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1 (21)PI A2 (22) Data de Depósito: 09/12/2005 (43) Data da Publicação: 02/12/2008 (RPI 1978) 11 BOI ilp i ll LO A 2 11 (51) Int.CI.: A61K 39/12 ( ) A61K 39/145 ( ) A61 K 39/23 ( ) A61 K 39/235 ( ) A61 K 39/295 ( ) (54) Título: VACINAS PARA A RESPOSTA RÁPIDA À (57) Resumo: VACINAS PARA A RESPOSTA RAPIDA À PANDEMIA DE GRIPE AVIÁRIA PANDEMIA DE GRIPE AVIARIA. A presente invenção refere-se a vacinas baseadas em adenovírus contra vírus de gripe aviária com (30) Prioridade Unionista: 09/12/2004 US 60/634,660 potencial de pandemia. A presente invenção provê vetores adenovirais com replicação defeituosa, cada um tendo um ácido nucléico que (73) Titular(es): UNIVERSITY OF PITTSBURGH OF THE codifica um polipeptideo de gripe A. Quando introduzido em um individuo o polipeptídeo de gripe A expresso induz a produção de COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION anticorpos que se ligam à gripe. A presente invenção também provê métodos para induzir uma resposta imune em um individuo. Vetor (72) Inventor(es): ADAM SOLOFF, ANDREA GAMBOTTO, GAO adenoviral com replicação defeituosa é administrado nos indivíduos, WENTAO, Paul D. Robbins, SIMON BARRATT-BOYES (74) Procurador(es): MONTAURY PIMENTA, MACHADO & LIOCE (86) Pedido Internacional: PCT US de 09/12/2005 E (87) Publicação Internacional: WO 2006/063101de 15/06/ _ em que o vetor tem um ácido nucléíco que codifica um polipeptídeo de gripe A. Quando o vetor é expresso no indivíduo, o polipeptídeo de gripe A induz o individuo a produzir anticorpos para a gripe. o 2500 IR HM ESPECIFICO HA2 ESPECIFICO o á T Ad.95 Ad.VN1203HA1 Ad.HK156HA1 Ad.VN1203HA IMUNIZAÇÃO

2 ter VACINAS PARA A RESPOSTA RÁPIDA À PANDEMIA DE GRIPE AVIÁRIA REFERÊNCIA CRUZADA A PRIORIDADE RELACIONADA Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de patente provisional dos Estados Unidos no. 60/ depositado em 9 de dezembro de 2004 e é incorporado à presente na íntegra. 1. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à vacinação de gripe e, em particular ao desenvolvimento rápido de vacinas 10 em resposta à pandemia de gripe aviária e a um método de induzir uma resposta imune em um indivíduo. 2. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Aves aquáticas selvagens, os hospedeiros naturais de todos os vírus de gripe A conhecidos, são as fontes de 15 vírus que causam surtos esporádicos da doença altamente fatal em aves domésticas. A emergência recente de cepas de gripe aviária altamente patogênica (HPAI) em aves e sua subseqüente transmissão a seres humanos no sudoeste da Ásia, com freqüentes surtos em aves levando à destruição de 20 centenas de milhares de animais, criou preocupações em torno da difusão de pandemia potencial da doença letal. Li e outros, Nature, 2004, 430: ; Yuen e outros, Lancet, 1998, 351: Em 1997, a gripe aviária altamente patogênica H5N1 foi transmitida de aves para seres humanos 25 em Hong Kong, resultando em dezoito pessoas infectadas e seis mortes, e ressurgiu em 2003 causando dois casos similares com uma fatalidade. Yuen, supra; Nicholson e outros, Lancet, 2003, 362: Em , os surtos extensos de HPAI H5N1 ocorreram em nove países 30 asiáticos resultando em 19 casos humanos na Tailândia, 91 no Vietnam, sete na Indonésia, e quatro em Camboja, com um total de 62 mortes relatadas. Além disso, infecções com H5N1 em grupos de família levantaram a possibilidade de

3 transmissão de ser humano para ser humano. À medida que a exposição humana a e infecção com vírus H5N1 continua a aumentar, assim também aumenta a probabilidade da geração de um vírus de reagrupamento de ser humano-aviário que pode 5 ser transmitido eficientemente na população humana global, que atualmente não tem imunidade específica a H5N1. Tais eventos de reagrupamento entre vírus de gripe A ave-ser humano e porco-ser humano têm sido associados às pandemias de gripe de 1957 e 1968; os eventos da pandemia de continuam não claros. A preocupação em relação ao potencial para a geração de uma cepa H5 de pandemia e sua morbidez e mortalidade concomitantes estão estimulando a busca por uma vacina eficaz. Embora as vacinas de H5 inativadas 15 convencionais continuem a ser avaliadas em experimentos clínicos, a capacidade de produção limitada de vacinas de gripe inativada convencionais poderia prejudicar gravemente a capacidade de controlar a difusão de pandemia de gripe aviária através da vacinação. Desse modo, abordagens 20 alternativas que fornecem opções rápidas e eficazes contra surtos futuros imprevisíveis são urgentemente necessárias. As estratégias atuais de vacinação contra gripe são limitadas pelo tempo necessário para gerar vacinas. A presente invenção provê métodos e composições para o 25 desenvolvimento rápido de vacinas em resposta à pandemia de gripe aviária. 2.1 VÍRUS DA GRIPE Vírus da gripe consistem em três tipos A, B e C. Os vírus da gripe A infectam uma ampla variedade de 30 pássaros e mamíferos, incluindo seres humanos, cavalos, porcos, furões e galinhas. Os vírus da gripe B e C estão presentes somente em seres humanos. Os animais infectados com Gripe A freqüentemente atuam como um reservatório para

4 o vírus da gripe, pela geração de reuniões de vírus genética e antigenicamente diversos que são transmitidos para a população humana. A transmissão pode ocorrer através do contato estreito entre seres humanos e os animais 5 infectados, por exemplo, pela manipulação de animais domésticos. A transmissão de ser humano para ser humano pode ocorrer através do contato estreito, ou através da inalação de gotículas produzidas por tosse ou coriza. A superfície externa da partícula do vírus de 10 gripe A consiste em um envelope de lipídeo que contém as glicoproteínas hemaglutinina (HA) e neuraminidase (NA). A glicoproteína HA compreende duas subunidades, denominadas HAl e HA2. HA contém um sítio de ligação de ácido siálico, que se liga ao ácido siálico encontrado na membrana externa 15 de células epiteliais do trato respiratório superior e inferior, e é absorvido na célula através da endocitose mediada por receptor. Após estar dentro da célula, a partícula do vírus da gripe libera seu genoma, que entra no núcleo e inicia a produção de partículas novas do vírus da 20 gripe. NA também é produzido, que cliva ácido siálico a partir da superfície da célula para evitar recaptura de partículas liberadas do vírus da gripe. O vírus incuba por um período curto, aproximadamente cinco dias em um caso típico, embora o período de incubação possa variar muito. O 25 vírus é secretado aproximadamente um dia antes do início da doença, e tipicamente dura até três a cinco dias. Os sintomas típicos incluem febre, fadiga, mal estar, dor de cabeça, dores, tosse e garganta inflamada. Alguns sintomas podem persistir por várias semanas após a infecção. 30 As diferentes cepas de vírus da gripe são caracterizadas principalmente por mutações nas glicoproteínas HA e NA, e desse modo HA e NA são utilizados para identificar subtipos virais (isto é, H5N1 indica HA

5 subtipo 5 e NA subtipo 1). Como tal, as vacinas de gripe freqüentemente alvejam as células HA e NA. As vacinas convencionais de vírus da gripe utilizam, freqüentemente, vírus inativados integrais, que possuem a molécula de HA 5 e/ou NA apropriada. Alternativamente, formas recombinantes das proteínas HA e NA ou suas subunidades foram utilizadas como vacinas. Entretanto, a gripe é um vírus de RNA e está desse modo, sujeito à mutação freqüente, resultando em alterações constantes e permanentes na composição 10 antigênica do vírus. A composição antigênica se refere às porções do polipeptídeo que são reconhecidas pelo sistema imune, como epítopos de ligação de anticorpo. Alterações pequenas, secundárias na composição antigênica são freqüentemente mencionadas como derivação antigênica. Vírus 15 da gripe A são também capazes de "trocar" materiais genéticos de outros subtipos em um processo denominado reagrupamento, resultando em uma grande alteração na composição antigênica mencionada como mudança antigênica. Como a resposta imune contra as partículas virais se baseia 20 na ligação de anticorpos às glicoproteínas de HA e NA, alterações freqüentes nas glicoproteínas reduzem a eficácia da resposta imune contra vírus da gripe com o passar do tempo, eventualmente levando a uma falta de imunidade. A capacidade da gripe A ser submetida a uma mudança 25 antigênica rápida pode freqüentemente disparar a epidemia de gripe devido à falta de imunidade preexistente à nova cepa. 2.2 VACINAS DE GRIPE Devido à capacidade dos vírus da gripe serem 30 submetidos à derivação antigênica rápida ou mudança antigênica, novas vacinas são periodicamente necessárias para combater novas cepas de gripe. Uma vacina eficaz deve incluir o tipo de vírus de gripe que é prevista ser

6 5/50 predominante no próximo período propício à gripe. Se o tipo errado de gripe não for incluído, a vacina não fornecerá proteção contra infecção. A produção de vacinas de vírus de gripe requer, portanto, a previsão de quais vírus da gripe 5 será prevalente, e não pode levar em consideração mudança antigênica súbita. Por conseguinte, há necessidade na técnica de um método para rapidamente gerar e produzir vacinas de vírus de gripe. Embora muitos subtipos de gripe A sejam capazes 10 de infectar aves, os surtos mais recentes de vírus altamente patogênicos foram causados pelos subtipos H5 e 'H7. As mudanças antigênicas potenciais dos vírus, e a ausência de imunidade resultante nas aves, levou à rápida dispersão do vírus entre as populações de aves, incluindo 15 galinhas e aves domésticas. Como a medição de controle padrão é a separação de todas as aves infectadas ou expostas, a rápida dispersão de gripe aviária resultou na destruição de milhões de aves no mundo inteiro. Surtos de gripe aviária podem ser, portanto, devastadores para 20 fazendas de aves domésticas afetadas, e resultam em imensas perdas de dinheiro. Embora rara, a infecção humana por gripe aviária também ocorre. Devido ao potencial de mudança antigênica rápida e dispersão rápida do vírus da gripe aviária, há uma grande preocupação de que uma pandemia 25 causada por um vírus de gripe aviária possa ocorrer no futuro. A rápida produção e administração de vacinas à base de adenovírus recombinante em aves e indivíduos com risco elevado em face de um surto pode servir para 30 controlar a dispersão de pandemia de gripe aviária letal. O tempo de desenvolvimento longo e capacidade limitada de produção de vacinas de gripe, inativadas, convencionais, poderiam prejudicar gravemente a capacidade de controlar a

7 6/50 dispersão de pandemia de gripe aviária através da vacinação. Desse modo, há necessidade na técnica de um - método de desenvolver rapidamente e produzir em massa, grandes quantidades de vacina de gripe. A presente invenção 5 provê o desenvolvimento rápido de uma vacina de gripe A baseada em adenoviral dirigida contra a proteína hemaglutinina (HA) da cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (VN/1203/04) isolada durante o surto humano letal de no Vietnam. A vacinação de anticorpos específicos de 10 HA induzidos em camundongos e imunidade celular ampla provavelmente fornece imunidade heterotípica. Camundongos vacinados com HA de comprimento total foram totalmente protegidos de um desafio intranasal letal com VN/1203/04. Além disso, uma única imunização subcutânea protegeu 15 totalmente as galinhas de um desafio intranasal maciço com VN/1203/04 capaz de matar todas as galinhas vacinadas de controle em 2 dias. 3. SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a vacinas à base de 20 adenovírus, por exemplo, uma vacina de gripe H5N1 de base adenoviral, contra vírus de gripe aviária com potencial de pandemia. Baseia-se, pelo menos em parte, em estudos em camundongos e galinhas que demonstram que a vacina de base adenoviral da invenção induz uma resposta imune. A presente 25 invenção provê vetores adenovirais de replicação defeituosa, cada um tendo um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de gripe A. A presente invenção provê os vetores à base de sorotipo-5 de adenovírus de E1/E3 apagado que expressam gene de hemaglutinina (HA) de códon otimizado 30 a partir de vírus de gripe A/Vietnam/1203/2004 (VN/1203/04). Esses vetores, de acordo com a invenção, podem ser administrados a um indivíduo para induzir uma resposta imune, incluindo, porém não limitado à produção de

8 anticorpos que se ligam à gripe. A presente invenção também provê métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo. Por exemplo, um método de acordo com a invenção compreende administrar ao 5 indivíduo um vetor adenoviral de replicação defeituosa, onde o vetor tem um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de gripe A e o polipeptídeo de gripe A expresso induz a produção de anticorpos para gripe no indivíduo DEFINIÇÕES Como utilizado aqui, "vírus de gripe aviária" se refere a qualquer vírus de gripe que pode infectar aves. "Vírus de gripe aviária altamente patogênico (HPAI)" se refere a um vírus de gripe aviária que é altamente 15 virulento e caracterizado por mortalidade elevada. Em uma modalidade, o vírus de gripe aviária é do subtipo H5. Em outra modalidade, o vírus de gripe aviária é do subtipo H7. Em outra modalidade, o vírus de gripe aviária é do subtipo H5N1. Em uma modalidade, o vírus de gripe aviária é 20 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Em outra modalidade, o vírus de gripe aviária é A/Hong Kong/156/1996 (H5N1). Como utilizado aqui, o termo "cdna" pode se referir a uma molécula de DNA de fita única ou fita dupla. Para uma molécula de cdna de fita única, a fita de DNA é 25 complementar ao RNA mensageiro ("mrna") transcrito de um gene. Para uma molécula de cdna de fita dupla, uma fita de DNA é complementar ao mrna e a outra é complementar à primeira fita de DNA. Como utilizado aqui, uma "seqüência de 30 codificação" ou uma "seqüência de nucleotídeo codificando" uma proteína específica é uma molécula de ácido nucléico que é transcrita e traduzida em um polipeptídeo in vivo ou in vitro quando colocado sob o controle de seqüências

9 8/50 reguladoras apropriadas. Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon de partida no termo-5' e um códon de parada de tradução no termo-3'. Uma seqüência de codificação pode incluir, porém não é limitado 5 a, moléculas de ácido nucléico procarióticas, cdna de mrna eucariótico, DNA genômico de fontes eucarióticos (por exemplo, de mamíferos), RNA viral ou DNA, e mesmo moléculas de nucleotídeos sintéticas. Uma seqüência de terminação de transcrição será normalmente localizada 3' em relação à 10 seqüência de codificação. Como utilizado aqui, o termo "seqüências de controle" se refere coletivamente a seqüências promotoras, sinais de poliadenilação, seqüências de terminação de transcrição, domínios reguladores a montante, 15 intensificadores e similares, e regiões não traduzidas (UTRs) incluindo 5'-UTRs e 3'-UTRs, que coletivamente fornecem a transcrição e tradução de uma seqüência de codificação em uma célula hospedeira. Como utilizado aqui, uma seqüência de controle "orienta a transcrição" de uma 20 seqüência de codificação em uma célula quando polimerase de RNA ligará a seqüência promotora e transcreverá a seqüência de codificação em mrna, que é então traduzida no polipeptídeo codificado pela seqüência de codificação. Como utilizado aqui, o termo "gene" se refere a 25 uma molécula de DNA que direta ou indiretamente codifica um produto de proteína ou ácido nucléico que tem uma atividade biológica definida. Como utilizado aqui, o termo "DNA genômico" se refere a uma molécula de DNA da qual uma molécula de RNA é 30 transcrita. A molécula de RNA é mais freqüentemente uma molécula de RNA mensageiro (mrna), que é finalmente traduzida em uma proteína que tem uma atividade biológica definida, porém alternativamente pode ser um RNA de

10 9/50 transferência (trna) ou uma molécula de RNA ribossômica (trna), que são mediadores do processo de síntese de proteína. Como utilizado aqui, duas moléculas de ácido 5 nucléico são "funcionalmente equivalentes" quando compartilham duas ou mais funções biológicas quantificáveis. Por exemplo, moléculas de ácido nucléico de seqüência primária diferente podem codificar polipeptídeos idênticos; tais moléculas, embora distintas, são 10 funcionalmente equivalentes. Nesse exemplo, essas moléculas também compartilharão um alto grau de homologia de seqüência. Similarmente, moléculas de ácido nucléico de seqüência primária diferente podem compartilhar a atividade como um promotor de transcrição de RNA, onde a transcrição 15 de RNA ocorre em uma subpopulação específica de células, e responde a um grupo exclusivo de substâncias reguladoras; tais moléculas de ácido nucléico são também funcionalmente equivalentes. Como utilizado aqui, uma região "heteróloga" de 20 uma construção de DNA é um segmento identificável de DNA em ou ligado a outra molécula de DNA que não é encontrada em associação à outra molécula em natureza. Um exemplo de uma seqüência de codificação heteróloga é uma construção onde a própria seqüência de codificação não é encontrada na 25 natureza (por exemplo, seqüências sintéticas tendo códons diferentes do gene nativo). Variação alélica ou eventos mutacionais de ocorrência natural não originam uma região heteróloga de DNA como utilizado aqui. Como utilizado aqui, duas moléculas de ácido 30 nucléico são "homólogas" quando pelo menos aproximadamente 60% a 75% ou preferivelmente pelo menos aproximadamente 80% ou mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 90% dos nucleotídeos compreendendo a molécula de ácido nucléico são

11 idênticas em um comprimento definido da molécula, como determinado utilizando software de análise de seqüência padrão como Vector NTI, GCG ou BLAST. Seqüências de DNA que são homólogas podem ser identificadas por hibridização sob 5 condições rigorosas, como definido para o sistema específico. A definição de condições de hibridização apropriadas está compreendida nos conhecimentos da técnica. Vide, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, volume I, Ausubel e outros, eds. John Wiley: Nova York, NY, 10 primeiramente publicado em 1989, porém com atualização anual, onde a especificidade de hibridização máxima para amostras de DNA imobilizadas em filtros de nitrocelulose pode ser obtida através do uso de lavagens repetidas em uma solução compreendendo 0,1-2 x SSC (15-30 mm NaCl, 1,5-3 mm 15 de citrato de sódio, ph 7,0) e 0,1% SDS (dodecil sulfato de sódio) em temperaturas de C ou maiores. Vide, também, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Para amostras de DNA imobilizadas em filtros de náilon, uma solução de lavagem 20 de hibridização rigorosa pode ser compreendida de 40 mm NaPO 4, ph 7,2, 1-2% SDS e 1 mm EDTA. Novamente, uma temperatura de lavagem de pelo menos C é recomendada, porém a temperatura ótima exigida para uma lavagem verdadeiramente rigorosa dependerá da extensão da sonda de 25 ácido nucléico, seu teor de GC, a concentração de cátions monovalente e a percentagem de formamida, caso haja, que estava contida na solução de hibridização (Ausubel e outros, supra). Como utilizado aqui, o termo "molécula de ácido 30 nucléico" inclui tanto DNA como RNA e, a menos que de outro modo especificado, inclui ácidos nucléicos tanto de fita dupla como de fita única. São também incluídas moléculas compreendendo tanto DNA como RNA, heteroduplexes de

12 DNA/RNA, também conhecidos como híbridos de DNA/RNA, ou moléculas quiméricas contendo tanto DNA como RNA na mesma fita. Moléculas de ácido nucléico da invenção podem conter bases modificadas. A presente invenção provê moléculas de 5 ácido nucléico tanto na orientação de "sentido" (isto é, na mesma orientação como a fita de codificação do gene) como na orientação de "anti-sentido" (isto é, em uma orientação complementar à fita de codificação do gene). Como utilizado aqui, o termo "operavelmente 10 ligado" se refere a um arranjo de moléculas de ácido nucléico em que os componentes assim descritos são configurados de modo a executar sua função usual. Desse modo, seqüências de controle operavelmente ligadas a uma seqüência de codificação são capazes de efetuar a expressão 15 da seqüência de codificação. As seqüências de controle não necessitam ser contíguas com a seqüência de codificação, desde que funcionem para orientar a expressão da mesma. Desse modo, por exemplo, seqüências não traduzidas, mas transcritas intermediárias podem estar presentes entre uma 20 seqüência promotora e a seqüência de codificação e a seqüência promotora pode ainda ser considerada "operavelmente ligada" à seqüência de codificação. Como utilizado aqui, o termo "seqüência" se refere a uma molécula de ácido nucléico tendo um arranjo 25 específico de nucleotídeos, ou uma função específica, por exemplo, uma seqüência de terminação. Como utilizado aqui, DNA exógeno pode ser introduzido em uma célula por processos mencionados como "transdução", "transfecção", ou "transformação." Transdução 30 se refere à introdução de material genético, RNA ou DNA, através da membrana de uma célula eucariótica via um vetor derivado de um vírus. A transfecção se refere à introdução de material genético através da membrana de uma célula

13 eucariótica por meio químico como por precipitação mediada por fosfato de cálcio, por meio mecânico como eletroporação, ou por meio físico como fornecimento biobalístico. Transformação se refere à introdução de 5 material genético em células não eucarióticas, como células bacterianas ou células de levedura, por meio químico, mecânico, físico ou biológico. O material genético fornecido na célula pode ou não ser integrado (covalentemente ligado) no DNA cromossômico. Por exemplo, o 10 material genético pode ser mantido em um elemento epissomal, como um plasmídeo. Uma célula não eucariótica estavelmente transformada ou célula eucariótica estavelmente transfectada é genericamente uma na qual o DNA exógeno se tornou integrado no cromossomo de modo que seja 15 herdado por células filhas através de replicação de cromossomo, ou um que inclua plasmídeos extracromossômicos estavelmente mantidos. Essa estabilidade é demonstrada pela capacidade da célula de estabelecer clones compreendidos de uma população de células filhas contendo o DNA exógeno. 20 Diz-se que células contendo DNA exógeno que não é integrado no cromossomo ou mantido extra-cromossomicamente através de gerações sucessivas de células de progênie são "transformadas de modo transiente" ou "transfectadas de modo transiente." 25 Como utilizado aqui, o termo "indivíduo" ou "paciente" se refere a um animal, por exemplo, uma ave ou mamífero. Em uma modalidade, o indivíduo é um ser humano. Em outra modalidade, o indivíduo é uma ave doméstica, como uma galinha ou um pato. 30 Como utilizado aqui, o termo "derivado" significa "obtido de", "descendente de" ou "produzido por". No contexto de ácidos nucléicos ou polipeptídeos derivados de uma fonte de origem específica, o termo derivado se refere

14 ao uso da fonte de origem como um gabarito para a seqüência de ácido nucléico ou a seqüência de aminoácido. O ácido nucléico ou polipeptídeo derivado da fonte de origem pode possuir todo ou parte do ácido nucléico ou seqüência de 5 aminoácido da fonte de origem, na presença ou ausência de deleções, substituições ou modificações. Uma "vacina", como esse termo é utilizado aqui, uma composição que elicia uma resposta imune (celular e/ou humoral) em um indivíduo. Uma vacina pode reduzir o risco 10 de infecção, porém não evita necessariamente a infecção. Em modalidades não limitadoras, específicas, uma vacina aumenta o nível de imunidade celular e/ou humoral em pelo menos 30 por cento, 50 por cento, ou 100 por cento de níveis de linha de base. 15 Os exemplos de categorias de vacina incluem vacinas de vírus vivo, onde o vírus foi enfraquecido ou atenuado, de tal modo que não possa causar doença; vacinas com vírus exterminado; vacinas que contêm uma ou mais proteínas virais; vírus quiméricos pelo que um vírus não 20 patogênico é construído para conter informações genéticas codificando peptídeo(s) imunogênicos de um vírus que causa doença; e DNA nu que codifica tais peptídeos. Das duas últimas categorias de vacina, o vírus não patogênico pode "fornecer" os peptídeos imunogênicos pela infecção de 25 células hospedeiras, e o DNA nu pode ser injetado, por exemplo, por via intramuscular, em células hospedeiras onde pode ser absorvido e finalmente expresso como proteína antigênica. As exigências para uma vacina ser eficaz variam de vírus para vírus, e dependem, entre outras coisas, de se 30 e até que ponto, imunidade humoral e/ou celular é necessária para reduzir a probabilidade de infecção, a variabilidade genética nas regiões imunogênicas de um vírus e virulência. Ainda outra categoria de vacinas utiliza RNA

15 de autolimite e auto-replicação ("replicons de RNA") que causam lise de células transfectadas e não causam as preocupações associadas a vacinas de DNA nu, que podem integrar em cromossomos hospedeiros (Cheng e outros, 2001, 5 J. Virol. 75(5): ). 4. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1. Imunização com vacina de HAs baseada em Ad5 induz respostas imunes específicas de vírus amplas e proteção em camundongos. A análise ELISPOT de IFN-y de 10 esplenócitos recentemente descongelados estimulados com peptídeos 15-mer em sobreposição consistindo na proteína de VN1203HA completo e seqüências de HK156HA não conservada, adicionais. São mostradas as respostas de dois animais por grupo. A) Respostas imunes celulares aditivas totais 15 dirigidas contra seqüências de HA1 (preto) ou HA2 (branco) tanto de VN1203HA como HK156HA. B-D) Distribuição de imunidade celular específica de cepa contra reuniões de peptídeos compreendendo a cepa VN1203HA de referência (VN.A, VN.B, VN.C) ou as seqüências HK156HA não conservadas 20 (HK.D) para regiões HAl (preto) e HA2 (branco). E-G) Caracterização de epítopos de peptídeo induzidos por vacina específica de cepa e conservada. Figura 2. Respostas imunes humorais em camundongos vacinados. (a) Respostas de anticorpo IgG HA 25 anti-h5n1. Soros de 8 camundongos por grupo foram coletados 8 semanas após a segunda imunização e testados por ELISA em relação à presença de anticorpos IgG específicos de subtipo H5N1 utilizando proteína recombinante HA VN1203 purificada. Títulos de anticorpo são expressos como valor log10 de 30 títulos de ponto final recíprocos. (b) Respostas de anticorpo HI de soro. Os soros foram coletados oito semanas após a segunda vacinação e testados individualmente em relação a anticorpo HI contra vírus VN/1203/04 (topo) ou

16 HK/156/97 (inferior). Títulos de anticorpo HI para camundongos individuais são expressos como um valor log2 do recíproco da diluição mais elevada de soro que inibe aglutinação de eritrócitos de cavalo a 1% por 4 unidades HA 5 de vírus. Linhas horizontais representam a média geométrica de cada grupo. (c) Cinética de produção de anticorpo HI de soro. Ad.VNHA (^), Ad.VNHAl ( ), Ad.HKHAl (X), ou vetor vazio Ad.W5 (0). Figura 3. Respostas imunes celulares em 10 camundongos vacinados. (a) Respostas específicas de HAl- e HA2 de esplenócitos tirados 3-5 dias após um segundo reforço como determinado por ELISPOT IFN- utilizando reuniões de peptídeos l5-mer. (b) Identificação de respostas específicas de epítopo individual como 15 determinado por ELISPOT IFN utilizando peptídeos 15-mer individuais como mostrado. Os dados representam média +SEM de determinações em triplicata em um mínimo de dois camundongos por grupo. SFC = células que formam ponto. Figura 4. Respostas imunes celulares em 20 camundongos vacinados. (a) Respostas específicas de HA1- e HA2 de esplenócitos tirados 3-5 dias após um segundo reforço como determinado por ELISPOT IFN- utilizando reuniões de peptídeos de 15 mer. (b) Identificação de respostas específicas de epítopo individuais como 25 determinado por ELISPOT IFN utilizando peptídeos 15 mer individuais como mostrado. Os dados representam média + SEM de determinações em triplicata em um mínimo de dois camundongos por grupo. SFC = células que formam ponto. 5. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 30 A presente invenção refere-se à vacinação baseada em adenovírus contra vírus da gripe aviária. A presente invenção se baseia, em parte, no desenvolvimento em 5

17 semanas de uma vacina de gripe de base adenoviral com base na cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) isolada durante o surto humano letal de Camundongos vacinados tinham ampla imunidade específica ao vírus e foram totalmente 5 protegidos de um desafio H5N1 intranasal letal, ao passo que todos os animais de controle que não receberam a vacina morreram em 9 dias. Desse modo, a presente invenção provê um sistema variável para produção rápida de vacina de gripe utilizando uma estratégia de vacinação baseada em 10 adenovírus contra um vírus de gripe aviária com potencial de pandemia. Em uma modalidade não de limite, a presente invenção provê um vetor adenoviral com replicação defeituosa compreendendo um ácido nucléico que codifica um 15 polipeptídeo de gripe A, onde o polipeptídeo expresso, quando introduzido em um indivíduo, induz a produção de anticorpos que se ligam à gripe. Em uma modalidade não de limite, a presente invenção provê um vetor da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades não de 20 limite, o polipeptídeo de gripe A compreende Hemaglutinina (HA) ou subunidade de HAl ou porções da mesma. Em modalidades não de limite específicas, o polipeptídeo de gripe A compreende qualquer um dos polipeptídeos de gripe A descritos nos Exemplos abaixo. Em uma modalidade, o 25 polipeptídeo de gripe A é derivado de A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Em outra modalidade, o polipeptídeo de gripe A é derivado de A/Hong Kong/156/1996 (H5N1). Em outra modalidade não de limite, a presente invenção provê um método para induzir uma resposta imune em 30 um indivíduo, o método compreendendo administrar ao indivíduo um vetor adenoviral de replicação defeituosa, onde o vetor compreende um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de gripe A, e onde o polipeptídeo induz o

18 indivíduo a produzir anticorpos que se ligam à gripe. O indivíduo pode ser um animal (por exemplo, ave, como galinha, pato, peru, ganso ou qualquer outra ave doméstica ou selvagem, ou mamífero), preferivelmente um ser humano. A 5 administração pode ser por qualquer método conhecido na técnica. Em modalidades não de limite, específicas, o vetor da invenção é administrado ao indivíduo por via intramuscular, intranasal ou subcutânea. O vetor e vacinas da invenção podem proteger 10 populações de seres humanos em alto risco como pessoas que trabalham com tratamento de saúde e cuidadores de animais. Além disso, dado que os vetores adenovirais humanos podem induzir imunidade em galinhas, aves suscetíveis podem ser vacinados de acordo com os métodos da invenção. A vacinação 15 difundida pode ser monitorada devido á imunidade simultânea a adenovírus, por exemplo. A vacina baseada em adenoviral da invenção pode conferir proteção cruzada a vários subtipos de vírus de gripe VETORES ADENOVIRAIS A presente invenção também se refere a vetores adenovirais de replicação defeituosa, para uso no fornecimento de ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de gripe A operavelmente ligado a seqüências 25 de controle de expressão de tal modo que o polipeptídeo gripe A possa ser expresso. Adenovírus são vírus de DNA não envolvidos, os quais são estáveis, fáceis de manipular, e são facilmente crescidos em títulos elevados. A deleção de genes a partir 30 do genoma adenoviral também permite a inserção de grandes pedaços de DNA estranho. Esses traços tornam os adenovírus muito desejáveis como vetores para entrega de DNA estranho em uma célula hospedeira. Os termos "vetor de adenovírus" e

19 "vetor adenoviral" são utilizados de modo intercambiável nesse relatório descritivo, e se referem a uma construção de polinucleotídeo da presente invenção. Uma construção de polinucleotídeo da presente invenção pode estar em qualquer 5 uma de várias formas, incluindo, porém não limitado a, DNA, DNA encapsulado em uma capa de adenovírus, DNA embalado em outra forma viral ou semelhante a viral (como herpes simplex, e AAV), DNA encapsulado em lipossomas, DNA complexado com polilisina, complexado com moléculas 10 policatiônicas sintéticas, conjugado com transferrina, e complexado com compostos como PEG para "mascarar" imunologicamente a molécula e/ou aumentar a meia vida, e conjugado com uma proteína não viral. Como utilizado aqui, o termo "DNA" inclui as bases padrão A, T, C e G, bem como 15 quaisquer análogos ou formas modificadas dessas bases, como nucleotídeos metilados, modificações internucleotídeos como ligações não carregadas e tioatos, uso de análogos de açúcar, e estruturas de suporte modificadas e/ou alternativas, como poliamidas. 20 O vetor adenoviral é deficiente pelo menos em uma função de gene que é necessária para propagação viral (isto é, uma função de gene adenoviral essencial), tornando o mesmo deficiente em replicação. O vetor adenoviral deficiente em replicação pode ser incubado em uma célula na 25 qual complementa a função de gene defeituoso para permitir propagação do vetor adenoviral deficiente em replicação. O vetor adenoviral pode ser deficiente pelo menos em uma função de gene essencial da região El do genoma adenoviral que é necessário para replicação viral. O vetor adenoviral 30 pode ser deficiente em uma ou mais funções de gene essenciais em duas ou mais regiões do genoma adenoviral. Por exemplo, o vetor adenoviral pode ser deficiente em uma ou mais das regiões El, E2, E3 ou E4. Em uma modalidade, os

20 19/50 vetores adenovirais são deficientes nas regiões El e E3. As fontes para o DNA de vetor adenoviral incluem qualquer espécie, cepa, subtipo, ou mistura de espécies, cepas, ou subtipos, de um adenovírus ou adenovírus 5 quimérico. O vetor adenoviral pode ser qualquer vetor adenoviral capaz de crescimento em uma célula, que é em alguma parte significativa (embora não necessariamente substancialmente) derivada de ou baseada no genoma de um adenovírus. O vetor adenoviral compreende, preferivelmente, 10 um genoma adenoviral do sorotipo 5. Ácidos nucléicos podem ser inseridos no vetor adenoviral de tal modo que, quando uma célula hospedeira é infectada pelo vetor adenoviral, os polipeptídeos codificados pelos ácidos nucléicos serão expressos. Os 15 ácidos nucléicos podem incluir seqüências de controle operavelmente ligadas a uma seqüência de codificação que codifica para um polipeptídeo. Em uma modalidade, a seqüência de codificação codifica um polipeptídeo de gripe. Em modalidades preferidas, a seqüência de codificação 20 codifica polipeptídeos derivados da cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) ou a cepa A/Hong Kong/156/1996 (H5N1). A construção de vetores adenovirais e inserção de ácidos nucléicos nos vetores adenovirais é bem entendida na 25 técnica e envolve o uso de técnicas biológicas moleculares padrão, como aquelas descritas, por exemplo, em Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, e Ausubel e outros, e outras referências mencionadas aqui. Além disso, vetores 30 adenovirais podem ser construídos e/ou purificados utilizando os métodos expostos, por exemplo, na patente US no e Pedidos de patente internacionais WO 98/56937, WO 99/15686, e WO 99/54441.

21 5.2 POLIPEPTÍDEOS E ÁCIDOS NUCLÉICOS DE GRIPE A presente invenção refere-se a composições e/ou métodos que compreendem e/ou utilizam, respectivamente, as diversas moléculas de ácido nucléico que podem ser 5 derivadas de vírus de gripe. Em uma modalidade preferida, o vírus da gripe é um vírus da gripe aviária. Em outras modalidades preferidas, o vírus é a cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (doravante "VN/1203/04") ou a cepa A/Hong Kong/156/1996 (H5N1) (doravante "HK/156/97"). O 10 ácido nucléico pode codificar o comprimento total ou as unidades HA1 ou HA2 do vírus. O HA do vírus da gripe A compreende duas regiões estruturais, uma região de cabeça globular e uma região de haste. A região de cabeça globular contém um sítio de 15 ligação de ácido siálico que é responsável pela fixação de vírus a uma célula alvo e desempenha um papel na atividade de hemaglutinação de HA. A região de haste contém um peptídeo de fusão que permite a fusão de membrana entre o envelope viral e a membrana externa da célula alvo. HA de 20 vírus de gripe A é ativado quando o HA é clivado em um sítio com uma protease, permitindo a ocorrência de infecção. O polipeptídeo maior desse modo obtido é denominado HAl enquanto o menor HA2. O ácido nucléico pode ser otimizado por códon. A 25 otimização por códon, um processo pelo qual as variantes de ácido nucléico do gene de interesse contêm códons que foram alterados para expressão ótima em uma dada célula hospedeira. Alterações de códon específicas dependerão da célula hospedeira sendo utilizada. A otimização por códon 30 pode ser executada utilizando software ou algoritmos prontamente disponíveis, como o algoritmo UpGene ( Gao, W. e outros Biotechnol. Prog., 2004, 20:

22 A presente invenção refere-se a ácidos nucléicos isolados codificando um polipeptídeo de gripe. Um gene codificando uma proteína viral de gripe, quer DNA genômico viral ou cdna, pode ser isolado de qualquer subtipo de 5 vírus de gripe. Os métodos para obter um gene de hemaglutinina viral de gripe, por exemplo, são bem conhecidos na técnica, como descrito acima (vide, por exemplo, Sambrook e outros, supra). Por conseguinte, qualquer subtipo de vírus de gripe pode potencialmente 10 servir como a fonte de ácido nucléico para a clonagem molecular de um gene viral de gripe. O DNA pode ser obtido por procedimentos padrão conhecidos na técnica a partir de DNA clonado (por exemplo, uma "biblioteca" de DNA) por síntese química, por clonagem de DNA, ou pela clonagem de 15 DNA viral de gripe genômico, ou fragmentos do mesmo, purificado da célula desejada. (Vide, por exemplo, Sambrook e outros, supra). Em modalidades preferidas, o DNA viral de gripe genômico é obtido da cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) ou a cepa A/Hong Kong/156/1996 (H5N1). 20 Após obtenção de DNA viral de gripe genômico, fragmentos de DNA podem ser gerados, alguns dos quais codificarão o gene desejado. O DNA pode ser clivado em sítios específicos utilizando diversas enzimas de restrição que são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, o DNA 25 pode ser fragmentado pelo uso de um DNAse ou por cisalhamento físico, por exemplo, por sonicação. Os fragmentos de DNA lineares podem ser então separados de acordo com o tamanho por técnicas padrão, incluindo, porém não limitado a, eletroforese de gel de poliacrilamida e 30 agarose e cromatografia de coluna. Inúmeros métodos bem conhecidos na técnica podem ser utilizados para identificar fragmentos de DNA específicos. Por exemplo, sondas podem ser utilizadas para

23 classificar seqüências conhecidas através de hibridização de ácido nucléico. Por exemplo, oligonucleotídeos correspondendo às informações de seqüência de aminoácidos parciais obtidos para a proteína viral de gripe podem ser 5 preparados e utilizados como sondas para DNA codificando o gene viral de gripe, ou como iniciadores para cdna ou mrna (por exemplo, em combinação com um iniciador poli-t para RT-PCR). Preferivelmente, fragmentos que são exclusivos para o gene viral de gripe alvo são utilizados como sondas. 10 Esses fragmentos de DNA com homologia substancial à sonda hibridizarão. Quanto maior o grau de homologia, condições de hibridização mais rigorosas podem ser utilizadas. A presença do gene pode ser detectada por ensaios com base nas propriedades físicas, químicas ou imunológicas 15 de seu produto expresso. Por exemplo, ácidos nucléicos que podem produzir proteínas com propriedades antigênicas específicas podem ser classificadas, por exemplo, medindo ligação a anticorpos, ou por medição de sua capacidade de eliciar uma resposta imune. 20 DNA viral de gripe da invenção também pode ser identificado por hibridização com mrnas complementares. Tais fragmentos de ácido nucléico podem representar DNA viral de gripe purificado, disponível, ou podem ser oligonucleotídeos sintéticos projetados a partir de 25 informações de seqüência de aminoácidos parciais. O DNA viral de gripe também pode ser identificado por ensaios funcionais ou análise de imunoprecipitação (por exemplo, atividade de fosfatase de tirosina) dos produtos de tradução in vitro. 30 A presente invenção refere-se a polipeptídeos de gripe codificados por ácidos nucléicos isolados. Isso inclui uma proteína de comprimento total, ou forma de ocorrência natural de uma proteína viral de gripe, e

24 quaisquer fragmentos da mesma a partir de qualquer fonte viral de gripe. Está compreendido na capacidade de uma pessoa de conhecimentos comuns na técnica utilizando métodos convencionais que são bem conhecidos na técnica 5 para selecionar proteínas virais de gripe, ou fragmentos do mesmo, com base em suas propriedades desejadas, como antigenicidade. Os exemplos não limitadores incluem classificar as proteínas virais de gripe ou fragmentos das mesmas por classificação em relação a sua capacidade de se 10 ligar a anticorpos específicos de gripe (por exemplo, por ELISA), ou em relação a sua capacidade de eliciar respostas imunes mediadas por célula (por exemplo, por ELISPOT). Em uma modalidade o polipeptídeo de gripe é hemaglutinina ou subunidades da mesma. Em outra modalidade, o polipeptídeo 15 de gripe é HA1. A produção e uso de derivados e análogos relacionados aos produtos de gene viral de gripe estão compreendidos no escopo da presente invenção. Os derivados de produto de gene viral de gripe podem ser feitos pela 20 alteração de codificação de seqüências de ácido nucléico por substituições, adições ou deleções que fornecem moléculas funcionalmente equivalentes. Preferivelmente, derivados são feitos que tenham atividade antigênica aumentada ou intensificada em relação à proteína viral de 25 gripe nativa. 5.3 VACINAS O vetor adenoviral com replicação defeituosa da presente invenção pode ser utilizado como uma vacina para reduzir o risco de infecção por gripe. Quando são 30 utilizados como vacinas, os vetores adenovirais com replicação defeituosa da presente invenção são administrados a um indivíduo utilizando métodos conhecidos. A administração pode ocorrer utilizando vias convencionais

25 de administração e/ou por vias que simulam a via pela qual a infecção pelo patógeno de interesse ocorre. Pode ser administrado em uma composição de vacina que inclui, além do vetor adenoviral com deficiência de replicação, um 5 veículo fisiologicamente aceitável. A composição também pode incluir um agente imunoestimulador ou adjuvante, agente aromatizante ou estabilizador. Vias de administração convencionais e farmaceuticamente aceitáveis incluem via intranasal, 10 intramuscular, intratraqueal, intratumoral, subcutânea, intradérmica, intravenosa, retal, nasal, oral e outras vias de administração parenterais. Vias de administração podem ser combinadas, se desejado, ou ajustadas dependendo do peptídeo antigênico ou da doença. A composição de vacina 15 pode ser administrada em uma dose única ou em múltiplas doses, e pode abranger a administração de doses de reforço, para eliciar e/ou manter imunidade. A vacina de vetor adenoviral com replicação defeituosa é administrada em uma "quantidade eficaz", isto 20 é, uma quantidade de vetor adenoviral com replicação defeituosa que é eficaz em uma via de administração selecionada para eliciar uma reposta imune eficaz para facilitar a proteção do hospedeiro contra infecção, ou sintomas associados à infecção, por um organismo 25 patogênico, isto é, vírus de gripe. Em algumas modalidades, uma "quantidade eficaz" de uma vacina de vetor adenoviral com replicação defeituosa é uma quantidade de vetor adenoviral com replicação defeituosa que é eficaz em uma via de administração para eliciar uma resposta imune eficaz 30 para reduzir ou inibir os sintomas associados à infecção por vírus de gripe, ou reduzir a probabilidade de que uma infecção por vírus de gripe ocorra. A quantidade de vetor adenoviral com replicação

26 defeituosa em cada dose de vacina é selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora ou outra resposta imunoterapêutica sem efeitos colaterais adversos, significativos genericamente associados a vacinas típicas. 5 Tal quantidade variará dependendo do ácido nucléico codificado pelo vetor, quer a formulação de vacina compreenda ou não um adjuvante, e uma variedade de fatores dependentes de hospedeiro. Uma dose eficaz de vacina de vetor adenoviral com replicação defeituosa envolverá 10 genericamente a administração de aproximadamente 2x10 1 a aproximadamente 10x10 1 partículas virais. Em uma modalidade, aproximadamente 4x10 1 a aproximadamente 7x10 1 de partículas virais são administradas. Em outra modalidade, aproximadamente 5x10 1 de partículas virais são 15 administradas. Uma quantidade ótima para uma vacina específica pode ser determinada por estudos padrão envolvendo observação de títulos de anticorpo e outras respostas em indivíduos. Os níveis de imunidade fornecida pela vacina podem ser monitorados para determinar a 20 necessidade, caso haja, de reforços. Após determinação de títulos de anticorpo no soro, imunizações de reforço opcionais podem ser desejáveis. A resposta imune à proteína da presente invenção é intensificada pelo uso de adjuvante e ou um imunoestimulador COMPOSIÇÕES DE VACINA A presente invenção provê ainda composições, incluindo composições farmacêuticas, compreendendo o vetor adenoviral com replicação defeituosa da invenção. As composições compreendendo vetor adenoviral com 30 replicação defeituosa da invenção podem incluir um tampão. Muitos tampões apropriados são bem conhecidos na técnica, e uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica é capaz de selecionar um tampão apropriado. Em alguns casos, a

27 composição pode compreender um excipiente farmaceuticamente aceitável, uma variedade do qual é conhecida na técnica e não necessita ser discutida em detalhe aqui. Quando utilizado como vacina, um vetor adenoviral 5 com replicação defeituosa da presente invenção pode ser formulado em uma variedade de modos. Em geral, a vacina da invenção é formulada de acordo com métodos bem conhecidos na técnica utilizando carreador(es) e/ou veículo(s) farmacêuticos apropriados. Um veículo apropriado é solução 10 salina estéril. Outras soluções de injeção estéril isotônica aquosa e não aquosa e suspensões estéreis aquosas e não aquosas conhecidas como sendo veículos farmaceuticamente aceitáveis e bem conhecidos daqueles versados na técnica, podem ser empregados para essa 15 finalidade. Opcionalmente, uma composição de vacina da invenção pode ser formulada para conter outros componentes, incluindo, por exemplo, adjuvantes, estabilizadores, ajustadores de ph, conservantes e similares. Tais 20 componentes são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. As composições de vacina da presente invenção podem conter múltiplos vetores adenovirais com replicação defeituosa, cada um contendo um polipeptídeo de vírus de 25 gripe diferente. 5.6 MÉTODOS DE TRATAMENTO A presente invenção também se refere a um método para induzir uma resposta imune em um mamífero, o método compreendendo administrar ao mamífero um vetor adenoviral 30 com replicação defeituosa, em que o vetor compreende um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de gripe A, e em que o polipeptídeo induz o mamífero a produzir anticorpos que se ligam à gripe.

28 A presente invenção provê métodos para eliciar uma resposta imune a um antígeno, compreendendo administrar a um indivíduo o vetor adenoviral com replicação defeituosa que contém um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de 5 gripe A da presente invenção, em que o vetor adenoviral com replicação defeituosa entra em uma célula, o polipeptídeo de gripe A é expresso, e uma resposta imune é eliciada para o polipeptídeo de gripe A. O polipeptídeo pode ser de comprimento variável, e pode estar sujeito a modificações 10 normais de célula hospedeira como glicosilação,miristilação ou fosforilação. Os polipeptídeos podem ser modificados para serem submetidos à expressão intracelular, extracelular ou de superfície de célula, por exemplo, pelo uso de uma seqüência de sinais. 15 O vetor adenoviral com replicação defeituosa da presente invenção pode ser administrado individualmente ou nas composições discutidas acima. O vetor de adenovírus com replicação defeituosa da presente invenção pode ser administrado em conjunto com outras drogas ou substância, 20 que podem promover absorção de DNA ou facilitar uma resposta imune. Utilizando os métodos e composições descritas aqui com relação à presente invenção, uma resposta imunoprotetora contra uma infecção por gripe pode ser 25 induzida em qualquer indivíduo, humano ou não humano, suscetível à infecção por gripe. O fato de se uma resposta imune é eficaz pode ser determinado por ensaios padrão, incluindo, porém não limitados a, monitoração da progressão dos sintomas de gripe, medição de anticorpos específicos de 30 gripe, ou medição que células que estão secretando anticorpos de gripe. A administração do vetor de adenovírus com replicação defeituosa pode ser executada através de

29 qualquer método conhecido na técnica, incluindo, porém não limitado a, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intranasal ou inalação. Em uma modalidade, o vetor de adenovírus com replicação defeituosa 5 é administrado através da via de mucosa por inalação nasal. A administração por mucosa pode também ser executada pelo uso de gotas nasais. As vias de administração por mucosa incluem as narinas, traquéia, língua ou membranas de mucosa. 10 Após serem vacinados, os indivíduos podem ser monitorados para determinar a eficácia do tratamento de vacinação. A monitoração da eficácia do tratamento de vacina pode ser executada por qualquer método conhecido por uma pessoa versada na técnica. Em uma modalidade, uma 15 amostra de sangue ou fluido pode ser ensaiada para detectar os níveis de anticorpos dirigidos à gripe. Em outra modalidade, ELISPOT pode ser executado para detectar uma resposta imune à gripe. Em uma modalidade, obtém-se a imunização com o 20 uso de um vetor de adenovírus com replicação deficiente contendo um ácido nucléico que codifica para o polipeptídeo de gripe HA ou um fragmento do mesmo. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo é a subunidade de HAl a partir da cepa A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (doravante 25 "VN/1203/04"). Em outra modalidade, o polipeptídeo é a subunidade de HAl a partir da cepa A/Hong Kong/156/1997 (H5N1). 6. EXEMPLOS 6.1. Exemplo 1: GERAÇÃO DE VETORES ADENOVIRAIS 30 QUE EXPRESSAM GRIPE Três vetores baseados em sorotipo de adenovírus 5 com deleção de El/E3 foram gerados. Esses vetores expressam Hemaglutinina de comprimento total (HA) ou subunidade HAl

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