Maria Christiane Valeria Braga Braile-Sternieri

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1 Maria Christiane Valeria Braga Braile-Sternieri Pericárdio Bovino Tratado com Ácido Glutâmico para Confecção de Próteses Valvulares Cardíacas: Estudos In Vitro e In Vivo Tese apresentada à Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Eixo Temático Medicina Interna. Orientador: Prof. Dr. Moacir F. de Godoy São José do Rio Preto 2013

2 Ficha Catalográfica Braile-Sternieri, Maria Christiane Valeria Braga Pericárdio bovino tratado com ácido glutâmico para confecção de próteses valvulares cardíacas: estudos in vitro e in vivo / Maria Christiane Valeria Braga Braile-Sternieri São José do Rio Preto, p. Tese (Doutorado) - Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP Eixo Temático: Medicina Interna Orientador: Prof. Dr. Moacir Fernandes de Godoy 1. Prótese de valva cardíaca; 2. Pericárdio bovino; 3. Ácido glutâmico; 4. Estudo experimental.

3 Maria Christiane Valéria Braga Braile-Sternieri Pericárdio Bovino Tratado com Ácido Glutâmico para Confecção de Próteses Valvulares Cardíacas: Estudos In Vitro e In Vivo BANCA EXAMINADORA TESE PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR Presidente e Orientador: Prof.Dr.Moacir Fernandes de Godoy 2º Examinador: 3º Examinador: 4º Examinador: 5º Examinador: Suplentes: São José do Rio Preto, / /.

4 SUMÁRIO Dedicatória... i Agradecimentos... ii Epígrafe... vi Lista de Figuras... vii Lista de Tabelas... xi Lista de Abreviaturas e Símbolos... xiii Resumo... xv Abstract... xvii 1. INTRODUÇÃO Calcificação Objetivo MATERIAIS E MÉTODOS Tratamentos Químicos para Reticulação do Pericárdio Bovino Tratamento Controle (PB GA) Tratamento Anticalcificante (PB GA+Glu) Testes Físicos Teste de Resistência Mecânica Análise Térmica Avaliação Estrutural e Ultraestrutural Microscopia de Luz Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Estudos in Vivo Teste de implante Determinação do Índice de Calcificação Calcinação dos Cadinhos Vazios... 27

5 Secagem dos Explantes Calcinação dos Explantes Determinação do Índice de Calcificação dos Explantes Análise Fractal Prótese Valvular de Pericárdio Bovino Confecção Caracterização Teste de Durabilidade Acelerada Análise Estatística RESULTADOS Testes Físicos Teste de Resistência Mecânica e Análise Térmica Avaliação Estrutural e Ultraestrutural Microscopia de Luz Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Implantes em Subcutâneo de Ratos Avaliação da Biocompatibilidade do Implante Análise de Cálcio dos Explantes Determinação Quantitativa da Calcificação Análise da Dimensão Fractal Durabilidade Acelerada DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS APÊNDICES ANEXOS... 89

6 i DEDICATÓRIA Aos meus filhos Sofia e Giovanni... minhas obras-primas e fontes inesgotáveis do meu entusiasmo. Ao meu melhor amigo, meu marido, Waltinho... pela nossa infinita cumplicidade e sintonia sempre!!!

7 ii AGRADECIMENTOS A Deus, pela vida e pela graça de poder realizar esse estudo. Ao querido Prof. Dr. Moacyr Fernandes de Godoy, com seu jeito manso e sagaz, olhar misterioso... sempre pronto a me aconselhar, corrigir, ensinar e, sobretudo, valorizar os meus avanços. Ao Prof. Dr. Gilberto Goissis, que me ensinou tudo sobre esse assunto, com muita paciência e carinho... Quantas vezes não pegou em minhas mãos e me ensinou a escrever! Ao Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga, por sua orientação segura e competente nos estudos morfológicos; suas críticas e sugestões foram decisivas para o andamento e concretização deste trabalho. Aos meus pais Domingo Braile e Maria Cecilia Braga Braile... o que falar desse casal de estudiosos e por que não dizer, casal de cientistas? Por uma vida inteira mostraram-me tantos caminhos e, além disso, que era possível percorrer por vários deles, mas sempre de cabeça erguida e alma aberta... nunca deixando a simplicidade e a essência de sermos pessoas comuns por onde passássemos... Muito obrigada, muito obrigada mesmo por tudo o que sou e o que sempre fizeram e fazem por mim e por todos nós! À minha irmã Patricia... Com certeza a inspiradora do meu primeiro sorriso... Sempre ao meu lado, minha protetora no escuro da noite e destemida nas viagens de avião... Transformou-se na minha gigante advogada de todas as horas... Primeira amiga da vida e para a vida toda!!! Nem tenho o que falar... Aos meus sobrinhos Rafael - o Grande, Luiza - La Bela, por me deixarem ser um pouquinho dona de vocês também! Mais sobrinhos... Fernanda, Fábio, Isa e Caio... que sempre alegram as nossas vidas... dão sentido e continuidade a nossa família.

8 iii Aos meus sogros Walter (in memorium), Carminha, meus cunhados Gisele, Luis Antonio, Wagner e Jucimara... que delícia tê-los como companheiros de minha jornada. Comigo para o que der e vier... Parceiros incondicionais... À base fundamental de tudo... Lino Braile e Maria Neviani Braile, Dario Pereira Braga e Cecilia Ferreira Braga... Inesquecíveis... Ao Prof. Dr. Renato Braz Araújo, companheiro incansável de estudos, por sua compreensão, amizade e alívio em todos os momentos. À Profª. Drª. Ana Paula Marques de Lima, Gerente de Pesquisas da Braile Biomédica, que sentou comigo e me fez quieta nos mais inusitados momentos... esteve junto de mim para que chegássemos até aqui! À Profª. Drª. Rosa Sayoko Kawasaki Oyama, por sua imensa dedicação e rigor científico, ajudou-me a trilhar o intrigante caminho da pesquisa... sempre com um sorriso no rosto, muito obrigada!!! Às minhas queridas Midori Cristina Okubo, Glaucia Grazielli Basso e Paula Inácio Rodrigues Ayres, sempre comprometidas com o meu estudo... Quanto fizeram com tabelas, estatísticas, fotos, formatações, revisão ortográfica e outras inúmeras revisões... Trabalho primoroso e amigo!!! Ao Vladimir Donizete Aparecido Ramires, Gerente de Desenvolvimento Biológico da Braile Biomédica, por toda ajuda na realização das técnicas de preservação do pericárdio. Ao Marcos Vinicius Pinto e Silva, Vinicius Ladeia, Aparecida de Fátima Giglioti e Solange Dourado. A amizade demonstrada por cada um de vocês e a colaboração técnica prestada no dia-a-dia do laboratório foi fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.

9 iv Aos meus assistentes Drª Eliana Migliorini Mustafá, Dr. Victor Rodrigues, Dr. Fuad Kassis Filho, Dr. Felipe Toledo, Dr. Edson Barboza Rezende, Drª Heloisa Ramazzini Braga, Dra. Daniela Zerezuela, e toda minha equipe do Instituto Domingo Braile, que cuidaram de nosso Serviço e dos pacientes com profissionalismo, dedicação e sobretudo amor quando precisei me ausentar para que meu sonho se concretizasse... Caríssima Cibele Olegario Vianna de Queiroz... não poderia deixar de citá-la...você é fundamental para nós... trabalhadora, incansável na organização de nosso Centro de Pesquisa. Muito obrigada às minhas funcionárias do Instituto Domingo Braile, nas pessoas de Maria Beserra de Souza Pereira e Ocely Aparecida Trevizan, as mais antigas, quero agradecer a todas por todo cuidado, atenção e preocupação para comigo e meu trabalho. Querido Weverson Martins, sinta-se incluído... por todo comprometimento. Aos meus Residentes e Estagiários do Instituto Domingo Braile que, no dia-a-dia, ajudam-me a percorrer os meandros da Medicina e os enigmas de cada diagnóstico, instigando-me sempre a conhecer mais... junto de vocês!! A vida é mais alegre com vocês!!!! Com gratidão... Ao Prof. Dr. José Victor Maniglia, Diretor Adjunto de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP), por seus constantes esforços em promover o nosso curso. Aos funcionários da Pós-Graduação da FAMERP, em especial a José Antonio Silistino e Fabiana Cristina Godoy, pela dedicação e atenção, pelo tratamento carinhoso e respeito dispensados aos alunos. Aos pacientes e familiares que confiam suas vidas e a de seus entes queridos a mim e a minha equipe... Que possamos sempre fazer jus a essa confiança. À minha terapeuta Aglair Pires, por seu magnífico conhecimento da alma humana e pelo seu destemor em me convencer que eu podia!!

10 v Às queridas Jocelena Cardoso Ferrarini e Nilzeli Xavier, minhas companheiras do lar... Saibam que sem a vossa ajuda fraternal e dedicação, pra lá de excepcional, seria absolutamente impossível a realização de toda a minha vida profissional. Aos meus Amigos, pois me ensinam a cada dia o verdadeiro sentido do companheirismo. Não existe patrimônio que mereça maior cuidado do que nossos afetos. (Aglair Grein)

11 vi Entre o plantio e a colheita, há o tempo de espera.

12 vii LISTA DE FIGURAS Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5: Figura 6: Figura 7: Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino do grupo controle (PB GA) Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino (PB) do grupo anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) PB GA+Glu Equipamento Q-Test para teste de resistência mecânica do pericardio bovino Equipamento Braile Biomédica para teste de encolhimento do pericárdio bovino (a) Exemplo de contorno irregular ajustado pelo método de Box-Counting; (b) Gráfico log-log para obtenção da dimensão fractal Equipamento de teste de fadiga de válvulas biológicas Fotomicrografias dos pericárdios bovinos (PB) submetidos aos tratamentos controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-C) e anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (D-F), corados pela Hematoxilina-Eosina (HE) (A e D), Orceína (B e E) e Tricrômio de Masson (C e F). As setas pretas indicam as fibras elásticas coradas pela Orceína e as setas amarelas a ondulação das fibras colágenas intensamente coradas pelo Tricrômio de Masson... 38

13 viii Figura 8: Figura 9: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura dos pericárdios bovinos (PB) submetidos aos tratamentos controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-B) e anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (C-D). A = Aumento Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB), submetidos a tratamento controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos após 14, 28, 60 dias do implante, mostrando diferentes graus de deposição de colágeno. Deposição discreta (D), moderada (M) e importante (I). Coloração: Tricrômio de Masson. A = Aumento Figura 10: Gráfico do escore total de agressão tecidual do subcutâneo pós-implante de PB GA e PB GA+Glu Figura 11: Fotomicrografias dos tipos celulares presentes nos pericárdios bovinos (PB), submetidos ao tratamento controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos, após 14, 28, 60 dias do implante e corado pela Hematoxilina-Eosina Figura 12: Fotomicrografias de pericárdios bovinos (PB) do grupo controle submetidos ao tratamento com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) (A-D) e PB com tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) (E-H), explantados de subcutâneo de rato e corados pelo método de Von Kossa. Setas indicam calcificação moderada. Aumento: 40X... 50

14 ix Figura 13: Gráfico Box-Plot: Resultados dos índices de calcificação de pericárdios bovinos (PB) do grupo controle tratado com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), implantados em subcutâneo de ratos, por períodos de 14, 28 e 60 dias (n= 5 PB/período de implante) Figura 14: Gráfico Box-Plot: Resultados da dimensão fractal de pericárdios bovinos (PB) do grupo controle tratado com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu) no pré-implante e após 14, 28 e 60 dias de implante, em subcutâneo de ratos (n= 5 PB/período de implante) Figura 15: Fotomicrografias e respectivas binarizações de pericárdios bovinos (PB) do grupo controle tratado com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), pré-implante e após 14, 28 e 60 dias de implante Figura 16: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB) do grupo controle antes (A e B) e após (C e D) o teste de durabilidade Figura 17: Válvulas cardíacas de pericárdio bovino (PB) do grupo com tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB Ga+Glu) antes (A e B) e após (C e D) o teste de durabilidade acelerada. Nota-se a presença de peeling (setas)... 57

15 x Figura 18: Esquema representativo do tratamento empregado no presente estudo. A: colágeno do pericárdio bovino na presença do GA. B. Tipos de ligações do GA com o colágeno; B1: Base de Shiff, reação de reticulação em que os dois aldeídos ligam-se ao colágeno; B2: apenas um grupamento aldeídico liga-se ao colágeno; B3: as moléculas de GA ligam-se formando uma cadeia polimérica. C: em meio ácido (H + ) ou alcalino (OH - ) as cadeias polimérica abrem-se, formando aldeídos livres que se ligarão ao ácido glutâmico. D: neutralização dos aldeídos livres pelo ácido glutâmico (adaptado de Carnevalli, ) Figura 19: Esquema representativo do tratamento químico com glutaraldeído (GA) para reticulação das fibras de colágeno do pericárdio bovino, seguido de tratamento com peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) formando o ácido carboxílico com consequente diminuição da toxicidade pelo glutaraldeído polimérico... 67

16 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1: Protocolo de implante de PB com tratamentos anticalcificante PB GA+Glu e controle PB GA, em subcutâneo de ratos Tabela 2: Propriedades mecânicas e térmicas de pericárdio bovino (PB) submetidos ao tratamento controle com glutaraldeído (PB GA) 0,5% (GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) (PB GA+Glu) Tabela 3: Tabela 4: Tabela: 5 Resultado das análises histopatológicas de pericárdios bovinos submetidos a tratamento convencional com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos, quanto à deposição de colágeno (n=5 animais / período de implante) Resultados das análises histopatológicas de pericárdio bovino (PB) submetido aos tratamentos controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), explantados de subcutâneo de ratos, quanto aos tipos celulares (n=5 animais / período de implante) Análise estatística comparativa dos tipos celulares presentes na reação inflamatória decorrente do implante de pericárdios bovinos (PB) submetidos ao tratamento controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetido ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), em subcutâneo de ratos, após 14, 28, 60 dias (n=5 PB / período de implante)... 47

17 xii Tabela 6: Tabela 7: Tabela 8: Resultado das análises histopatológicas de pericárdios bovinos (PB) do grupo controle submetidos ao tratamento com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e PB submetidos ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), após implante em região subcutânea de ratos por 14, 28 e 60 dias, corados pelo método de Von Kossa Valores médios ± desvio-padrão (DP) de calcificação (µg de Ca ++ /mg de tecido seco), de acordo com o tempo de implante de pericárdios bovinos (PB) submetidos ao tratamento controle com glutaraldeído (GA) 0,5% (PB GA) e ao tratamento anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) 1% (PB GA+Glu), em subcutâneo de ratos (n=5 PB / período de implante) Comparação dos índices de calcificação de PB e/ou cúspide de válvula porcina, fixados com GA e submetidos ou não a tratamentos anticalcificantes, após implante em subcutâneo de ratos... 65

18 xiii LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E SIGLAS A Aumento AAMI Association for the Advancement of Medical Instrumentation ANSI American National Standards Institute ASTM American Society for Testing and Materials bpm Batimentos por minuto CEL GIG Células gigantes CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais d Coeficiente angular D Discreta DF ou d Dimensão fractal DP Desvio padrão et al. et alii (e outros) FAMERP Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto GA Glutaraldeído Glu Ácido glutâmico HE Hematoxilina-Eosina I Importante ICP OES Espectrometria de emissão ótica com plasma induzido ISO International Organization for Standardization L Lado M Moderada MACROF Macrófagos MEV Microscopia eletrônica de varredura n Número NEOV Neovascularização NI Não informado NS Diferença estatística não-significante OECD Organization for Economic Co-operation and Development P Probabilidade PB Pericárdio bovino PLASM Plasmócitos PMN Polimorfonucleares ppm Partículas por milhão RMS Root mean square S1 Solução 1 S2 Solução 2 S3 Solução 3 SIF Serviço de Inspeção Federal

19 xiv Tº Temperatura T s Temperatura de encolhimento USA United States of America x Vezes % Porcentagem > Maior Maior ou igual < Menor Menor ou igual Marca registrada ºC Graus Celsius / centígrado Ca Cálcio cm Centímetro cm 2 Centímetro quadrado g Grama h Horas H 2 O 2 Peróxido de hidrogênio kev Quilo eletrovolts kg Quilograma kgf/mm 2 Quilograma força por milímetro quadrado l Litro µg Micrograma µm Micra mg Miligrama mg/kg Miligrama por quilograma mg/l Miligrama por litro MgSO 4 Sulfato de magnésio min Minuto ml Mililitro mm Milímetro mmhg Milímetro de mercúrio mol/l Mol por litro (concentração molar) N Normal NaCl Cloreto de sódio NaOH Hidróxido de sódio ph Potencial hidrogeniônico

20 xv RESUMO Introdução: Estudos têm mostrado que as doenças das valvas cardíacas acometem indivíduos de todas as faixas etárias. Quando pacientes com estas doenças apresentam piora em manifestações clínicas, como dilatação das câmaras cardíacas, arritmias e insuficiência cardíaca, o tratamento é cirúrgico, visando o reparo por meio de plastia ou troca por próteses valvulares mecânicas ou biológicas. Apesar da vantagem das biopróteses serem atrombogênicas, não estão livres de falhas primárias, sendo a calcificação a principal delas. O presente estudo avaliou as propriedades do pericárdio bovino in vitro e in vivo após tratamento anticalcificante com glutaraldeído e ácido glutâmico para confecção de biopróteses cardíacas. Materiais e Métodos: Foram utilizados 180 pericárdios bovinos, divididos em dois grupos: o Controle (PB GA) tratado convencionalmente com glutaraldeído 5% (n=90) e o com Tratamento Anticalcificante (PB GA+Glu), tratado convencionalmente com glutaraldeído seguido de tratamento com ácido glutâmico 1% (n=90). Após tratamento químico os pericárdios de ambos os grupos foram submetidos ao teste de resistência mecânica, análise térmica, avaliação estrutural e ultraestrutural. Em seguida foram implantados em subcutâneo de ratos e explantados após 14, 28 e 60 dias para determinação da biocompatibilidade e do índice de calcificação. Para auxiliar na avaliação comparativa do aspecto histológico de uma forma mais objetiva, foi utilizado o cálculo da dimensão fractal. Ao final foram confeccionadas válvulas cardíacas de PB para realização do teste de durabilidade acelerada. Resultados: Amostras de pericárdio bovino do grupo PB GA+Glu foram biocompatíveis ao organismo animal. A análise de calcificação dos explantes de pericárdios bovinos, dos grupos PB GA e PB GA+Glu, realizada pelo método de Von Kossa, revelou discreta calcificação em todos os pericárdios, em todos os períodos (14,28 e 60 dias) tanto no grupo PB GA quanto no grupo PB GA+GLU. No entanto a espectrofotometria de absorção atômica mostrou aumento discreto gradual da concentração de cálcio nos pericárdios bovinos do grupo PB GA aos 14, 28 e 60 dias, enquanto que nos pericárdios bovinos submetidos ao tratamento anticalcificante permaneceu mais estável e em níveis mais baixos. Na análise da dimensão fractal, o pré-implante foi significantemente maior no grupo PB GA (P<0,0001). Após o implante a

21 situação inverteu-se, com a dimensão fractal sendo significantemente maior no grupo PB GA+Glu aos 14, 28 e 60 dias (P= 0,0495; P=0,0034 e P=0,0002, respectivamente). As válvulas confeccionadas com PB de ambos os grupos, submetidas ao teste de durabilidade acelerada, apresentaram integridade estrutural aos 200 milhões de ciclos de batimentos. Conclusões: Pericárdio bovino reticulado pelo glutaraldeído e tratado com ácido glutâmico apresentou características biomecânicas, térmicas e morfológicas apropriadas para a confecção de válvulas cardíacas. Os experimentos em implante subcutâneo de ratos mostraram que os grupos químicos de glutaraldeído reativo livre, após reação com o ácido glutâmico, causaram redução significante da calcificação tecidual. xvi

22 xvii ABSTRACT Introduction: Studies have shown that the heart valve diseases affect individuals of all age groups. When patients with these diseases have worsening of clinical manifestations such as cardiac chamber dilatation, arrhythmias and heart failure, treatment is surgical repair order by repair or replacement by mechanical or biological valve prosthesis. Despite the advantage of being non-thrombogenics, bioprostheses are not free from primary failure and calcification is the main one. The present study evaluated the properties of bovine pericardium in vitro and in vivo after anticalcification treatment with glutaraldehyde and glutamic acid for manufacturing cardiac bioprostheses. Materials and Methods: A total of 180 bovine pericardium were divided in two groups: Control (BP GA) treated conventionally with 5% glutaraldehyde (n=90) and with anticalcification treatment (BP GA+Glu), treated with glutaraldehyde followed by treatment with 1% glutamic acid (n=90). After chemical treatment the pericardium of both groups were submitted to mechanical strength, thermal analysis, structural and ultrastructural tests. Then were subcutaneously implanted in rats and explanted after 14, 28 and 60 days to determine the biocompatibility and calcification index. The fractal dimension was calculated to evaluate the histological appearance in both groups. Finally, some bioprostheses were manufactured for achieving accelerated durability test. Results: Samples of bovine pericardium group BP GA+Glu were biocompatible to animal organism. The analysis of calcification of bovine pericardium explants from groups BP GA and BP GA+Glu held by the Von Kossa method, revealed mild calcification at all the pericardium, in all periods (14, 28 and 60 days) in both groups. However the atomic absorption spectrophotometry showed gradual slight increase in calcium concentration in bovine pericardium group BP GA at 14, 28 and 60 days, whereas in bovine pericardium subjected to anticalcification treatment remained more stable and at lower levels. In the analysis of the fractal dimension, the pre-implantation was significantly higher in group BP GA (P<0.0001). After implantation, the situation was reversed, with the fractal dimension is significantly higher in BP GA+Glu at 14, 28 and 60 days (P=0.0495, P= and P=0.0002, respectively). The valves prepared with BP of both groups were submitted to the accelerated durability test, showed structural integrity of the 200 million cycles of beats. Conclusions: Crosslinked bovine pericardium treated with glutaraldehyde and glutamic acid showed biomechanical, thermal and morphological properties appropriated for manufacturing heart valves. Experiments in rat subcutaneous implant showed that the group BP GA+Glu had a significant reduction in tissue calcification.

23 1. INTRODUÇÃO

24 Introdução - 2 Estudos médicos sobre doenças das valvas cardíacas têm mostrado que elas acometem indivíduos de todas as faixas etárias em todo mundo e são um problema de saúde pública, tanto em países desenvolvidos como naqueles em desenvolvimento. 1,2 De acordo com o estudo realizado por Nkomo et al. (2006), 1 a prevalência dessas doenças nos Estados Unidos, em 2000, foi estimada em 4,2 a 5,6 milhões de adultos. Sua forma moderada acomete 2,5% da população geral, porém, com o avanço da idade, esta prevalência sofre um aumento considerável, atingindo 8,5% dos indivíduos com anos e 13,2% dos indivíduos com idade superior a 75 anos. No Brasil não há dados estatísticos do número de indivíduos portadores dessa doença, porém, de acordo com os dados do Ministério da Saúde, em 2011, foram realizadas cirurgias cardíacas de trocas valvares. 3 As valvas cardíacas são estruturas com características próprias e sua vida útil depende da sua posição intracardíaca, quantidade, qualidade e arquitetura de sua matriz extracelular, principalmente do colágeno, elastina e glicosaminoglicanas 4. Além disso, apresentam capacidade de adaptação e autorreparação diante de diferentes tipos de estresse. 5 A arquitetura da matriz extracelular e o fenótipo das células intersticiais valvares são dinâmicos, mantendo-se em constante transformação durante toda a vida, inclusive em situações patológicas. 6

25 Introdução - 3 Apesar disso, fatores genéticos, mecânicos, inflamatórios e imunogênicos podem alterar a morfologia dessas valvas, tornando-as não funcionantes e interrompendo a homeostase valvar. 7 Dentre as principais enfermidades das valvas cardíacas, considerando sua posição intracardíaca, destacam-se: Valva aórtica bivalvulada: cardiopatia congênita de maior prevalência, podendo evoluir para estenose e/ou regurgitação, endocardite infecciosa, dilatação da aorta e até mesmo dissecção aórtica. 8,9 Estenose valvar aórtica calcificada: ocorre devido à calcificação das cúspides valvares, tanto em valvas normais como em valvas aórticas bicúspides congênitas. 10,11 Em valvas normais manifesta-se preferencialmente em indivíduos na oitava década de vida. 12 Degeneração mixomatosa da valva mitral: ocorre quando os folhetos tornam-se aumentados, engrossados e redundantes, propiciando complicações como insuficiência valvar, endocardite infecciosa, tromboembolismo e fibrilação atrial. 5 Doença valvar reumática: corresponde a uma das sequelas da febre reumática. Representa problema grave de saúde em países de baixa renda e condição sanitária precária. 5

26 Introdução - 4 É consenso que, quando pacientes com doença valvar cardíaca apresentam piora em manifestações clínicas como dilatação das câmaras cardíacas, arritmias e insuficiência cardíaca, o tratamento é cirúrgico, visando reparo da(s) valva(s) por meio de plastia ou pela troca por próteses. Atualmente existem dois tipos de prótese valvular cardíaca: mecânicas e biológicas. Próteses mecânicas são compostas por materiais não biológicos como polímeros, metal e carbono pirolítico, enquanto as biológicas são confeccionadas, pelo menos em parte, com tecidos biológicos como pericárdio bovino (PB), valvas porcinas, valvas homólogas ou, mais recentemente, pericárdio de outros animais Próteses mecânicas têm elevada durabilidade, entretanto, apresentam desvantagens como tromboembolismo sistêmico e/ou trombose da prótese. Além disso, obrigam ao uso contínuo de anticoagulantes, favorecendo sangramento ou, na falha da anticoagulação, trombose. Os medicamentos anticoagulantes são instáveis quanto aos seus efeitos, sendo que a maioria dos pacientes encontra-se fora da faixa terapêutica segura. 23 Biopróteses não são trombogênicas e permitem fluxo central semelhante ao das valvas nativas. Apesar desta vantagem, podem ocorrer calcificação e ruptura da sua estrutura e, com isso, falhas primárias. 24

27 Introdução Calcificação A calcificação é uma das principais causas de falha em próteses valvulares cardíacas, tanto de PB como porcinas, 25,26 caracterizada pela formação de sais insolúveis de fosfato de cálcio nos folhetos valvares. 27 No estudo particular da calcificação, verificou-se ser ela de origem multifatorial, 28,29 incluindo desde fatores relacionados à estrutura física e química dos implantes até o metabolismo do hospedeiro e fatores mecânicos. A calcificação pode ocorrer precocemente em próteses tratadas com glutaraldeído (GA), principalmente naquelas submetidas a um elevado grau de estresse mecânico e em indivíduos jovens. 24 O GA é o agente mais utilizado na fixação química do PB. Esse fixador atua na reticulação do colágeno, dando estabilidade ao material, tornando-o mais durável, além de diminuir sua antigenicidade e garantir a esterilidade. 30 Este processo com o GA também é conhecido como método de curtição do PB ou processo de reticulação. 15,31,32 Materiais fixados com GA não são inertes, mesmo após o término de todo o processo químico. O tecido biológico continua liberando moléculas de GA monomérico a partir do GA polimérico presente. Portanto, biopróteses têm toxicidade tanto local como sistêmica para o hospedeiro. 13,28,33-35 O PB tratado com GA apresenta aldeídos livres que,

28 Introdução - 6 juntamente com os fosfolípides e a antigenicidade residual do tecido das biopróteses, são importantes nos mecanismos de calcificação. 24,36-38 As estratégias de prevenção da calcificação são baseadas em: 1. Terapias no paciente, como: - terapia sistêmica com agentes anticalcificantes; - terapia local com dispositivos implantáveis de liberação prolongada de drogas; 2. Tratamento no PB antes da confecção da bioprótese, como: - adição de agentes de natureza química que promovam alterações estruturais do tecido; 24 - modificações de biomateriais, como remoção de componente com potencial para calcificação. 39,40 Considerando as estratégias relacionadas ao tratamento do PB, diversos métodos têm sido propostos para redução da calcificação, tais como: 1. Remoção de fosfolípides; Inativação de aldeídos livres; Redução de antigenicidade e toxicidade de biopróteses tratadas com GA; 36,45,52,53 4. Descelularização. 39,40,54-56

29 Introdução - 7 Para este estudo sobre calcificação do PB, foram escolhidos a estratégia 2 e o método 3, o que resultou na adição de ácido glutâmico (Glu) ao processo de curtição feito com GA. A inativação de aldeídos livres pode ser realizada por meio da adição de agentes químicos como lisina, glutamina, arginina, ácido α- amino-oléico, octanediol, etanol, diamina, Glu, entre outros. 48,52,57-63 O Glu, um aminoácido não essencial, foi escolhido porque vem sendo utilizado após reticulação convencional do PB com GA, resultando na redução da citotoxicidade localizada e sistêmica, permitindo a proliferação das células endoteliais na superfície do PB e, ao mesmo tempo, reduzindo significativamente índices de calcificação em estudos in vivo. 51,64,65 Entretanto, os resultados para diminuir a calcificação de materiais fixados com GA, seguido de tratamento com aminoácidos como Glu, são controversos, pois vão desde a redução significativa da calcificação 51,64,65 até índices maiores de calcificação. 48 Esses dados têm suscitado dúvidas quanto à eficácia do tratamento com Glu para redução simultânea de toxicidade e dos índices de calcificação. Uma avaliação mais detalhada desses procedimentos sugere que tais discrepâncias podem ser atribuídas a diferenças nas condições experimentais.

30 Introdução - 8 Quando o PB é fixado com GA e, em seguida, submetido a tratamento com Glu em ph 3,0, baixos índices de calcificação são obtidos. 65 Por outro lado, o mesmo tratamento em ph 6,0 mostra índices de calcificação elevados. 48 Na literatura, estudos in vitro de biopróteses valvulares cardíacas de PB tratadas com Glu, após reticulação convencional com GA, são escassos. 51,66 Braile et al. (2011), 66 comparando resultados de desempenho hidrodinâmico e durabilidade acelerada entre próteses valvulares de PB submetidas a tratamento com Glu após fixação com GA, constataram que parâmetros como gradiente pressórico, área efetiva, fração de regurgitação (desempenho) e durabilidade apresentaram resultados similares, sugerindo que alterações morfológicas produzidas pelo Glu não influenciaram no desempenho da prótese valvular. Também resultados de pesquisas experimentais in vivo sobre calcificação de PB, submetido a tratamento químico com Glu utilizando implantes subcutâneos em ratos, são controversos. Alguns autores verificaram que essa estratégia reduziu significativamente a taxa de calcificação. 50,64,65,67 Por outro lado, Jorge-Herrero et al. (1996) 48 constataram que não houve diminuição significativa na quantidade de cálcio acumulado no PB.

31 Introdução - 9 Considerando que trabalhos pré-clínicos sobre tratamento do PB com GA+Glu em ph alcalino e ácido, utilizado na confecção de próteses valvulares cardíacas, não foram encontrados na literatura, justifica-se o estudo in vitro e in vivo de PB e biopróteses tratadas com Glu. Com este estudo pretende-se avaliar: 1. Se o tratamento anticalcificante propiciará a despolimerização das ligações de GA e, ao mesmo tempo, inativação de aldeídos livres presentes na matriz extracelular do PB fixado com GA. 2. Se o tratamento anticalcificante propiciará melhor preservação da estrutura desse tecido biológico, podendo minimizar alguns mecanismos de calcificação de biopróteses sem efeitos deletérios. 3. Se o PB que receberá o tratamento anticalcificante será adequado para confecção de biopróteses cardíacas valvulares, levando à redução do índice da calcificação e ao aumento da vida útil da válvula cardíaca no paciente.

32 Introdução Objetivo O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro e in vivo o PB processado com GA e tratado com Glu, considerando-se: caracterização mecânica, térmica e morfológica do pericárdio bovino tratado com GA+Glu para confecção de bioprótese valvular cardíaca; avaliação do índice de calcificação de implantes de PB tratado com GA+Glu em subcutâneo de rato; avaliação da durabilidade acelerada de biopróteses valvulares cardíacas com a utilização deste PB tratado com GA+Glu.

33 2. MATERIAIS E MÉTODOS

34 Materiais e Métodos - 12 Foram utilizados 180 PB (n=180), obtidos de animais machos com até 60 meses de idade, recolhidos em frigoríficos de classe internacional, inspecionados pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF). A preparação do PB compreendeu uma série de etapas que envolveram a coleta do PB, a limpeza, o curtimento em GA e a conservação em formaldeído Tratamentos Químicos para Reticulação do Pericárdio Bovino Os PB foram tratados quimicamente de duas formas: tratamento convencional do PB com GA 0,5%, denominado tratamento controle PB GA, realizado em 90 PB (n=90); tratamento experimental do PB com GA 0,5% e Glu 1%, denominado tratamento anticalcificante PB GA+Glu, realizado em 90 PB (n=90). O tratamento químico com GA 0,5% promove a reticulação das fibras de colágeno do PB, mantendo o alinhamento ou paralelismo dos feixes colágenos, de modo que não sofram estiramento ou alteração da sua ondulação natural. Dessa forma, os pericárdios terão a devida elasticidade mecânica, necessária para a correta funcionalidade da bioprótese.

35 Materiais e Métodos Tratamento Controle (PB GA) O tratamento químico de reticulação com GA 0,5%, no grupo controle PB GA, foi realizado de acordo com o estudo de Braile (1990). 15 O processo compreende quatro etapas, cada uma com um tempo específico de tratamento, totalizando 18 dias. No frigorífico, os PB ricos em fibras colágenas e livres de gordura foram visualmente selecionados e transportados até o laboratório, em galões plásticos contendo solução de cloreto de sódio (NaCl) 0,9% e sulfato de magnésio (MgSO 4 ) 8 mosmóis, tamponado em ph 7,4, com tampão fosfato 0,13M/l, no qual é transportado para o laboratório a temperatura de 6±4ºC, permanecendo no máximo por quatro horas. Essa solução é chamada de solução de limpeza. No laboratório os PB foram colocados em nova solução de limpeza, sendo anteriormente retirados a gordura e restos de tecidos (debris). A seguir, foram montados em um suporte e submetidos ao tratamento de reticulação (curtimento) em solução de fixação de GA 0,5%. Depois de curtido, os PB foram lavados em solução de NaCl 0,9% e mantidos por três dias em solução conservadora de formaldeído a 4%. Após este período os PB foram submetidos a um tratamento com uma solução oxidante de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), por um período de 4 a 6 horas. Este procedimento tem como objetivo retirar dos PB as substâncias

36 Materiais e Métodos - 14 antigênicas, as impurezas e restos celulares, além de aumentar a resistência do tecido. Uma vez completada esta etapa, os pericárdios foram novamente lavados em solução de NaCl 0,9% e colocados em solução conservadora de formaldeído a 4%. Após esta fase, foram submetidos a testes de controle de qualidade, sendo apenas liberados aqueles que atenderem aos critérios previamente estabelecidos, com base em mínimos exigíveis. A Figura 1 apresenta o fluxograma com as etapas do processo de reticulação do PB GA.

37 Materiais e Métodos - 15 Figura 1: Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino do grupo controle (PB GA). A espessura dos pericárdios liberados para a confecção das biopróteses foi rigorosamente medida (0,18 mm a 0,50 mm), de modo a adequar esse valor em razão direta com o diâmetro do anel da válvula a ser montada.

38 Materiais e Métodos - 16 Desde a coleta dos pericárdios até a sua liberação para confecção das válvulas, o índice de rejeição atinge 90% Tratamento Anticalcificante (PB GA+Glu) O tratamento químico de reticulação com GA 0,5% no grupo anticalcificante PB GA+Glu foi idêntico ao do grupo controle PB GA até a 4ª curtição com GA (Figuras 1). A partir desta etapa, os PB foram submetidos a um tratamento de choque de ph com uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 0,1N por 24 horas, e então tratados com ácido acético 0,01N em ph 7,4 para neutralização do ph. Em seguida, receberam tratamento com a solução anticalcificante de Glu a 1% em ph 3,5 por 24 horas. Na sequência, os PB foram lavados em solução NaCl 0,9% para eliminação do excesso de Glu, neutralizados em solução de NaOH 0,01N em ph 7,4 e mantidos por 3 dias em solução conservadora de formaldeído. A partir desta etapa os procedimentos foram idênticos aos realizados nos PB do grupo controle PB GA, envolvendo as etapas com a solução antioxidante, conservação em solução de formaldeído e confecção das válvulas (Figura 2).

39 Materiais e Métodos - 17 Figura 2: Fluxograma do tratamento do pericárdio bovino (PB) do grupo anticalcificante com ácido glutâmico (Glu) PB GA+Glu.

40 Materiais e Métodos Testes Físicos Todos os PB dos grupos controle (n=90) e anticalcificante (n=90) foram submetidos aos testes físicos de resistência mecânica e análise térmica Teste de Resistência Mecânica O teste de resistência mecânica fornece os valores de tensão de ruptura (kgf/mm 2 ), elongação (%) e tenacidade (%), obtidos a partir de uma carga aplicada sobre uma amostra de PB (corpo de prova). À medida que é aplicada uma carga sobre o corpo de prova, esta é automaticamente correlacionada com a elongação provocada no material, acabando por gerar um diagrama de carga-elongação. A partir desse diagrama foram calculados os valores para tensão, ruptura, elongação e índice de tenacidade. A elongação é a deformação sofrida pelo corpo de prova do PB, até que ocorra a ruptura. A tenacidade é a medida da energia necessária para romper o tecido. Os parâmetros de resistência mecânica foram avaliados como requerido pela Norma - ISO 5840: Cardiovascular Implants - Cardiac Valve Prostheses 68 e os ensaios realizados conforme a norma ASTM D638 (Standard Test Method for Tensile Properties of Plastics). 69

41 Materiais e Métodos - 19 O teste foi realizado em todas as amostras de PB quimicamente tratadas com solução anticalcificante e naquelas com tratamento controle, no equipamento Q-Test (MTS Systems Corporation número de série: M206170/ Figura 3). Figura 3: Equipamento Q-Test para teste de resistência mecânica do pericardio bovino. Para confecção das válvulas foram selecionados os PB que atingiram os parâmetros de aceitação: Tração 1,50 kgf / mm 2 ; Elongação 17,0%; Tenacidade 11,0%.

42 Materiais e Métodos Análise Térmica O Teste de Encolhimento representa a temperatura na qual o PB encolhe 1/5 do seu comprimento original, possibilitando uma avaliação indireta do grau de reticulação do colágeno com o GA, indicando se o tecido foi efetivamente fixado. O equipamento de análise térmica para realização do teste de encolhimento do PB, desenvolvido pela Braile Biomédica, consiste em um sistema de aquecimento de água controlado eletronicamente, cuja temperatura varia durante todo o teste, na razão de 1ºC/min, até atingir o valor desejado (Figura 4). O corpo de prova (2,0 cm x 0,8 cm) foi fixado nas garras e o equipamento acionado para aquecer o banho-maria (1ºC/min). No momento em que a amostra apresentou um encolhimento de 20% de seu tamanho, o sensor foi tracionado acionando o alarme. Com o alarme acionado, o termômetro digital fixou-se em um valor que corresponde ao valor da temperatura de encolhimento. A temperatura mínima considerada para garantir a fixação adequada das fibras de colágeno pelo GA foi de 83 C.

43 Materiais e Métodos - 21 Figura 4: Equipamento Braile Biomédica para teste de encolhimento do pericárdio bovino Avaliação Estrutural e Ultraestrutural Microscopia de Luz Após os tratamentos, as amostras de PB de ambos os grupos foram fixadas em formaldeído 10%, lavadas em água, desidratadas em etanol, clarificadas em xilol e então incluídas em paraplast. Cortes histológicos

44 Materiais e Métodos - 22 com 5 µm de espessura foram obtidos em micrótomo rotativo semiautomático. Para cada fragmento foram analisados cerca de cinco cortes histológicos. Após a desparafinização e hidratação, os cortes foram submetidos à coloração por hematoxilina-eosina (HE), tricrômio de Masson e Orceína. As fotomicrografias coloridas foram obtidas no fotomicroscópio Zeiss Jeneval Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Amostras (1,0 cm 2 ) de PB GA e GA+Glu, após serem quimicamente tratadas e adicionadas em tampão fosfato 0,13M em ph 7,4, foram lavadas com água destilada (3 vezes por 30 min) para remoção do tampão fosfato. Em seguida foram congeladas a -90 C e liofilizadas em um equipamento Liofilizador Liobras Mod. L101 (LIOTOP). A liofilização é um processo que remove a água ou outros solventes de uma solução ou um produto por sublimação, em condições de baixa temperatura e pressão. As amostras de PB liofilizadas foram recobertas com ouro em Metalizador Balsers modelo SDC 050. As fotomicrografias para os materiais estudados foram obtidas em um equipamento ZEISS DSM 960, operando com feixe de elétrons entre 10 e 20 kev, no Centro de

45 Materiais e Métodos - 23 Caracterização e Desenvolvimento de Materiais da Universidade Federal de São Carlos Estudos in Vivo A metodologia utilizada para o implante de PB em subcutâneo de ratos seguiu os procedimentos descritos na norma ISO (2000) 70 e Guidance Notes for Analysis and Evaluation of Repeat-Dose Toxicity Studies (2000), 71 após aprovação pelo Comitê de Ética no Uso de Animais CEUA da TECAM (Parecer Nº 8255/ ) (Anexo 1). Foi utilizado um total de 30 ratos (n=30) machos da linhagem Wistar (Rattus novergicus), divididos em dois grupos: Grupo controle PB GA com 15 animais (n=15) e Grupo anticalcificante PB GA+Glu com 15 animais (n=15). Cada grupo foi subdividido em três subgrupos com 5 animais cada (n=5), de acordo com o tempo de implante de 14, 28 e 60 dias, conforme apresentado na Tabela 1.

46 Materiais e Métodos - 24 Tabela 1: Protocolo de implante de PB com tratamentos anticalcificante PB GA+Glu e controle PB GA, em subcutâneo de ratos. Período do implante (dias) PB GA+Glu (n) PB GA (n) PB = pericárdio bovino; GA = glutaraldeído; Glu = ácido glutâmico; n = número Teste de Implante Os animais foram aclimatados às condições de laboratório por cinco dias antes do início do teste e foram examinados durante esse período; animais com quaisquer sinais de anormalidade não foram utilizados no estudo. Nesse período foram acondicionados em caixas de polipropileno convencionais (41,0 x 34,0 x 16,0 cm) contendo, no máximo, cinco animais por caixa e alimentados com ração e água filtrada à vontade. As caixas com os animais foram identificadas com números, número de animais, sexo, data de nascimento, número do protocolo e as datas do teste. Os animais foram pesados e identificados com canetas coloridas de forma a permitir a avaliação individual. Cada animal recebeu dois implantes de PB em subcutâneo, sendo um controle (PB GA) e um tratado (PB GA+Glu), com 1 cm 2 cada.

47 Materiais e Métodos - 25 O PB conservado em formaldeído 10% foi lavado por submersão em solução de NaCl 0,9% (soro fisiológico) por 15 minutos por cinco vezes. Cada fragmento implantado foi pesado em balança analítica, modelo AB 204/S (Mettler Toledo), antes da realização do implante. Os animais foram anestesiados com a associação de cetamina 10% (60 mg/kg), xilazina 2% (5 mg/kg) e diazepan 0,5% (5 mg/kg) pela via intraperitoneal. Foram realizadas tricotomia e antissepsia da região do gradil costal (região dorso lateral) de ambos os lados de cada animal. A distribuição dos locais de implante foi: A. Região dorso lateral anterior esquerda: PB tratamento anticalcificante PB GA+Glu; B. Região dorso lateral posterior esquerda: PB tratamento controle PB GA. Foi realizada incisão em cada ponto descrito anteriormente e, após o posicionamento do implante, suturada com fio inabsorvível (nylon 2-0) em padrão de ponto simples separado. Cada animal foi mantido isolado em caixas convencionais para a espécie durante os sete primeiros dias de observação, com troca diária de bandagem semioclusiva, para garantir a cicatrização completa da ferida cirúrgica. Todos os animais foram pesados no início do período de exposição e semanalmente, para acompanhamento de ganho de peso. Os animais

48 Materiais e Métodos - 26 foram individualmente observados por um período de 14, 28 e 60 dias, cinco dias por semana, para avaliação de sinais clínicos de toxicidade e sete dias por semana para a presença de animais mortos e moribundos. Uma vez por semana, no momento da pesagem dos animais, foi realizada nova tricotomia e remarcação das áreas do implante. Após 14, 28 e 60 dias, os animais foram eutanasiados com uso de dióxido de carbono e realizada necropsia. Durante a necropsia foram colhidos os locais de pele contendo o implante dos dois pontos implantados, nos três grupos experimentais. A região de implante nos grupos experimentais foi retirada com um mínimo de 2 mm de área adjacente. Cada explante foi novamente pesado e uma parte de cada um (aproximadamente 50%) foi utilizada para dosagem do cálcio. O material remanescente foi fixado em formol 10% e processado conforme item Foram realizadas as colorações de HE, Von Kossa e Tricrômio de Masson para observação de inflamação, calcificação e fibrose, respectivamente, por histomorfometria Determinação do Índice de Calcificação

49 Materiais e Métodos - 27 A determinação do índice de calcificação dos PB explantados foi realizada por Espectroscopia de Emissão Ótica com Plasma Induzido. Para isto, as amostras de PB foram submetidas à calcinação, um processo em que a matéria orgânica é submetida a temperaturas superiores a 400 C, por períodos de tempo pré-estabelecidos, obtendo-se, ao final, um resíduo de mineralização formado por sais presentes na amostra e carbonatos derivados da decomposição da matéria orgânica em temperatura elevada. As etapas envolvidas no processo de determinação do índice de calcificação estão descritas abaixo Calcinação dos Cadinhos Vazios Cadinhos limpos foram numerados e calcinados em mufla a 900 C por um período de quatro horas. Após resfriamento foram pesados e novamente colocados na mufla para mais uma sessão de calcinação. Como não houve variação de peso de uma pesagem para outra, o protocolo foi mantido em apenas um tempo de calcinação de quatro horas para o restante dos cadinhos Secagem dos Explantes Os explantes foram colocados nos cadinhos calcinados e transferidos para estufa a 90 C por quatro horas. Após este período os

50 Materiais e Métodos - 28 cadinhos foram resfriados por oito horas e pesados. O procedimento foi repetido e não houve variação de peso de uma pesagem para outra, portanto o protocolo foi mantido em apenas uma secagem Calcinação dos Explantes Os cadinhos contendo as amostras secas foram colocados em uma mufla a 900 C por quatro horas. Após este período, os cadinhos foram removidos, deixados resfriar e pesados. O procedimento foi repetido até que o peso tornasse constante e o resíduo de calcinação foi determinado pela diferença entre o peso do cadinho com o resíduo e o cadinho vazio Determinação do Índice de Calcificação dos Explantes Os resíduos de calcinação foram dissolvidos em 2 ml de solução de ácido nítrico 1,0M e transferidos para frascos identificados, fechados hermeticamente, encaminhados para o Centro de Caracterização e Desenvolvimento de Materiais da Universidade Federal de São Carlos, para serem analisados por Espectrometria de Emissão Ótica com Plasma Induzido (ICP OES), em equipamento da Varian modelo Vista AX (IT AQ- 206 rev013). Para o elemento cálcio, o limite de detecção instrumental encontrado foi de 0,018 (mg/l) ppm. O volume utilizado por amostra no equipamento foi de 1 ml.

51 Materiais e Métodos Análise Fractal Para auxiliar na avaliação comparativa do aspecto histológico de uma forma mais objetiva, foi utilizado o cálculo da dimensão fractal. A dimensão fractal é a dimensão que caracteriza uma estrutura fractal, ou seja, uma estrutura não-homogênea, não-simétrica. Os padrões irregulares como, por exemplo, a forma de uma nuvem, de uma montanha, etc., necessita da existência de uma forma diferente de geometria, que atenda à descrição desses padrões fragmentados existentes na natureza. Para isso, o matemático francês Benoit Mandelbrot criou o termo fractal, originário do latim fractus, cujo significado é quebrado, fragmentado, para descrever alguns tipos de fenômenos espaciais e temporais. 72 As medidas da dimensão fractal foram realizadas utilizando o software ImageJ (Image Processing and Analysis in Java), versão 1.45k. Foram analisadas imagens de microscopia de luz dos PB do grupo controle PB GA e grupo anticalcificante PB GA+Glu, antes e depois do implante subcutâneo (14, 28 e 60 dias de implante). As curvas para determinação da dimensão fractal foram geradas pelo método de Box-Couting, um dos métodos mais conhecidos e utilizados para estimar a dimensão fractal de uma forma ou imagem, pela sua simplicidade de implementação. Esse método consiste em cobrir a