QUEILA ARAÚJO DE ÁVILA MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA TRISTEZA PARASITÁRIA BOVINA

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1 QUEILA ARAÚJO DE ÁVILA MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA TRISTEZA PARASITÁRIA BOVINA CAMPO GRANDE-MS 2008

2 QUEILA ARAÚJO DE ÁVILA MÉTODOS DIAGNÓSTICOS PARA TRISTEZA PARASITÁRIA BOVINA Trabalho apresentado para o cumprimento de atividades referentes ao curso de Especialização Latu sensu em Vigilância em Saúde e Defesa Sanitária Animal - UCB Prof. Orientador: Kamyla Ayumi Katayama CAMPO GRANDE-MS 2008

3 AGRADECIMENTO Agradeço a Deus, aos amigos e familiares, a minha orientadora, aos professores e as pessoas que colaboraram na elaboração do trabalho.

4 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Necropsia de bovino acometido de babesiose por B. bovis, apresentando fígado aumentado de volume, congesto e vesícula biliar distendida FIGURA 2 Necropsia de bovino acometido por anaplasmose, apresentando icterícia... 09

5 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Números médios de B. microplus em animais da raça Nelore, Ibagé e meio sangue Fleckvieh, Chianina e Charolês x Nelore sob condições extensivas de pastagem no Brasil Central TABELA 2 Sinais clínicos mais comuns da TPB de acordo com o agente etiológico TABELA 3 Premunição associada ao uso de imidocarb, para regiões com baixa infestação por carrapatos TABELA 4 Enzimas e substratos utilizados nos ensaios de ELIZA, ph necessário e cor decorrente da ação da enzima ao substrato... 20

6 SUMÁRIO AGRADECIMENTO... iii LISTA DE FIGURAS... iv LISTA DE TABELAS... v INTRODUÇÃO ASPECTOS DA SANIDADE ANIMAL NO SETOR DA PRODUÇÃO NACIONAL HEMOPARASITOSES TRISTEZA PARASITÁRIA BOVINA Definição e Etiologia Modo de Transmissão Importância Epidemiologia Patogenia e Sinais Clínicos Diagnóstico Diagnóstico Clínico Diagnóstico Laboratorial Diagnóstico Anatomopatológico Diagnóstico Diferencial Controle do Carrapato CONTOLE DO CARRAPATO Controle do Carrapato Fora do Hospedeiro Controle do Carrapato Sobre o Hospedeiro PROFILAXIA DA TPB Premunição Vacinas Vacinas com cepas vivas atenuada congeladas e refrigeradas Vacina contra o carrapato Quimioprofilaxia da TPB TRATAMENO TÉCNICAS DE MENSURAÇÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA AOS AGENTES DA TPB IFI ELISA TCR CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 23

7 INTRODUÇÃO Este trabalho tem por finalidade apresentar as técnicas de diagnóstico e avaliação de perfil imunológico para a Tristeza Parasitária Bovina (TPB), tratamento e profilaxia e apresenta a relevância da utilização destas técnicas para diagnóstico da enfermidade, uma vez que acompanha a distribuição geográfica do carrapato bovino. Particularmente no Mato Grosso do Sul, os casos de TRB são mais freqüentes em bezerros recém nascidos ou com poucos meses de vida e cujos diagnósticos são passiveis de serem confundidos principalmente com a hemoglobinúria animal (Clostridium haemolyticum), Diarréia Viral Bovina (DVB) ou intoxicação por planta tóxica, fato que, em defesa sanitária animal traz claros impactos para os programas de defesa implantados, discredibilidade do sistema, além de sérios prejuízos econômicos com a terapêutica.

8 1. ASPECTOS DA SANIDADE ANIMAL NO SETOR DA PRODUÇÃO NACIONAL. Uma união sólida na cadeia produtiva, incluindo produtores pesquisadores, técnicos, médicos veterinários e o governador, é de fundamental importância para implementar com sucesso um plano de longo a médio prazo para a conquista do mercado internacional pela carne brasileira e seus produtos, uma vez que o potencial de produção é contundente. A pecuária é um dos sustentáculos primordiais da economia nacional, cuja tendência é competitividade e eficiência plena, um sistema de desenvolvimento sustentável, fundamentada no tripé melhoramento genético, alimentação e sanidade animal, item último sine qua nom para qualquer programa de produção apresentar viabilidade. Sabe-se as medidas profiláticas devem prevalecer às de ordem terapêuticas e que estas devem ser destacadamente de ponta, eficientes e economicamente viáveis, por isso procurou-se no experimento, testar os métodos profiláticos e diagnósticos mais viáveis para enfermidade estudada. O Brasil revelou recentemente (no episódio de febre aftosa em outubro de 2005) algumas fragilidades dos sistemas de vigilância em saúde animal, principalmente no que diz respeito a demora em confirmar diagnósticos. O mundo fica atento à sensibilidade do sistema de vigilância sanitária, ou seja, a rapidez de detecção de enfermidades é que dá transparência, biossegurança e confiabilidade ao sistema de defesa e vigilância sanitária. Há de se distinguir que existe a grande demanda de treinamento para técnicas diagnosticas especificas e rápidas, por isso a proposição deste trabalho. 2. HEMOPARASITOSES 2.1. Tristeza Parasitária Bovina Definição e etiologia Denomina-se tristeza parasitária bovina (TPB), o complexo de enfermidades causadas por agentes etiológicos distintos, porém com sinais clínicos e epidemiologia similares: babesiose e anaplasmose, transmitidas principalmente pelo carrapato B. microplus. Caracteriza-se por hipertemia, anemia, hemoglobinúria, icterícia, anorexia, hemaciação e alta mortalidade em bovinos sensíveis (LEMOS, 1998).

9 No Brasil a babesiose bovina é causada pelos protozoários Babesia bovis (KESSLER et al, 1998), cuja patogenia é a mais severa entre os dois agentes dessa espécie, e Babesia bigemina (SMITH & KILBORNE, 1893). E a anaplasmose tem como agente etiológico o Anaplasma marginale. Os parasitos do gênero Babesia spp. são protozoários intraeritrocitários transmitidos biologicamente por carrapatos de família Ixodidae e o A. marginale é uma rickettisia intraeritrocitária que possui uma variedade maior de vetores, envolvendo carrapatos das famílias Ixodidae, Argasidae, Díptera e hematófagos das famílias Culicidade, Muscidade e Tabanidae (KESSLER et al, 1998) Modo de transmissão Na babesiose por B. bovis e B. bigemina as fêmeas do carrapato fixadas na epiderme dos bovinos se ingurgitam de sangue, ingerindo com ele, certo número de parasitos intraglobulares. O ixodideo após completar o ciclo de vida parasitária, abandona o hospedeiro e inicia a ovoposição no solo das pastagens, transmitindo a sua descendência os parasitos babesídeos com os quais se infectou, e a reconhecida transmissão efetiva do B. bovis se dará portanto, pelas formas larvares de B. microplus originário de teleógenas infectadas que, após transmissão se tornam negativas, (MAHONE & MIRRE, 1979) e a B. bigemina tem um ciclo mais longo, sendo transmitida a partir do estágio de ninfa, até parte do estágio adulto (CALLOW & HOYTE, 1961). O período de incubação, da babesiose, é de 7 a 14 dias, podendo aumentar ou diminuir dependendo da taxa de inoculação e da sensibilidade do hospedeiro. Parte do ciclo das Babesias spp, inclusive a reprodução sexuada ocorre no carrapato vetor. A fêmea adulta se infecta nas últimas horas do ingurgitamento. No intestino do carrapato os parasitos se transformam em gametas que se fundem dando origem a merozoítos que invadem a hemolinfa e iniciam ciclos de fissão múltipla nos diversos órgãos da fêmea ingurgitada, inclusive ovário. Quando as larvas infectadas começam a se alimentar nos bovinos, a multiplicação continua nas células epiteliais das glândulas salivares, originando os esporozoítos que são inoculados pela saliva. Os esporozoítos invadem os eritrócitos, transformam-se em trofozoítos que por fissão binária dão origem a dois merozoítos que rompem a célula e invadem outras (KESSLER et al, 1998). O A. marginale, é uma rickettisia que faz multiplicação nas células do epitélio intestinal do carrapato e este pode infectar-se em qualquer estágio. A transmissão para o bovino ocorre de estágio para estágio e os machos, por sua maior longevidade e mobilidade, são considerados mais importantes na transmissão da anaplasmose. O modo de transmissão pelos insetos hematófogos, apesar de admitida por alguns autores, não tem seu mecanismo

10 bem esclarecido. O período de incubação é de 21 a 35 dias com a manifestação dos sinais clínicos (KESSLER et al, 1998) Importância A doença é de relevada importância uma vez que ocorre em praticamente todos os Estados da Federação e a ocorrência de surtos se deve à introdução de animais livres dos agentes em áreas endêmicas, do deslocamento de animais de uma região para outra, (SCHENK et al, 1993), bem como a redução e controle da população de carrapatos, seja por condições climáticas, procedimentos químicos, (MAHONEY,1997), ou de outras formas. O deslocamento de animais de uma região enzoótica para outra pode precipitar manifestações clínicas da doença devido a incapacidade destes resistentes, sob condições de estresse à exposição de cepas antigenicamente diferentes. Segundo WALL (1993), todos os bovinos são susceptíveis às infestações por carrapatos e a babesiose, embora os zebuínos apresentem uma maior resistência ao carrapato (tab. 1). Tabela 1 Números médicos de B. microplus em animais da raça Nelore, Ibagé e meio-sangue Fleckvieh, Chianina e Charolês x Nelore sob condições extensivas de pastagem no Brasil Central. Grupo genérico Numero de carrapatos/dia Limites mínimos Limites máximos Nelore 0(9x) 28 Fleckvieh x Nelore 1 76 Chianina x Nelore 1 89 Charolês x Nelore 0(1x) 58 Ibagé 0(1x) 624 Fonte: KESSLER et al, (1998). O carrapato B. microplus provoca processo espoliativo que interfere no ganho de peso durante a vida do animal, inocula toxinas na corrente circulatória, podendo intervir na síntese protéica e transmitir os agentes da tristeza parasitária bovina, (KESSLER et al, 1998). Desta forma, limita economicamente a produção pecuária com perdas relacionadas aos efeitos diretos e indiretos da parasitose. Os primeiros referem-se à mortalidade, morbidade, convalescença longa com baixas na produção (BLOOD, 1997), além da depreciação do couro. As perdas indiretas, aos custos de tratamento da parasitose e da enfermidade, e restrição ao trânsito de animais devido à quarentena. Principalmente na região Centro-Oeste vem ocorrendo freqüentes importações de animais provenientes de áreas livres de carrapatos e introdução de raças taurinas, através do

11 cruzamento industrial, tornando os animais mais sensíveis ao carrapato e as doenças por ele transmitidas. Diante destas circunstâncias, é recomendado conhecimento bio-ecológico, distribuição zoogeográfica dos carrapatos, valorização dos carrapaticidas, banhando estrategicamente com correta diluição do principio ativo e manejo dos banheiros (GOMES, 1998), alem de vacinar previamente os animais contra os agentes da tristeza parasitária bovina (KEESLER et al, 1992) Epidemiologia A ocorrência da doença está relacionada à presença do carrapato nas regiões de bovinocultura e distribuída praticamente por todos os Estados brasileiros. No Brasil há regiões classificadas de acordo com a presença ou não desse ixodideo em: áreas livres, áreas de instabilidade enzoótica e área estabilidade enzoótica. As áreas livres são aquelas onde não é possível o desenvolvimento do carrapato por condições ambientais, onde as temperaturas são muitas limitantes, como extremo sul do Rio Grande do Sul, da Argentina e áreas do Nordeste. Os bovinos criados nestas áreas são altamente susceptíveis à tristeza parasitária bovina quando transportados para áreas de estabilidade enzoótica, necessitando imunização ou proteção por agentes químicos (FARIAS, 1995). As áreas de instabilidade enzoótica são as que possuem uma estação fria bem definida, impedindo o desenvolvimento da fase livre de carrapato, limitando a população em uma ou duas gerações. Desta forma haverá alguns indivíduos jovens susceptíveis, isto é, quando bezerros nascem em um período onde não são expostos ao carrapato, tornando altamente suscetíveis a TPB. Os baixos níveis imunológicos não são capazes de proteger o rebanho frente aos agentes da tristeza, durante as estações mais quentes, ocasionando surtos de babesiose e anaplasmose (FARIAS, 1995). Nas áreas de instabilidade enzoótica, o carrapato existe durante o ano inteiro, ocorrendo de três a quatro gerações. Os animais criados nestas áreas recebem inócuo constante e adquirem altos títulos de anticorpos. Os casos clínicos geralmente ocorrem entre os 30 e 90 dias de idade, com elevada morbidade e baixa mortalidade (MADRUGA et al, 1985). Particularmente no Estado de MS, os casos de tristeza parasitária bovina são mais freqüentes em bezerros recém-nascidos ou com poucos meses de vida. A babesiose e a anaplasmose diagnosticada em animais jovens desde o nascimento até o desmame pode ser explicada pela redução dos níveis de anticorpos anti-b. bigemina e anti-b. bovis verificados entre o 30º e o 60º dias de vidas do bezerro (MADRUGA et al, 1984) igualmente para a

12 redução dos anticorpos anti-a. marginale se da em torno de 60 dias de vida (MADRUGA et al, 1985). Os casos clínicos registrados em bovinos adultos geralmente estão associados à entrada de animais na propriedade vindos de outros Estados (áreas livres, de instabilidade enzoótica ou portadores de cepas exóticas, pois nem sempre há proteção cruzada) ou por queda de resistência dos animais. A imunidade induzida por Babesia spp. e Anaplasma em bovinos é de origem humana e celular. Os níveis de anticorpos anti-babesia caem em media 4 a 5 meses após a falta de contato com o agente, enquanto que os anti-anaplasma permanecem por período mais longos, podendo ser detectados até 5 anos após a eliminação do agente (FARIAS, 1995) Patogenia e sinais clínicos Quando aos agentes, podemos caracterizar a tristeza parasitária bovina em duas fases distintas: a de babesiose e a de anaplasmose. A patogenia nos bovinos está ligada à espécie (B. bovis é mais patogênica que a B. bigemina), cepa, taxa de inoculação, idade, estresse e raça. Na babesiose, os primeiros sinais clínicos normalmente são observados entre o 8º e 16º dia após a infecção e se caracterizam por hipertermia, anemia, hemaciação, pêlos arrepiados e icterícia resultante da destruição dos eritrócitos pela saída do parasita após sua divisão, por alteração da membrana, fiando rígida e rompendo-se ao entrar nos capilares, fagocitose nos órgãos do sistema reticulo-endotelial e auto-eritrofagocitose (LEMOS, 1998). A B. bigemina provoca anemia hemolítica progressiva, levando vários dias para levar o animal à morte, em conseqüência, parte da hemoglobina ultrapassa o filtro renal já lesado pela anóxia e toxinas. A urina assume coloração avermelhada, de forma que a hemoglobinúria é característica da babesiose por B. bigemina (LEMOS, 1998). A B. bovis pode produzir curso agudo e superagudo. Na fase aguda os sinais clínicos são semelhantes ao provocados pela B. bigemina, com hemólise em massa. O curso rápido da doença deve, sobretudo ao choque hipotensivo resultante da ação dos catabólitos do parasita que atuam calecreínas plasmáticas responsáveis pela vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular que dependendo da intensidade pode levar a estase circulatória e choque. Fatores de coagulação também são ativados formando trombos no interior dos vasos. A hemoglobinúria é discreta quando presente e a queda de hematócrito se deve muito mais a alterações na dinâmica sangüínea do que a hemólise. Os eritrócitos se concentram nos capilares, sendo que os cerebrais, por sua sinuosidade ficam repletos de eritrócitos alterados pela infecção. Estes sofrem modificações antigênicas em sua superfície, além de perder elasticidade devido a peroxidação lipídica resultante do grande consumo metabólico de glucose pelo parasita (FARIAS, 1995). O acumulo desses eritrócitos, somado à obstrução dos vasos cerebrais por trombos provocam sintomatologia nervosa. Ocorre degeneração do endotélio vascular com extravasamento de líquido nos espaços perineurais e intersticiais. Este é o quadro conhecido como babesiose

13 cerebral e se caracteriza por agressividade, incoordenação motora com morte em 2 ou 3 dias (FARIAS, 1995). Na anaplasmose a destruição dos eritrócitos ocorre nos órgão do sistema retículo endotelial onde são fagocitadas. Há auto-eritofagocitose, o curso é mais rápido e os menos agudos se caracterizam por icterícia, pois a hemoglobina é reabsorvida e transformada em bilirrubina dando coloração amarela às mucosas, porem não há hemoglobinúria (FARIAS, 1995). Sinais mais A. marginale B. bovis B. bigemina Comuns Anemia Icterícia Urina pode estar normal. Ictercia Febre Urina Avermelhada na fase Urina cor coca-cola Depressão Anorexia Terminal Podem ocorrer sinais neurológicos Tabela 2 Sinais clínicos mais comuns da TPB de acordo com o agente etiológico. Obs. B. bovis pode apresentar manifestações nervosas características de incoordenação e agressividade Diagnóstico Diagnóstico clínico O diagnóstico clínico torna-se de suposição uma vez que os sinais clínicos podem ser confundidos com os de outras doenças. Ao proceder o exame clínico, nos casos de suspeita de tristeza parasitaria bovina, deve-se colher sangue com anticoagulante para determinação do volume global e preparar lâminas delgadas de sangue periférico para o exame direto. No caso de bovinos de outras regiões, é conveniente fazer a colheita de amostras de sangue sem anticoagulante para a

14 obtenção de soro e determinação da presença de anticorpos específicos. Em caso de suspeita de morte por babesiose, deverá ser feita necropsia preparando-se claps ou esfregaços de cérebro para diagnóstico laboratorial (KESSLER & SCHENK, 1998) Diagnóstico laboratorial Os exames laboratoriais fornecem a confirmação definitiva do diagnóstico clínico e identificação especifica do agente, fornecendo subsídios ao tratamento e orientação às medidas profiláticas, cuja eficiência esta intimamente ligada à identificação rápida e segura da etiologia (KESSLER & SCHENK, 1998). Os principais exames laboratoriais para o diagnótico de certeza são: exame parasitológico ou direto, hematócrito, e os sorológicos; fixação de complemento (FC), imunofluorescência indireta (IFI), teste de conglutinação rápida (TCR) e imunoadsorção enzimátia (ELIZA), (KESSLER & SCHENK, 1998) Diagnóstico anatomopatológico Realizado através dos achados de necropsia e histopatológicos, são variáveis de acordo com o agente etiológico. Quando o agente envolvido for a B. bovis, os principais achados de necropsia são mucosas e serosas acentuadamente pálidas, fígado e baços escuros, congestos e aumentados de volume (FIG. 2), vesícula biliar distendida e os linfonodos aumentados e escuros. Os rins podem estar aumentados e escuros e a urina avermelhada. O cérebro pode apresentar acentuada congestão da rede capilar e da substância cinzenta, que torna-se avermelhada, no caso da babesiose cerebral. Em determinadas ocasiões, a morte pode ocorrer em decorrência de coagulação intravascular disseminada (CID), observa-se nesses casos, hemorragias generalizadas (LEMOS, 1998). Quando for relacionada à B. bigemina será encontrado mucosas, serosas e carcaças anêmicas, podendo estar ictéricas; o fígado e baço estarão aumentados de volume e congestos, a vesícula biliar distendida, os linfonodos e rins aumentados e escuros, e a urina vermelho escura (LEMOS, 1998).

15 Em casos de anaplasmose a carcaça apresenta-se ictérica (FIG. 3), com o fígado e o baço aumentados de volume. Em casos superagudos, pode-se não observar icterícias, apenas severa anemia caracterizada por intensa palidez da carcaça. A urina não apresenta alteração de colocação (LEMOS, 1998). Histologicamente haverá congestão em diferentes órgãos e presença de pigmentos biliar no fígado. Na babesiose por B. bigemina ou B. bovis, nota-se a presença de material eosinofílico alaranjado na luz dos túbulos renais, bem como alterações degenerativas no epitélio tubular dos rins e no quadro de CID, formação de numerosos microtrombos nos capilares de diversos órgãos. Essas alterações não são específicas e são extremamente variáveis quando à intensidade. A confirmação pode ser realizada através de exame laboratorial tipo imprints de diferentes órgãos fixados em álcool metílico por 3-5 minutos e corados por Giemsa (LEMOS, 1998). FIGURA 1. Necropsia de bovino acometido de babesiose por B. bovis, apresentando fígado congesto, aumentado de volume e vesícula biliar distendida. FIGURA 2. Necropsia de bovino acometido de anaplasmose, apresentando icterícia Diagnóstico diferencial Principalmente pela identificação do agente, deve-se realizar o diagnóstico diferencial de leptospirose, intoxicação por Senna ocidentalis, hemoglobinúria bacilar,

16 intoxicação por cobre, Pteridium aquilinum, trombocitopenia aguda, severa intoxicação por Bachiaria sp., e diatesis hemorrágica associada ao vírus da diarréia viral bovina (KESSLER et al, 1998) Controle do carrapato 3.1. Controle do carrapato fora do hospedeiro As medidas de controle adotadas estão relacionadas diretamente à classificação epizootiológica das áreas de ocorrência e ao objetivo da atividade pecuária. Uma vez que a erradicação nem sempre é a melhor opção, considerando-se o momento e o país, esse controle está baseado no conhecimento taxonômico, bioecológico e sanitário do transmissor nos diferentes climas e regiões (KESSLER et al, 1998). Pode ser realizado por: cruzamentos de raças bovinas mais resistentes aos carrapatos, desenvolvimento de pastagens com poder antixenose e antibiose, introdução de novos fármacos que deixe menos resíduos nos produtos de origem animal, fiscalização do governo visando o registro, qualidade dos pesticidas, medicamentos veterinários, introdução, utilização de vacinas, entre outras (GOMES, 1998). Uma associação de métodos alternativos de controle ao ixodídeo permite a redução do uso de produtos químicos e faz-se necessário, tanto em área onde se verificam grandes infestações durante o ano todo, quanto em área com baixa infestação, mesmo que em algumas épocas do ano (GONZALES, 1975). Em relação ao ciclo do ixodídeo fora do hospedeiro, bons resultados têm sido obtidos com o descanso das pastagens associados ao controle por fungos ou com gramíneas (GOMES, 1998) Controle do carrapato sobre o hospedeiro Pode ser realizado por meio de ferormônios, substâncias tóxicas, machos e fêmeas estéreis, mecanismos imunológicos e agentes químicos (GOMES, 1998). A escolha e o uso correto da carrapaticidas, assim como a mudança de produto quando necessário, são fatores preponderantes para a obtenção dos resultados esperados. Os três mais recentes grupos químicos de produtos carrapaticidas disponíveis no mercado são as formamidina, os piretróides, as avermectinas, além dos organofosforatos do grupo mais antigo (FARIAS, 1995).

17 A aplicação dos carrapaticidas se faz por meio de pulverização, imersão, dorsal e outras formas. As pulverizações manuais são mais indicadas para as propriedades com poucos animais, enquanto que os banheiros de imersão e aspersão são mais indicados para aquelas com grande número de animais. Já a aplicação utilizando processo mecânico ou dorsal irá depender do número de animais, do grau de tecnologia da propriedade, assim como avaliação do custo/ benefício. Em qualquer método empregado é importante o período residual do produto para que as aplicações sejam com intervalos de 14 ou 21 dias. O número de banhos com estes intervalos irá depender da redução almejada e da densidade populacional dos carrapatos (GOMES, 1998). A correta aplicação dos carrapaticidas quanto à concentração, dose, época, intervalo entre outras recomendações técnicas é uma forma eficiente de retardar por tempo considerável o surgimento de populações resistentes aos princípios ativos. A resistência pode ser detectada através de testes se sensibilidade dos carrapatos aos carrapaticidas, denominado de biocarrapaticidograma (GOMES, 1998). 4. Profilaxia da TPB 4.1. Premunição Premunição ou imunidade concomitante é a forma mais antiga de imunização contra os agentes da tristeza parasitária bovina. Consiste na inoculação de sangue de animais reconhecidamente portadores da enfermidade, em animais suscetíveis, estimulando uma resposta imunitária (KESSLER et al, 1998). Coleta-se sangue desfibrinado ou com anticoagulante, de bovinos adultos, portadores crônicos, geralmente mantidos à campo e inocula-se, por via subcutânea, quantidades que variam de 2 a 5 ml, nos animais que se deseja imunizar. Os animais devem ser examinados diariamente, durante os períodos de reação, os animais que foram medicados especificamente deverão ser reinoculados para reforço da imunidade (KESSLER et al, 1998). Os pontos de estrangulamento da técnica são os seguintes: ter um animal doador que deve ser negativo para as doenças transmissíveis e clinicamente sadio para suportar a condição de doador e o não conhecimento do inóculo Vacinas No esquema de vacinação, é inoculado no bovino, sangue com títulos conhecidos de parasitas que tiveram sua patogenicidade muito reduzida ou eliminada por atenuações. São

18 organismos vivos, capazes de se multiplicar e induzir o bovino a uma resposta imunológica, sem no entanto, provocarem a enfermidade (KESSLER et al, 1998) Vacinas com cepas vivas atenuadas congeladas e refrigeradas A B. bovis é atenuada após passagens rápidas, isto á, o sangue com os parasitas é inoculado em bezerros sensíveis, esplenectomizados, que entram em alta parasitemia cerca de 7 dias após a inoculação. O sangue desse bovino é inoculado em outro animal, nas mesmas condições e assim sucessivamente (SCHENK, 1999). A B. bigemina é atenuada através de passagens lentas. O sangue com o parasita é inoculado em um bovino suscetível, porem intacto. Esse animal torna-se portador e, 3 meses após é esplenectomizado, onde se obtem a parasitemia e seu sangue é inoculado em outro bovino intacto para mais uma passagem lenta. O número de passagens exigidas para a atenuação varia de acordo com a espécie e a cepa. O grau de atenção é conhecido através de inoculação em animais susceptíveis (SCHENK, 1999). A atenção de A. centrale exige passagem sucessivas em ovinos esplenectomizados e é utilizado para imunização contra a anaplasmose (SCHENK, 1999). As vacinas contra a babesiose constituem-se de cepas de B. bovis e B. bigemina atenuadas a partir de isolados puros, por passagens sucessivas em bezerros, clinica e laboratorialmente sadios, mantidos em área de isolamento. Com base nos resultados experimentais, pode-se concluir que as cepas de B. bovis e B. bigemina desenvolvidos pela Embrapa Gado de Corte, apresentam-se pouco virulentas e capazes de estimular uma imunidade protetora superior a 97%, após uma única vacinação, em bovinos suscetíveis. Estas vacinas foram registradas como Embravac B. bovis e Embravac B. bigemina. Atualmente a vacina está sendo comercializada pelo laboratório Hemopar com o nome comercial de Embravac Hemopar (KESSLER et al, 1998). A necessidade da vacina ser conservada em nitrogênio líquido, em parte, é compensada pela estabilidade garantida ao longo do tempo (três anos) e da possibilidade do teste prévio da partida antes da sua libertação para o campo, diminuindo a possibilidade de transmissão de agentes virulentos e outros patógenos (KESSLER et al, 1998). Essas vacinas são apresentadas em tubos criogênicos, separadamente, cada tubo contendo as cepas atenuadas de B. bovis, B. bigemina, A. centrale e um frasco com diluente (KESSLER et al, 1998). Os tubos com as vacinas são mantidos em botijão de nitrogênio líquido. No dia previsto para a vacinação os tubos devem ser retirados do nitrogênio líquido e descongelados em banho-maria a 37º C (KESSLER et al, 1998).

19 Após descongelamento, com uma seringa e agulha hipodérmica, o conteúdo dos três tubos é transferido para o frasco contendo diluente. Este frasco é mantido à temperatura ambiente. Após diluída, a vacina pode ser utilizada por até doze horas, no mangueiro, desde que protegida do calor excessivo e dos raios solares. A dose a ser aplicada é de 2 ml por via subcutânea, preferencialmente em bovinos de 4 a 18 meses de idade (KESSLER et al, 1998). Recomenda-se vacinar quando houver transferência de animais de áreas de instabilidade enzoótica para áreas de estabilidade enzoótica, ou de áreas livres para áreas endêmicas e nos períodos de controle intensivo de carrapatos com carrapaticidas. Não se recomenda a vacinação de outros em estação reprodutiva, vacas prenhes e animais estressados (SCHENK, 1999). Outra vacina contra a tristeza parasitária bovina encontra-se disponível no mercado e produzida pelo laboratório Hemopar, é a Eritrovac. Esta è uma vacina viva atenuada e refrigerada Vacina contra o carrapato A vacina utilizada no controle do carrapato, com nome comercial GAVAC¹, é composta por glicoproteína da superfície de membrana das células digestivas do intestino médio de fêmeas semi-ingurgitadas de B. microplus (Bm 86) recombinada em Eschericia coli (SOARES et al, 1998). Utilizando vacina recombinante obtiveram-se resultados de 40% na redução do número de teleóginas em animais vacinados em relação ao grupo controle, no peso das fêmeas, nas posturas e da fertilidade dos ovos. A vacina reduz significativamente as infestações por carrapatos no hospedeiro e nas pastagens. A redução na população desta espécie de carrapatos acontece pelo fato de alterar os processos biológicos, principalmente o processo metabólico da digestão, afetando gerações que se sucedem. Consequentemente, a reprodução torna-se menos eficiente e a capacidade de sobrevivência das larvas diminui sensivelmente (SOARES et al, 1998). O programa de vacinação, na primeira fase, deve se associado a métodos de controle convencionais até atingir níveis baixos de infestação, aumentando progressivamente os intervalos de tratamento acaricidas. As imunizações semestrais dos animais possibilitam estabelecer níveis de anticorpos suficientes para garantir populações aceitáveis de carrapatos sobre os animais vacinados (SOARES et al, 1998). O mecanismo de ação da vacina recombinante manifesta-se principalmente sobre as formas adultas dos parasitas, causam lesões que incompatibilizam o processo de oogênese, afetando seu ciclo vital. Esta vacina garante segurança, podendo ser aplicada simultaneamente

20 às outras vacinas de uso rotineiro na prevenção de outras doenças, sem apresentar efeitos colaterais (SOARES et al, 1998). A imunização programada com a vacina é uma alternativa viável que demonstra elevada eficácia de ação duradoura no controle racional do carrapato, garantindo a obtenção de alimentos de origem animal de qualidade, livres de resíduos e na preservação do meio ambiente. Esta vacina é um produto biológico alternativo (KESSLER et al, 1998) Quimioprofilaxia da TPB As drogas recomendadas para a quimioprofilaxia são as derivadas do imidocarb, devido a seu efeito babesicida e anaplasmicida de longa duração. A dose profilática é a metade da terapêutica, para que os níveis plasmáticos atingidos sejam capazes de impedir a multiplicação dos agentes, permitindo, contudo a sua sobrevivência no organismo do hospedeiro, com conseqüente estímulo da imunidade celular e humoral (FARIAS, 1995). A utilização dos derivados do imidocarb para uma proteção inicial de animais não imunes, é eficaz, desde que seja observado o intervalo máximo entre as aplicações, que é de 28 dias. Uma vez protegidos, os bovinos devem ser infectados, através da infestação por carrapatos ou da inoculação de sangue parasitado, para que ocorra imunidade adquirida, deixando de depender da produção química (FARIAS, 1998). Em FARIAS (1995) há recomendações de inóculo de sangue com os três agentes da TPB no dia zero, seguindo de uma aplicação de 0,6 mg/kg de imidicarb, 7 dias após, quando então começarem a surgir os sinais clínicos de babesiose. No 21º dia os animais deverão ter contato com infestação moderadas de carrapatos, no 28º dia deve ser aplicado imidocarb, para prevenir o aparecimento dos sinais clínicos de anaplasmose. Dessa maneira, a Babesia spp. será eliminada, mas os animais ficam protegidos pela droga. À medida que o produto for sendo eliminado da corrente sangüínea, a proteção será compensada pela exposição dos animais ao carrapato infectado, se estabelecendo assim, um equilíbrio hospedeiro/parasito. Este mesmo autor também recomenda um esquema de quimioprofilaxia em casos em que não seja possível ou necessária a inoculação de sangue. Esse esquema é indicado para animais que serão expostos a altas infestações por carrapatos, que agirão como vacinadores (FARIAS, 1995). Tabela 3 Premunição associada ao uso de imidocarb, para regiões com baixa infestação por carrapatos. Medidas de manejo Dias Zero

21 Inoculação de sangue 5 ml Aplicação de imidina - 0,6 mg/kg - 3,0mg/kg Infestação por Carrapatos - - sim sim Fonte: FARIAS, (1995). O uso do imidocarb com a oxitetraciclina simplifica o processo de premunição associado à quimioprofilaxia, reduzindo as pedras e tornando desnecessário a acompanhamento diário do veterinário, o que reduz os custos. Recomenda-se no dia zero, a inoculação de 3 ml de sangue de bovino portador dos três agentes. No 7º dia, aplicação de 1,2 mg/kg de imidocarb, no 15º dia, 20 mg/kg de oxitetraciclina, no 30º dia faz-se o desafio inoculando-se 3 ml de sangue parasitado e no 45º dia aplica-se 20 mg/kg de oxitetraciclina (FARIAS, 1995). As técnicas de premunição e quimioprofilaxia podem levar a uma imunização incompleta dos bovinos, podendo ainda provocar o quadro clínico da doença nos animais inoculados. O controle clínico dos animais exige mão-de-obra capacitada e além disso, os animais que sobrevivem a uma infecção mista pelos agentes da tristeza parasitária bovina têm recuperação lenta, havendo portanto, severa queda de produção (FARIAS, 1995). Por todos esses aspectos a imunoprofilaxia com inócuo capaz de induzir uma resposta imunológica, sem riscos de provocar a doença e as conseqüentes quedas de produção é fundamental. 5. Tratamento O tratamento de bovinos, em zonas enzoóticas, deve buscar um equilíbrio entre parasita e hospedeiro, recuperando clinicamente o bovino e deixando que alguns agentes permaneçam, tornando-o um portador (FARIAS, 1995). O sucesso do tratamento depende da eficácia das drogas, da aplicação correta, e sobretudo, de um diagnóstico precoce, permitindo a terapia durante a fase inicial da enfermidade, quando as lesões não são tão graves e o comprometimento do estado geral do animal ainda é reversível. O prognóstico é desfavorável para os animais tratados já com extrema debilidade física e para os que apresentarem comprometimento do sistema nervoso central, no caso de B. bovis (FARIAS, 1995). Na quimioterapia da tristeza parasitaria bovina são usadas drogas de efeito específico contra o parasito, alem de uma medicação de suporte, que visa melhorar o quadro clínico do animal, nos casos mais graves (FARIAS, 1995).

22 - Babesicidas As grandes babesias são mais sensíveis às drogas do que as pequenas. Uma única aplicação de babesicida geralmente é suficiente para recuperar um bovino com babesiose por B. bigemina (do grupo das grandes babesias), enquanto que a B. bovis (do grupo das pequenas babesias) pode requerer duas ou mais aplicações para ser controlada (FARIAS, 1995). - Azul de Tripan Foi a primeira droga específica utilizada no tratamento de infecções por B. bigemina, já no início deste século. Atualmente não é mais usada, por não ser eficiente contra B. bovis, produzir descoloração da carne do animal, ainda, pelo surgimento de drogas mais eficazes (FARIAS, 1995). - Derivados do Quinorônio São produtos derivados da uréia, bastantes eficazes contra B. bigemina e um pouco menos contra B. bovis. Durante muitos anos foram as drogas usadas para combater a babesiose bovina, sendo ainda comercializada em alguns países. A sua relativa toxicidade (afetam o sistema parassimpático do bovino), somada a pouca eficácia contra a B. bovis fizeram com que, nos últimos 20 anos perdessem o mercado para os produtos derivados da diamidina (FARIAS, 1995). - Derivados da Diamidina São os babesicidas mais utilizados nos últimos anos, com baixa toxidade para o bovino e bastante eficazes contra as babesias. Atuam diretamente sobre o acido nucléico do parasita, ao qual se aderem, distorcendo sua estrutura helicoidal. Dezoito a 24 horas após a administração de uma dose terapêutica, as grandes babesias desaparecem da corrente sangüínea e, no caso de B. bovis, grandes parte dos parasitas dos parasitas apresentam-se degenerados. Comercialmente sua apresentação é sob a forma de solução a 5-7%, e a dose recomendada é de 3-3,35 mg/kg. A dose ser administrada e o número de aplicações dependem da espécie causadora da enfermidade. A B. bigemina por ser mais sensível, requer doses menores e, geralmente uma única aplicação. Se o agente for B. bovis, são necessárias, no mínimo, duas aplicações com intervalo de 24 horas (FARIAS, 1995). As doses devem ser aplicadas por via intramuscular profunda, com cuidados de contenção do bovino, por causar intensa dor. Pode ainda causar uma leve tumefação no local de aplicação que tende a desaparecer em, no maximo três dias (FARIAS, 1995).

23 - Anaplasmicidas As tetraciclinas são as drogas mais eficazes no tratamento da anaplasmose bovina. Quando aplicadas durante a fase aguda da enfermidade, retardam e inibem o crescimento do A. marginale, havendo uma destruição gradativa das hemácias parasitadas. Causam supressão da multiplicação e degeneração do A. marginale, que num primeiro momento apresenta-se distendido, vacuolizado e, posteriormente, torna-se reduzido e compacto. Estas devem ser aplicadas por via intramuscular profunda. As tetraciclinas tradicionais são efetivas no tratamento da anaplasmose, mas apresentam a desvantagem de ser necessário mais de uma aplicação de 10 mg/kg para controlar a infecção (FARIAS, 1995). A tetraciclina de longa ação, com única aplicação de 200 mg/kg, equivale a 3 de 10 mg/kg que é recomendada para as tetraciclinas tradicionais (FARIAS, 1995). - Clortetraciclinas Devem ser feitas no mínimo cinco aplicações com intervalos de 24 horas. A dose recomendada é de 5 mg/kg (FARIAS, 1995). - Oxitetraciclinas São bastante eficazes no tratamento da anaplasmose e são apresentadas como produtos de longa duração ou de ação curta. Para o controle da fase clínica da anaplasmose, são necessários, no mínimo, três dias, com aplicações diárias de 3-5 mg/kg para os produtos de curta ação. Quando aos de longa ação, geralmente uma única aplicação de 20 mg/kg é suficiente para provocar a regressão do quadro clínico (FARIAS, 1995). - Imidocarb Atua diretamente sobre Babesia spp. provocando vacuolização do citoplasma, redução dos ribossomas e dilatação da cisterna do núcleo. A dose recomendada para o tratamento da babesiose é 1,2 mg/kg e da anaplasmose é de 3,0 mg/kg, sempre em uma única aplicação subcutânea. O tratamento não deve ser repetido antes do 7º dia após a primeira aplicação, e a dose recomendada não deve se excedida, pois trata-se de um produto de relativa toxicidade. Deve-se tomar o cuidado de não aplicá-lo em vacas prenhes ou que estejam produzindo leite para o consumo humano, e só abater os animais tratados, 28 dias após a ultima aplicação (FARIAS, 1995). - Medicação de Suporte

24 Nos casos leves, a aplicação de drogas específicas geralmente é suficiente para reverter o quadro clínico. No entanto, a sobrecarga hepática, devido ao excesso de hemoglobina a ser metabolizada, pode ser amenizada pela aplicação de soro glicosado. A soroterapia não é indicada na tristeza parasitária bovina e pode concorrer para o agravamento do estado do animal, porque nas anemias graves há decréscimo da viscosidade sangüínea, diminuindo a resistência do fluxo nos vasos periféricos, de modo que quantidades muito superiores de sangue retornam ao coração. Em conseqüência, o débito cardíaco aumenta, produzindo sobrecarga de trabalho para o coração (FARIAS, 1995). Nos casos mais graves, muitas vezes, é necessário uma transfusão de sangue para evitar o choque hipovolêmico. A transfusão aumenta as possibilidades de êxito das drogas específicas e o volume de sangue total a ser inoculado dependerá da intensidade da anemia e do peso do animal, mas no limite de até 2 litros de sangue para 250 kg de peso vivo (FARIAS, 1995). As vitaminas B12, ácido fólico, ácido nicotínico, tiamina e a pirodoxina são responsáveis pela velocidade de mutação das hemácias. É desnecessário a aplicação de medicamentos à base de ferro, pois a anemia provocada pela TPB é hemolítica, e a hemoglobina liberada é incorporada pelas células do sistemas reticulo endotelial, e o ferro liberado é novamente utilizado para a formação de hemoglobina, ou armazenada no pool da ferritina (FARIAS, 1995). Em síntese, o sucesso de um tratamento depende de realizar-se um diagnóstico precoce, eliminar o agente, dar condições ao fígado de reação, mantendo o paciente sob condições favoráveis, com um mínimo de movimentação, sombra, água e alimento à disposição (FARIAS, 1995). 6. Técnicas de mensuração da resposta imunológica humoral aos agentes da TPB. Os testes sorológicos são fundamentais para a avaliação epidemiológica e, consequentemente, para a determinação da necessidade ou não de implementação de medidas preventivas na região ou propriedade. Por outro lado, uma vez estabelecida a aplicação de medidas preventivas, por meio de premunição ou vacinas atenuadas, estas mesmas provas sorológicas constituem importantes indicadores da infectividade e, indiretamente, da imunidade conferida pelo método aplicado, pois a resposta humoral é um fator limitante no estabelecimento da imunidade à infecção causada pelos organismos da tristeza parasitaria bovina (MAHONEY et al, 1979) Imonofluorescência indireta (IFI).

25 O teste de Imunofluorescência indireta (IFI) tem sensibilidade de 99.1%, especificidade de 99,7%, precisão de 99,4%, e baixo custo (MADRUGA et.al., 1998). Na IFI, além do antígeno e do soro teste é necessário a anti-imunoglobulina marcada com o fluorocromo, sendo isotiocianato de fluoresceína a mais utilizado. O teste é realizado em duas fases, na primeira o antígeno é incubado com soro. Se for positivo, formará complexos imunes antígeno-anticorpo. Na segunda fase o complexo formado é colocado em incubação com a anti-imunoglobina com o isotiocianato de fluoresceína. A literatura é realizada em microscópio com luz ultravioleta (FIGURA 1 e 2) (MADRUGA et al,). FIGURA 3. Leitura de IFI B. bovis.

26 FIGURA 4. Leitura IFI A. marginale Teste de imunoadsorção enzimática (ELISA) Os ensaios de imunoadsorção enzimática têm como objetivo tornar visível a reação antígeno/anticorpo, marcando um dos reagentes com uma enzima. Esta age sobre um substrato, produzindo uma coloração, proporcional à quantidade do reagente marcado, cuja absordância pode ser medida por espectrofotometria. Neste teste os poços das placas plásticas de poliestireno ou polivinil (placas de ELISA) são cobertas com antígenos solúveis protéicos, que se ligam firmemente ao plástico. Os complexos antígeno-anticorpo serão formados pela adição de soro. Utiliza-se uma antiimunoglobulina conjugada a uma enzima (peroxidase ou fosfatase alcalina), que forma o complexo antígeno-anticorpo-anti-imunoglobulina conjugada com enzima. Este complexo será detectado com adição de um substrato da enzima e a intensidade da cor, proporcional a quantidade presente na reação. Vários ELISAS indiretos com antígenos brutos de B.bigemina, B.bovis e A.marginale foram produzidos no Brasil e variações têm sido descritas. O advento de anticorpos monoclonais proporcionou o desenvolvimento de ELISA baseado na inibição competitiva. Neste tipo de ELISA, os epítopos no antígeno que cobrem os poços são disputados pelos anticorpos existentes no soro e por um anticorpo monoclonal produzido em camundongo. Adiciona-se ao sistema a anti-imunoglobulina de camundongo marcado com biontina. A enzima utilizada é a fosfatase alcalina cojugada com a avidina, que se combinará com a biontina. O substrato adicionado somente desenvolverá cor se o anticorpo monocional permanecer no sistema. O soro será considerado positivo se a anticorpo monoclonal for impedido de se ligar ao antígeno. Consequentemente, a cor decorrente da ação da enzima no

27 substrato não é desenvolvida, ou o valor da densidade ótica no leitor da ELISA é consideravelmente inferior ao registrado com o soro controle negativo (MADRUGA et al, 1998). Tabela 4 Enzimas e substratos utilizados nos Testes de ELISA, ph necessário e a cor decorrente da ação da enzima ao substrato. Enzima PH ideal Subtrato cromogênico Comprimento de onda/cor produzida Fosfatase 9-10 Paranitrofenil 405 nm/amarela Alcalina Fosfato (PNPP) B galactosidase Nitrofenil-B Galactopiranisida 420 nm/azul púrpura (0NPG) Peroxidase 5-7 H202-Ácido azino di-etil 415 nm/verde Benzotiazolino sulfônico (ABIS) Peroxidase 5-7 H202-Tetra metil benzidina (TNB) 450nm/azul Peroxidase 5-7 H202 0-Fenileno diamina (OPD) 492nm/laranja Glucose+cromógeno p/perosidase Glucose 4-7 Verde/laranja/azul Uréia+Amarelo De Bromo Cresol Uréase 6,5-7,5 588 nm/roxa Fonte: SOARES, Teste de conglutinação rápida (TCR) Os anticorpos, que são bivalentes, podem se ligar a partículas de antígenos, formando complexos insolúveis, que darão origem a grumos de aglutinação. A aglutinação é produzida por uma suspensão de partículas antigênicas com soro imune e ocorre em duas etapas. Inicialmente os anticorpos se combinam rapidamente com as partículas, sendo esta a interação primária. A interação secundária, ou aglutinação propriamente dita, é um processo mais lento, pois a aderência entre as partículas ocorre por contato. Diversas provas de aglutinação foram desenvolvidas, mas as que apresentaram melhores resultados foram as conglutinações. Estas reações ocorrem devido à presença do complemento e conglutininas. A primeira delas foi o teste de cartão para Anaplasma, posteriormente para B.bovis e mais recentemente para B.bigemia. Estes testes demonstraram uma sensibilidade e especificidade acima de 90% (MADRUGA et al, 1998). Os testes de conglutinação rápida para diagnóstico de anticorpos contra B.bovis (TCR-B.bovis) e B.bigemina (TCR-B.bigemina) foram desenvolvidos recentemente e apresentam sensibilidade e especificidade similares à IFL. Devido à simplicidade da execução, economia na produção e rapidez na obtenção dos resultados, os TCRs para essas espécies poderão ser utilizados a campo ou em laboratórios com reduzidos recursos de equipamentos e de mão-de-obra especializada (MADRUGA et al,1998).

28 7. CONCLUSÃO Algumas crises vivenciadas no setor do agro negócio brasileiro, notadamente quanto a surtos de doenças, como a febre aftosa e influenza aviária, evidenciou a suma importância da Epidemiologia na defesa e vigilância sanitária animal. Existe na atual conjuntura uma preocupação mundial com controle mais rigoroso por parte das autoridades sanitárias sobre os rebanhos de corte e a prioridade desse controle deve ser a parte diagnóstica, pois recaem sobre este fato todas as medidas emergências aplicadas nos programas sanitários implantados. A escolha da apresentação das técnicas diagnósticas para a TPB deve-se ao fato de a enfermidade persistir durante muitos anos nos rebanhos sul-matogrossenses, apesar das inovações referentes ao controle dos vetores e na genética dos animais (antígenos Dufly). Essa persistência, passando sem registro, ou pior, sendo registrada equivocadamente, mascara a prevalência da TPB no Estado. Devemos atentar para o fato de que, com a globalização houve a queda das barreiras econômicas, mas se estabeleceu a barreira sanitária como fator limitante do comércio internacional, aumentando significativamente a importância da participação do profissional que atua em áreas de vigilância sanitário animal. E cabe a esses profissionais a busca pelo aperfeiçoamento e treinamento, principalmente no que se refere aos métodos diagnósticos, que em se tratando de TPB, são relativamente rápidos, eficientes, confiáveis e economicamente viáveis. A exigência de que o profissional esteja constantemente se capacitando assegura, em episódios de surtos, rapidez, clareza e eficiência na elaboração do diagnóstico e conseqüentemente, colabora para o maior envolvimento por parte da população em entender e confiar nas restrições impostas pelos programas de controle de enfermidades. Os serviços veterinários e a comunidade produtiva fazem parte de um mesmo processo e a colaboração entre ambos é a base para que os programas de sanidade alcancem sucesso e agreguem valor e credibilidade aos produtos agropecuários, melhorando as condições sociais da população.

29 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, F.R.; MADRUGA, C.R. Imunidade contra Trypanossoma vivax. In: KESSLER, R.H.; SCHENK, M.A.M. Carrapato, tristeza parasitária e tripanossomose dos bovinos. Campo Grande: Embrapa-CNPGC, p BLOOD, D.C.; RADOSTISTS, O.M.A.; GAY, C.C. Clinica Veterinária, 7. ed., Rio de Janeiro. Guanabara Koogan, p. CALLOW, L.L.; HOYTE, H.M.D. The separation of Babesia bigemina from Babesia argenina and Theileria mutans. Australian veterinary Journal, v.37, p , 196. FARIAS, N.A.R. Diagnóstico e Controle da tristeza Parasitária Bovina. Guaíba: Agropecuária, FERREIRA-NETO, J.M; VIANA, E.S. Patologia clinica veterinária. Belo Horizonte: Rabelo Brasil, p. GOMES, A. O carrapato do boi Boophilus, ciclo, biologia, epidemiologia, patogenia e controle. In: KESSLER, R.H.; SCHENK, M.A.M. Carrapato, tristeza parasitaria e tripanossomose dos bovinos. Campo Grande. M.S.: Embrapa-CNPGC, p GONZALES, J.C. O controle do carrapato dos bovinos. Porto Alegre: Sulina, p. KESSLER, R.H.; SCHENK, M.A.M. Carrapato, tristeza parasitaria e tripanossomose dos bovinos. Campo Grande. M.S.: Embrapa-CNPGC, KESSLER, R.H.; SCHENK, M.A.M.; MADRUGA, C.R.; SACCO, A.M.S.; MIGUITA, M. Tristeza Parasitaria dos bovinos (TPB). In: CHARLES, T.P.; FURLONG, J. Doenças Parasitarias dos bovinos de leite. Coronel Pacheco: CNPGL, p LEMOS, A.A. Principais enfermidades de bovinos de Corte do Mato Groso do Sul. Reconhecimento e diagnóstico. Campo Grande. M.S: [s.n.], p