EFEITOS DO ESTRESSE PERINATAL SOBRE A RELAÇÃO MÃE- FILHOTE DE RATAS

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1 ss UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: NEUROCIÊNCIAS EFEITOS DO ESTRESSE PERINATAL SOBRE A RELAÇÃO MÃE- FILHOTE DE RATAS Chrles Frncisco Ferreir Porto Alegre/RS 21

2 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: NEUROCIÊNCIAS EFEITOS DO ESTRESSE PERINATAL SOBRE A RELAÇÃO MÃE- FILHOTE DE RATAS Dissertção presentd o Curso de Pós- Grdução em Ciêncis Biológics: Neurociêncis, d Universidde Federl do Rio Grnde do Sul, como requisito prcil pr otenção do Título de Mestre em Ciêncis Biológics: Neurociêncis. Mestrndo: Chrles Frncisco Ferreir Orientdor: Dr. Aldo Bolten Lucion Co-Orientdor: Dr. Annel Ferreir Porto Alegre 21

3 III fi `tü t VA ea YxÜÅ ÇÉ? ÑxÄÉ vâ wtwé ÅtàxÜÇtÄ yéüçxv wéa

4 IV "Escolho meus migos não pel pele ou outro rquétipo qulquer, ms pel pupil. Tem que ter rilho questiondor e tonlidde inquietnte. A mim não interessm os ons de espírito nem os mus de háitos. Fico com queles que fzem de mim louco e snto. Deles não quero respost, quero meu vesso. Que me trgm dúvids e ngústis e güentem o que há de pior em mim. Pr isso, só sendo louco. Quero-os sntos, pr que não duvidem ds diferençs e peçm perdão pels injustiçs. Escolho meus migos pel cr lvd e pel lm expost. Não quero só o omro ou o colo, quero tmém su mior legri. Amigo que não ri junto não se sofrer junto. Meus migos são todos ssim: metde oeir, metde seriedde. Não quero risos previsíveis nem choros piedosos. Quero migos sérios, dqueles que fzem d relidde su fonte de prendizgem, ms lutm pr que fntsi não despreç. Não quero migos dultos nem chtos. Quero-os metde infânci e outr metde velhice. Crinçs, pr que não esqueçm o vlor do vento no rosto e velhos, pr que nunc tenhm press. Tenho migos pr ser quem eu sou. Pois os vendo loucos e sntos, oos e sérios, crinçs e velhos, nunc me esquecerei de que normlidde é um ilusão imecil e estéril." Oscr Wilde (16/1/184 3/9/19)

5 V TzÜtwxv ÅxÇàÉá Em primeiro lugr grdeço os meus njos protetores por estrem comigo em todos os momentos d minh vid, me orientndo, por pensmentos e incentivos de corgem qundo distânci e o tempo não nos permitim estr juntos. Vocês Mri Cléto Rfel Fermino, Benedito Fermino, Angel, Grç, Crmem, Antoniet, Mri, Pulo, Pedro, João, Césr e Mrcos são os responsáveis por eu estr qui. Origdo por todo crinho e poio nos momentos que julguei mis difíceis. Isto é por nós! Se hoje sou o que sou, sou grçs vocês. A todos os meus fmilires sorinhos, sorinhs, tios, tis, cunhdos e cunhds por tod jud que me fornecerm durnte mis um etp de minh vid. Ao Professor Aldo Lucion, muito origdo pel oportunidde! Por tod pciênci, dedicção e conhecimento gerdo durnte relizção deste trlho. À Professor Annel Ferreir pel co-orientção. Sempre dispost esclrecer dúvids e sugerir soluções, mesmo long distânci. Pel perspicáci n discussão de spectos relevntes no plnejmento e execução deste trlho, pelo exemplo de profissionl consciente em que me espelho

6 VI cd vez mis; pelo compnheirismo em tods s hors e pel convivênci grdável que temos tido. Ao Professor Gilerto Luiz Snvitto por todo o uxílio e explicções prestdos pr relizção deste trlho. Aos meus migos, minh segund fmíli. Sempre presentes pr comemorr s os conquists e tmém pr confortr nos momentos de ngústi. Pr jmis me fzer esquecer o verddeiro vlor que cd cois tem. Márcio M. Mchiori, Déor P. Rico, Tigo M. A. Ferrri, Julin P. Lim, Griel DAll Agnol, Griel Sores, Cléo, Clodis Boscrioli e Dery Nery Neto. Como const em Eclesiástico, cpítulo 6, versículo Quem encontrou um migo, encontrou um tesouro.... Pr vocês: Suelen, Silvn Jcos, Ptríci Feks, Krin Wissheimer e Lr Isys, minhs moedinhs de ouro, meu super origdo por tudo! De corção! Pel mizde, pelos conselhos e pel leldde. Não poderi deixr de grdecer o Vgner Fgnni Linrtevichi. Por ser temporl, pel tenção, crinho, pciênci, compreensão nos momentos difíceis, incentivo, por todo uxílio prestdo e por sempre creditr em mim. Aos migos Edson Rolim d Silveir, Vlerí Schmidt e Tlit Cmrgo pel pciênci no convívio diário. Ao Angelo Cstrogiovnni, pelo uxílio propulsor no qul o emsmento científico dest etp pudesse ser primordo. Ao Ninão, à Medéi e à Brnc pel prticipção neste protocolo. Aos migos e colordores Emily De Conto, Letíci Wildner, Mir Luttz, Lucino e Mrcelo Souz: sempre em-humordos, pcientes e

7 VII dispostos. Por todo o poio técnico indispensável pr relizção deste trlho, grdeço de corção! À colorção d doutornd Luis Amáli Diehl pelo uxílio em determinds tividdes experimentis desenvolvids. Origdo pel pciênci e pel disposição em judr! Aos demis colegs de lortório, por tod mizde e tolerânci, pelo poio técnico e pel experiênci comprtilhd, otimizndo o trlho e tornndo-o menos árduo. Adolfo Reis, An Rquel Krkow, An Lúci Ceconello, Croline Perinzzo, Everson Menezes, Felipe Roch, Helen Bsso, Jeferson Kik Guilherme, Lígi Centenro, Márci Scherem, Mrcelo Hererts, Simone Louzd, Thigo Henriques, Vnise Seen. À colorção de Pul n limpez e orgnizção do iotério. Aos Professores e Funcionários do Deprtmento de Fisiologi e deste Curso de Pós-Grdução em Ciêncis Biológics: Neurociêncis d UFRGS, pel cortesi, profissionlismo e dedicção de sempre. Ao CNPq e FAPESP pelo poio finnceiro. A todos que, cientes ou não, contriuírm pr que eu pudesse concluir esse trlho.

8 VIII Çw vx LISTA DE FIGURAS... XII LISTA DE ABREVIATURAS... XXII RESUMO... XXIII ABSTRACT... XXV 1. INTRODUÇÃO HIPÓTESE OBJETIVOS Ojetivo gerl Ojetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS Locl de Relizção Comitê de Étic em Pesquis Institucionl Animis Fêmes Filhotes... 16

9 IX Cálculo do tmnho mostrl Grupos experimentis Grupos de gestntes Pdrões dicionis dotdos neste protocolo Delinemento experimentl Procedimento de estresse pré-ntl Procedimento de estresse pós-ntl Oservção do comportmento mternl Oservção do comportmento gressivo mternl Teste gudo de ndo forçdo Teste de lirinto em cruz elevdo Desenho experimentl Descrte de nimis Análise esttístic Fontes de finncimento RESULTADOS Dis em estresse pré-ntl Número totl de filhotes Comportmento mternl Construção de ninho Ammentção Interção com os filhotes Mãe no ninho sem posição de mmentção Freqüênci de lmids... 4

10 X Permnênci for do ninho Comportmento gressivo mternl Postur gressiv Investigção socil Interção com os filhotes Moilidde Rering Grooming Atque frontl Atque lterl Morder ceç do intruso Morder o corpo do intruso Imoilidde Teste gudo de ndo forçdo Lirinto em cruz elevdo DISCUSSÃO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS Dosgens hormonis REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 66

11 XI 1. ANEXOS... A Anexo I... A Construção de ninho... B Ammentção... D Interção com os filhotes... F Mãe no ninho sem posição de mmentção... H Número de lmids... J Permnênci d mãe for do ninho... L

12 XII _ áàt wx Y zâütá Figur 1. Rt sumetid o estresse pré-ntl restrição de mrvlh durnte últim semn do período gestcionl (7 ± 1 dis ntes d prturição) Figur 2. Procedimento de estresse pré-ntl. Figur 3. Procedimento de estresse pós-ntl. Figur 4. Imgem demonstrndo um rt sumetid o procedimento de estresse pós-ntl. Figur. Comportmento mternl. A. Lmid B. Ammentção com dorso muito rquedo. C. Ammentção com dorso pouco rquedo. D. Ammentção em supino. Figur 6. Registro do comportmento mternl relizdo pr cd rt lctnte.

13 XIII Figur 7. Fich utilizd pr relizção do registro do comportmento mternl. Figur 8. Teste de lirinto em cruz elevdo. Figur 9. Delinemento experimentl. Figur 1. Permnênci de dis em estresse pré-ntl. Figur 11. Número totl de filhotes. Figur 12. Construção do ninho. A. Freqüêncis totis diáris de construção do ninho. B. Médis semnis de construção do ninho. Figur 13. Ammentção. A. Freqüêncis totis diáris de mmentção. B. Médis semnis de mmentção. Figur 14. Interção com os filhotes. A. Freqüêncis totis diáris de interção com os filhotes. B. Médis semnis de interção com os filhotes. Figur 1. Mãe no ninho sem posição de mmentção.

14 XIV A. Freqüêncis totis diáris de mãe no ninho sem posição de mmentção. B. Médis semnis de mãe no ninho sem posição de mmentção. Figur 16. Freqüêncis de lmids. A. Freqüêncis totis diáris de lmids. B. Médis semnis de lmids. Figur 17. Permnênci for do ninho. A. Freqüêncis totis diáris de permnênci for do ninho. B. Médis semnis de permnênci for do ninho. Figur 18. Postur gressiv A. Ltêncis de postur gressiv. B. Freqüêncis de postur gressiv. C. Porcentgens de tempo de postur gressiv. Figur 19. Investigção socil. A. Ltêncis de investigção socil. B. Freqüêncis de investigção socil. C. Porcentgens de tempo de investigção socil. Figur 2. Interção com os filhotes. A. Ltêncis de interção com os filhotes. B. Freqüêncis de interção com os filhotes.

15 XV C. Porcentgens de tempo de interção com os filhotes. Figur 21. Moilidde A. Ltêncis de moilidde. B. Freqüêncis de moilidde. C. Porcentgens de tempo de moilidde. Figur 22. Rering. A. Ltêncis de rering. B. Freqüêncis de rering. C. Porcentgens de tempo de rering. Figur 23. Grooming. A. Ltêncis de grooming. B. Freqüêncis de grooming. C. Porcentgens de tempo de grooming. Figur 24. Atque frontl. A. Ltêncis de tque frontl. B. Freqüêncis de tque frontl. C. Porcentgens de tempo de tque frontl. Figur 2. Atque lterl. A. Ltêncis de tque lterl. B. Freqüêncis de tque lterl.

16 XVI C. Porcentgens de tempo de tque lterl. Figur 26. Morder ceç do intruso. A. Ltêncis de morder ceç do intruso. B. Freqüêncis de morder ceç do intruso. C. Porcentgens de tempo de morder ceç do intruso. Figur 27. Morder o corpo do intruso. A. Ltêncis de morder o corpo do intruso. B. Freqüêncis de morder o corpo do intruso. C. Porcentgens de tempo de morder o corpo do intruso. Figur 28. Imoilidde. A. Ltêncis de imoilidde. B. Freqüêncis de imoilidde. C. Porcentgens de tempo de imoilidde. Figur 29. Teste gudo de ndo forçdo. A. Freqüêncis totis de movimentção, imoilidde e climing. B. Ltêncis de movimentção, imoilidde e climing. C. Porcentgens de tempos de movimentção, imoilidde e climing. D. Porcentgens de freqüêncis totis de movimentção, imoilidde e climing. Figur 3. Lirinto em cruz elevdo.

17 XVII A. Porcentgem de permnênci nos rços ertos. B. Porcentgem de permnênci nos rços fechdos. C. Porcentgem de freqüênci de entrds nos rços ertos. D. Porcentgem de freqüênci de entrds nos rços fechdos. Figur 31. Construção do ninho. A. Freqüêncis de construção do ninho. Di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de construção do ninho. Di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de construção do ninho. Di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. D. Freqüêncis de construção do ninho. Di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 32. Construção do ninho. A. Freqüêncis de construção do ninho. Di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de construção do ninho. Di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de construção do ninho. Di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 33. Ammentção.

18 XVIII A. Freqüêncis de mmentção di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de mmentção di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de mmentção di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. D. Freqüêncis de mmentção di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 34. Ammentção. A. Freqüêncis de mmentção di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de mmentção di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de mmentção di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 3. Interção com os filhotes. A. Freqüêncis de interção com os filhotes di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de interção com os filhotes di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de interção com os filhotes di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro.

19 XIX D. Freqüêncis de interção com os filhotes di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 36. Interção com os filhotes. A. Freqüêncis de interção com os filhotes di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de interção com os filhotes di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de interção com os filhotes di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 37. Mãe no ninho sem posição de mmentção. A. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. D. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 38. Mãe no ninho sem posição de mmentção. A. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro.

20 XX B. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de mãe no ninho sem posição de mmentção di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 39. Número de lmids. A. Freqüêncis de número de lmids di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de número de lmids di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de número de lmids di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. D. Freqüêncis de número de lmids di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 4. Número de lmids. A. Freqüêncis de número de lmids di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de número de lmids di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de número de lmids di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 41. Permnênci for do ninho.

21 XXI A. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 2 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 3 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 4 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. D. Freqüêncis de permnênci for do ninho di pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. Figur 42. Permnênci for do ninho. A. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 6 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. B. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 7 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro. C. Freqüêncis de permnênci for do ninho di 8 pós-ntl: período clro 1, clro 2, clro 3 e escuro.

22 XXII _ á áàt wx TuÜxä tàâütá ACTH Hromônio Adrenocorticotrófico AVP Hormônio rginin vsopressin CRH Hormônio lierdor de corticotrofins CORT Hormônio corticosteron GH Hormônio do crescimento GR Promotor do receptor de glicocorticóide HPA Hipotálmo-Hipófise-Adrenl LC Locus Coeruleus N Número Amostrl NA Nordrenlin ODC Ornitin descroxilse PRL Hormônio Prolctin PVN Núcleo prventriculr do hipotálmo SNC Sistem Nervoso Centrl

23 XXIII exáâåé O comportmento mternl em rts consiste de vários elementos integrdos que estão relciondos com nutrição e o cuiddo dos filhotes. Interções n relção mãe-filhote são importntes pr o crescimento e desenvolvimento dequdos dos mmíferos. A interrupção de estímulos sensoriis providos pel mãe tem efeitos negtivos no desenvolvimento d ninhd em muits espécies. Em modelos nimis trtmentos estressores às fêmes prenhs ocsionm mudnçs notáveis n fisiologi e no comportmento de su ninhd, podendo cusr numeross disfunções tnto ns mães qunto em seus filhotes O presente trlho tem por ojetivo investigr os efeitos de dois tipos de eventos estressores mientis durnte o período perintl - restrição de sustrto pr construção do ninho e presentção de um preddor nturl - em como sus diferentes cominções, sore o pdrão comportmentl d relção d mãe pr com su cri, em rts wistr, em como seu pdrão de comportmento gressivo, possíveis comportmentos tipo-depressivos e o nível de nsiedde destes nimis. Como resultdo, oserv-se no presente trlho que, os estresses mientis plicdos durnte o período perintl não ocsionrm lterções significtivs nos comportmentos relciondos o cuiddo mternl ou o

24 XXIV comportmento gressivo mternl. Entretnto, oservou-se um pdrão diferencido de cuiddo mternl ns fêmes sumetids os eventos estressores estuddos. Além disso, não form oservdos comportmentos tipo-depressivos (medidos pelo teste gudo de ndo forçdo) ou umento do nível de nsiedde (medido pelo teste de lirinto em cruz elevdo) dests mães sumetids estes prdigms.

25 XXV TuáàÜtvà Mternl ehvior in rts consists of severl integrted elements tht re relted to nutrition nd cre of the offspring. Mother-pup interctions re importnt for proper growth nd development of mmmls. The interruption of sensory stimultion provided y the mothers hs negtive effects on offspring s development in mny species. In niml models stressors tretment plplied to pregnnt femles cuses drmtic chnges in their offspring s physiology nd ehvior, which my cuse mny disorders in oth mothers nd pups. This study imed to investigte the effects of two types of environmentl stressors during the perintl period - the restriction of sustrte for nest uilding nd exposure to nturl predtor - s well s their different comintions on the ehviorl pttern of the mother s reltionship towrds their offspring in Wistr rts, s well s their pttern of ggressive ehvior, possile depressive-like ehvior nd nxiety level. As result it ws oserved in this study tht the environmentl stresses pplied during the perintl period did not produce significnt chnges in ehviors relted to mternl cre or mternl ggressive ehvior in femles sujected to the stressful events studied. However, there ws distinct pttern of mternl cre in femles sujected to stressful events studied. Furthermore, depressive-like ehviors (mesured y cute forced swim test) or nxiety

26 XXVI (mesured y the elevted plus mze test) were not oserved in these mothers sujected to these prdigms.

27 1 \ÇàÜÉwâ ûé O Comportmento Mternl O comportmento mternl em rts consiste de vários elementos integrdos que estão relciondos com nutrição e o cuiddo dos filhotes. Eles podem envolver diretmente os filhotes (mmentção, lmid, usc de filhotes) ou não (construção de ninhos, gressão mternl). Este pdrão complexo prece espontnemente em mães primíprs. Perto d dt do prto, mãe inici um seqüênci de mudnçs comportmentis que vism receer dequdmente os filhotes (Numn & Insel, 23). El mud seus pdrões de limpez corporl, levndo mis tempo n limpez d região mmári e, lguns dis ntes do prto, el constrói um ninho com o sustrto disponível (Numn, 1988). Um ds hipóteses que poderi explicr o rápido surgimento do comportmento mternl serim s mudnçs hormonis que ocorrem no término d gestção (Numn, 1994). No finl d gestção e durnte os primeiros dis de lctção, fême pss por mudnçs hormonis (Byrnes & Bridges, 26; Numn, 1994) e comportmentis importntes que induzem e hilitm-n proteger e orientr ninhd (Poindron, 2; Stern & Johnson, 199). Entretnto, um vez estelecid interção mãe-filhote, respost mternl pss ser induzid por estímulo dos filhotes, independentemente d ção

28 2 hormonl (Vn Leengoed et l., 1987). A rt lctnte precis de vários estímulos, lém ds mudnçs hormonis cusds pel gestção em si, pr estelecer um respost mternl. O principl estímulo é presenç dos filhotes, que tri tenção d mãe, com lguns comportmentos como voclizções e movimentos do corpo (Pwluski et l., 29; Poln & Hofer, 1999) e pelo olfto (Poindron, 2; Lévy et l., 24; Lévy, 1998; Moore, 198; Jns & Leon, 1983). Os filhotes de rtos, ssim como miori dos roedores, nscem ltriciis, isto é, são prcilmente imóveis, desprovidos de pêlos, surdos e cegos, incpzes de se locomover e de regulr su tempertur (Grot & Ader, 1969; 197). Durnte o período d lctção, s mães presentm comportmento de cuidr dos filhotes e mnifestm-no pel usc dos mesmos qundo estes se fstm do ninho, pel estimulção d micção por meio d lmid nogenitl, pelo posicionmento sore os filhotes pr provê-los de nutrição e clor, pel construção do ninho e por defes contr intrusos (Grot & Ader, 1969; Stern & Johnson, 199; Alert & Wlsh, 199). Até proximdmente o 12º di de vid é mãe quem tom inicitiv de se proximr dos filhotes. Sendo ssim, vrição no cuiddo mternl pode ser considerd o diferencil pr s experiêncis sensoriis no desenvolvimento dos filhotes. Após esse período, os filhotes estão ptos se locomover e deixr o ninho, então são eles que se proximm d mãe pr requerer cuiddos (Grot, 197). O comportmento mternl é crcterizdo por um ritmicidde, sendo mis intenso durnte o di e, no ciclo clro-escuro, sofre um inversão cd três dis. A mãe não lter miori dos comportmentos em relção os filhotes, ms lter periodicidde deste, isto é, el começ ter cuiddo mternl durnte o período escuro e tmém durnte o período clro (Schelstrete et l., 1992).

29 3 Interções n relção mãe-filhote são importntes pr o crescimento e desenvolvimento dequdos dos mmíferos. A interrupção de estímulos sensoriis providos pel mãe tem efeitos negtivos no desenvolvimento d ninhd em muits espécies (Schnerg & Kuhn, 198; Puk et l., 1986). O estelecimento de um interção norml entre mãe e o filhote é crítico pr o crescimento e o desenvolvimento comportmentl n miori ds espécies de mmíferos (Moriceu & Sullivn 2, Sullivn 23). A relizção de comportmentos recíprocos entre mãe e o filhote ument chnce do filhote soreviver, e vindo soreviver, ele irá se reproduzir e crir, com sucesso, seus próprios filhos (Insel & Young 21, Annd & Sclzo 2, Fleming et l. 1999). Em rtos, diferençs individuis ns resposts comportmentis e endócrins o estresse estão ssocids com s vrições que ocorrem sore o cuiddo mternl durnte infânci (Cldji et l., 1998, McCrty et l., 1992;). Isso inclui um redução n tividde de ornitin descroxilse (ODC), que é um índice sensível de crescimento e diferencição celulr, n diminuição d secreção do hormônio do crescimento (GH), em como um umento n secreção de corticosteron (CORT) (Puk et l., 1986). Há ddos que demonstrm, em rtos, ocorrer vrições nturis no cuiddo mternl que lterm permnentemente o comportmento e regulção neuroquímic dos filhotes (Chmpgne et l. 23, Bredy et l., 23; Levine et l. 21, Frncis et l., 22). Liu et l. (1997) mostrrm que os filhotes de mães que permnecem mis tempo com os mesmos, lmendo-os mis, qundo dultos presentm um umento d concentrção de receptores pr glicocorticóides no hipocmpo e um menor secreção de ACTH e corticosteron em respost o estresse.

30 4 Resposts Ao Estresse A homeostse é um processo de coordenção fisiológic o qul mntém estável mior prte dos estdos no orgnismo. Este equilírio estável pode ser constntemente meçdo por um vriedde de distúrios ou estímulos, tnto externos qunto internos. Nests situções de meç ou perigo, os orgnismos desencdeim diverss resposts dpttivs que vism mnter homeostsi, chmds de resposts o estresse. As resposts o estresse, que hilitm um orgnismo enfrentr um meç ou desfio de estímulos mientis, consistem em um complexo conjunto de componentes endócrinos, neurovegettivos e comportmentis (Cldji et l., 21; Johnstone et l., 2; Ptin et l., 22; Rim et l., 29, Kier et l., 21). Os dois principis sistems neuroendócrinos envolvidos em integrr s resposts um estressor são o eixo hipotálmo-hipófise-drenl (HPA) e o sistem neurovegettivo simpático. A tivção do eixo HPA result n lierção de cortisol ou corticosteron do córtex d drenl. O umento d tividde ctecolminérgic e d tivção deste eixo integrdo com diversos outros sistems neuroendócrinos regul função vsculr e cptção de energi, fcilitndo s resposts comportmentis dequds e servindo pr mnter homeostse (Meney et l., 1993; Meerlo et l., 1999). Pr que isto ocorr, os neurônios do núcleo prventriculr (PVN) do hipotálmo, sintetizm e secretm o hormônio lierdor de corticotrofin (CRH) e rginin-vsopressin (AVP), que irão tur tivndo hipófise nterior e promovendo lierção do hormônio drenocorticotrófico (ACTH). Este, por su vez irá promover secreção de glicocorticóides pelo córtex d drenl (Hnd et l., 1994; Frncis et l., 1996; Hermn & Cullinn, 1997).

31 Os glicocorticóides, em um orgnismo dulto, servem pr regulr diverss funções que vism mnutenção dos processos metólicos ásicos, em como regulção de um orgnismo em respost o estresse. No homem, o glicocorticóide de mior importânci é o cortisol e no rto, corticosteron. A mior prte dos efeitos d corticosteron é rpidmente revertid em um orgnismo dulto, entretnto dministrção deste hormônio durnte o desenvolvimento tem mostrdo efeitos permnentes no crescimento e n diferencição de diversos sistems, incluindo o sistem nervoso centrl (SNC) (Levine, 21). Estudos com modelos nimis demonstrrm um decréscimo induzido pelo estresse durnte o período de lctção ns concentrções plsmátics de ocitocin (Crter & Lightmn, 1987; Higuchi et l., 1988; Neumnn et l., 1993), ctecolmins, prolctin (Higuchi et l., 1989), ACTH e corticosteron (Stern et l., 1973; Wlker et l., 1992; Windle et l., 1997). A tivção do sistem neurovegettivo simpático tmém é induzid em respost o estresse e result n lierção de nordrenlin (NA) nos terminis sinápticos e pel medul d drenl n corrente sngüíne, onde juntmente com os glicocorticóides irá umentr lipólise, glicogenólise e o ctolismo de proteíns. Além dest descrg periféric, o estresse tmém induz secreção de nordrenlin no SNC, sendo que grnde prte origin-se no Locus coeruleus (LC) (Meli & Dumn, 1991; Konstndi et l., 2). Assim, s ctecolmins promovem diverss lterções ns funções vegettivs, o que irá contriuir pr que o orgnismo mntenh o equilírio homeostático durnte o estresse (Kopin, 199). A corticosteron é um dos principis hormônios vlidos n respost diversos tipos de estressores, entretnto prolctin (PRL) tmém responde esses estímulos, sendo utilizd como um eficiente mrcdor d respost o

32 6 estresse. Em rtos, tnto em mchos qunto em fêmes, exposição gud diversos tipos de estressores result em um considerável umento nos níveis plsmáticos de prolctin (Wilson et l., 2). Dentre os estímulos estressores, pode-se citr o estresse por éter, por contenção e por exposição o clor (Freemn et l., 2). Diferentemente d respost d corticosteron, que é mis trdi e prolongd, prolctin retorn os níveis sis dentro de proximdmente 1 minutos. Foi demonstrdo que, o pico de concentrção plsmátic de PRL ocorre entre 2 e minutos pós o estresse por exposição o éter e o retorno às concentrções sis ocorre pós minutos (Wkyshi et l., 1971). Sendo ssim, os níveis de PRL juntmente com os de ACTH podem ser considerdos, como índice quntittivo ds resposts diferentes estressores (Freemn et l., 2). Estresse Perintl Ns últims décds tem se demonstrdo um incrível umento de interesse no tópico de influêncis mientis sore fisiologi e comportmento de orgnismos (Klinichev et l., 22; Bker et l., 28; Bker et l., 29). Váris evidêncis indicm que exposição eventos dversos no início d vid pode umentr vulnerilidde inúmers psicoptologis n vid dult (Heim et l., 1997; Ldd et l., 2; Cldji et l., 21). Muitos estudos oservcionis de modelo de estresse já são reltdos em seres humnos, entre eles, estresse pré-ntl em mulheres, onde se tem demonstrdo diverss vrições desse desequilírio fisiológico como: índices ortivos, dificulddes durnte o prto, ixo peso dos neontos e lts

33 7 percentgens de descendentes premturos (Homer et l., 199). Além disso, lguns utores sugerem existênci de um relção entre o estresse psicológico mternl e o umento, nos filhos, d incidênci de sintomtologi de esquizofreni e depressão (Huttunen & Nisknen, 1978; Vn Os. et l.,1998; Wtson et l., 1999; Gutteling et l. 2). Em modelos nimis, trtmentos estressores às fêmes prenhs ocsionm mudnçs notáveis n fisiologi e no comportmento de su ninhd (Ptin et l., 2; Drnudéry & Mccri, 28). Eles podem cusr numeross disfunções tnto ns mães qunto em seus filhotes (Becker et l., 1977; Brlow et l., 1978; Power et l., 1986; Peters, 1988; Weinstock et l., 1988; Henry et l., 1994; Mccri et l., 199; Prdon et l., 2). Esse tipo de estudo tem sido exmindo de um mneir mis extensiv, principlmente em rtos, onde lterções nesse período, lém de cusr efeitos já comentdos nteriormente, ind podem fzer com que ocorrm nesses nimis hipertividde, emocionlidde umentd e déficits cognitivos neurológicos (Stott, 1973; Smith et l., 1981; Grimm et l., 1987; Weller et l., 1988; Weinstock et l., 1992; Poltyrev et l., 1996; Weinstock, 1997; Götz et l., 28). Além disso, outrs pesquiss mostrm que o estresse durnte esse período fet tnto cpcidde como discriminção do prendizdo no wter mze em rtos (Smith et l., 1981). O estresse pré-ntl de form repetid produz déficits comportmentis, ms esss lterções não precem ser diferentes qunto comprds com os produzidos por um estresse de form mis gud, como por exemplo, um preddor nturl (um gto). Nesse estudo de presentção um preddor nturl ind pode-se verificr que s concentrções de corticosteron de mães estressds form em superiores os ds mães controles (Lordi et l., 2).

34 8 O estresse, no período d lctção em rtos fet tmém relção mãefilhote. Estudos demonstrrm que lterções ou interferêncis nest relção podem provocr distúrios, modificndo o comportmento d mãe em relção os filhotes, cusndo ssim mudnçs comportmentis, neuroendócrins, imunológics e neuris que precem perdurr o longo d vid do niml (Arnsten, 1998; Gomes et l., 1999; Meerlo et l., 1999; Pdoin et l., 21; Chmpgne et l., 23; Giovenrdi et l., 2). Em humnos, pesquiss demonstrrm que depressão é comum durnte gestção e é ssocid com indicdores de privção sócio-econômic, violênci e perd de um relcionmento íntimo, e com um prévi históri de depressão (Lovisi et l., 2). Atulmente, muits questões sore os mecnismos de ção envolvidos n depressão pós-prto ind permnecem desconhecids (Bennett et l., 24). No período próximo o prto, um gm de lterções comportmentis e endócrins têm sido reltds em relção à responsividde o estresse em inúmers espécies, incluindo: rtos, ovelhs e humnos, por meio de dptções de quse todos os níveis do eixo hipotálmo-hipófise-drenl (HPA). Ests dptções podem incluir lterções nos processos de percepção o estressor em regiões límics do encéflo, n vlição emocionl de um estímulo externo, resultndo em: (1) um respost comportmentl lterd um ddo estressor (Wlker et l., 199; Windle et l., 1997; Neumnn et l., 1998; Lightmn et l., 21); e (2) lterções de inputs excittórios e iniitórios os neurônios hipotlâmicos do núcleo prventriculr (PVN) e/ou núcleo supróptico (Toufexis & Wlker, 1996; Dougls et l., 1998) sintetizndo o hormônio lierdor de corticotrofins (CRH), ocitocin ou vsopressin.

35 9 Conseqüentemente, tividde de neurônios de hormônio lierdor de corticotrofins (CRH) e de vsopressin, os quis representm ser os principis reguldores d síntese e secreção do hormônio denocorticotrófico (ACTH) no nível d denohipófise do eixo HPA, é esperdmente lterd. Um diminuição n tividde do sistem CRH, por exemplo, incluindo síntese de CRH no PVN (Dougls & Russell, 1994) e ligção de CRH n denohipófise (Neumnn et l., 1998) demonstrd no período finl d gestção pode, o menos em prte, somr pr redução d lierção de ACTH e consequentemente de corticosteron no sngue em respost um estímulo externo tnto durnte o período de gestção qundo no período de lctção (humnos: Altemus et l., 199; rtos: Stern et l., 1973; Lightmn & Young III, 1989; Wlker et l., 199; Windle et l., 1997; Neumnn et l., 1998; ovelhs: Keller-Wood, 199). Além desss lterções no processmento do estímulo receido, lterções dos mecnismos de retrolimentção negtiv do eixo HPA ddo por glicocorticóides vi receptores minerlo e glicocorticóides presentes nos níveis límico, hipotlâmico e denohipofisário, podem resultr em um deslocmento do ponto excittório d respost o estresse no período periprto (Johnstone et l., 1998, 2). Além disso, emor ltmente tivdos no período pós-prto fim de grntir s funções reprodutivs, o sistem ocitocinérgico responde pouco estímulos não diretmente ligdos eventos reprodutivos e é tenudo conforme indicdo por um redução n secreção de ocitocin no sngue em respost diversos estímulos (Crter & Lightmn, 1987; Neumnn et l., 199, 1998; Wlker et l, 199; Dougls & Russell, 21).

36 1 O umento d tividde encefálic do sistem ocitocinérgico no período pósprto lev à hipótese de um prticipção de ocitocin ns dptções comportmentis e neuroendócrins vist neste momento (Neumnn, 21). Bsedo nesse conjunto de ddos, o presente trlho tem por ojetivo investigr os efeitos de diferentes tipos de eventos estressores durnte o período perintl, em como sus diferentes cominções, sore o pdrão comportmentl d relção d mãe pr com su cri, em rts wistr.

37 11 [ Ñ àxáx Considerndo-se que eventos mientis que ocorrm no período perintl produzem efeitos sore spectos comportmentis e neuroendócrinos ds fêmes de inúmers espécies e que, estes se mnifestm n diminuição ou redução do comportmento mternl, diminuição do comportmento gressivo mternl, umento d nsiedde e em lterções dos níveis hormonis responsivos eventos estressores e/ou relciondos o comportmento mternl, levntou-se hipótese de que estímulos mientis estresssntes (restrição de sustrto pr construção do ninho, em como presenç de um preddor nturl) comindos possm fetr os mecnismos que regulm o comportmento mternl, diminuindo interção mãe-filhote.

38 12 u}xà äéá O presente trlho tem por ojetivo nlisr os efeitos d cominção de estímulos mientis estressntes no período gestcionl e nos dois primeiros dis pós-prto sore o comportmento mternl de rts lctntes. O modelo utilizdo se trt de um dptção do protocolo experimentl desenvolvido por Fenoglio et l., 26 cujo estímulo estressnte plicdo em rts lctntes foi redução do sustrto pr construção do ninho, o qul é um estímulo nturl e relciondo o comportmento mternl pois s mesms, nos últimos dis de gestção, já começm preprr o ninho, mntendo-o durnte tod lctção. Pretendemos com isso ssocir o estresse um tividde do comportmento mternl, ou sej, o fto d fême ter que cuidr de seus filhotes. Além disso, no primeiro di pós o prto, rt foi expost gudmente um preddor nturl (gto dptdo de Ptin et l., 22). O presente protocolo comin estresse pré-prto e pós-prto d mãe. Ojetivos Específicos Mis especificmente, este projeto pretendeu estudr os efeitos do estresse cusdos pels vrições do miente próximo o prto e s lterções do comportmento mternl induzids por este procedimento qundo comprdos

39 13 nimis que não sofrerm nenhum intervenção neste período. Dess mneir, pretendeu-se induzir um diminuição do comportmento mternl e do comportmento gressivo mternl juntmente com um umento do nível de nsiedde destes nimis. Pr isso propomos: Verificr os efeitos dos eventos estressores pré-ntl (restrição de sustrto) e pós-ntl (presentção um preddor nturl), individulmente ou comindos, sore: o comportmento mternl; nos prâmetros envolvidos no teste de comportmento gressivo mternl; nos prâmetros envolvidos no teste gudo de ndo forçdo e nos prâmetros envolvidos no teste de lirinto em cruz elevdo.

40 14 `tàxü t á x ` àéwéá Locl de Relizção Todos os experimentos ixo relciondos presentrm condições de serem relizdos n Universidde Federl do Rio Grnde do Sul. Estes experimentos form relizdos no lortório de Neuroendocrinologi do Comportmento do Instituto de Ciêncis Básics d Súde (lortório 11 ICBS UFRGS), so orientção do professor Dr. Aldo Bolten Lucion e co-orientção d professor Dr. Annel Ferreir Universidd de L Repulic (UDELAR Montevideo - Urugui). Comitê de Étic em Pesquis Institucionl O Comitê de Étic em Pesquis d Universidde Federl do Rio Grnde do Sul nlisou o projeto número 279 em 2 de novemro de 28, reunião número 39, t número 119. O mesmo foi provdo por estr dequdo étic e metodologicmente e de cordo com Resolução 196/96 e complementres do Conselho Ncionl de Súde.

41 1 Animis Fêmes Form utilizds 6 rts fêmes dults não prenhs (proximdmente 4 dis), d vriedde Wistr, provenientes do iotério d Universidde Federl do Rio Grnde do Sul. As mesms form trnsferids o iotério setoril do lortório de Neuroendocrinlogi do Comportmento. Ests rts os 7 dis presentndose n fse estrl Proestro form colocds em cixs-residênci juntmente com um mcho sexulmente tivo durnte s primeirs hors do período noturno do ciclo, com mrvlh servindo de sustrto. Anlismos dirimente s fses do ciclo estrl dests fêmes pr grntir prenhez. As fêmes presentrm um monitormento diário pr que o prto fosse o mis controldo possível. Ao ssegurrmos prenhez d fême (nlisndo o ciclo estrl e presentndo espermtozóides n secreção vginl), est foi dispost individulmente em um cix-residênci contendo mrvlh ou um pequeno montnte d mesm como sustrto (dependendo do grupo experimentl que mesm foi inserid) durnte todo o período gestcionl. Todos os nimis form mntidos no iotério setoril so um ciclo clro-escuro de 12:12 hors, com início d fse escur às 18:3 hors. A tempertur do iotério foi mntid constnte em torno de 22ºC±1 C. Todos os nimis tiverm livre cesso à águ e comid durnte todo o período dest pesquis.

42 16 Filhotes Os filhotes form mntidos juntmente com fême durnte todo o período de lctção. Tentmos minimizr mnipulção dos mesmos (tnto d mãe qunto dos filhotes), pois nlismos durnte os primeiros 8 dis de lctção o comportmento mternl, sendo tl mnipulção mntid pens pr pdronizção do número de filhotes no di d prturição (pdronizdo como 6 8 filhotes por ninhd) e pr s limpezs ds cixs-residêncis. No di 9 pós-ntl, os filhotes form trnsferidos com su respectiv mãe pr outro comprtimento pr relizção d filmgem do comportmento gressivo mternl. Estes filhotes form descrtdos prtir do 21º di (pós-desmme) seguindo todos os procedimentos exigidos pelo Comitê de Étic dest Instituição de Ensino, qundo todos os experimentos com mães e filhotes já tinhm sido concluídos. Todos os nimis form mntidos no iotério so um ciclo clro-escuro de 12:12 hors, com início d fse escur às 18:3 hors. A tempertur do iotério foi mntid constnte em torno de 22ºC±1 C. Todos os nimis tiverm livre cesso à águ e comid durnte todo o período dest pesquis. Cálculo do tmnho mostrl Comportmento Mternl: Pr relizção dos testes de comportmento mternl o n mostrl foi clculdo pr vriável freqüênci de lmer os filhotes, com se em estudos relizdos pelo grupo SMITH et l., 24. Foi considerdo um poder de 99.9% pr um nível de significânci de p <.. n clculdo de 17 nimis por grupo.

43 17 Comportmento Agressivo Mternl: Pr relizção dos testes de comportmento gressivo mternl o n mostrl foi o mesmo utilizdo pr os testes de comportmento mternl, visto que s mesms rts form sumetids este protocolo experimentl. Teste de Ndo Forçdo: Pr relizção dos testes de ndo forçdo o n mostrl foi o mesmo utilizdo pr os testes de comportmento mternl, visto que s mesms rts form sumetids este protocolo experimentl. Teste de Lirinto em Cruz Elevdo: Pr relizção dos testes de lirinto em cruz elevdo o n mostrl foi o mesmo utilizdo pr os testes de comportmento mternl, visto que s mesms rts form sumetids este protocolo experimentl. O número de mostrs por grupo/por experimento vrim entre os estudos, pois muits vezes gestção não se esteleceu, o número de filhotes foi muito pequeno e ninhd foi excluíd dos experimentos ou por prolems ns nálises ds filmgens dos testes comportmentis. Grupos Experimentis Grupos de Gestntes As rts prenhs form dividids em qutro grupos sendo seus respectivos n demonstrdos entre prênteses: Grupo controle (n = 14): As fêmes deste grupo form disposts em cixsresidênci e, durnte todo o período gestcionl e pós-ntl (8 primeiros dis pós-

44 18 prto), não form presentds os ftores de estresse utilizdos neste experimento (restrição de mrvlh ou presentção o preddor) sendo, portnto, considerds nosss fêmes controle. As cixs form higienizds no di d prturição e no 9º di pós-prto. Grupo estresse pré-ntl (n = 14): As fêmes deste grupo form disposts em cixs-residêncis e, o consttr-se prenhez ds mesms, form mntids durnte o período gestcionl com pouco sustrto (mrvlh) e um lâmin de ppel filtro em sus devids cixs (procedimento explicdo dinte). Durnte o período gestcionl, ests fêmes presentrm mnipulção de sus cixsresidênci minimizd, pr que o gente estressor redução de sustrto fosse o principl ftor de impcto sore o comportmento ds mesms. Pr o devido fim, durnte este período, s cixs-residênci não form limps. No di (di d prturição) s cixs-residênci form limps e durnte o restnte do período experimentl, o protocolo de higienizção ds cixs-residênci foi mntido no pdrão comum (sendo limps no di d prturição e no 9º di pós-ntl). Grupo estresse pós-ntl (n = 14): As fêmes deste grupo form colocds em cixs-residênci e, o consttr-se prenhez ds mesms, form mntids durnte o período gestcionl em cixs-residênci contendo um montnte pdrão norml de sustrto (mrvlh). No di 1 pós-ntl est cix-residênci foi encminhd à sl de nálise ns primeirs hors do ciclo escuro (19:1 19:3 hors) e deixd lá durnte um período de tempo pr mientlizção d fême e seus filhotes um novo miente. Após mientlizção, s fêmes deste grupo experimentl form presentds o preddor por dus vezes de 1 minutos, com

45 19 um intervlo de 1 minutos entre ms s presentções. As fêmes form trnsferids novmente o iotério setoril do lortório de Neuroendocrinologi e li mntids durnte todo o período de lctção (té o 1º di pós-ntl). Durnte todo este experimento, s cixs-residênci form higienizds normlmente seguindo o pdrão comum do lortório (sendo limps no di d prturição e no 9º di pós-ntl). Grupo estresse pré e pós-ntl (n = 14): As fêmes deste grupo form disposts em cixs-residêncis e, o consttr-se prenhez ds mesms, form mntids durnte o período gestcionl com pouco sustrto (mrvlh) e um lâmin de ppel filtro em sus devids cixs (procedimento explicdo dinte). Durnte o período gestcionl, ests fêmes presentrm mnipulção de sus cixs-residênci minimizd, pr que o gente estressor redução de sustrto fosse o principl ftor de impcto sore o comportmento ds mesms. Pr o devido fim, durnte este período, s cixs-residênci não form limps. No 1º di pós-ntl est cix-residênci foi encminhd à sl de nálise ns primeirs hors do ciclo escuro (19:1 19:3 hors) e deixd lá durnte um período de tempo pr mientlizção d fême e seus filhotes um novo miente. Após mientlizção, s fêmes deste grupo experimentl form presentds o preddor por dus vezes de 1 minutos, com um intervlo de 1 minutos entre ms s presentções. As fêmes que form utilizds pr os testes comportmentis form trnsferids novmente o iotério setoril do lortório de Neuroendocrinologi e li mntids durnte todo o período de lctção (té o 1º di pós-ntl). Durnte todo este experimento, s cixs-residênci form higienizds

46 2 normlmente seguindo o pdrão comum do lortório (sendo limps no di d prturição e no 9º di pós-ntl). Pdrões dicionis dotdos neste protocolo: Seguindo o pdrão de todos os grupos experimentis, tods s rts pertencentes este experimento (portnto, todos os grupos) form disposts, durnte o período gestcionl té o primeiro di pós-ntl, em cixs-residênci contendo um lâmin de ppel filtro (medids: 37,cm x 31cm) ixo d mrvlh dispost como sustrto. Pr o grupo controle, quntidde de mrvlh disponiilizd durnte este período foi de 12g de sustrto dispostos sore lâmin de ppel filtro. Pr os grupos que form sumetidos o estresse pré-ntl (Figur 1), quntidde de mrvlh disponiilizd durnte este período foi de 2g de sustrto disposts sore lâmin de ppel filtro. Figur 1: Rt sumetid o estresse pré-ntl - restrição de mrvlh - durnte últim semn do período gestcionl (7 ± 1 dis ntes d prturição);

47 21 Delinemento Experimentl Procedimento 1 Procedimento de estresse pré-ntl Pr relizção do procedimento de estresse pré-ntl, rts prenhs com seu período de gestção devidmente confirmdo por nálises do ciclo estrl form disposts em cixs-residênci com restrição de sustrto (mrvlh) e um lâmin de ppel filtro (protocolo dptdo prtir de Fenoglio et l., 26 Figurs 1 e 2) pr construção do ninho proximdmente um semn ntes do prto. Durnte o período gestcionl, ests fêmes presentrm mnipulção de sus cixs-residênci minimizd, pr que o gente estressor redução de sustrto fosse o principl ftor de impcto sore o comportmento ds mesms. Portnto, sus cixs não form higienizds nest fse. No di 1 pós-ntl, s fêmes que form mntids pr posteriores testes comportmentis dotrm novmente o pdrão comum de higienizção ds cixs-residênci utilizdos em nosso lortório ( limpez ds cixs foi relizd dus vezes por semn té o finl do experimento).

48 22 Modelo experimentl Ninho com restrição de mrvlh Prto Período de Lctção (21 dis) 7 dis ntes do prto Di Figur 2: Procedimento de estresse pré-ntl. Procedimento de estresse pós-ntl A relizção do procedimento de estresse pós-ntl (Figur 3) ocorreu no primeiro di pós-prto. No primeiro di pós-ntl (di 1) cix-residênci contendo fême e su ninhd foi trnsferid durnte o período escuro dos rtos (19:1 19:3 hors) do iotério setoril do lortório de Neurociêncis pr um sl de experimentos situd no próprio Instituto. A cix-residênci foi então mntid por um determindo tempo nest nov sl pr que fême e os filhotes se dptssem com o novo miente. Depois de consttd mientlizção, um giol contendo um gto dulto foi dispost sore cix-residênci contendo fême e su ninhd. Est giol foi deixd nest posição durnte 1 minutos. Pssdos estes 1 minutos, est giol foi retird d sl de experimento por 1 minutos e, novmente, foi recolocd sore cix-residênci por mis 1 minutos (protocolo dptdo de Ptin et l., 22 Figur 4).

49 23 Modelo experimentl Estresse com preddor Prto Período Gestcionl Di Di 1 Figur 3: Procedimento de estresse pós-ntl. Figur 4: Imgem demonstrndo um rt sumetid o procedimento de estresse pós-ntl; Procedimento 2 Oservção do comportmento mternl O comportmento mternl nos qutro grupos de fêmes lctntes (N=17 por grupo) foi oservdo dirimente em qutro seções de 72 minutos cd té o di 8 pós-prto (Figur 6). As oservções ocorrerm em tempos regulres, sendo três períodos n fse clr (1:, 13: e 16:h) e um n fse escur (18:3h). Em cd período o comportmento ds lctntes foi oservdo e registrdo cd 3 minutos (2 oservções por período x 4 períodos por di = 1 oservções/mãe/di Figur 7). Os comportmentos nlisdos form: (1) mãe com os filhotes; (2) mãe lmendo os filhotes (lmer superfície do corpo e região nogenitl Figur A); (3) mãe mmentndo com o dorso em rquedo

50 24 (Figur B); (4) mãe mmentndo com o dorso pouco rquedo (Figur C); () postur pssiv de mmentção (Figur D) e (6) permnênci d mãe for do ninho. O prâmetro utilizdo pr cd comportmento foi freqüênci. Figur : Comportmento mternl. A. Lmid. B. Ammentção com dorso muito rquedo. C. Ammentção com dorso pouco rquedo. D. Ammentção em supino. Modelo experimentl 72 minutos/cd R1 R2 R3 R4 Ciclo clro Ciclo escuro *R= Registros Figur 6: Registro do comportmento mternl relizdo pr cd rt lctnte.

51 2 Fich de registro do Comportmento Mternl Figur 7: Fich utilizd pr relizção do registro do comportmento mternl. Procedimento 3 Oservção do comportmento gressivo mternl O registro de comportmento gressivo ds fêmes foi relizdo no 9º di pós-prto ns primeirs hors do ciclo escuro ( prtir ds 18:3 hors). Como um form de preprção pr relizção deste teste, s fêmes e seus respectivos filhotes form colocds no miente de filmgem durnte um período ntecipdo

52 26 de tempo pr que pudessem se costumr o novo miente, evitndo ssim que ocorressem lterções do seu pdrão de comportmento. Pr relizção do teste foi colocdo um mcho intruso dentro d cixresidênci d fême por 1 minutos. Durnte este período os comportmentos form registrdos em mídi e posteriormente nlisdos em um progrm de computdor. Os comportmentos nlisdos form: tque frontl, no qul fême tc o intruso n direção d ceç; tque lterl, fême tc em direção o corpo do intruso; morder o corpo, fême morde o corpo do intruso; morder ceç, fême morde o intruso n ceç ou no pescoço; postur gressiv, fême cerc o intruso e levnt um ds pts trseirs em direção o intruso; investigção socil, fême investig o intruso; interção com os filhotes, fême interge de lgum mneir com ninhd; cminhr, qundo fême cminh pel cix; rering, qundo fême levnt s dus pts dinteirs e s deix sore s ords d cix; grooming, uto-limpez d fême. Os prâmetros nlisdos pr estes comportmentos form s freqüêncis e s durções. Procedimento 4 Teste gudo de ndo forçdo O teste de ndo forçdo é um teste comumente usdo pr medir o efeito de drogs ntidepressivs no comportmento de nimis de lortório ou é tido como um protocolo pdrão pr que se poss indicr comportmentos depressivos em nimis de lortório (tipicmente rtos ou cmundongos). A mior prte dos

53 27 modelos nimis de depressão, como o ndo forçdo (Popov, J. S., Petkov, V. V., 199) e o desmpro prendido (Overmeir, J. B.; Seligmn, M. E. P., 1967), vli o desenvolvimento de lterções comportmentis e fisiológics em respost à préexposição evento estressnte inescpável. O teste de ndo forçdo se utiliz de um continer circulr de águ ( centímetros de diâmetro com 7 centímetros de ltur) contendo centímetros de colun de águ (profundidde), tornndo-o um lugr sem escptóri pr s rts, com tempertur controld de 23 C ± 1 C. As fêmes form sumetids o treino de ndo forçdo (Tril) um sessão de 1 minutos no continer de águ no 1 di pós-ntl, durnte s primeirs hors do período escuro (18:4 19:4 hors). Após est sessão individul, s rts form colocds em cixs pr descnso, secs e então recolocds em sus cixsresidênci. No 11 di pós-ntl, durnte o mesmo horário (primeirs hors do período escuro) s fêmes form sumetids o teste de ndo gudo forçdo proprimente dito. Este teste consistiu de um sessão individul de minutos no continer de águ. Utilizmos um filmdor pr que o teste comportmentl fosse grvdo em mídi e posteriormente nlisdo por um progrm computcionl. Os prâmetros comportmentis nlisdos pr este teste form: imoilidde, locomoção e climing, sendo que sus ltêncis, sus freqüêncis e sus durções form contilizds.

54 28 Procedimento Teste de lirinto em cruz elevdo O lirinto em cruz elevdo (Figur 8) é um modelo de nsiedde que é utilizdo em lrg escl como um teste pr verificção de compostos nsiolíticos como tmém se trt de um importnte ferrment n pesquis neuroiológic de nsiedde. O teste consiste de um prelho com dois rços ertos ( x 1cm cd um) e dois rços fechdos ( x 1cm cd um), todos com o teto erto, sendo os rços fechdos cercdos por predes lteris com 4cm de ltur, elevdo 1cm do chão. O modelo é sedo n versão de roedores espços ertos. Est versão lev o comportmento que envolve prevenção de áres erts o limitr seus movimentos somente pr os espços fechdos ou pr s rests de um espço delimitdo. No lirinto em cruz elevdo est crcterístic se trduz em um preferênci de permnênci nos rços fechdos (Pellow et l., 198; Treit et. l., 1993; Rodgers, 1997; Crorez e Bertoglio, 2). A redução de nsiedde no lirinto em cruz é indicd por um umento n proporção de tempo gsto nos rços ertos (tempo nos rços ertos / tempo totl nos rços ertos e fechdos), e um umento n proporção de entrds nos rços ertos (entrds nos rços ertos / totl de entrds nos rços ertos e fechdos). O número totl de entrds nos rços e o número de entrds nos rços fechdos são usulmente utilizdos como medids geris de tividde (Hogg, 1996). As fêmes form sumetids este teste ns primeirs hors do ciclo escuro do 12 di pós-ntl. Els form disposts individulmente no centro do prto e,