UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS COMPARAÇÃO ENTRE DUAS VACINAS COMERCIAIS CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES DE ÁREAS ENDÊMICAS: IgG E SUBCLASSES, PARASITISMO E TRANSMISSÃO PARASITÁRIA POR XENODIAGNÓSTICO Consuêlo Barreto Fernandes SALVADOR - BAHIA FEVEREIRO

2 Sistema de Bibliotecas da UFBA Fernandes, Consuêlo Barreto. Comparação entre duas vacinas comerciais contra leishmaniose visceral em cães de áreas endêmicas: IgG e subclasses, parasitismo e transmissão parasitária por xenodiagnóstico / Consuêlo Barreto Fernandes f.: il. Orientadora: Profª. Drª. Stella Maria Barrouin Melo. Coorientadora: Profª. Drª. Daniela Farias Larangeira. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, Salvador, Vacinas. 2. Teste imunoenzimático. 3. Leishmaniose visceral. 4. Leishmune. 5. Leish-Tec. I. Melo, Stella Maria Barrouin. II. Larangeira, Daniela Farias. III. Universidade Federal da Bahia. Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia. IV. Título. CDD CDU

3 ii CONSUÊLO BARRETO FERNANDES COMPARAÇÃO ENTRE DUAS VACINAS COMERCIAIS CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES DE ÁREAS ENDÊMICAS: IgG E SUBCLASSES, PARASITISMO E TRANSMISSÃO PARASITÁRIA POR XENODIAGNÓSTICO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal nos Trópicos, da Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Área de concentração: Saúde Animal. Orientadora: Prof. Dra. Stella Maria Barrouin Melo Coorientadora: Prof. Dra. Daniela Farias Larangeira SALVADOR - BA FEVEREIRO 2013

4 iii CONSUÊLO BARRETO FERNANDES COMPARAÇÃO ENTRE DUAS VACINAS COMERCIAIS CONTRA LEISHMANIOSE VISCERAL EM CÃES DE ÁREAS ENDÊMICAS: IgG E SUBCLASSES, PARASITISMO E TRANSMISSÃO PARASITÁRIA POR XENODIAGNÓSTICO Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos Salvador, 28 de fevereiro de Comissão Examinadora: Prof. Dra. Stella Maria Barrouin Melo MEVZ UFBA Orientador Presidente Prof. Dra. Deborah Bittencourt Mothé Fraga MEVZ UFBA Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela ICS/UFBA

5 iv Que eu continue com vontade de viver, mesmo sabendo que a vida é, em muitos momentos, uma lição difícil de ser aprendida. Que eu permaneça com vontade de ter grandes amigos, mesmo sabendo que, com as voltas do mundo, eles vão indo embora de nossas vidas. Que eu realimente sempre a vontade de ajudar as pessoas, mesmo sabendo que muitas delas são incapazes dever, sentir, entender ou utilizar essa ajuda. Que eu mantenha meu equilíbrio, mesmo sabendo que muitas coisas que vejo no mundo escurecem meus olhos. Que eu realimente a minha garra, mesmo sabendo que a derrota e a perda são ingredientes tão fortes quanto o sucesso e a alegria. Que eu atenda sempre mais à minha intuição, que sinaliza o que de mais autêntico eu possuo. Que eu pratique mais o sentimento de justiça, mesmo em meio à turbulência dos interesses. Que eu manifeste amor por minha família, mesmo sabendo que ela muitas vezes me exige muito para manter sua harmonia. E, acima de tudo... Que eu lembre sempre que todos nós fazemos parte dessa maravilhosa teia chamada vida, criada por alguém bem superior a todos nós! E que as grandes mudanças não ocorrem por grandes feitos de alguns e, sim, nas pequenas parcelas cotidianas de todos nós! Chico Xavier

6 Dedico este trabalho â minha família: Aos meus pais Walmir e Maria José, e â minha irmã Êrika, pela paciência e apoio incondicional; À minha sobrinha Maria Flor, acontecimento revolucionário e integrante essencial do nosso jardim-vida; Ao meu noivo Ricardo, presente da vida e parceiro incansável; E aos dois anjos que encheram nossas vidas de brilho por dezoito anos, me inspiraram durante esta jornada, e agora nos prestigiam com suas vizitas em sonho, Rex e Ranna. v

7 vi AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, cuja presença foi sentida a cada passo nesta jornada... À minha família e ao meu noivo Ricardo, pela compreensão e amparo em todos os momentos; À minha amiga-irmã Denise Soledade, brevemente Doutora, pela amizade infalível, pelo exemplo de competência, equilíbrio, superação, e valioso auxílio; À Dra. Stella Maria Barrouin Melo, pela orientação e por ter acreditado e apostado na minha capacidade; À Emanuelle Gomes, Ester Cardoso, Alex Oliva, Tiago Feitosa e toda equipe do Laboratório de Infectologia Veterinária (LIVE), sem a qual este trabalho não seria possível; em especial à Clauceane de Jesus pela preciosa parceria e serenidade fundamental durante os ELISAs e em todos os momentos deste projeto; à Lídia Oliveira e Paulo Bahiano pelo apoio impagável nas coletas e exames clínicos; à Danielle Leal, Rafaela Gonçalves e Diná Becerra pelo essencial auxílio na biologia molecular; e à Dra. Daniela Larangeira por conduzir-me no difícil momento das primeiras punções; Às colegas do Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCM), Lívia Mendonça, Sabrina Lambert, e em especial Bárbara Paraná, por todo o apoio prestado; À equipe do Laboratório de Patologia e Biointervenção (LPBI) da FIOCRUZ Bahia, em especial ao Médico Veterinário Marcelo Bordone, pela sempre solícita e valiosa colaboração nos cultivos; Ao Batalhão de Polícia de Choque da Bahia, em especial ao Médico Veterinário Edgard Passos, sempre prestativo e disposto a ajudar, por todo o auxílio prestado; aos guardiões dos cães participantes deste estudo, que gentilmente nos receberam tantas vezes em suas

8 vii casas, prestando imprescindível colaboração; e aos cães, que foram nossa grande motivação; A todo o corpo docente, funcionários e colegas da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da UFBA que direta ou indiretamente participaram deste estudo; Às instituições FAPESB, CNPq e CAPES pelo apoio financeiro que viabilizou o desenvolvimento deste projeto. O valor de cada sim dado por vocês sempre esteve muito além da ajuda momentânea... A todos, minha enorme gratidão!!

9 viii LISTA DE FIGURAS Figura 1. Medianas dos valores das densidades ópticas (DOs) para IgG total, obtidas utilizando ELISA indireto, de 75 cães submetidos ao protocolo completo de vacinação contra leishmaniose visceral com Leishmune (G2, n=36) ou Leish-Tec (G3, n=39) e não infectados após 11 meses de monitoramento. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Valor de ponte de corte: 0,280. Os asteriscos indicam as diferenças estatísticas entre as vacinas (p < 0,05 teste de Mann- Whitney) Figura 2. Medianas dos valores das densidades ópticas (DOs) para IgG1e IgG2 (figuras A e B, respectivamente), obtidas utilizando ELISA indireto, de 75 cães submetidos ao protocolo completo de vacinação contra leishmaniose visceral com Leishmune (G2, n=36) ou Leish-Tec (G3, n=39) e não infectados após 11 meses de monitoramento. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Valor de ponte de corte para IgG1-0,180 e IgG2-0,123. Os asteriscos indicam as diferenças estatísticas entre as vacinas (p < 0,05, teste de Mann-Whitney) Figura 3. Valores das densidades ópticas (DOs) para IgG total, IgG1e IgG2 (figuras A, B e C, respectivamente), obtidas utilizando ELISA indireto, de 82 cães submetidos ao protocolo completo de vacinação contra leishmaniose visceral com Leishmune (G2, n=40) ou Leish-Tec (G3, n=42). T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T

10 ix LISTA DE TABELAS Tabela 1. Caracterização dos cães participantes do estudo no grupo 1 (G1) 30 cães não imunizados e naturalmente infectados; grupo 2 (G2) 40 cães imunizados com Leishmune ; grupo 3 (G3) 42 cães imunizados com Leish-Tec Tabela 2. Tabela 3. Sinais clínicos, densidades ópticas (DO) para IgG, IgG1 e IgG2 obtidas utilizando ELISA indireto, parasitemia e xenodiagnóstico de animais imunizados com Leishmune (grupo G2) e Leish-Tec (grupo G3), naturalmente infectados por Leishmania. Resultados obtidos aos 11 meses após a primeira dose de vacina (T6) Comparação das reações adversas ocorridas em cães vacinados com Leishmune (grupo G2) e Leish-Tec (grupo G3) no período perivacinal: T0 primeira dose da vacina; T1 segunda dose, 21 dias após a primeira; T2 terceira dose, 21 dias após a segunda Tabela 4. Animais imunizados com Leishmune (G2, n=36) e Leish-Tec (G3, n=39), não infectados após 11 meses de monitoramento, que apresentaram DOs acima do ponto de corte para IgG, IgG1 e IgG2 obtidas utilizando ELISA indireto. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T Tabela 5. Tabela 6. Dados quantitativos das avaliações clínicas e laboratoriais após 11 meses de monitoramento (T6) dos animais dos quatro grupos experimentais: G1- controle positivo; G2 - vacinados com Leishmune ; G3 - vacinados com Leish-Tec e G4 - cães com resultados limítrofes ao ponto de corte no ELISA antes da primeira dose de vacina Sinais clínicos, densidades ópticas (DO) para IgG, IgG1 e IgG2 obtidas utilizando ELISA indireto, parasitemia e xenodiagnóstico de animais do grupo G4 - nove cães hígidos com resultados limítrofes ao ponto de corte no ELISA (DO entre 0,224 e 0,336) antes da primeira dose de vacina. Resultados observados aos 11 meses após a primeira dose de vacina (T6)... 48

11 x SUMÁRIO Página Resumo Abstract Introdução Revisão de literatura Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral Expansão da doença Agente etiológico e vetor Aspectos imunopatológicos e clínicos da leishmaniose visceral canina A resposta imune do cão à infecção por Leishmania chagasi A fisiopatologia e clínica da doença canina Métodos de diagnóstico clínico e laboratorial da leishmaniose visceral canina Avaliação clínica ambulatorial e de patologia clínica Métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-leishmania Métodos diretos para detecção de infecção por Leishmania Métodos moleculares para detecção de DNA parasitário Métodos parasitológicos Avaliação da transmissibillidade da Leishmania ao vetor pelos cães O controle da doença no Brasil e no mundo As vacinas contra leishmaniose visceral canina como medida de controle da endemia A vacina Leishmune A vacina Leish-Tec Hipótese de trabalho Objetivos Objetivo geral Objetivos específicos Material e métodos Resultados e discussão... 34

12 xi 7. Conclusão Referências bibliográficas... 50

13 1 Comparação entre duas vacinas comerciais contra leishmaniose visceral em cães de áreas endêmicas: IgG e subclasses, parasitismo e transmissão parasitária por xenodiagnóstico. RESUMO O êxito da vacinação de cães poderia reduzir significativamente a incidência de leishmaniose visceral (LV) zoonótica, entretanto, ainda são necessários estudos sobre a viabilidade da utilização de vacinas caninas na Saúde Pública no Brasil. Neste estudo foram avaliadas as duas vacinas comercializadas atualmente no Brasil segundo parâmetros de segurança e proteção contra infecção, e transmissão de parasitos por cães naturalmente expostos à infecção em área endêmica para leishmaniose visceral. Entre julho de 2010 e julho de 2012, 30 cães naturalmente infectados, domiciliados em áreas endêmicas para LV canina, foram selecionados para compor o grupo 1 (G1) e 100 cães saudáveis das mesmas áreas foram imunizados com as vacinas Leishmune, grupo 2 (G2), ou Leish-Tec, grupo 3 (G3). Os sinais clínicos pós-vacinais, sorologia e parasitismo esplênico foram monitorados durante o período vacinal, vinte e um dias, 3, 6 e 9 meses após a vacinação. A transmissão parasitária foi avaliada por xenodiagnóstico no 11º mês de monitoramento. Efeitos adversos como apatia, dor e edema local ocorreram em 2,5% (1/40) e 14,3% (6/42) dos animais do G2 e G3, respectivamente. Ocorreu um pico de resposta humoral para IgG aos 21 dias após a primeira dose da vacina no G2 e 21 dias após a segunda dose no G3; a taxa de soroconversão aos 11 meses foi de 27,8% no G2 e 30,8% no G3. Os animais do G2 apresentaram maiores níveis de subclasses IgG1 e IgG2 em comparação ao G3, com diferenças significativas (p=0,000) e pico de reatividade 21 dias após a terceira dose da vacina no G2 para ambas as subclasses. Os animais do G1 apresentaram maiores reatividades para IgG, IgG1 e IgG2 com diferenças significativas (p=0,000) quando comparados aos G2 e G3. Ao final do estudo, parasitismo esplênico foi detectado em 11,1% (4/36) dos animais do G2 e 8,8% (3/34) dos cães do G3. A transmissão de Leishmania dos cães aos flebotomíneos no ensaio xenodiagnóstico foi detectada em 36,6% (11/30), 2,9% (1/34) e 6,1% (2/33) dos animais do G1, G2 e G3, respectivamente. Não foram encontradas diferenças significativas quanto aos aspectos

14 2 clínicos, parasitológicos, de soroconversão e transmissibilidade do parasito ao vetor entre os cães vacinados com as vacinas Leishmune ou Leish-Tec. Os animais vacinados com a Leishmune apresentaram maiores níveis de resposta humoral de subclasses de IgG. Palavras-chave: ELISA, aspirado esplênico, cultivo, PCR, Leishmune, Leish-Tec Comparison of two commercial vaccines for leishmaniasis in dogs naturally exposed to infection in endemics areas: IgG subclasses, parasitism and transmission by xenodiagnosis ABSTRACT A successful vaccination of dogs could significantly reduce the incidence of zoonotic visceral leishmaniosis (VL), however studies about the viability of the use of canine vaccines in the Brazil s Public Health system are still necessary. In this study, we evaluated the two vaccines currently commercialized in Brazil for their safety and protection against infection, and transmission of parasites by dogs naturally exposed to the infection in endemics areas for visceral leishmaniosis. Between July 2010 and July 2012, 30 naturally infected dogs, living in areas endemic for LV canina were selected to compose the group 1 (G1) and 100 healthy dogs from the same areas were immunized with either vaccines Leishmune, group 2 (G2) or Leish-Tec, group 3 (G3). Postvaccinal clinical signs, serology and splenic parasitism were monitored during the vaccination period, twenty-one days, 3, 6 and 9 months after vaccination. The parasitic transmission was evaluated by xenodiagnosis in the 11 th month of monitoring. Adverse reactions such as apathy, pain and injection site swelling occurred in 2,5% (1/40) e 14,3% (6/42) of the animals in G2 and G3, respectively. A IgG humoral response peak occurred 21 days after the first vaccine dose in G2 and 21 days after the second dose in G3; the seroconversion tax at 11 months was 27,8% in G2 and 30,8% in G3. The animals in G2 presented higher levels of IgG1 and IgG2 subclasses when compared with G3, with significant differences (p = 0,000) and reactivity peak 21 days after the

15 3 third dose of vaccine in G2 for both subclasses. The G1 animals showed higher reactivity for IgG, IgG1 and IgG2 with significant differences (p = 0,000) when compared to G2 and G3. In the end of the study, splenic parasitism was detected in 11,1% (4/36) of the animals in G2 and 8,8% (3/34) of the dogs in G3. The transmission of Leishmania to the phlebotomine sandflies in the xenodiagnosis assay was detected in 36,6% (11/30), 2,9% (1/34) and 6,1% (2/33) of the animals in G1, G2 and G3, respectively. There were no relevant differences regarding the clinical aspects, parasitology, seroconversion and parasite transmissibility to the vector between the dogs vaccinated with the vaccines Leishmune or Leish-Tec. The animals vaccinated with Leishmune presented higher levels of humoral response of IgG subclasses. Keywords: ELISA, splenic aspiration, cultivation, PCR, Leishmune, Leish-Tec

16 4 1. INTRODUÇÃO As áreas endêmicas para leishmaniose visceral (LV) têm aumentado durante os últimos 10 anos, e apesar da subnotificação de casos, cerca de novos casos de LV humana ocorrem anualmente (WHO, 2012a) na Ásia, Europa, Oriente Médio, África e nas Américas (WHO, 2012b). O principal agente etiológico desta zoonose nas Américas é a Leishmania chagasi (SHERLOCK, 1996), cujo principal vetor é o flebotomíneo Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (LUTZ e NEIVA, 1912). No ano de 2011 foram confirmados casos de LV humana no Brasil (BRASIL, 2012), sendo o cão considerado o principal reservatório da infecção em áreas urbanas (MAIA-ELKHOURY et al., 2008). Entretanto, as tentativas governamentais de controle da LV, baseadas principalmente na eutanásia de cães soropositivos, é uma prática onerosa, que encontra resistência ética e emocional, e não têm impedido o aumento do número de casos humanos no País (COURTENAY et al., 2002; MAIA- ELKHOURY et al., 2008). Segundo alguns autores, o êxito da vacinação de cães pode reduzir significativamente a incidência da LV humana em áreas endêmicas, sendo a estratégia de controle com melhor relação custo-benefício a ser adotada (DYE, 1996; ALVAR et al., 2004). No Brasil, primeiro país no mundo a ter vacinas contra LV canina sendo comercializadas, existem atualmente duas vacinas registradas no Ministério da Agricultura (MAPA): a Leishmune, registrada em 2003 e baseada no antígeno glicoproteico ligante de fucose e manose (FML) de Leishmania donovani com adjuvante saponina (da SILVA et al., 2001; BORJA-CABRERA et al., 2002; PARRA et al., 2007), e a Leish-Tec, registrada em 2007, que contém o antígeno A2, proteína recombinante do estágio amastigota de várias espécies de Leishmania, e como adjuvante a saponina (COELHO et al., 2003; ZANIN et al., 2007; FERNANDES et al., 2008). Estas vacinas, somadas à CaniLeish (Virbac, França), lançada em 2011 na União Européia (MORENO et al., 2012), são as três únicas vacinas comerciais contra a LV canina em todo o mundo até o momento. Entretanto, apesar das vacinas registradas no MAPA cumprirem com os requisitos técnicos exigidos no momento da concessão dos registros (anos 2003 e 2007), o Ministério da Saúde (MS) do Brasil não autorizou o seu uso em Saúde Pública, devido

17 5 à falta de dados convincentes sobre a efetividade desses produtos no controle da doença (BRASIL, 2009a). Segundo o MS, ensaios biológicos com as vacinas contra LV canina devem demonstrar a possibilidade de distinção entre infecção natural pela Leishmania chagasi e a resposta imune ao produto vacinal por testes sorodiagnósticos de rotina, além da redução da incidência de infecção, doença e transmissão do parasito ao vetor (BRASIL, 2007). Quanto aos estudos sobre transmissibilidade da Leishmania ao vetor por cães vacinados, o MS exige a comprovação inequívoca da sua capacidade de bloquear o ciclo da doença (BRASIL, 2005). Os estudos publicados até o momento pelos autores das vacinas (SARAIVA et al., 2006; FERNANDES et al., 2008) ainda não atenderam tal demanda do MS. Diante deste cenário, o presente estudo é uma contribuição independente para elucidar a viabilidade da utilização dessas vacinas na Saúde Pública do Brasil, trazendo o incremento qualitativo das pesquisas sobre transmissibilidade versus vacina, consequentemente colaborando com informações relevantes para a adequação da sistemática adotada no controle e prevenção da LV neste País.

18 6 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral Expansão da doença Os órgãos mundiais de vigilância epidemiológica consideram a leishmaniose visceral (LV) uma importante Doença Negligenciada pelos governos e pela ciência de modo geral, que apresenta ampla distribuição, ocorrendo na Ásia, na Europa, no Oriente Médio, na África e nas Américas, onde também é denominada leishmaniose visceral americana (LVA) ou calazar neo-tropical (WHO, 2012b). Na América Latina, a LV foi descrita em pelo menos 12 países, sendo que cerca de 90% dos casos ocorrem no Brasil, especialmente na Região Nordeste (BRASIL, 2006). A doença está distribuída em 21 Unidades Federadas, atingindo as cinco regiões brasileiras. No período entre 2006 e 2010 foram registrados casos humanos de LV no país, sendo que a região Nordeste representou 47,1% dos casos, seguida pelas regiões Norte (18,0%), Sudeste (17,8%), Centro-Oeste (8,6%) e Sul (0,1%) (BRASIL, 2011a). No ano de 2011, dos casos registrados no Nordeste, 358 ocorreram na Bahia, número inferior apenas aos encontrados no Ceará e Maranhão, com 539 e 454 casos registrados, respectivamente (BRASIL, 2012). No estado da Bahia, entre os anos de 2004 e 2008, foram registrados casos humanos de LV, o que correspondeu a 19% dos casos registrados no Nordeste e 10% no País. A letalidade média neste período foi de 7,0%, com maior valor no ano de 2006 (8,2%). Em 2008, foram confirmados 164 casos novos, distribuídos em 19% dos municípios do Estado. Do total de casos, 7% ocorreram em Salinas da Margarida, seguido pelos municípios de Guanambi e Macaúbas, com 6% cada. De acordo com a classificação epidemiológica adotada pelo Ministério da Saúde, 182 municípios da Bahia apresentaram transmissão de LV no período de 2006 a 2008 (BRASIL, 2009b), e no ano de 2011, 358 novos casos foram confirmados (BRASIL, 2012). A emergência de casos humanos de LV em territórios antes não endêmicos parece ser precedida por um aumento na incidência da infecção e do surgimento de novos focos caninos (MAIA-ELKHOURY et al., 2008). Na Bahia, a doença canina

19 7 ocorre em municípios como Jacobina (ASHFORD et al., 1998), Jequié (FRAGA et al., 2012), Feira de Santana (OLIVEIRA e ARAÚJO, 2003; SOUZA et al., 2008), e na região metropolitana de Salvador, em Dias D Ávila, Camaçari e Lauro de Freitas (BARBOZA et al., 2006; JULIÃO et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2010). Apesar da proximidade a estas áreas, um inquérito epidemiológico realizado nos distritos sanitários de Itapuã, Cajazeiras e Pau da Lima, em Salvador, não demonstrou ocorrência de casos autóctones da doença em cães. Os autores alertam, entretanto, para a urgente necessidade de implantação de uma política de vigilância da leishmaniose visceral contemplando ações efetivas no diagnóstico, prevenção e controle desta zoonose a fim de evitar o avanço da doença (BARBOZA et al., 2009) Agente etiológico e vetor As leishmanioses são zoonoses causadas por protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e gênero Leishmania que, na forma aflagelada (amastigota), é parasita intracelular de macrófagos no homem, no cão e em uma variedade de animais silvestres. Seus vetores são flebotomíneos hematófagos que, ao alimentarem-se de um hospedeiro, ingerem a forma amastigota da Leishmania, que diferencia-se em promastigota (flagelada) nos seus tubos digestórios. Essas promastigotas dividem-se por fissão binária e migram para a probóscida do inseto vetor, sendo assim inoculadas em um novo hospedeiro quando o inseto alimenta-se (URQUHART et al., 1996; FORTES, 1997). A Leishmania (Leishmania) chagasi pertence ao chamado complexo Leishmania donovani, no qual estão incluídas as três principais espécies causadoras da leishmaniose visceral, L. (L.) chagasi, L. (L.) infantum e L. (L.) donovani (SHERLOCK,1996), sendo L. chagasi e L. infantum consideradas atualmente espécies sinônimas (KUHLS et al., 2011). O parasito já foi identificado em humanos, cães, gatos, canídeos selvagens, marsupiais e roedores no Brasil (DEANE e DEANE, 1954; SHERLOCK et al., 1984; IKEDA-GARCIA et al., 2007). A principal espécie de flebotomíneo transmissora de LV nas Américas é a Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (LUTZ e NEIVA, 1912). O inseto apresenta

20 8 distribuição abrangente e coincidente com os focos da doença, hábito alimentar eclético, inclusive antropofílico, e com comprovação da infecção em exemplares natural e experimentalmente infectados (LAINSON e RANGEL, 2005). No Brasil, esses flebotomíneos são conhecidos popularmente por mosquito palha, birigui ou tatuquiras, independentemente da espécie à qual pertencem (FEITOSA et al., 2000). Devido a interferências antrópicas ambientais, este vetor sofreu alteração na sua ecologia, demonstrando uma mudança no perfil de transmissão da LV que era inicialmente considerada uma doença de ambiente rural. Fatores como a urbanização desordenada, migrações, aumento populacional e degradação ambiental em diferentes países ou regiões, têm causas e repercussões múltiplas e complexas, tanto quanto a compreensão do processo de adaptação de insetos vetores, vírus, bactérias ou protozoários existentes em ambientes naturais a novos habitats em áreas antropizadas (XIMENES et al., 2007). No ambiente urbano, os cães domésticos são considerados o principal reservatório do parasito, desenvolvendo papel relevante no ciclo de transmissão aos seres humanos, e vêm sendo responsabilizados pela propagação da doença observada nas grandes cidades brasileiras onde, desde a década de 1980, ocorre um aumento contínuo de casos humanos no Brasil. Entretanto, as medidas governamentais brasileiras, baseadas principalmente na eutanásia de cães soropositivos, não têm impedido o aumento do número de casos humanos no País (MAIA-ELKHOURY et al., 2008) Aspectos imunopatológicos e clínicos da LVC A resposta imune do cão à infecção por L. chagasi Estudos realizados em cães com infecção natural ou experimental com L. chagasi têm revelado que muitos animais sobrevivem à infecção, desenvolvendo uma resposta imune celular contra o parasito que resulta em resistência (ABRANCHES et al., 1991; CABRAL et al., 1992; GENARO et al., 1992; PINELLI et al., 1994). O sucesso da resistência de hospedeiros depende da resposta de células T e é influenciada

21 9 pela ativação de macrófagos por citocinas derivadas dessas células (GUARGA et al., 2000). Vários autores têm verificado a importância das citocinas do tipo Th1 na capacidade do hospedeiro canino, e também murino, em combater a infecção por Leishmania (PINELLI et al., 1994; MAEKAWA et al., 1998; LAGE et al., 2007) e responder à quimioterapia (LI et al., 1997; KOLE et al., 1999; MORENO et al., 1999; ENGWERDA et al., 2002). Nestes indivíduos, uma ativação de macrófagos por citocinas Th1, principalmente o interferon gama (IFN-γ), levaria à destruição ou inibição do crescimento das formas parasitárias intracelulares, envolvendo a produção de óxido nítrico (REINER e LOCKSLEY, 1995). Nos cães, quatro subclasses de IgG foram descritas, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 (MAZZA et al., 1993), sendo as duas primeiras as mais estudadas. Uma resposta imune com predominância de células Th1 é caracterizada pela produção mais acentuada de imunoglobulinas da classe G2, associadas à resistência à doença com quadro clínico menos grave. Por outro lado, a geração de uma resposta imune Th2 influencia a produção de imunoglobulinas G1, associadas à progressão da doença e um quadro clínico mais acentuado (PINELLI et al., 1994; SOLANO-GALLEGO et al., 2001a). Assim, vários estudos foram feitos visando utilizar essas subclasses para o prognóstico de doença através de sua correlação com o estado clínico do animal (SOLANO- GALLEGO et al., 2001a; INIESTA et al., 2005; ALMEIDA et al., 2005a; REIS et al., 2006a), porém os resultados são controversos. Alguns estudos verificaram uma produção mais intensa de IgG1 em animais sintomáticos em contraposição a uma predominância de IgG2 em cães resistentes à infecção (DEPLAZES et al., 1995; NIETO et al., 1999; SOLANO-GALLEGO et al., 2001a; INIESTA et al., 2005). Outros autores observaram, contrariamente, maiores níveis séricos de IgG2 nos animais sintomáticos (BOURDOISEAU et al., 1997; LEANDRO et al., 2001; ALMEIDA et al., 2005a; REIS et al., 2006a; TEIXEIRA-NETO et al., 2010; DE FREITAS et al., 2012). Apesar dos resultados controversos, ainda persiste a proposta de que a análise comparada de níveis séricos de subclasses de IgG possa representar um método indireto e fácil de identificação de cães resistentes ou susceptíveis à doença (DEPLAZES et al., 1995; FERNANDEZ-PEREZ et al., 2003; INIESTA et al., 2005; REIS et al., 2006a; TEIXEIRA-NETO et al., 2010).

22 10 No cão, a intensidade de carga parasitária é diretamente proporcional à intensidade de sinais clínicos e à gravidade da doença (REIS et al., 2006a, 2006b, 2006c), à predominância de citocinas associadas à resposta imune Th2 (LAGE et al., 2007) e à redução nas contagens de células T helper circulantes, no baço e no fígado (GUARGA et al., 2000; SANCHEZ et al., 2004). Altas cargas parasitárias também são associadas à maior infectividade aos flebótomos durante o repasto sanguíneo (MICHALSKY et al., 2007; RIBEIRO et al., 2008). Os parâmetros imunológicos e parasitológicos para prognóstico na LV canina ainda não estão bem definidos, mas a resistência à doença tem sido associada ao desenvolvimento de um padrão de resposta Th1, com uma forte resposta imune celular e aumento dos níveis de citocinas como interferon gama (IFN-γ) e fator de necrose tumoral (TNF), necessárias para ativação de macrófagos e morte do parasita intracelular, enquanto a forma ativa da doença parece estar relacionada à produção de altos níveis de anticorpos, redução da resposta imune celular (PINELLI et al., 1994; RODRIGUEZ-CORTES et al., 2007a) e com aumento dos níveis de interleucina-10 (IL- 10) (LAGE et al., 2007). Nos macrófagos, o óxido nítrico produzido a partir do precursor L-arginina, pela enzima óxido nítrico-sintase induzível (inos), é uma das mais importantes moléculas responsáveis pela morte do parasito (SISTO et al., 2001) A fisiopatologia e clínica da doença canina A partir da inoculação de formas promastigotas metacíclicas na pele do cão, esses parasitos são fagocitados por macrófagos da epiderme, no interior dos quais diferenciam-se em amastigotas e multiplicam-se intensamente até o rompimento da membrana celular, liberando novas formas amastigotas que difundem-se por disseminação hematogênica para outros tecidos ricos em células do sistema monocítico fagocitário, como linfonodos, fígado, baço e medula óssea. Caso o hospedeiro apresente falhas na geração de resposta protetora contra o patógeno, a doença pode ser fatal (PINELLI et al., 1994). Tem sido relatado que o aparecimento de sinais clínicos característicos de leishmaniose visceral ocorre principalmente como consequência da

23 11 alta produção de anticorpos no hospedeiro associada à deposição de imunocomplexos solúveis em diferentes tecidos (QUINNELL et al., 2003). Nem sempre fatal, a infecção em cães pode ocorrer de forma subclínica ou manifestar-se como uma doença auto-limitante (SOLANO-GALLEGO et al., 2009), mas a infecção subclínica não é necessariamente uma condição permanente, e fatores como a imunossupressão ou doenças concomitantes, podem quebrar o equilíbrio estabelecido pelo controle exercido por uma resposta imune eficaz sobre a multiplicação do parasito nesses cães, levando à progressão da doença clínica (BANETH et al., 2008; SOLANO-GALLEGO et al., 2009). Apesar da grande diversidade de manifestações clínicas possíveis de LV canina, nas áreas endêmicas existem desde animais clinicamente saudáveis até aqueles que exibem um quadro clínico característico de estágios finais da doença (BARROUIN- MELO et al, 2006; SOLANO-GALLEGO et al, 2009). Os sinais associados à leishmaniose visceral canina (LVC) são inespecíficos, podendo ser encontradas alterações cutâneas, como alopecia e úlceras; esplenomegalia; linfoadenomegalia; alterações oculares, como conjuntivite, ceratoconjuntivite seca, blefarite e uveíte; alterações locomotoras; emaciação; onicogrifose; anemia e apatia (ALMEIDA et al., 2005b; REIS et al., 2006a; AGUIAR et al., 2007). O período de incubação é bastante variável, de três meses a vários anos, podendo os animais permanecerem assintomáticos por toda a vida. Enquanto a prevalência da infecção em cães em áreas endêmicas pode chegar a 50% ou mais, a prevalência da doença clínica ocorre entre 3% a 10% dos animais, demonstrando que a maioria dos cães infectados não apresentam sinais clínicos, o que dificulta o diagnóstico de LVC (GOMES et al., 2008a). A ausência de sinais clínicos característicos de LVC que possam ser usados como um marcador clínico específico para infecção, torna as técnicas laboratoriais indispensáveis para a obtenção de um diagnóstico preciso (AGUIAR et al., 2007). Por isso recomenda-se a associação de vários métodos diagnósticos, devendo ser utilizado ao menos um método parasitológico para confirmar a positividade (MOREIRA et al., 2007).

24 Métodos de diagnóstico clínico e laboratorial da LVC Avaliação clínica ambulatorial e de patologia clínica O diagnóstico da LVC requer a associação de todas as ferramentas ao alcance do médico veterinário, iniciando por uma minuciosa anamnese reunindo informações pertinentes sobre a permanência, acesso ou convívio com algum cão originado de área endêmica e sobre o uso de estratégias de prevenção da picada de flebotomíneos. Tratase de um diagnóstico complexo, mesmo com vasto exame clínico e realização de exame de patologia clínica, muitas vezes os resultados de hemograma completo, perfil bioquímico e urinálise, podem ser inespecíficos e não contribuírem para o diagnóstico da LVC (SOLANO-GALLEGO et al., 2011). Algumas alterações bioquímicas e hematológicas em cães naturalmente ou experimentalmente infectados são relatadas, tais como: anemia normocítica e normocrômica, leucopenia, trombocitopenia, elevação das proteínas totais com hipergamaglobulinemia e hipoalbuminemia e alterações nas enzimas hepatocelulares (alanina amino transferase e aspartato amino transferase) (ABRANCHES et al., 1991; GENARO et al., 1992; REIS et al., 2006a). Embora os dados hematológicos e as avaliações das funções hepática e renal dos cães com LVC tenham um valor limitado para o diagnóstico da doença, estes parâmetros fornecem importante embasamento para a avaliação do estado clínico dos animais, do prognóstico da doença e da evolução de cães tratados (da COSTA-VAL et al., 2007) Métodos sorológicos para detecção de anticorpos anti-leishmania O Ensaio Imunoenzimático (ELISA) é a técnica mais precisa, quantitativa e largamente usada para a medição da quantidade total de imunoglobulinas em um sobrenadante de cultura ou amostra de soro e, por esta técnica, utilizando antígenos ligados a suportes sólidos, é possível avaliar a quantidade de anticorpo em uma amostra

25 13 específica para um antígeno em particular (ABBAS, 2008). Este imunoensaio é o teste oficial recomendado pelo MS para confirmação dos casos de LVC triados pelo teste imunocromatográfico rápido no Brasil (BRASIL, 2011b), e baseia-se na detecção e quantificação de anticorpos IgG em amostras de soro (BRASIL, 2006), com o uso do kit Ensaio Imunoenzimático Leishmaniose Visceral Canina (EIE-LVC) produzido por Bio- Manguinhos/FIOCRUZ, que utiliza placa de poliestireno sensibilizada com antígenos solúveis de Leishmania major-like (LIRA et al., 2006). Apesar da alta sensibilidade do ELISA, sua especificidade depende do antígeno utilizado, (SUNDAR e RAI, 2002). A utilização de um antígeno a partir de uma espécie de Leishmania diferente daquela espécie alvo responsável pela doença na área inquirida pode influenciar significativamente o resultado do diagnóstico da LVC. O uso de antígenos preparados com L. amazonensis ou L. braziliensis substituíndo L. chagasi, resultou em significativa redução dos valores de densidades ópticas obtidas em cães positivos para LVC (BALEEIRO et al., 2006). Tais questões têm norteado muitos estudos na busca por antígenos adequados ao diagnóstico da LVC nas áreas endêmicas brasileiras. O rk39, por exemplo, é uma proteína recombinante de L. infantum que demonstrou sensibilidade de 95-98% e especificidade de 100% em ELISA (ROSÁRIO et al., 2005). Da mesma forma, a proteína A2, expressa na forma amastigota de Leishmania donovani, vem sendo estudada. Sua forma recombinante é uma potencial candidata a antígeno no diagnóstico da LVC por ELISA (CARVALHO et al., 2002). Outros autores descrevem a utilização de fucose-manose-ligante (FML) como antígeno no teste ELISA obtendo como resultado 100% de sensibilidade e 96% de especificidade (PALATNIK-DE-SOUSA et al., 1995). Embora a legislação brasilera preconize que em áreas endêmicas apenas sejam utilizadas vacinas que possibilitem a distinção entre cães vacinados e infectados após a imunização, utilizando kits diagnósticos registrados no MAPA (BRASIL, 2007), essa distinção parece não ser possível atualmente. Buscando alternativas para esse problema, a determinação da razão entre as subclasses de IgG foi proposta para diferenciar cães vacinados com Leishmune (IgG1/IgG2 1) de cães infectados (IgG1/IgG2 1) utilizando a fucose-manose-ligante como antígeno no ELISA (FML-ELISA) (MENDES et al., 2003), entretanto, outros autores encontraram IgG1/IgG2 < 1 para ambos os grupos testados (de AMORIM et al., 2010). A determinação das subclasses de IgG não

26 14 é geralmente usada no diagnóstico da LVC, mas, em especial a IgG1 e IgG2, têm sido testadas largamente como marcadores de susceptibilidade e consequente prognóstico da doença, entretanto os resultados encontrados são conflitantes, o que provavelmente está relacionado à especificidade dos anticorpos policlonais comerciais disponíveis para detectar estas subclasses (DAY, 2007). Por ser a técnica mais comumente utilizada no diagnóstico da LVC, inúmeras associações entre os resultados obtidos no ELISA e outros parâmetros que participam da epidemiologia da doença vêm sendo feitas, assim, alguns autores avaliaram o potencial de cães em transmitir a Leishmania ao vetor, obtendo uma relação positiva entre os títulos de anticorpos séricos detectados no ELISA e a taxa de infecção dos flebótomos utilizados no xenodiagnóstico (COURTENAY et al., 2002; da COSTA- VAL et al., 2007). O teste imunocromatográfico rápido é de fácil execução e possibilita o diagnóstico da LVC em áreas endêmicas remotas, dispensando etapas críticas de incubação e equipamentos de leitura ótica. O MS do Brasil utiliza, para triagem dos cães soropositivos para anticorpos anti-leishmania, o Teste Imunocromatográfico Rápido de Plataforma de Duplo Percurso (TR DPP LVC), uma tecnologia desenvolvido pela empresa norte americana Chembio e a empresa nacional Bio-Manguinhos, que utiliza o antígeno rk26/rk39 proteínas recombinantes da L. infantum, e propicia a obtenção do resultado após 15 minutos da coleta da amostra biológica (soro, plasma ou sangue total) (BRASIL, 2011). Em estudos realizados com este teste, foi demonstrada baixa sensibilidade para o diagnóstico da LVC em cães portadores assintomáticos. Os autores enfatizam a necessidade do desenvolvimento de um ensaio com melhor valor preditivo (GRIMALDI et al., 2012). A RIFI (Reação de Imunofluorescência Indireta) baseia-se na detecção de anticorpos na amostra através de anticorpos secundários acoplados a um corante fluorescente, o qual é posteriormente visualizado por um microscópio de fluorescência (ABBAS, 2008). Esta técnica foi utilizada no Programa de Controle da LVC do Brasil para confirmação do diagnóstico positivo obtido utilizando o ELISA até o ano de 2011, quando deixou de ser utilizada (BRASIL, 2011b). Algumas desvantagens da RIFI é exigir alto nível de habilidade e experiência, o alto custo das instalações necessárias e a falta de praticidade por requerer uma série de diluições do soro (MAIA e CAMPINO,

27 ). A sua sensibilidade é bastante variada, havendo relatos de 21,6% (SILVIA et al., 2001) a 100% (CIARAMELLA et al., 1997). Outro teste sorológico que pode ser utilizado no diagnóstico da LVC é o Western blotting (WB), entretanto, este não é apropriado ao diagnóstico de rotina e na avaliação de um grande número de amostras, uma vez que é mais laborioso e dispendioso, estando a sua utilização atualmente limitada à pesquisa (FERROGLIO et al., 2007), apesar de ser descrito por alguns autores como um método mais sensível e precoce quando comparado a RIFI e ao ELISA, sugerindo a possibilidade da sua utilização como método confirmatório, preditor da doença e do parasitismo no cão (AISA et al., 1998) Métodos diretos para detecção de infecção por Leishmania Métodos moleculares para detecção de DNA parasitário A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é o método mais confiável para determinar a presença e identificação da Leishmania, não só nos casos de doença ativa, mas também subclínica (MAIA e CAMPINO, 2008), sendo baseado na amplificação in vitro de sequências nucleotídicas específicas presentes no DNA do parasito (GOMES et al., 2008a). A detecção do DNA de Leishmania para diagnóstico pode ser realizada em uma ampla variedade de amostras tais como: sangue total, aspirado de linfonodo e medula óssea, pele, baço ou pela técnica com coleta menos invasiva de swab conjuntival (MAIA et al., 2009; LEITE et al., 2010; QUEIROZ et al., 2010), entretanto, foi observada que a utilização de amostras de sangue total ou papa de leucócitos obtidas a partir do sangue centrifugado, reduzem a sensibilidade do método (STRAUSS-AYALI et al., 2004). É observada ampla variação na sensibilidade da PCR entre os diferentes estudos, que pode ser explicada pela distribuição heterogênea do parasita em cada tecido (MAIA et al., 2009), assim como a eficácia da técnica vai depender do primer, material

28 16 biológico, e do método utilizado para extração do DNA (ALVAR et al., 2004; MAIA e CAMPINO, 2008), logo, o resultado negativo no diagnóstico por PCR de um cão com suspeita clínica, não é suficiente para afastar a possibilidade de infecção. Considerando a prevalência crescente da LVC, o desenvolvimento e aplicação de técnicas de diagnóstico com maior sesibilidade e especificidade é fundamental para controlar esta doença (ALVAR et al., 2004). Além disso, a falha de métodos convencionais para diagnosticar com precisão cães assintomáticos, quando comparados com técnicas de biologia molecular, tem sido relatada (SOLANO-GALLEGO et al., 2001b), entretanto, estas têm um custo consideravelmente maior que as técnicas sorológicas (MAIA et al., 2009), dificultando a sua utilização nos Programas de Controle da LV. Com o custo ainda maior que a PCR convencional, a PCR em tempo real, quantitativa, permite o acompanhamento contínuo da amplificação de sequencias específicas do DNA enquanto a reação ocorre e, por inferência, a quantificação do DNA presente na amostra, a partir daí, uma estimativa da carga relativa de parasitos em diferentes amostras pode ser obtida (MAIA e CAMPINO, 2008). As vantagens da PCR em tempo real em relação à convencional são a redução do tempo de ensaio, redução do risco de contaminação e melhora da sensibilidade (GOMES et al., 2008a), entretanto, em estudo recente, a sensibilidade obtida na PCR convencional (88,9%) realizada a partir de fragmentos de baço foi maior quando comparada a encontrada na PCR em tempo real (83,3%), demostrando que nem sempre a sensibilidade da técnica quantitativa é superior (SOLCÁ et al., 2012), embora esta seja muito útil no diagnóstico da leishmaniose canina, além de permitir que a carga parasitária seja monitorada durante e depois do tratamento em diferentes amostras, proporcionando a previsão de recidiva da doença associada a carga parasitária residual (MAIA e CAMPINO, 2008) Métodos parasitológicos O isolamento do parasita em meios de cultura possui especificidade de 100%, e é considerado o padrão de referência para o diagnóstico da infecção por Leishmania.

29 17 Entre os meios de cultura utilizados tem-se o monofásico, como o meio Schneider, ou bifásico, como o meio Novy-McNeal-Nicolle (NNN) composto de Agar sangue e Schneider. O diagnóstico negativo somente deve ser confirmado após quatro semanas sucessivas de pesquisa da presença dos parasitos no meio de cultura através da microscopia óptica (MAIA e CAMPINO, 2008), sendo o diagnóstico positivo dado pela visualização de formas promastigotas ativas durante este mesmo intervalo de observação das culturas. A sensibilidade desta técnica é muito variável, pois a distribuição dos parasitas parece não ser homogênea no mesmo tecido nem entre diferentes tecidos do mesmo hospedeiro (SUNDAR e RAI, 2002), sendo que os materiais biológicos com a maior taxa de culturas positivas são o baço, linfonodos e medula óssea (MADEIRA et al., 2006; MAIA et al., 2009). Alguns autores obtiveram uma sensibilidade de 97,9% em culturas utilizando o aspirado esplênico, e de 25% em culturas realizadas com aspirado de linfonodo para diagnóstico da LVC provocada por L. chagasi; também foi notada uma melhor tolerância dos animais à punção do baço quando comparada a de linfonodo (BARROUIN-MELO et al., 2004). Algumas desvantagens tais como: demora no resultado, suscetibilidade à perícia do profissional em manipular e avaliar as culturas, contaminações com outros agentes e fragilidade do parasito em meio de cultivo, a dependência da carga parasitária no hospedeiro e dificuldades na produção do meio de cultura, fazem com que esta não seja uma técnica comumente utilizada no diagnóstico de rotina da LVC. Outras técnicas de diagnóstico parasitológico consistem na observação microscópica de formas amastigotas de Leishmania em esfregaços de tecidos ou órgãos infectados corados com giemsa, tais como: medula óssea, gânglios linfáticos, pele e sangue periférico, porém com sensibilidade baixa em animais assintomáticos (ALVAR et al., 2004). A análise histopatológica de órgãos que são corados com hematoxilina e eosina também tem sido utilizada para detectar a presença de parasitas, requerendo, entretanto, minuciosas análises uma vez que as formas amastigotas do parasito não são facilmente reconhecidas (MAIA e CAMPINO, 2008).

30 Avaliação da transmissibilidade da Leishmania ao vetor pelos cães O xenodiagnóstico baseia-se na detecção e isolamento do patógeno usando o próprio vetor natural que é colocado para alimentar-se no hospedeiro. Após o repasto sanguíneo, diferentes métodos podem ser empregados para avaliar a presença da Leishmania no flebotomíneo, como a PCR que é altamente específica e sensível, podendo detectar cerca de 10 leishmanias por vetor (MICHALSKY et al., 2007; MYSKOVA et al., 2008). Outra possibilidade de menor custo, porém menos sensível, é a dissecção dos flebótomos e posterior análise do seu tubo intestinal sob microscopia óptica (MYSKOVA et al., 2008), sendo que por este método podem ocorrer resultados falso positivos devido a presença de Trypanosoma e Endotrypanum na forma promastigota no intestino do vetor (PAIVA et al., 2007). A técnica de xenodiagnóstico é extremamente útil para avaliar a importância epidemiológica de cães parasitados com Leishmania, permitindo estabelecer não só as taxas de alimentação de flebotomíneos, mas também fornecendo dados importantes sobre o potencial destes cães na transmissibilidade da infecção (MOLINA et al., 1994; MICHALSKY et al., 2007). Os estudos disponíveis na literatura, entretanto, são controversos. Alguns autores relatam que cães assintomáticos não teriam importância epidemiológica por não serem capazes de transmitir o parasito ao vetor (TRAVI et al., 2001; VERÇOSA et al., 2008), enquanto em outros experimentos, a transmissibilidade em cães assintomáticos foi comprovada, embora com menores taxas de infectividade ao flebótomo quando comparados a cães com sinais clínicos (da COSTA-VAL et al., 2007; MICHALSKY et al., 2007). Embora seja uma técnica de grande utilidade na elucidação de importantes questões sobre o papel do estado clínico do animal e do tratamento da LVC na epidemiologia da doença, a utilização desta técnica não é recomendada na rotina, sendo seu uso limitado à pesquisa, uma vez que só pode ser executada em laboratórios especializados, onde uma colônia de flebotomíneos esteja bem estabelecida (da COSTA-VAL et al., 2007; MAIA e CAMPINO, 2008). O bloqueio do ciclo é o grande desafio para as vacinas contra LVC, para elucidar esta questão o xenodiagnóstico é o método mais indicado e o único conclusivo.

31 O Controle da doença no Brasil e no mundo A estratégia preconizada pelo MS no Brasil para o controle da LV baseia-se nas seguintes ações: diagnóstico e tratamento precoce dos casos humanos, redução da população de flebotomíneos através da borrifação com cipermetrina e deltametrina, eliminação dos reservatórios e atividades de educação em saúde, sendo que estas medidas de controle devem estar sempre integradas para que possam ser efetivas (BRASIL, 2006). Entretanto, a prática de eutanásia dos cães é comumente utilizada de forma isolada e tem sido o único método utilizado pelo Ministério da Saúde (MS) do Brasil. Além ser uma medida onerosa, a eutanásia de cães encontra resistência ética e emocional, sendo questionada sua eficiência na redução da incidência da doença humana (COURTENAY et al., 2002). Os cães eutenasiados são imediatamente substituídos por filhotes que são altamente susceptíveis ao protozoário, adquirindo rapidamente a infecção, num período de aproximadamente dois meses, quando introduzidos em áreas conhecidamente endêmicas (DYE, 1996). Assim, estudos para definir a eficácia desta prática no controle da leishmaniose sempre suscitam dúvidas a respeito da sustentabilidade desta estratégia (ASHFORD et al., 1998; SOUZA et al, 2008). Demonstrada por algumas pesquisas realizadas na Europa, a utilização de coleiras impregnadas com inseticida pode reduzir o risco do cão contrair a leishmaniose (REITHINGER et al., 2004). Para a realidade brasileira, o custo inviabiliza a utilização da coleira para a maior parte da população de áreas endêmicas, sendo sua manutenção uma prática de difícil aplicação. Além disso, o efetivo controle da LVC no Brasil enfrenta entraves desde o diagnóstico da doença. O próprio Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose do Brasil traz a informação que de uma maneira geral o diagnóstico da LVC vem se apresentando como um problema para os serviços de saúde pública. A problemática deve-se principalmente a três fatores: variedade de sinais clínicos semelhantes às observadas em outras doenças infecciosas; alterações histopatológicas inespecíficas e inexistência de um teste diagnóstico 100% específico e sensível. Afirma também que o diagnóstico parasitológico é o método de certeza e se baseia na demonstração do parasito obtido de

32 20 material biológico de punções hepáticas, linfonodos, esplênica, de medula óssea e biópsia ou escarificação de pele. O mesmo manual declara, entretanto, que tais técnicas são impraticáveis em programas de saúde pública (BRASIL, 2006), evidenciando assim que muitos cães são eutanasiados sem a confirmação do diagnóstico. O tratamento de cães infectados, prática comum em países da União Européia, poderia ser uma alternativa a contribuir para o controle da LV, uma vez que reduz significativamente a carga parasitária e a infectividade de cães para flebótomíneos (RIBEIRO et al., 2008; MIRÓ et al., 2011). No Brasil, várias portarias proibitivas sobre a abordagem terapêutica da LVC foram emitidas a partir do ano de 2003 pelo MS. A Portaria interministerial n do ano de 2008 proibiu, em todo o território nacional, o tratamento da leishmaniose visceral em cães infectados ou doentes com produtos de uso humano ou produtos não registrados no Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2008a). Em Nota Técnica, este ministério afirmou ainda que até aquele momento, todos os medicamentos citados na literatura para o tratamento da LVC eram, no Brasil, de uso exclusivo humano (BRASIL, 2008b). Entretanto, em janeiro de 2013 o acordão nº 8268/2013, prolatado pela quarta turma do Tribunal Regional Federal (TRF) declarou ilegal a Portaria 1.426/2008 (BRASIL, 2013), autorizando o médico veterinário a efetuar o tratamento de cães com LV As vacinas contra LV canina como medida de controle da endemia A inexistência de tratamento efetivo para a cura total da doença canina, e a polêmica sobre a eliminação indiscriminada de cães infectados, levou à tentativa de desenvolvimento de novas estratégias de controle, sendo o desenvolvimento de vacinas caninas a principal delas (TESH, 1995; DYE, 1996). Há relatos de grupos de pesquisa em diferentes regiões do mundo, reportando estudos com candidatos a vacina para utilização no cão (DUNAN et al., 1989; MAYRINK et al., 1996; PANARO et al. 2001; GRADONI et al., 2001; RAMIRO et al., 2003; MOHEBALI et al., 2004; RAFATI et al., 2005; LEMESRE et al., 2007; MORENO et al., 2007; GIUNCHETTI et al., 2008; TODOLÍ et al., 2010; GOTO et al., 2011). As vacinas representariam a principal ferramenta para o controle da leishmaniose; o êxito da vacinação de cães poderia

33 21 reduzir significativamente a incidência de LV humana, sendo a estratégia de controle com melhor relação custo-benefício (DYE, 1996; ALVAR et al., 2004). Diferentes tecnologias podem ser utilizadas nas formulações de vacinas para leishmaniose, sendo as elaboradas com o extrato bruto do agente infeccioso vivo ou morto denominadas de primeira geração; as que utilizam antígenos purificados ou expressados por bactérias recombinantes são as chamadas de segunda geração, e as produzidas a partir de genes que codificam antígenos do agente infeccioso transportados por plasmídeos de DNA (rdna), as de terceira geração (GRADONI, 2001; PALATNIK-DE-SOUZA, 2008). Também proteínas da saliva de flebótomos estão sendo estudadas para imunização contra LV. Proteção contra infecção com L. infantum foi obtida com o uso da proteína salivar LJM19 na imunização de hamsters (GOMES et al., 2008b) e a imunização de cães com as proteínas LJM17 e LJL143 induziu uma resposta humoral com predominância de anticorpos IgG2 durante todo período de estudo e produção significativa de interferon-γ (IFN-γ) por células T CD3+ e CD4+, indicando um perfil Th1 de resposta, sendo estes resultados encorajadores para um futuro estudo em condições naturais (COLLIN et al., 2009). No Brasil, foi testada para imunização de cães uma vacina de primeira geração elaborada a partir do antígeno de L. amazonensis e utilizando o Bacillus Calmette-Guérin (BCG) como adjuvante, necessitando porém de mais estudos (ARAÚJO et al., 2011). Na União Europeia foi lançada no ano de 2011 a vacina LiESP/QA21, sob o nome comercial de CaniLeish (Virbac, França), primeira vacina autorizada neste país. Esta vacina é composta por proteínas excretadas-secretadas de L. infantum (LiESP) e adjuvante saponina QA21. Cães vacinados desenvolveram uma resposta imune humoral caracterizada pela produção de IgG2 e um perfil Th1 de resposta celular (MORENO et al., 2012). A incidência de infecção em cães naturalmente expostos e vacinados com a CaniLeish num estudo duplo cego realizado no Sul da França foi de 0,61% (1/165), enquanto que no grupo controle foi de 6,86% (12/175) resultando na eficácia vacinal de 92% (LEMESRE et al., 2007). Para o desenvolvimento de uma vacina esta deve ser submetida às seguintes etapas de experimentação (BRASIL, 2007):

34 22 Fase I: estudos de segurança para demonstrar a ausência de efeitos colaterais adversos relevantes em animais sadios, sensíveis ao agente em estudo, em condições de laboratório. Fase II: nessa fase, além de confirmar a segurança, será determinada a imunogenicidade, a via de administração, a dose e esquema que serão utilizados na Fase III, bem como a estimativa preliminar da eficácia em animais sensíveis da espécie-alvo. Fase III: destina-se à realização de estudos controlados, randomizados e mascarados para avaliar a eficácia vacinal. Fase IV: compreende a fase de vigilância e pesquisa pós registro do produto. O Brasil foi o primeiro país no mundo em que vacinas contra a LVC foram comercializadas e consumidas pela população de áreas endêmicas. Atualmente, no mercado brasileiro, há dois produtos. A vacina Leishmune, (da SILVA et al., 2001; BORJA-CABRERA et al., 2002; PARRA et al., 2007) liberada para comercialização pelo MAPA em 2003 e a Leish-Tec, comercializada a partir de 2007 (COELHO et al., 2003; ZANIN et al., 2007; FERNANDES et al., 2008). Ambas as vacinas brasileiras preconizam o exame sorológico antes da vacinação para comprovação da soronegatividade e o mesmo protocolo vacinal que compreende a aplicação de três doses, respeitando-se um intervalo de 21 dias entre elas e revacinação anual. Para a manutenção das suas licenças, o governo estabeleceu o cumprimento dos requisitos existentes no Regulamento Técnico aprovado pela Instrução Normativa Interministerial n 31, de Julho de 2007, o qual estipulou um prazo de 36 meses a partir da sua publicação, para os fabricantes adaptarem-se e, entre outras providências, estabelece que estes devem avaliar a capacidade do cão vacinado em transmitir o agente ao vetor e a distinção entre cães vacinados e infectados através dos métodos diagnósticos oficiais utilizados pelo governo (BRASIL, 2007). Estas são algumas das principais questões a serem esclarecidas para a viabilização da utilização das vacinas na saúde pública. Em outubro de 2009, uma Nota de Esclarecimento afirmou que as vacinas registradas no MAPA cumprem com os requisitos técnicos de eficácia, vigentes no momento da concessão dos registros (anos 2003 e 2007), mas que, entretanto, o Ministério da Saúde ainda não recomenda o seu uso em saúde pública, pois estão ainda sendo realizados estudos para avaliar a utilização destes produtos para este fim (BRASIL, 2009b).

35 A vacina Leishmune A vacina Leishmune é composta pelo antígeno complexo glicoproteico ligante de fucose e manose (FML) de Leishmania donovani, presente na superfície da Leishmania durante todo o seu ciclo, e pelo adjuvante saponina QS21 (FORT DODGE, 2004). Em Outubro de 2011 esta vacina obteve licença definitiva do MAPA (PALATNIK-DE-SOUSA, 2012). A imunização de cães com a Leishmune induziu um padrão imunológico caracterizado pelo aumento dos níveis de IFN-γ, óxido nítrico (NO) e IgG2 anti-l. chagasi (ARAÚJO et al., 2009). Também foram observadas alterações fenotípicas precoces em neutrófilos e monócitos e a promoção de uma resposta seletiva, pricipalmente associada à ativação de células T CD8 + (ARAÚJO et al., 2011). Forte resposta imune humoral foi observada em cães imunizados com esta vacina, com considerável aumento de IgG, IgG1 e IgG2, sendo observados picos de produção de anticorpos, soroconversão e positividade até seis meses após vacinação no teste ELISA com antígeno total de promastigota de Leishmania e anticorpos policlonais, o que pode levar cães vacinados a serem erroneamente identificados como infectados (MARCONDES et al., 2011). Resultados discordantes, entretanto, foram alcançados quando, em campanha de controle sorológico de áreas endêmicas, apenas 76 dos (1,3%) cães vacinados com Leishmune apresentaram positividade no teste preconizado pelo MS, utilizado em inquérito epidemiológico no Brasil (PALATNIK- DE-SOUSA et al., 2009). Em ensaios da Fase III a Leishmune demonstrou ter uma eficácia de 76-80% e proteção vacinal de 95% que durou pelo menos 3,5 anos e foi concomitante com a redução da incidência da LV em humanos (da SILVA et al., 2001; BORJA-CABRERA et al., 2002), alcançando a marca de 98% de proteção vacinal em um estudo de coorte com 550 cães de cidades endêmicas para LVC do Sudeste do Brasil (BORJA- CABRERA et al., 2008). A capacidade de interromper o ciclo epidemiológico da doença é característica fundamental para eficiência de uma vacina no controle da LV em cães e humanos. Estudos utilizando artefatos para alimentação do L. longipalpes (SARAIVA et al., 2006), ou com um número restrito de xenodiagnósticos em cães, vem demonstrando um

36 24 possível efeito redutor na taxa de infecção do vetor em cães vacinados com Leishmune (de AMORIM et al., 2010). Também o uso terapêutico desta vacina, com o dobro da quantidade do adjuvante em sua formulação, vem sendo estudado. Borja-Cabrera e colaboradores (2010) observaram que a imunoterapia com este produto promoveu a redução dos sinais clínicos e carga parasitária em gânglios linfáticos, e a imunoquimioterapia com Leishmune enriquecida associada a alopurinol e anfotericina B, eliminou os sinais clínicos, a infecção e os animais tornaram-se negativos nas reações de PCR para DNA de Leishmania A vacina Leish-Tec A Leish-Tec é uma vacina recombinante que utiliza o antígeno A2, uma proteína específica do estágio amastigota de várias espécies de Leishmania (L. donovani, L. infantum, L.chagasi, L. amazonensis e L mexicana), e tem como adjuvante também a saponina (HERTAPE CALLIER, 2009). A proposta desta vacina é induzir resposta imune celular protetora contra a infecção em cães, devido à capacidade imunoestimulante do antígeno vacinal recombinante A2 (ra2) (COELHO et al., 2003; ZANNIN et al., 2007; FERNANDES et al., 2008). Em estudo da Fase II cães foram imunizados com a Leish-Tec, verificando-se um aumento significativo de IFN-γ e baixos níveis de interleucina 10 (IL-10) nos animais vacinados. No ELISA realizado com extrato de proteína total de promastigotas de L. chagasi e anticorpos policlonais, não houve aumento significativo nos valores de IgG total permitindo assim a distinção entre cães vacinados e infectados, embora seja necessário para confirmar esse achado, dados adicionais obtidos após a vacinação de grande número de cães mantidos em condições de campo. Seis meses após a infecção experimental houve diferença significativa para IgG2, mas não para IgG1, entre cães vacinados que não foram infectados e cães vacinados que foram infectados (FERNANDES et al., 2008). Estudos da Fase III da Leish-Tec ainda não foram publicados. Encontra-se em preparação o manuscrito de um estudo duplo-cego randomizado executado numa área

37 25 endêmica para LV, localizada na cidade de Porteirinha, Minas Gerais, Brasil. Neste estudo, cães foram vacinados e acompanhados por um ano, sendo que 96% permaneceram não infectados até o final do período, demonstrando uma eficácia vacinal de 71% com base nos resultados de cultura de aspirado de medula óssea. Entre os animais que apresentaram anticorpos anti-a2 em resposta à Leish-Tec, foi encontrado 82% de eficácia vacinal (FERNANDES et al., 2012). 3. HIPÓTESE DE TRABALHO Há diferença entre as vacinas comercias Leishmune e Leish-Tec sob os aspectos de reações adversas, soroconversão, parasitismo e transmissão de Leishmania ao vetor por cães vacinados e naturalmente expostos à infecção. 4. OBJETIVOS 4.1. Objetivo geral Avaliar comparativamente cães vacinados com Leishmune e Leish-Tec quanto aos parâmetros de: transmissibilidade, quadro clínico, soroconversão e parasitismo Objetivos específicos 1. Selecionar e vacinar animais sadios e soronegativos seguindo-se o protocolo preconizado pelas vacinas e monitorá-los por 11 meses; 2. Verificar a soropositividade dos animais vacinados pela técnica ELISA (IgG e subclasses); 3. Pesquisar a presença de Leishmania nos animais vacinados utilizando as técnicas de PCR e cultura de aspirado esplênico;

38 26 4. Proceder ao exame xenodiagnóstico com flebótomos criados em insetário para verificação da transmissibilidade da Leishmania dos cães para o vetor após a vacinação. 5. MATERIAL E MÉTODOS 5.1. Aspectos éticos O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal da Bahia, Brasil, protocolo n 19/2011, e foi conduzido de acordo com os princípios éticos de experimentação animal, aprovado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal Animais e área de estudo Um total de 180 cães foi pré-selecionado de acordo com critérios préestabelecidos relacionados a saúde clínica, negatividade em teste sorodiagnóstico ELISA indireto para LV canina e serem domiciliados em área endêmica. A área de estudo incluiu os municípios de Lauro de Freitas, Jauá e Barra do Pojuca, no Litoral Norte do Estado da Bahia, Brasil, onde a prevalência da doença no período do estudo, de 2010 a 2012, variou de 24-41% (BASTOS et al., 2011; BORDONE et al., 2012). O estudo iniciou com 100 animais selecionados e divididos em dois grupos de 50 cães vacinados com as vacinas Leishmune e Leish-Tec, respectivamente. Deste total, 91 cães foram monitorados até o final do estudo. Nove cães saíram do estudo por motivos como mudança de endereço para áreas não endêmicas (6 animais) e mortes por outras doenças (2 animais) ou acidentes (1animal). Outro grupo, de nove animais, foi monitorado separadamente por apresentar valores limítrofes (20% acima ou abaixo) ao ponto de corte no ELISA para IgG total no momento do início da vacinação, devido a dificuldades operacionais inerentes ao trabalho em campo, que resultaram em 3 a 4 semanas de intervalo entre a triagem e a primeira dose de vacina.

39 27 Outros 30 cães foram selecionados, ao longo do estudo, como controles positivos para os testes diagnósticos, por apresentarem sinais da doença, positividade parasitológica ou sorológica, além de serem domiciliados na mesma área endêmica e próximos às habitações dos animais que receberam as vacinas. Esses animais foram examinados apenas uma vez e seus dados admitidos no estudo para demonstrar a ocorrência natural da infecção na área. Por razões éticas, não houve um grupo inicialmente negativo e propositalmente não vacinado para verificação de incidência sem vacinação, uma vez que havia dados publicados sobre a prevalência da doença canina na área no mesmo período. Participaram do estudo cães de ambos os sexos, com ou sem raça definida, e idade de um a dez anos (Tabela 1), após concordância expressa dos seus guardiões em termo de consentimento assinado, livre e esclarecido, onde concordaram em seguir as normas do Ministério da Saúde do Brasil no caso de parasitismo confirmado no decorrer do monitoramento. Cada animal foi monitorado por 11 meses após a aplicação da primeira dose de vacina. Tabela 1 - Caracterização dos cães participantes do estudo no grupo 1 (G1) 30 cães não imunizados e naturalmente infectados; grupo 2 (G2) 40 cães imunizados com Leishmune ; grupo 3 (G3) 42 cães imunizados com Leish-Tec. Características G1 G2 G3 30 (100%) 40 (100%) 42 (100%) Gênero Raça Macho 13 (43,3%) 17 (42,5%) 17 (40,5%) Fêmea 17 (56,6%) 23 (57,5%) 25 (59,5%) SRD* 16 (53,3%) 19 (47,5%) 20 (47,6%) Rottweiler 3 (10,0%) 6 (15,0%) 10 (23,8%) Pastor Alemão 3 (10,0%) 2 (5,0%) 6 (14,2%) Poodle 4 (13,4%) 4 (10,0%) 2 (4,8%) Boxer 2 (6,7%) 2 (5,0%) 2 (4,8%) Labrador 1 (3,3%) 2 (5,0%) 1 (2,4%) Pastor Malinois 0 2 (5,0%) 1 (2,4%) Doberman 1 (3,3%) 1 (2,5%) 0 Golden Retriever 0 1 (2,5%) 0 Shih-Tzu 0 1 (2,5%) 0 Idade (anos) (46,7%) 19 (47,5%) 17 (52,4%) (53,3%) 21 (52,5%) 20 (47,6%) *SRD: cães sem raça definida (mestiços).

40 Vacinas comerciais A vacina Leishmune é apresentada em frascos contendo o antígeno purificado Fucose Manose Ligante-FML liofilizado (1,5 mg) com o adjuvante saponina (0,5 mg), sendo cada dose reconstituída em 1 ml de solução salina 0,9% no momento da aplicação (FORT DODGE, 2004). Foram utilizadas 150 doses do lote 004/10. A vacina Leish-Tec é apresentada em um frasco contendo o antígeno recombinante A2 (0,10 mg) e o adjuvante saponina (0,5 mg) em solução salina 0,9% (1,0 ml) (HERTAPE CALLIER, 2008). Foram utilizadas 150 doses do lote 011/ Desenho do estudo e vacinação Foi realizado um ensaio clínico, randomizado, e o desenho experimental objetivou trabalhar em uma realidade o mais próximo possível da natural e com um mínimo de interferência nas condições reais de público-alvo potencial para uma campanha de vacinação pública para fins de controle da doença. Os animais selecionados, portanto, foram animais de estimação ou de guarda, domiciliados em residências localizadas em ambiente de exposição natural à infecção. Foi utilizado o critério, estabelecido pelos fabricantes da vacina e pelo MAPA, de negatividade do cão em exames sorológicos, para a aplicação do protocolo vacinal. Foram formados quatro grupos: o grupo 1 (G1), controle positivo, foi composto pelos 30 animais naturalmente infectados por Leishmania sp., positivos na sorologia por ELISA e ao exame parasitológico. As amostras biológicas desses animais foram coletadas em apenas um momento, assim como seu exame clínico; o G1 não recebeu vacinas. Os grupos 2 (G2) e 3 (G3) foram compostos por animais hígidos e negativos na sorologia por ELISA indireto, que foram imunizados com as vacinas comerciais. O G2, com 40 cães, recebeu a Leishmune e o G3, com 42 cães, recebeu a Leish-tec. A vacinação foi realizada conforme preconizado pelos fabricantes, em três doses injetadas pela via subcutânea, em intervalos de 21 a 30 dias entre doses, na região da cernelha de cada animal, utilizando-se agulhas estéreis descartáveis tamanho 25x0,7 mm. O grupo

41 29 de nove animais hígidos com resultados limítrofes no exame sorológico compôs o grupo G4, sendo 5 vacinados com a Leishmune e 4 com a Leish-Tec. O monitoramento foi realizado em todos os animais vacinados. Foram realizadas sete avaliações ao longo de onze meses, nos seguintes tempos (T): T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Nas sete avaliações foram realizados exames clínicos dos animais e coleta de sangue para determinação da IgG total e subtipos IgG1 e IgG2. A punção esplênica para realização de cultura e PCR, assim como o xenodiagnóstico, foram realilzados apenas na última avaliação (T6). Caso um animal apresentasse, em uma das avaliações parciais, evidências sorológicas ou clínicas de infecção ativa, os exames parasitológicos e o xenodiagnóstico eram antecipados Exame clínico e coleta de amostras biológicas Os exames clínicos foram realizados nos cães do G1, no momento da coleta de sangue e nos G2, G3 e G4, inicialmente para a triagem dos cães a serem vacinados, e em todas as avaliações seguintes, para observação do estado geral de saúde do animal, ocorrência de sinais de LV canina e de segurança vacinal. No exame clínico foram avaliados o comportamento do animal; estado corporal; presença de alterações cutâneas, oculares e nas mucosas; onicogrifose; palpação esplênica, hepática e de linfonodos; além de parâmetros fisiológicos, como temperatura retal, frequências cardíaca e respiratória, e estado de hidratação. O histórico de reações adversas às vacinas foi obtido de todos os responsáveis pelos animais. Os dados foram catalogados em fichas clínicas individuais e os animais classificados em clinicamente hígidos ou com alterações clínicas. As amostras de sangue periférico foram obtidas em veias cefálica, femoral ou jugular, e mantidas em tubos sem anticoagulante até o processamento no laboratório

42 30 para separação do soro e posterior armazenamento a -20 C para realização da sorologia por ELISA indireto. A punção esplênica foi realizada sob sedação dos cães com 0,5 mg/kg de acepromazina 1% (Vetnil, Brasil) via intravenosa, seguindo-se a técnica previamente descrita por Barrouin-Melo et al. (2006). As amostras foram transportadas resfriadas em isopor com gelo até o laboratório onde imediatamente foram inoculados cerca de 100 µl desse material em meio de cultura. Cerca de 300 µl das amostras obtidas foram conservados a -20 C até a extração do DNA para realização da PCR Ensaio Imunoenzimático (ELISA) indireto Os níveis séricos de IgG total anti-leishmania foram utilizados para a triagem dos cães candidatos à vacinação e observação da soroconversão pós vacinal, sendo os resultados considerados limítrofes quando as densidades ópticas obtidas foram 20% acima ou abaixo do ponto de corte estabelecido (DO entre 0,224 e 0,336). Além disso, em todas as avaliações, foram determinadas as leituras de densidades ópticas das amostras analisadas para IgG total e subclasses IgG1 e IgG2 anti-leishmania para estabelecimento da curva de resposta humoral às vacinas. No G1 esses parâmetros foram estabelecidos em um único momento. Para tanto, utilizou-se a técnica de ELISA indireto (VOLLER et al., 1979; PARANHOS-SILVA et al., 1996), modificada para o presente estudo. O antígeno solúvel de promastigotas de Leishmania chagasi foi utilizado a 6,0 µg/ml em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M (ph 9,6), no volume de de 100µL/poço para sensibilização, durante 12 a 14 horas a 4 C, de microplacas de poliestireno de 96 poços e fundo chato (PerkinElmer, Holanda). Os sítios antigênicos foram bloqueados por uma hora à temperatura ambiente com 200 µl/poço de solução salina tamponada com fosfato 0,15M (ph 7.4), contendo 0,05% de Tween-20 (Vetec, Brasil) e 5% de leite em pó desnatado (PBS-T-Leite a 5%). Amostras dos soros diluídas a 1:500 em PBS-T-leite a 5% para IgG total e IgG2 e a 1:100 para IgG1, foram adicionadas a 100 µl/poço. Após incubação por uma hora à temperatura ambiente, foram adicionados 100 µl/poço de anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Bethyl, EUA) diluídos em PBS-T-leite a 5% a 1: (anti-igg); 1: (anti-

43 31 IgG2) e 1:2.000 (anti-igg1) de cão, e a placa incubada por uma hora à temperatura ambiente. Quatro lavagens com 200 µl de PBS-T foram realizadas após cada etapa de incubação. A revelação foi feita com 100 µl por poço de uma solução composta por peróxido de hidrogênio (0,03%) orto-fenilenodiamina (OPD) (Sigma, EUA) em tampão citrato-fosfato (ph 5,1) por vinte minutos à temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 30 μl por poço de ácido sulfúrico 4 N. A leitura da placa foi feita imediatamente com filtro de 492 nm em um leitor de ELISA (Asys, Áustria) e os valores foram expressos em densidade óptica (D.O). Controles negativos e positivos foram repetidos em todas as placas e as amostras foram testadas em duplicata Cálculo do ponto de corte para o ELISA Os valores de ponto de corte foram determinados pela média das DOs dos soros de cães hígidos de áreas não endêmicas para LVC (placa referência) mais três vezes o desvio padrão. Assim, os valores de corte encontrados para IgG total, IgG1 e IgG2 foram: 0,280, 0,180 e 0,128, respectivamente Cálculo da D.O corrigida (DOc) Para a comparação entre os valores das DOs encontradas nas diferentes placas, estas foram multiplicadas por um fator de correção interplacas (FC) que é dado, segundo Zwirner (1996), pela fórmula: FC = média da D.O. do controle positivo da placa de referência média da D.O. do controle positivo de cada placa Portanto, DOc = DO x FC

44 Cultura de aspirado esplênico para diagnóstico parasitológico O diagnóstico parasitológico da infecção por Leishmania foi realizado com o cultivo de aspirados esplênicos em meio bifásico, contendo 1,5 ml de meio sólido Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) e 2 ml de meio Schneider s suplementado com 20% de Soro Fetal Bovino (Gibco, EUA) e 100mG/mL de gentamicina (Sigma, EUA). As culturas foram mantidas a 23 C e examinadas semanalmente sob microscopia óptica por quatro semanas. O diagnóstico positivo na cultura ocorreu quando houve identificação em lâmina de formas promastigotas apresentando movimentação ativa Xenodiagnóstico O xenodiagnóstico foi realizado para avaliação da capacidade de transmissão de Leishmania do cão para o vetor, sob sedação com 0,5 mg/kg de acepromazina 1% (Vetnil, Brasil) via intravenosa. Recipientes padronizados com 40 fêmeas e 15 machos do vetor Lutzomyia longipalpis, telados com malha fina em uma extremidade, foram colocados para alimentarem-se na face interna da orelha direita dos cães durante 30 minutos. Após o repasto sanguíneo, os flebótomos foram mantidos no insetário, em condições controladas, com alimentação à base de solução de frutose por cinco dias. Em seguida, foram colocados em tubos estéreis a -20 C até a extração de DNA Extração de DNA Para a extração do DNA dos aspirados esplênicos dos cães, foi utilizado o kit comercial PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, EUA) de acordo com instruções do fabricante, e o DNA genômico obtido foi armazenado a -20 C até a realização da PCR. Para a extração de DNA dos grupos de flebótomos utilizados em cada cão, os insetos foram descongelados, macerados em microtubos com a utilização de agulha

45 33 40x12 mm e seguiu-se o protocolo sugerido pelo fabricante do kit comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, EUA). A avaliação da qualidade e da concentração de cada amostra de DNA obtida foi realizada em um espectrofotômetro digital (NanoDrop, EUA). A concentração de DNA nas amostras provenientes dos flebótomos foi ajustada para 5 ng/µl para a realização da PCR e pesquisa da presença de DNA de L. chagasi Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) A PCR para detecção do DNA de L. chagasi no aspirado esplênico e nos flebótomos foi realizada segundo Lachaud et al. (2002) com modificações padronizadas em nosso laboratório. Resumidamente, a reação com 50µl consistiu de 1µl de DNA de amostras de aspirados esplênicos ou de flebótomos na concentração de 5ng/µl, 200µM de DNTP (Invitrogen, EUA), 1,5mM de MgCl2; 1U de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 30 pmol/µl de um dos seguintes primers: RV1 5 - CTTTTCTGGTCCCGCGGGTAGG-3 e RV2 5 -CCACCTGGCCT ATTTTACACCA-3. Todas as amplificações foram realizadas utilizando termociclador (Biometra, Alemanha), como segue: desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos; 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, anelamento a 62ºC por 30 segundos, extensão a 72ºC por 90 segundos e passo final de extensão final de 72ºC por 5 minutos. Como controles negativos, foram utilizados água livre de DNAse e RNAse e DNA de amostra de fragmento de baço e flebótomos de xenodiagnóstico de cão não infectado. Os controles positivos foram DNA de L. chagasi (1 ng/µl) e DNA (5 ng/µl) de amostra de fragmento de baço e flebótomos de xenodiagnóstico de cão infectado. Estes controles foram utilizados em cada reação.. Os produtos da PCR foram corados com solução de Sybr Gold (Invitrogen, EUA) e submetidos à corrida eletroforética horizontal em gel de agarose 2%, em tampão Tris borato EDTA (TBE), juntamente com o marcador de peso molecular 100pb (Invitrogen, EUA). Os resultados foram visualizados em um transluminador e fotodocumentador (Biometra, Alemanha).

46 Análise estatística Para a comparação entre os grupos de animais vacinados (G2 e G3) quanto às frequências de gênero, raça e idade, foi utilizado o teste qui-quadrado. Considerando-se que os dados obtidos não apresentaram distribuição normal, as diferenças na reatividade para IgG, IgG1 e IgG2, entre os grupos de animais vacinados (G2 e G3) em cada avaliação, e entre cada um deles e o grupo de animais infectados (G1), foram verificadas pelo teste estatístico não paramétrico de Mann-Whitney, e consideradas significativas quando p<0,05. Devido ao pequeno número de animais amostrados no G4, foi realizada apenas análise descritiva deste grupo. 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO Todos os animais do grupo controle positivo (G1) apresentaram doença clínica, com sinais de leishmaniose visceral canina (LVC), com maior ou menor gravidade. Nestes animais foram observadas alterações cutâneas (hiperqueratose, alopecia, descamação, úlceras ou formação de pústulas), alterações nas mucosas (palidez ou congestão), lesões oculares (conjuntivite, ceratoconjuntivite seca ou uveíte), onicogrifose, perda de peso, apatia, esplenomegalia ou linfadenopatia. Durante o período de monitoramento, 92,5% (37/40) dos cães do grupo vacinado com a Leishmune (G2) permaneceram saudáveis, concordando com os resultados de 92% (SILVA et al., 2001), 95% (BORJA-CABRERA et al., 2002) e 83,3% (de AMORIM et al., 2010) de outros autores. Quanto à Leish-Tec (G3), foi encontrado o resultado de 92,8% (39/42) de higidez no grupo vacinado e mantido em condições naturais de exposição à infecção. Esse é um resultado inédito, uma vez que a única publicação disponível na literatura refere-se a sete cães imunizados com a Leish-Tec e desafiados com infecção experimental (FERNANDES et al., 2008). Dentre os animais dos G2 e G3, sete foram comprovadamente infectados, com diagnóstico positivo no cultivo ou PCR de aspirado esplênico, sendo que seis destes revelaram sinais clínicos de LVC, porém, menos severos quando comparados aos animais do G1, que apresentaram condições clínicas condizentes com doença ativa. Os

47 35 dados das avaliações clínicas dos G2 e G3 estão expressos na Tabela 2, assim como os resultados de sorologia da última avaliação (T6), parasitemia por isolamento do parasito por cultivo ou PCR de aspirado esplênico e xenodiagnóstico. Cães infectados podem permanecer saudáveis, de forma subclínica (SOLANO-GALLEGO et al., 2009), o que tornam as técnicas laboratoriais indispensáveis para detectar infecção (LACHAUD et al., 2002). No presente estudo, apenas animais comprovadamente infectados em exames de detecção parasitária e com sinais clínicos, foram capazes de transmitir parasito ao flebotomíneo nos exames xenodiagnósticos. Animais considerados resistentes são caracterizados por manter baixas cargas parasitárias e capacidade mínima ou nula de transmissão da infecção ao vetor (DYE et al., 1992; VERÇOSA et al., 2008). Tabela 2 - Sinais clínicos, densidades ópticas (DO) para IgG, IgG1 e IgG2 obtidas utilizando ELISA indireto, parasitemia e xenodiagnóstico de animais imunizados com Leishmune (grupo G2) e Leish-Tec (grupo G3), naturalmente infectados por Leishmania. Resultados obtidos aos 11 meses após a primeira dose de vacina (T6). Animal Vacina Sinais clínicos IgG (DO) 1 Leishmune Feridas nas pontas das orelhas, mucosas pálidas 2 Leishmune Esplenomegalia, linfadenomegalia IgG IgG1 (DO) IgG2 (DO) Cultivo PCR baço Xenodiagnóstico 1,811 Positivo 1,309 1,333 Positivo Positivo Negativo 0,319 Positivo 0,203 0,240 Negativo Positivo Positivo 3 Leishmune Sem sinais 0,269 Limítrofe 0,235 0,142 Negativo Positivo Negativo 4 Leishmune Feridas nas pontas das orelhas, mucosas pálidas 5 Leish-Tec Linfadenomegalia, perda de peso, mucosas pálidas 6 Leish-Tec Linfadenomegalia, hiperqueratose, alopecia 0,282 Limítrofe 0,682 0,287 Negativo Positivo Negativo 0,906 Positivo 0,224 0,399 Positivo Positivo Positivo 0,218 Negativo 0,113 0,108 Negativo Positivo Negativo 7 Leish-Tec Esplenomegalia, 0,203 Negativo 0,111 0,075 Negativo Positivo Positivo linfadenomegalia Para o diagnóstico sorologico foi considerada a IgG total - ponto de corte de 0,280. Pontos de corte: 0,180 (IgG1); 0,128 (IgG2).

48 36 Todos os animais dos G2 e G3 permaneceram ativos e alimentando-se bem até o fim das avaliações, com exceção do período perivacinal quando alguns apresentaram reações adversas às vacinas (Tabela 3): dor, edema e formação de nódulo inflamatório no local da aplicação da vacina foram observados em 2,5% (1/40) dos animais do G2, após a terceira dose da vacina, e perduraram por dois dias. No G3, foram observadas reações vacinais em 14,3% (6/42) dos animais, tais como: apatia em 66,6% (4/6), dor local em 50% (3/6), edema local em 50% (3/6), claudicação em 50% (3/6), formação de nódulo inflamatório no local da aplicação em 33,3% (2/6), anorexia em 33,3% (2/6) ou hiporexia em 33,3% (2/6), sendo que as reações observadas duraram dois dias após a segunda dose da vacina e de um a cinco dias após a terceira dose. As observações do presente estudo sobre segurança vacinal demonstram que ambas as vacinas produziram reações adversas em menos de 10% dos animais (7/82). A frequência de 14,3% (6/42), portanto maior no grupo G3, foi também associada a maior intensidade de reações adversas locais e sistêmicas, quando comparada à frequência de 2,5% (1/40) no G2 em que apenas um animal apresentou reações locais. Diferentemente, outros autores relataram reações como dor local, anorexia, apatia, edema local, vômito e diarréia em cães vacinados com a Leishmune (PARRA et al., 2007). Os resultados aqui presentes contradizem também os relatos de ausência de reações adversas em cães vacinados com o composto imunogênico da vacina Leish- Tec (FERNANDES et al., 2008). Apesar da apresentação de ambas as vacinas testadas no presente estudo conter a mesma quantidade de adjuvante, são utilizados compostos diferentes. A Leishmune utiliza uma mistura de saponinas incluindo a fração purificada QS21 (OLIVEIRA-FREITAS et al., 2006), enquanto a Leish-Tec utiliza a saponina Riedel (FERNANDES et al., 2008). Reações adversas vêm sendo atribuídas à utilização de saponinas como adjuvantes em vacinas, sendo que alguns estudos demonstram que a toxicidade varia consideravelmente entre as diferentes saponinas e doses utilizadas, sendo a QS21 considerada de baixa toxicidade (KENSIL et al., 1991; SANTOS et al., 2002). Em ambos os grupos deste estudo, houve uma tendência à maior frequência e intensidade das reações adversas à medida que as doses se repetiam, ou seja, maior frequência na segunda em comparação à primeira dose e da mesma forma após a terceira em relação à segunda dose (Tabela 3). De fato, como vários componentes de uma vacina podem servir de potenciadores do sistema

49 37 imunológico, quanto maior a exposição num menor espaço de tempo, maior o risco de reação sistêmica ou local, embora a severidade e tipo de reação varie de acordo com a composição da vacina, a via de administração, composição genética e outras diferenças entre indivíduos da mesma espécie (MOORE e HOGENESCH, 2010). No presente estudo os grupos G2 e G3 tinham a mesma frequência de gênero (macho ou fêmea), raça (com ou sem raça definida) e idade (1 a 5 ou 6 a 10 anos). Tabela 3 - Comparação das reações adversas ocorridas em cães vacinados com Leishmune (grupo G2) e Leish-Tec (grupo G3) no período perivacinal: T0 primeira dose da vacina; T1 segunda dose, 21 dias após a primeira; T2 terceira dose, 21 dias após a segunda. Primeira dose (T0) Segunda dose (T1) Terceira dose (T2) Reações Leishmune (N=40) Leish-Tec (N=42) Leishmune (N=40) Leish-Tec * (N=42) Leishmune ** (N=40) Leish- Tec *** (N=42) 0/40 0/42 0/40 1/42 1/40 5/42 Apatia Dor local Edema local Claudicação Anorexia Hiporexia Nódulo Os resultados mostrados são cumulativos, os cães apresentaram mais de uma reação por dose de vacina. * Duração das reações: 1 dia. ** Duração das reações: 2 dias. *** Duração das reações: 1 a 5 dias. Animais imunizados com as duas vacinas e não infectados após 11 meses de monitoramento, apresentaram curvas similares para IgG total, ocorrendo um pico das medianas das DOs aos vinte e um dias após a primeira dose da vacina (T1) no G2, caracterizando uma soroconversão que foi mantida até vinte e um dias após a terceira dose (T3). No G3 ocorreu pico das medianas das DOs aos vinte e um dias após a segunda dose da vacina (T2) (Figura 1). Nestes períodos, animais imunizados com uma ou outra vacina poderiam ser diagnosticados como soropositivos para LVC. Durante

50 38 todo o período de monitoramento, os animais vacinados com a Leishmune (G2) apresentaram maiores valores de medianas das DOs para IgG total em relação aos vacinados com a Leish-Tec (G3), com diferença estatística significativa no T3 (p=0,023) e T4 (p=0,005). Em ambos os grupos, as medianas das DOs exibem uma tendência a nova elevação: a partir de T4 (90 dias após T3) no G3, e de T5 (180 dias após T3) no G2, porém se mantêm abaixo do ponto de corte para IgG total (DO=0,280) até o final do estudo (Figura 1). Também a avaliação quantitativa demonstra que no período perivacinal e até vinte e um dias após a terceira dose (T3), a maioria dos animais vacinados com ambas as vacinas apresentaram DO acima do ponto de corte no ELISA para detecção de IgG total canina contra antígeno total de L. chagasi no presente estudo (Tabela 4). Figura 1 Medianas dos valores das densidades ópticas (DOs) para IgG total, obtidas utilizando ELISA indireto, de 75 cães submetidos ao protocolo completo de vacinação contra leishmaniose visceral com Leishmune (G2, n=36) ou Leish-Tec (G3, n=39) e não infectados após 11 meses de monitoramento. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Valor de ponte de corte: 0,280. Os asteriscos indicam as diferenças estatísticas entre as vacinas (p < 0,05 teste de Mann-Whitney).

51 39 Tabela 4 - Animais imunizados com Leishmune (G2, n=36) ou Leish-Tec (G3, n=39), não infectados após 11 meses de monitoramento, que apresentaram DOs acima do ponto de corte para IgG, IgG1 e IgG2 obtidas utilizando ELISA indireto. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Tempos Leishmune Leish-Tec IgG (%) IgG1 (%) IgG2 (%) IgG (%) IgG1 (%) IgG2 (%) T0-47,2 (17/36) 61,1 (22/36) - 61,5 (24/39) 79,5 (31/39) T1 58,3 (21/36) 58,3 (21/36) 72,2 (26/36) 56,4 (22/39) 64,1 (25/39) 69,2 (27/39) T2 75,0 (27/36) 72,2 (26/36) 83,3 (30/36) 61,5 (24/39) 43,6 (17/39) 59,0 (23/39) T3 52,8 (19/36) 83,3 (30/36) 100 (36/36) 35,9 (14/39) 35,9 (14/39) 89,7 (35/39) T4 11,1 (4/36) 58,3 (21/36) 88,9 (32/36) 10,3 (4/39) 64,1 (25/39) 84,6 (33/39) T5 13,9 (5/36) 55,6 (20/36) 88,9 (32/36) 20,5 (8/39) 41,0 (16/39) 84,6 (33/39) T6 27,8 (10/36) 66,7 (24/36) 72,2 (26/36) 30,8 (12/39) 46,1 (18/39) 61,5 (24/39) Pontos de corte: 0,280 (IgG); 0,180 (IgG1); 0,128 (IgG2). Resultados semelhantes foram obtidos em outro estudo prospectivo, em que cães vacinados com a Leishmune apresentaram soroconversão aos 42 dias após a primeira dose da vacina, além de pico de resposta humoral aos 48 dias após a terceira dose (MARCONDES et al., 2011). Se as medidas de controle governamental são baseadas na eliminação de cães positivos em testes sorológicos, como ocorre no Brasil, a soroconversão causada por uma vacina contra a leishmaniose pode levar cães imunizados à eutanásia. Atualmente há controvérsia a respeito da soroconversão causada por antígenos vacinais e a distinção entre cães vacinados e infectados por sorotestes, o que tem motivado estudos com diferentes antígenos em testes de ELISA, como a utilização da fucose-manose-ligante (BORJA-CABRERA et al., 1999; da SILVA et al., 2001; BORJA-CABRERA et al., 2002; MENDES et al., 2003) ou antígeno solúvel de Leishmania (de AMORIM et al., 2010; MARCONDES et al., 2011) após vacinação de cães com Leishmune. Os resultados apontam não ser possível distinguir animais vacinados com Leishmune daqueles infectados, com os protocolos utilizados na rotina, e corroboram nossos achados de 27,8% (10/36) de animais vacinados apresentando soroconversão na

52 40 última avaliação realizada, onze meses após a primeira dose da vacina. Outras abordagens demonstram resultados contrários, em que a resposta humoral vacinal é identificada como soroconversão pelos mesmos métodos em um pequeno índice, de 1,3% (PALATNIK-de-SOUSA et al., 2009). Quanto à vacina Leish-Tec, até o presente momento não há na literatura dados ou estudos conclusivos sobre a identificação de cães vacinados por testes de rotina para eliminação de cães naturalmente infectados. Há apenas um estudo que conclui que não houve soroconversão em um grupo de sete animais imunizados com a Leish-Tec e testados por ELISA com antígeno total de L. chagasi (FERNANDES et al., 2008). O presente estudo, portanto, apresenta uma abordagem inédita quanto ao produto Leish- Tec, uma vez que dos 39 animais imunizados com esta vacina que não foram naturalmente infectados durante 11 meses de monitoramento, 56,4% (22/39) apresentaram soroconversão já após a primeira dose, e 30,8% (12/39) ainda na última avaliação realizada (Tabela 4), utilizando ELISA indireto com antígeno total preparado a partir de parasitos isolados na mesma área endêmica dos cães avaliados. As medianas das DOs nos ELISAs para subclasses IgG1 e IgG2 apresentaram maior distinção entre os grupos de animais vacinados, caracterizada por resposta imune humoral mais intensa de ambas as subclasses nos animais vacinados com Leishmune (G2) em comparação aos animais vacinados com Leish-Tec (G3), apresentando pico 21 dias após a terceira dose da vacina (T3). Os níveis de IgG1 e IgG2 anti-leishmania observados nos animais vacinados com Leish-Tec (G3) foram bastante reduzidos, apesar de ter ocorrido pico de IgG2 vinte e um dias após a terceira dose (T3). As diferenças observadas entre os G2 e G3 foram estatisticamente significativas para IgG1 no T2 (p=0,003) e T3 (p=0,000) e também para IgG2 no T2 e T3 (p=0,000) (Figura 2).

53 Figura 2 - Medianas dos valores das densidades ópticas (DOs) para IgG1e IgG2 (figuras A e B, respectivamente), obtidas utilizando ELISA indireto, de 75 cães submetidos ao protocolo completo de vacinação contra leishmaniose visceral com Leishmune (G2, n=36) ou Leish-Tec (G3, n=39) e não infectados após 11 meses de monitoramento. T0 imediatamente antes da primeira dose da vacina; T1 imediatamente antes da segunda dose (21 dias); T2 imediatamente antes da terceira dose (42 dias); T3 aos vinte e um dias após a terceira dose; T4 noventa dias após a T3; T5 cento e oitenta dias após a T3; e T6 duzentos e setenta dias após a T3. Valor de ponte de corte para IgG1-0,180 e IgG2-0,123. Os asteriscos indicam as diferenças estatísticas entre as vacinas (p < 0,05, teste de Mann-Whitney). 41