foi calculado o custo unitário por método dividindo o custo total pelo número de amostras/animais testados. As análises de custo-efetividade e de sensibilidade foram realizadas utilizando o programa Excel Análise de custo-efetividade A efetividade do procedimento foi estabelecida como o número de animais corretamente diagnosticados em cada método. A proporção total de diagnóstico correto pelos testes foi estimada utilizando os resultados da cultura para micobactérias e do TCC como referência. A análise de custo-efetividade identificou a intervenção que promoveu um maior número de animais corretamente diagnosticados como positivo com o menor custo total. Neste sentido foram calculadas as relações de custo-

50 50 efetividade (C/Ef), por método diagnóstico, considerando os custos totais (C) no numerador e a efetividade (Ef) no denominador. Foi avaliada a relação custo-efetividade de cada protocolo e adicionalmente feita uma comparação de uma nova intervenção em relação a uma intervenção já existente (TCS + TCC) com relação ao custo e à efetividade. As células na matriz de custo-efetividade representaram resultados possíveis quando se compararam alternativas no que diz respeito a custo e efetividade. Neste cenário as alternativas que mais caras e menos efetivas devem ser excluídas (BRASIL, 2009). Quatro cenários são possíveis (A, B, C e D), visualizados no plano de custo-efetividade (Figura 3). Neste plano, em que a origem é a intervenção existente, no eixo horizontal é representada a diferença de efetividade ( Efetividade ou I - E) da nova intervenção em relação à existente, e no eixo vertical é representada a diferença de custo ( Custo ou I - C). Neste sentido, trabalhou-se com a razão incremental de novas estratégias diagnósticas comparadas com a estratégia diagnóstica de referência existente para rebanhos leiteiros (TCS + TCC). A razão incremental de custo-efetividade foi definida como a razão entre a diferença dos custos e da nova intervenção vigente, e a diferença das efetividades das mesmas (RI=C1-C2/Ef1-Ef2). A razão incremental de custo-efetividade expressou o custo por uma unidade de efetividade (VANNI et al., 2009). Figura 3 - Plano de custo-efetividade. A, B, C e D são exemplos de novass intervenções. Adaptado de Vanni e colaboradores (2009).

51 51 5. RESULTADOS CUSTO DOS TESTES DE DIAGNÓSTICO Os protocolos de campo e laboratoriais utilizados neste estudo foram revisados e os custos informados adiante (Tabela 1 e Figura 4). Tabela 1 - Componentes de custo referentes aos testes diagnósticos utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. Itens TCS TCC IFN ELISA MPB7-/83 CULTURA Custo em Reais (R$) Transporte 186,80 186,80 93,40 93,40 93,40 93,40 Assistência Veterinária Materiais usados a campo 240,00 240,00 120,00 120,00 120,00 120,00 243,00 313,00 163,00 163,00 323,00 343,00 Mobilização de 100,00 100,00 50,00 50,00 50,00 50,00 funcionários fazenda Materiais de 0,00 0,00 714,30 714,30 750,00 375,00 consumo de laboratório Salário de 0,00 0,00 357,60 357, ,40 357,60 técnico laboratórioiii Desvalorização 0,00 0,00 130,80 130,80 172,50 184,10 de equipamentos laboratoriais TOTAL 769,80 839, , , , ,10 HP

52 , , , , ,00 500,00 0,00 TCS TCC IFN ELISA MPB7-/83 CULTURA HP Figura 4 Custo em reais (R$) dos componentes referentes aos testes de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e de plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado. Os custos totais computados de cada teste, somados os custos fixos e variáveis, e demonstrados na Tabela 1 foram utilizados para demonstrar o custo total de cada protocolo diagnóstico estabelecido pelo grupo de pesquisa. Os custos totais foram divididos de acordo com o número de animais testados em cada protocolo produzindo o valor do custo unitário (Figura 5 e Tabela 2). Custo unitário dos protocolos diagnósticos (R$) Custo Unitário (R$) Figura 5 - Custo unitário em reais (R$) dos protocolos de diagnóstico utilizados em bovinos e amostras de tecido, de soro e plasma bovino provenientes de um rebanho naturalmente infectado.