CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL

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1 INSTITUTO DE MACROMOLÉCULAS PROFESSORA ELOISA MANO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO IMA - UFRJ CROMATOGRAFIA DE PERMEAÇÃO EM GEL Ricardo Cunha Michel LAFIQ sala J rmichel@ima.ufrj.br

2 ou CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO POR TAMANHO O experimento de GPC / SEC O princípio da técnica Determinação relativa de Massa Molar Precisão e Exatidão da técnica O problema da relação entre massa molar e volume hidrodinâmico

3 Cromatografia Separar é Reduzir a entropia Métodos cromatográficos, de uma forma geral, - permitem a separação, quantificação e identificação de espécies químicas; - separam os componentes de uma mistura pela distribuição destes componentes em duas fases que se encontram em contato, uma fase móvel e outra fase estacionária; - durante a passagem da fase móvel pela estacionária, os componentes da mistura são seletivamente retidos pela fase estacionária, o que resulta em migrações diferenciais destes componentes. - a retenção seletiva pode operar por mecanismos entrópicos ou entálpicos.

4 Cromatografia Permeação em Gel ou Exclusão por Tamanho A Cromatografia de Permeação em Gel é uma técnica na qual existe um suporte fixo, um gel, que NÃO É a fase estacionária, mas que a contém. Além disto, espera-se que não haja interações entre os componentes da amostra a separar e o suporte fixo, de modo que todo o processo cromatográfico deve se dar apenas devido ao tamanho dos componentes da mistura. Este aspecto desta técnica cromatográfica justifica seu outro nome: Cromatografia de Exclusão por Tamanho

5 Cromatografia de Exclusão por Tamanho SEC Também conhecida por GPC, cromatografia de permeação em gel, ou GFC, cromatografia de filtração em gel, ou cromatografia em peneira molecular de difusão restrita. Permite obter a distribuição de Massa Molar, bem como os valores relativos de Massa Molar Numérica Média (Mn) e de Massa Molar Ponderal Média (Mw).

6 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho Esta imagem pode ter Direitos Autorais

7 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso

8 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho processamento de dados seringa garrafa contendo a fase móvel 'loop' detector coluna bomba isocrática ou de gradiente Estas imagens podem ter Direitos Autorais injetor descarte ou reuso

9 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Como é a Coluna de Separação? A coluna consiste de um tubo metálico recheado de pequenas esferas de polímero reticulado. Obs.: esta foto apenas representa os poros das partículas que recheiam a coluna, sendo, de fato, imensamente maiores do que os poros reais. Estas imagens podem ter Direitos Autorais

10 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Ação da Coluna de Separação Esta imagem pode ter Direitos Autorais

11 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Qual o princípio desta cromatografia? Estas imagens podem ter Direitos Autorais

12 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Descrições do Princípio de Funcionamento Um dos modos de descrever como a separação ocorre: as moléculas pequenas o bastante para entrarem nos poros da resina, ao longo da coluna, são momentaneamente removidas do fluxo principal de solvente (exclusão), necessitando de mais tempo para atravessar a coluna. Outro modo de descrever este processo é: as moléculas que são pequenas o bastante para entrar nos poros da coluna têm acesso a um volume maior da mesma.

13 Como Calcular Massa Molar? Massa Molar e sua Distribuição n=0 : Mn Concentração (g/ml) Mx = i i Ci Mi Ci M i n n 1 n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) n=1 : Mw

14 Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (ml)

15 Como Calcular Massa Molar? tensão elétrica (volts) Como é a curva obtida no experimento de GPC? tempo (minutos) ou volume (ml) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração, para cada fração eluída através da coluna.

16 Como Calcular Massa Molar? Como é a curva obtida no experimento de GPC? n=0 : Mn n Concentração (g/ml) tensão elétrica (volts) Mx = tempo (minutos) ou volume (ml) Precisamos obter da curva: valores relativos a Massa Molar e valores relativos a concentração, para cada fração eluída através da coluna. Ci M i i C i M i n 1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) volume de eluição massa molar (curva de calibração) concentração em cada volume de eluição (detectores de concentração)

17 Curva de Calibração Injeção de padrões M1, V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar. M2, V2 As diferentes amostras de padrão, cada qual com um diferente valor de massa molar, possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3, V3 volume de eluição em ml M4, V4 volume de eluição em ml Assim, quanto maior a massa molar, maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna. Os padrões de M.M. conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento, coluna, solvente e temperatura.

18 Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1, V1 Com os pares de pontos log(mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta, cujos parâmetros são a e b. Isto é, y = a + b.x log M i =a b.v e volume de eluição em ml log (Mw) M2, V2 volume de eluição em ml M3, V3 volume de eluição em ml M4, V4 volume de eluição em ml volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 a b.v e

19 Curva de Calibração Tempo de Eluição versus Volume de Eluição Se medimos, de fato, o TEMPO de eluição, por quê fazemos as contas usando o VOLUME de eluição? Porque a curva passa a ser independente da vazão empregada! Vei vazão. t ei

20 Cálculo de Massa Molar Concentração (g/ml) O que falta? Falta obter Ci Volume de retenção massa molar OK!

21 Como Calcular Massa Molar? Sensores de Concentração Os dois sensores principais utilizados para a medida da concentração das alíquotas fracionadas da amostra principal são: Detector de Índice de Refração (RI) Detecta a diferença de índice de refração entre a solução e o solvente empregado. Esta diferença é função da concentração da amostra. Detector de UltraVioleta (UV) (Photodiode Array Detector - Matriz de Foto-diodos) Detecta a quantidade de luz ultra violeta absorvida em um ou vários comprimentos de onda. Sendo conhecida a absorvância e os parâmetros da célula, esta quantidade é proporcional a concentração da amostra.

22 Sensores de Concentração Matriz de Foto-diodos alíquota proveniente da coluna Célula de fluxo Grade de difração Fonte de UV O sinal em cada foto-diodo é função da absorção da amostra na faixa de Matriz de Foto-diodos comprimentos de onda detectados por este foto-diodo específico. PC ADC

23 Sensores de Concentração Refratômetro Diferencial A deflexão do feixe de luz é função da diferença entre o índice de refração da amostra e o índice de refração do solvente empregado. Detectores alíquota proveniente da coluna Fonte de luz de comprimento de onda conhecido (branca, em alguns modelos)

24 Concentração é necessária ou um valor proporcional a concentração Estes sensores de concentração geram um sinal elétrico, em Volts, cujo valor é proporcional à concentração da alíquota: Sinal (V) C ou seja: C = k.sinal (V) C i =.si Assim, as equações para cálculo de massa molar média podem ser descritas em termos do sinal elétrico gerado, sem a necessidade de se calibrar os sensores de concentração para obter os valores das constantes. Mx n C M i i Ci M n 1 i n n. s M. s M i i i i Mx n 1 n 1. s M. s M i i i i n s M i i n 1 s M i i

25 Medida em SEC Resumo 1) As colunas separam a amostra de acordo com os volumes hidrodinâmicos das moléculas presentes; 2) A amostra separada passa pelo detector de concentração, o qual gera um sinal de tensão proporcional a concentração da amostra; 3) Da curva obtida de sinal proporcional à concentração versus volume de eluição converte-se os valores de volume de eluição em valores de Massa Molar, utilizando a curva de calibração previamente obtida; 4) Com a nova curva de sinal proporcional à concentração versus massa molar são calculados os valores de Massa Molar Média Numérica, Massa Molar Média Ponderal e dispersidade de acordo com as equações mostradas.

26 Cálculo dos Valores de Massa Molar Preparação da curva obtida Tipicamente, utiliza-se uma reta para fazer este ajuste.

27 Agora a curva está pronta para ser analisada, gerando os valores de Massa Molar. massa molar

28 Cálculo da Massa Molar e Polidispersão Concentração (g/ml) Mx = C i M in i C i M i n 1 i n=1 : Mw n=2 : Mz n=3 : Mz+1 PD = Mw/Mn Massa Molar (g/mol) n=0 : Mn

29 Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC - primeira parte INI: DEFDBL A-Z CLS rem A curva de calibracao INPUT "Entre com a inclinacao (b) ";R8 PRINT INPUT "Entre com a intersecao (a) ";R9 PRINT INPUT "Entre com intervalo de volume ";nit rem nit eh constante para simplificar o trabalho do usuario - os valores de volume de eluicao nao precisariam ser igualmente espacados PRINT PRINT VE: rem os valores da rotina estatistica sao calculados durante a leitura dos dados a partir do teclado Q=0:R3=0#:R5=0#:R6=0#:R7=0#:N=0 PRINT"Press. <ENTER>":LINE INPUT S$:CLS INPUT "Entre com o volume de eluicao Ve para o primeiro valor de intensidade Hi <-1 p/ novas incl e interc> ", R7 IF R7=-1 then GOTO INI PRINT : PRINT PRINT "Entre com os valores de Hi, seguidos de <RETURN>.<-1 indica fim dos dados>" rem os valores de hi ja tiveram a linha de base subtraida PRINT

30 Cálculo Automatizado Exemplo em BASIC - segunda parte entr: N = N + 1: INPUT X: PRINT " "; CHR$(30); "<---"; N; CHR$(167);" Hi" rem truquezinho grafico meio ultrapassado, este do chr$30 - Só funciona em DOS IF X = -1 THEN goto RES 'rotina estatistica Q = R7 * R8 + R9 R3 = R3 + X R5 = R5 + X * EXP(Q) R6 = R6 + X / EXP(Q) R7 = R7 + nit goto entr RES: PRINT : PRINT "Mw = "; INT(R5 / R3) PRINT "Mn = "; INT(R3 / R6) PRINT "Mw/Mn = "; INT((R5 / R3) / (R3 / R6) * 100) / 100 goto VE

31 Programa desenvolvido no IMA para cálculo de M.M. por GPC

32 Massas Molares Médias obtidas por GPC São valores relativos e não absolutos! Os valores de massa molar obtidos para uma dada distribuição são calculados a partir de uma curva de calibração, obtida para amostras padrão. Assim, os valores de massa molar obtidos são ditos serem valores relativos.

33 Precisão e Exatidão na técnica de GPC.. precisão: (repetitividade) melhor do que 5% exatidão ou acurácia: (concordância com o valor verdadeiro) em torno de 10% Esta imagem pode ter Direitos Autorais

34 O problema da calibração Relação entre massa molar e volume hidrodinâmico M1, V1 volume de eluição em ml Uma amostra com a mesma massa do padrão 2, porém de um polímero mais rígido, será mais aberta, isto é, terá um volume hidrodinâmico maior e sairá mais cedo da coluna. De acordo com esta curva de calibração, será como se a amostra tivesse uma massa molar maior do que sua massa real. M2, V2 ln (Mw) volume de eluição em ml M3, V3 volume de eluição em ml M4, V4 volume de eluição em ml volume de eluição em ml

35 MASSA MOLAR E VOLUME HIDRODINÂMICO Massa Molar versus Volume Hidrodinâmico Fatores que afetam o Volume Hidrodinâmico Conformação e Configuração (Rigidez, Ramificações etc.)

36 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar Em SEC a separação se dá por Volume Hidrodinâmico De fato, a técnica de SEC não separa as moléculas de acordo com suas massas molares, mas de acordo com o volume hidrodinâmico que apresentam. Assim, a curva de calibração obtida só é válida para amostras que possuam a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico que aquela apresentada pelos padrões empregados.

37 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar O que é Volume Hidrodinâmico? O Volume Hidrodinâmico indica quão grande é o novelo em solução. O volume hidrodinâmico não informa sobre a distribuição de massa no interior do novelo. Para uma dada amostra, quanto maior for sua massa molar, maior será seu volume hidrodinâmico.

38 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar Fatores que afetam esta relação Os fatores que afetam a relação entre Vh e M.M. são: Configuração da cadeia polimérica Conformação da cadeia polimérica Interação entre o polímero e o solvente Temperatura

39 Volume Hidrodinâmico e Massa Molar exemplos Mesmo valor de massa molar, mas diferentes valores de volume hidrodinâmico cadeia mais aberta, maior Vh Mesmo valor de volume hidrodinâmico, mas massas molares distintas: cadeia mais fechada, menor Vh

40 Massa Molar Relativa......quer dizer mais do que se imagina! Quando se usa um padrão de massa molar que não possui a mesma relação entre Vh e MM que o polímero-problema, então a massa molar obtida será relativa também ao tipo de padrão usado: relativa por ter sido calculada com o uso de padrões de massa molar e relativa ao tipo de padrão usado!

41 O que realmente significa quando se diz que a amostra apresenta certo valor de Massa Molar? Quando se diz: A massa do polímero-problema foi calculada usando padrões de PS, obtendo-se o valor de g/mol. ou: A massa do polímero-problema foi calculada em g/mol em relação a padrões de PS....na verdade o que se quer transmitir é: O polímero-problema apresenta o mesmo volume hidrodinâmico que PS de massa molar igual a g/mol.

42 Curvas de Calibração Calibração com Padrões de Distribuição Estreita de Massa Molar Calibração com Amostras de Distribuição Larga de Massa Molar Calibração Universal Quando cada tipo de calibração é mais eficaz Técnicas Absolutas em GPC

43 Calibração com Padrões de Distribuição Estreita

44 Calibração com Padrões de Distribuição Estreita Injeção de padrões M1, V1 Padrões para GPC são amostras poliméricas com distribuição estreita e conhecida de massa molar. M2, V2 As diferentes amostras de padrão, cada qual com um diferente valor de massa molar, possuem a mesma relação entre massa molar e volume hidrodinâmico. volume de eluição em ml volume de eluição em ml M3, V3 volume de eluição em ml M4, V4 volume de eluição em ml Assim, quanto maior a massa molar, maior o volume hidrodinâmico e mais cedo esta amostra deixa a coluna. Os padrões de M.M. conhecida são injetados para que se obtenha o volume de eluição de cada um deles neste equipamento, coluna, solvente e temperatura.

45 Curva de Calibração Básica: volume de eluição versus massa M1, V1 Com os pares de pontos log(mi) e Vi traça-se um gráfico e calcula-se a melhor reta, cujos parâmetros são a e b. Isto é, y = a + b.x log M i =a b.v e volume de eluição em ml log (Mw) M2, V2 volume de eluição em ml M3, V3 volume de eluição em ml M4, V4 volume de eluição em ml volume de eluição em ml A massa molar de qualquer amostra que tenha a mesma relação entre massa e volume hidrodinâmico que os padrões e que deixe a coluna após Ve é dada por: M i =10 a b.v e

46 Curva de Calibração Relação entre Massa Molar e Volume de Eluição Ajuste Polinomial log (Mi) linear log M i =a b.v e quadrático (2a ordem) 2 log M i =a b.v e c.v e Volume de Eluição cúbico (3a ordem) 2 3 log M i =a b.v e c.v e d.v e Alguns fabricantes de colunas sugerem que se use polinomiais de 5 a ordem!!! Isto por quê a distribuição de volume dos poros no recheio da coluna não é linear!

47 Curva de Calibração Limites de Exclusão Ve V0 KVP Ve = volume de eluição V0 = volume intersticial Vp = volume dos poros K = coeficiente de distribuição do soluto O pico em (A) indica algum tipo de repulsão entre as moléculas do polímero (exclusão iônica). V0 Esta imagem pode ter Direitos Autorais VP V0+VP -O pico em (C) indica adsorção do polímero pelo material da coluna. -O modo como este polímero elui poderia ser representado pela curva indicada em (B) (interações hidrofóbicas ou hidrofílicas).

48 Curva de Calibração Alguns Exemplos Estas imagens podem ter Direitos Autorais

49 Curva de Calibração Atenção aos limites da curva! Não extrapolar! Sempre observar com atenção os picos em torno de Vo e de Vo+Vp! Uma amostra com moléculas que ultrapassem os limites de eluição da coluna poderá se apresentar da seguinte forma: Parece bimodal, não? Mas não é! Vejam: Todas as moléculas maiores do que o limite de exclusão sairão juntas da coluna, isto é, serão acumuladas no volume de eluição V o, parecendo constituir um pico. O mesmo tipo de problema pode ocorrer com moléculas menores do que o limite da coluna, as quais sairão em torno de Vo+Vp.

50 Curva de Calibração Padrões Comuns Padrões para GPC orgânico: poli(metaacrilato de metila) poli(isoprenos) polibutadienos poli(thf) Padrões para GPC aquoso: poli(etileno glicol) poli(óxido de etileno) pululanas Polidispersão usual: < 1,1

51 Calibração com Amostras de Distribuição Larga

52 Calibração com Amostras de Distribuição Larga Injeção de padrões Nesta técnica, para se realizar a análise de uma dada amostra-problema, injeta-se na coluna um padrão de distribuição larga e de massa molar conhecida. Este padrão pode ser comercial ou, se possível, do mesmo polímero sendo analisado. A curva de distribuição é obtida para este padrão, na mesma coluna e condições na qual se analisará a amostra-problema. De posse desta curva de distribuição e dos valores conhecidos de M w e de Mn para o padrão, calcula-se por um método iterativo a curva de calibração que será empregada para a análise das amostras-problema. É conveniente empregar pelo menos dois padrões ao usar esta técnica. Os pontos da curva de calibração correspondem a M n e a Mw de cada um dos padrões empregados.

53 Calibração Universal

54 Calibração Universal em duas formas diferentes Existem duas formas de realizar a Calibração Universal: A primeira delas é a calibração universal clássica, para a qual se utiliza um viscosímetro em linha com o sistema de GPC. Em um mesmo volume de eluição, as amostras problema e padrão apresentarão um mesmo volume hidrodinâmico e, portanto, um mesmo valor para o produto [ ].M. Uma vez dispondo deste produto para o padrão, basta medir a [ ] da amostra problema em cada alíquota e calcular seu valor de M. Caso o equipamento não disponha de um viscosímetro em linha, pode ser usada a segunda forma de construção da calibração universal. Esta forma combina os princípios da calibração universal com a equação de Mark-Houwink-Sakurada. Neste caso, obtém-se M da amostra-problema em relação a uma curva construída com padrões de distribuição estreita. Este valor de M é, então, corrigido, usando-se para tal os valores de K e de a da amostra problema e do padrão.

55 Calibração Universal Para sistemas com viscosímetro em linha - Polímeros com o mesmo volume hidrodinâmico (VH) eluirão no mesmo volume de eluição; - A interação do polímero com o solvente irá se refletir no valor de viscosidade intrínseca, [ ]; - Segundo Einstein VH. M V Assim, [ ]1.M1 = [ ]2.M2 - Medindo o valor de [ ] para padrões de massa molar conhecida, e verificando seus volumes de eluição, pode-se traçar a curva log([ ].M) versus volume de eluição a qual consistirá na curva de calibração para este polímero. - Mede-se Ve para cada alíquota da amostra-problema e obtém-se da curva de calibração seu valor de [ ].M. Divide-se este valor por [ ] medido no viscosímetro para esta alíquota e obtém-se M da alíquota. - As curvas de calibração para uma grande variedade de polímeros orgânicos são sobreponíveis, por isto o nome Calibração Universal.

56 Calibração Universal log([ ].M) curvas para vários polímeros em uma mesma coluna volume de eluição Esta imagem pode ter Direitos Autorais

57 Calibração Universal Para sistemas sem viscosímetro em linha Do princípio de calibração universal: [ 1 ]. M 1=[ 2 ]. M 2 Substitui-se [ ] pelo valor da equação de Mark-Houwink-Sakurada: [ ]=K.M a Desta forma se obtém: Isolando M1 nesta equação: 1 a1 K1. M 1 1 a 2 =K 2. M a1 K M 1i = K1.M 1 a 2 1 a 1 2i M2 é obtido para a amostra-problema a partir do Ve e de uma curva de calibração com padrões de distribuição estreita. Se forem conhecidos 'K' e 'a' para as amostras padrão e problema, obtém-se M1, o valor corrigido de massa.

58 Curva de Calibração Universal e a equação de Mark-Houwink-Sakurada log([ ].M) Curva de Calibração Universal log([ ].M) versus Ve volume de eluição log([ ]) Mark-Houwink log k Estas imagens podem ter Direitos Autorais log [ ] versus log M [ ] = KMa a log (M) a é a inclinação e log(k) é a interseção da curva mostrada

59 Técnicas Absolutas em GPC Descrição sucinta Espalhamento de Luz Estático SLS Osmometria de Membrana Estas imagens podem ter Direitos Autorais Mi RTci i

60 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho Estas imagens podem ter Direitos Autorais

61 Cromatografia de Exclusão por Tamanho Esquema Básico do Aparelho

62 As Colunas Recheios Definição de termos Escolha das colunas Eficiência, seletividade e resolução Contribuições para o alargamento dos picos Condições ótimas de análise Contaminação, entupimento, controle de pressão Proteção das colunas

63 Colunas de GPC Recheios Características desejadas: Inércia química, estabilidade nas condições desejadas de ph e temperatura, reduzida interação com a amostra etc. Recheios comuns de colunas para água: Géis de dextrana (ex.: Sephadex da Pharmacia) Géis de poliacrilamida (ex.: Bio-Gel da Bio-Rad) Glicose-Divinilbenzeno Géis de ágar, agarose, Sepharose etc. (para GPC em baixa pressão) Recheios comuns de colunas para solventes orgânicos: Divinilbenzeno Divinilbenzeno sulfonado Poliestireno-Divinil benzeno Poli(meta acrilato de metila) Os recheios podem ser melhor escolhidos se for conhecida a aplicação específica que se deseja para o equipamento.

64 Curva de Calibração Alguns Exemplos Estas imagens podem ter Direitos Autorais

65 Escolha da Coluna de Separação Estas imagens podem ter Direitos Autorais

66 Escolha da Coluna de Separação de acordo com sua Curva de Calibração Neste exemplo, a coluna 2 separa melhor as amostras A, B e C. Deseja-se que pequenas variações de VH nas amostras levem a grandes variações no volume de eluição de seus picos. Assim, deve-se escolher sempre as colunas de separação cuja curva de calibração apresente a MENOR inclinação na faixa de massa molar das amostras de interesse. Esta imagem pode ter Direitos Autorais

67 Escolha da Coluna de Separação Esta imagem pode ter Direitos Autorais

68 Escolha da Coluna de Separação observar as sugestões dos fabricantes Estas imagens podem ter Direitos Autorais

69 Qualidade da Separação - RESOLUÇÃO O que é? do que depende? Alta resolução significa boa seletividade (grande mudança em Ve para pequenas mudanças em R H) e grande eficiência (pequeno alargamento de bandas - pequeno W). Esta imagem pode ter Direitos Autorais

70 Seletividade O que é? Seletividade é a habilidade de separar os picos entre si. Em GPC uma boa seletividade significa que a coluna é capaz de levar a uma grande mudança no volume de eluição para pequenas mudanças no raio hidrodinâmico das amostras. baixa seletividade grande seletividade

71 Seletividade Como medir? A seletividade pode ser medida pela separação relativa entre os picos de interesse: t R1 t 0 t R 2 t0 A seletividade pode ser melhorada alterando-se o coeficiente de distribuição. Para uma dada coluna, isto se consegue através de mudanças no solvente. Isto justifica o uso de bombas-gradiente. Esta imagem pode ter Direitos Autorais

72 Eficiência O que é? Eficiência está relacionada com a faixa de valores de volume de eluição que correspondem a um mesmo valor de volume hidrodinâmico, isto é, eficiência está relacionada ao alargamento dos picos. Grande eficiência significa que os picos são estreitos. Uma medida de eficiência é o número de pratos teóricos de uma dada coluna, que relaciona a largura do pico com o tempo que a amostra ficou retida na coluna. alta eficiência baixa eficiência A eficiência pode ser controlada alterando-se a vazão da fase móvel e evitando irregularidades na mesma.

73 Verificando a Eficiência Número de Pratos Teóricos 2 t R1 N =5,54. w 1 /2 Quanto maior o comprimento da coluna, maior é o número de pratos teóricos, mas maior será a pressão. Altura Equivalente a um prato teórico (HETP) HETP = comprimento da coluna / N Esta imagem pode ter Direitos Autorais Para indicar a eficiência em uma dada coluna, de forma independente de seu comprimento, indica-se a altura equivalente de um prato teórico, HETP.

74 Eficiência de Separação Alargamento de Bandas Fora da Coluna Todos os tubos, células de fluxo e conectores pelos quais as frações eluídas passarão contribuem para o alargamento das bandas! Para reduzir este efeito de alargamento: * usar tubos com diâmetro interno reduzido; * usar conectores sem volume morto; * usar células dos detectores que não diluam ou misturem zonas separadas; * as frações coletadas devem ser de volume reduzido, para preservar a separação obtida.

75 Eficiência, Seletividade e Resolução Relação entre os termos Resolução OK? eficiência boa eficiência ruim OK! OK! OK! NÃO! seletividade boa seletividade ruim

76 Alargamento da Curva Difusão Difusão ao longo do comprimento da coluna. Estas imagens podem ter Direitos Autorais

77 Alargamento da Curva em função da Vazão Transferência de massa para dentro e para fora dos poros do recheio. Estas imagens podem ter Direitos Autorais

78 Alargamento da Curva Os Efeitos Principais Estas imagens podem ter Direitos Autorais

79 Alargamento da Curva Efeitos Combinados - Condições ótimas de análise Estas imagens podem ter Direitos Autorais

80 Alargamento da Curva Efeitos Combinados - em função do tamanho molecular Esta imagem pode ter Direitos Autorais

81 Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC? Para a seleção de uma coluna de GPC, é necessário conhecer o tipo de polímero que será analisado. Serão análises de rotina (sempre os mesmos polímeros), como em controle de qualidade? ou Serão análises variadas, como em um centro de pesquisas? Quanto mais informações, melhor, porém as informações básicas são:

82 Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC? Qual é o polímero? Em quais solventes é solúvel? Em quais condições ocorre esta solubilização? (ph, concentração salina, temperatura, presença de etanol ou DMSO etc.) Qual é a faixa de massa molar esperada para estas análises? Existem informações sobre quais colunas, solventes e temperaturas outros laboratórios utilizam para realizar estas análises? (ou sugestões dos próprios fabricantes das colunas?) A partir destas informações, os passos para a escolha da coluna são:

83 Como escolher uma coluna (ou conjunto de colunas) para GPC? * Procurar colunas que operem com a 'classe' de solventes necessários para as análises de interesse: solventes orgânicos ou aquosos. * Dentre estas colunas, procurar por aquelas que suportem as condições de análise (ph, temperatura, concentração salina, presença de outros solventes). * Do subconjunto já selecionado, rejeitar aquelas colunas cujo recheio possa interagir com a amostra-problema. * Entre as colunas sobrantes, selecionar aquelas que apresentem a melhor separação das amostras-problema na faixa de valores de massa molar de interesse, isto é, colunas cuja curva de calibração nominal cubra toda a faixa desejada, apresentado uma inclinação o mais próxima possível de 45 graus. * Dentre estas, selecionar as colunas com o maior número de pratos teóricos, isto é, com a melhor resolução e eficiência. * Comparar a lista de colunas selecionadas com aquelas indicadas na literatura. * Verificar preços; prazos de entrega; necessidade e disponibilidade de pré-colunas etc.

84 É importante notar que algumas das figuras ou tabelas utilizadas neste material podem ter restrições para uso não acadêmico, por questões de copyright, de decisão de seus proprietários, sendo usadas aqui de acordo com as condições de "fair use". O material, figuras e tabelas de minha autoria podem ser usados para finalidades didáticas, usando a seguinte forma de citação: Ricardo Cunha Michel; Métodos Físicos Aplicados a Polímeros (MMP-712) ; Anotações de aula; Instituto de Macromoléculas Professora Eloisa Mano, IMA/UFRJ, Rio de Janeiro, 2015.

85 FIM