Identificação da Proteína Envolvida no Olfato de Pheidole sp. (Hymenoptera: Formicidae): Morfo-espécie Responsável por Casos de Infecção Hospitalar

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1 Identificação da Proteína Envolvida no Olfato de Pheidole sp. (Hymenoptera: Formicidae): Morfo-espécie Responsável por Casos de Infecção Hospitalar Marcos Filipe Pesquero 1 PBIC, João Bosco Pesquero 2, Lauro Thiago Turaca 3, Marcos Antônio Pesquero 4 Universidade Estadual de Goiás Unidade de Morrinhos. CEP , Brasil. 1 filipepesq@hotmail.com, 2 jbpesquero@unifesp.br, 3 lauro.thiago@hotmail.com, 4 mapesq@ueg.br Palavras-Chave: Proteína-Químico-Sensorial (CSP), Infecção-hospitalar, Feromônio, Inseto-social. 1 INTRODUÇÃO A infecção hospitalar tem despertado grande interesse no meio científico devido à elevação das taxas de morbimortalidade de pacientes hospitalizados e a sua ocorrência depende das condições sanitárias e da presença de vetores dos microrganismos patogênicos (QUIRINO, 1997). Várias espécies de formigas se beneficiam com a presença do homem e algumas destacam-se como pragas devido aos problemas ocasionados direta ou indiretamente à população humana (VINSON, 1986; VANDER MEER et al., 1990). Espécies de formigas que vivem no interior de edificações em ambiente urbano são caracterizadas pelo tamanho corporal pequeno, mobilidade das colônias, unicolonialismo e poliginia (PASSERA, 1994). As principais espécies consideradas pragas urbanas no Brasil são exóticas, destacando-se Monomorium pharaonis (L.), Monomorium floricola Jerdon, Paratrechina longicornis (Latreille) e Tapinoma melanocephalum (Fabricius). Linepithema humile (Mayr), Paratrechina fulva (Mayr), Wasmannia auropunctata (Roger) e algumas espécies de Camponotus, Pheidole, Brachymyrmex e Solenopsis, nativas do Brasil, também são consideradas importantes pragas urbanas (CAMPOS-FARINHA et al., 2002). 1

2 Levantamentos da fauna de formigas em hospitais do Brasil demonstram que esses insetos transportam microrganismos patogênicos, sendo importantes vetores de bactérias resistentes a antibióticos (PEÇANHA, 2000; RODOVALHO et al. 2007; CARNEIRO et al., 2008.), representando risco potencial de infecção em hospitais devido à sua grande mobilidade no interior destes ambientes (FOWLER et al., 1993; BUENO & FOWLER, 1994; COSTA et al.; 2006; PESQUERO et al., 2008). Métodos preventivos de colonização e forrageio das formigas são também importantes para o controle da disseminação de doenças em ambiente hospitalar (QUIRINO, 1997). Dados sobre biologia, ecologia e distribuição espacial contribuem para o manejo de formigas-praga direcionando as ações de controle e dessa forma, reduzindo custos e riscos de contaminação ambiental (ZARZUELA et al., 2002). A comunicação entre as formigas ocorre através de sinais químicos denominados feromônios, que determinarão no indivíduo receptor uma resposta comportamental e/ou fisiológica adaptativa em atividades diversas tais como reprodução, forrageio e defesa. Enquanto a emissão do sinal pode se originar de glândulas localizadas em várias partes do corpo, a recepção do sinal químico normalmente ocorre em órgãos especializados denominados de antenas, localizados na região cefálica e conectados ao deutocérebro (CORRÊA & SANT ANA, 2001; LIMA & DELLA-LUCIA, 2001). No ápice das antenas, genes codificam proteínas específicas responsáveis pelo transporte dos feromômios e outros semioquímicos da cutícula aos nervos receptores olfativos (VOGT, 2003). Tais proteínas químico-sensoriais (CSP) apresentam resíduos de cisteína bem conservados (PIKIELNY et al., 1994), sendo recentemente identificada em Solenopsis invicta (LEAL & ISHIDA, 2008), espécie de formiga com maior número de estudos sobre expressão gênica devido à sua importância como praga introduzida nos EUA (BACCI Jr, 2007). Várias pesquisas têm sido desenvolvidas com insetos da ordem Hymenoptera para estudo da expressão gênica diferencial e dos processos biológicos (LOBO et al. 2003; TIAN et al. 2004). O gênero Pheidole ainda é pouco explorado nas questões biomoleculares, mas acredita-se na hipótese que as proteínas envolvidas na comunicação olfativa sejam a explicação para o comportamento poligínico desta espécie. Ferreira & Grattapaglia (1998) afirmaram que a utilização de marcadores 2

3 moleculares visando obter análise filogenética, divergência gênica, identificação do genótipo, avaliação de germoplasma, fisiologia e outras características moleculares, são importantes ferramentas para se esclarecer a causa poligínica e responder questões taxonômicas de espécies ainda pouco estudadas. Contudo, a extração de DNA para realização destes estudos, deve possuir metodologias otimizadas para se obter material genético de qualidade, estando ciente que o porte destes animais, por serem insetos, dificulta ainda mais o processo de extração deste material (WALDSCHMIDT et al., 1997). 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Extração de RNA total Para a extração do RNA total, amostras de antenas (1000) e abdomens (500) de formigas operárias e rainhas Pheidole sp. coletadas em hospital e mantidas vivas até o momento das análises, foram homogeneizados, separadamente, em presença de TRIzol (Invitrogen) na proporção de 1mL de TRIzol por 100mg de tecido. A mistura foi passada 3 vezes na ponteira e incubadas por 5 minutos a temperatura ambiente para dissociação dos complexos nucleoproteicos. Para preciptação do RNA presente no homogenato, 200 L de clorofórmio por ml de TRIzol utilizado foram adicionados. Essa mistura foi agitada por inversão por 15 segundos e centrifugada a g por 15 minutos a 4 ºC. Após centrifugação, a fase superior que contém o RNA foi recolhida, tranferida para um novo tubo livre de RNAses e adicionou-se 500 L de isopropanol para cada ml de TRIzol e novamente a centrifugação por 10 minutos a 4 ºC e g. O RNA precipitado foi então lavado com 1 ml de etanol 70% preparado com H 2 O MilliQ, seco à temperatura ambiente e re-suspendido em H 2 O MilliQ. A concentração de RNA foi medida espectrofotometricamente em Nanodrop e sua integridade avaliada em gel de agarose 1%. 3

4 2.2 Identificação da sequência do gene CSP A sequência do gene de Pheidole sp. que expressa a proteína químicosensorial (CSP) localizada na antena foi identificada através das ligações de oligonucleotídeos (primers) que se localizam no início e término da sequência do RNA mensageiro do gene de S. invicta (Número de acesso Genebank AY713302). A reação em cadeia da polimerase (RCP) foi executada em diferentes temperaturas de anelamento para se verificar uma possível amplificação e padronização do gene CSP de Pheidole sp. 2.3 Reação de Transcrição Reversa Em um micrograma de RNA foi feito transcrição reversa utilizando a enzima Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase (Invitrogen). A fita de cdna foi sintetizada do RNA total com iniciadores oligodt. 2.4 Reação da Polimerase em Cadeia (RPC) A 2 L de cdna sintetizado anteriormente foi adicionada uma solução (mix) contendo 0,5 L de dntps (desoxirribonucleotídeos trifosfatos) 10 mm; 0,5 L de oligonucleotídios (forward e reverse, 10 mm cada); 1,5 L de MgCl 2 50 mm; 6 L de solução tampão 5X concentrada; 0,2 L da enzima [GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega, Madison - USA)] e 14,3 L de água Milli-Q para completar 25 L de reação. A reação foi amplificada em termociclador segundo as programações de ciclos (Quadro 1). 4

5 Quadro 1. Programações de ciclos utilizados na PCR. Temperatura Tempo Número de ciclos 95 C 3 minutos 1 ciclo 95 C 5 segundos 60 C 15 segundos 35 ciclos 72 C 40 segundos 72 C 7 minutos 1 ciclo 4 C Indefinido 1 ciclo 2.5 Oligonucleotídeos utilizados baseados na sequência do gene da CSP de Solenopsis invicta Primer Forward: 5 CTAGTATCCAGGTACTGCG 3 Primer Reverse: 5 TTAGGCTCGGGCATCTTCAAG 3 Amplicom: aproximadamente 375 pb. 2.6 Purificação (Kit Qiagen) As bandas apresentadas no gel de agarose após a RT-PCR foram removidas com o auxílio de um bisturi e a fatia do gel foi transferida para um tubo de reação de 1,5 ml. O gel foi solubilizado pela adição de Buffer QG na proporção de 3 volumes de tampão para cada volume de gel. As amostras foram incubadas a 50 C por 10 minutos e em seguida foi adicionado um volume de isopropanol 100% para cada volume de gel. A solução foi transferida para uma coluna acoplada a um tubo de 2,0 ml e centrifugada a x g por um minuto. O conteúdo líquido do tubo foi removido, sobre a coluna e adicionou-se 0,5 ml de tampão QG, centrifugando-o a 1000 x g por um minuto. Em seguida, foram adicionados 0,75 ml de tampão PF e centrifugou-o a x g por um minuto. A coluna foi transferida para um tubo de 1,5 ml e a amostra eluida em 30 μl de buffer EB (10 mm Tris-Cl, ph 8,5). 5

6 Após a purificação, 3 μl de cada amostra foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%. Os produtos foram novamente identificados de acordo com o peso molecular. 2.7 Ligação do fragmento amplificado ao plasmídeo PGeim-T O fragmento amplificado e o plasmídeo pgem-t foram ligados para a formação do vetor pgem-t-csp, utilizando-se a enzima T4 ligase (BioLabs Corp.), conforme o protocolo: adição de 2 L do tampão de ligação (4x), adição de 3:1 relação fragmento/plasmídeo e adição de 1 L da enzima T4 ligase para um volume final de 20 L, incubando overnight a 4 ºC. Um volume de 10uL da reação de ligação foi utilizado para a transformação de bactérias E. coli. A seguir está indicado a fórmula utilizada para o cálculo das proporções das amostras na reação de ligação, o mapa do plasmídeo PGeim-T easy e os sítios de clivagem das enzimas de restrição (Figura 1). 2.8 Quantidade inserto (ng) = Quantidade de vetor (ng) X tamanho inserto (kbp) / tamanho vetor (kbp) X 3/1 Figura 1. Mapa do plasmídeo PGeim-T easy e os sítios de clivagem das enzimas de restrição. 6

7 2.9 Bactérias competentes Bactérias E. coli Top 10F congeladas a -80 C foram inoculadas em 5 ml de meio LB e incubadas à 37 C por 12 horas com agitação à 170 rpm. Adicionou-se 0,5 ml de células à 100 ml de meio LB e levou-se à 37 C, com agitação a 160 rpm. O OD600 foi medido a cada 30 min até que chegou-se ao valor de 0,5. As células foram ressuspensas, levadas ao gelo durante 20 minutos e centrifugadas a 5000xg por 5 minutos a 4 C,. As células foram ressuspensas na metade do volume da cultura original estéril-filtrada 0,1M CaCl2. Adicionou-se glicerol esterilizado à célula para uma concentração final de 25% (v / v) e 50% LB (v/v) até que foram armazenadas à - 80 C até a utilização Transformação de bactérias Para transformação, bactérias E. coli competentes (linhagem TOP10F ) foram transformadas e cultivadas em meio LB Broth, contendo o antibiótico Ampicilina como marcador de seleção (concentração de 100 µg/ml). A transformação das bactérias E. coli foi feita mediante o seguinte protocolo: adição de 20 µl do plasmídeo pgem-t-csp em 200ul de bactérias competentes e 800 µl de LB; incubação no gelo por 30 minutos; choque térmico a 42 ºC por 1 minuto; choque térmico no gelo por 5 minutos e incubação sob agitação de 250 rpm a 37ºC por 90 minutos. Após o processo de transformação, as bactérias foram plaqueadas em placa de Petri contendo 20 ml de meio LB Agar com Ampicilina na concentração de 100 µg/ml, 100μl de IPTG 100mM e 20μl de X-Gal (50mg/ml) para a seleção das bactérias contendo o plasmídeo. As placas foram incubadas à 37 C por 20 horas Análise da transformação Após o crescimento das colônias, estas foram submetidas à PCR e o produto desta à digestão com a enzima de restrição Eco RI, para verificação do tamanho do inserto clonado. Após a confirmação foi feito o processo de Mini-prep para produção 7

8 do plasmídeo. Tendo sido confirmado o crescimento e a transformação, as colônias isoladas foram inoculadas em 5mL de meio LB contendo 100 µg/ml de Ampicilina e cultivadas em estufa a 37 ºC para crescer por um período de horas Miniprep Soluções Mini-prep: Meio de cultura LB 20g/L LB Broth Base (Lennox L Broth Base, Invitrogen Cat. # ), autoclavada e estéril. Solução A (GET) p/100ml Glicose 50mM 0,9 g Glicose Tris HCl 25mM ph 8,0 2,5 ml Tris HCl 1M ph 8,0 EDTA 10 mm 2,0 ml EDTA 0,5 M Antes do uso adicionou-se 30µL de RNAse A (4mg/mL) a cada 70µL da solução A Solução B NaOH 200mN SDS 1% p/100ml 2,0mL NaOH 10N 5,0 ml SDS 20% em H2O Solução C p/100ml KAc (acetato de potácio) 3M 29,44g HAc (ácido ácetico glacial) 5mL 8,7mL do estoque TE Tris HCl 10mM ph EDTA 1mM ph8.0 EDTA 0,5M 18,6g EDTA2H2O em 100mL H2O ajuste o ph para 8,0 com NaOH e autoclave. 8

9 As bactérias em meio LB foram centrifugadas a x g por 30 segundos. O sobrenadante foi descartado e o pellet ressuspenso em 100µL da solução A com RNase. Adicionou-se 200 µl da solução B e incubou-se à temperatura ambiente por 5 minutos. Adicionou-se 200µL da solução C, seguido de centrifugação a x g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para tubo de 1,5 ml. Adicionou-se 300µL de isopropanol 100% e centrifugado a x g por 10 minutos. Lavou-se o pellet com etanol (500µL) 70%-75% e centrifugou-se a x g por 5 minutos. O sobrenadante foi completamente retirado, deixando o tubo 15 minutos à 60ºC. Resuspendeu-se o pelllet em 50µL de água e a concentração de DNA foi medida em Nanodrop ND Sequenciamento O sequenciamento foi realizado utilizando-se o método automático com corante fluorescente (ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits, Applied Biosystems) no aparelho ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Os oligonucleotídeos utilizados no sequenciamento foram os mesmos utilizados na PCR. A 100ng do vetor adicionou-se 3,2 pmoles de cada oligonucleotídeo (forward e reverse), 1 μl de solução Big Dye, 1 μl do tampão de reação 10x e água Milli-Q para um volume final de 10 μl. Amplificou-se a reação em termociclador segundo as programações de ciclos (Quadro 2). 9

10 Quadro 2. Programações de ciclos utilizadas para amplificação da reação de sequenciamento. Temperatura Tempo Número de ciclos 94 C 5 segundos 1 ciclo 94 C 20 segundos 48 C 10 segundos 25 ciclos 60 C 4 minutos 4 C Indefinido 1 ciclo Posteriormente, a reação foi purificada por precipitação pela adição de 40 μl de isopropanol 75%, seguida de agitação e incubação à temperatura ambiente por 15 minutos. Após a centrifugação (4000 g/30 minutos/25 C), desprezou-se o etanol e 200 μl de isopraponol 75% foram adicionados. Em seguida, centrifugou-se novamente as amostras, o sobrenadante foi desprezado e as amostras incubadas a 90 C por 1 minuto para completa evaporação do isopropanol. O precipitado de DNA foi re-suspendido em 2 μl de tampão de corrida (Blue Dextran), as amostras denaturadas a 95 C por 2 minutos e imediatamente colocadas em gelo até o momento da aplicação no gel. A última etapa do sequenciamento consistiu na corrida eletroforética das amostras em gel de poliacrilamida (Long Ranger) 5%/Uréia 6M, em tampão TBE (1X), por 7 horas, no sequenciador ABI Prism 377. As sequências obtidas foram comparadas à sequência de referência e todas as alterações foram confirmadas pelo sequenciamento da fita reversa. 10

11 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO A extração de RNA pela metodologia do Trizol resultou em um padrão de banda semelhante ao observado por (RODOVALHO, 2006) com formigas operárias e soldados de Camponotus vittatus (Figura 2). a) b) Figura 2: padrão de bandas da extração de RNA. a) Pheidole sp. b) Camponotus vittatus. Tendo inicialmente aplicado iniciadores RH, ao correr as amostras no gel não houve resultados significantes em bandas. Essas amostras foram então descartadas, sendo substituídos os iniciadores RH pelos iniciadores Oligo DT. Na primeira RT-PCR realizada com temperatura de anelamento a 60 C surgiram bandas fracas. Dessa forma, realizamos o repcr com temperaturas de anelamento mais baixas (55 C e 58 C) que as indicadas pelo protocolo, nas quais obtivemos insertos satisfatórios às alturas de 1000pb e 500pb (Figura 3). 11

12 1000pb 500pb Figura 3. Padrão de bandas do repcr de Pheidole sp. às temperaturas de anelamento a 55 C e 58 C. Após a digestão do vetor pgem-t-csp com enzimas de restrição ECO RI, pode-se observar os insertos de 500 e 1000 pb inseridos no vetor. Devido aos tamanhos serem correspondentes ao esperado, iniciamos o sequenciamento do vetor para análise da seqüência clonada e posterior verificação de homologia com a seqüência do gene de S. invicta (Figura 4). As seqüências serão alinhadas (BioEdit 7, 2004; Multialin, traduzidas (Expasy Proteomics Server, e comparadas com o banco de dados GenBank o mais rápido possível. As seqüências resultantes serão depositadas no banco de dados público dbest. A condição predominante da sensibilidade a componentes químicos voláteis que orientam as atividades dentro e fora das colônias de formigas, assim como sua determinação genética, têm auxiliado estudos filogenéticos a compreender a evolução dentro das principais ordens de insetos. Xu et al. (2009) concluíram que as CSP s são mais conservativas dentro das ordens de insetos do que as OBP s, indicando que o aparecimento da maioria dos genes dessas famílias de proteínas difere entre si quanto ao período de diversificação das ordens. González et al. 12

13 (2009) encontraram três grupos distintos de himenópteras nas análises de CSP s. Um desses grupos é composto exclusivamente por Formicidae e, suas análises sugerem ser uma evolução mais recente dentro da subfamília Myrmicinae. autores ainda encontraram uma proteína (Si-CSP1) altamente expressa nas antenas de S. invicta, sugerindo uma função olfativa. Os resultados aqui obtidos com todo o corpo de formigas operárias demonstram a expressão genética dessa família de proteínas (CSP) em Pheidole sp., sendo necessários estudos envolvendo partes isoladas do corpo (antena e abdome) para se poder sugerir suas funções. Os 3000pb 1000pb 500pb Figura 4. Amostras da clonagem do gene CSP no vetor p-gem-t-csp corridas no gel de agarose. 4 CONCLUSÕES Pelo menos uma proteína químico-sensorial (CSP) foi encontrada na espécie Pheidole sp. tendo base em gene específico de S. invicta. Portanto, todo o conhecimento futuro adquirido nessa área para o controle de S. invicta nos EUA pode contribuir também para o controle de Pheidole sp. no Brasil. Entretanto, mais estudos envolvendo o seqüenciamento e análise isolada de partes do corpo da formiga são relevantes para essa finalidade. 13

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