FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ROGER ASEVEDO DOS SANTOS

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1 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ROGER ASEVEDO DOS SANTOS VARIABILIDADE DO GENE NAT2 HUMANO E PERFIL DE ACETILAÇÃO EM HANSÊNICOS DO ESTADO DE RONDÔNIA Porto Velho 2010

2 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO ROGER ASEVEDO DOS SANTOS VARIABILIDADE DO GENE NAT2 HUMANO E PERFIL DE ACETILAÇÃO EM HANSÊNICOS DO ESTADO DE RONDÔNIA Dissertação de mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós- Graduação em Biologia Experimental, da Universidade Federal de Rondônia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental Área de concentração: Genética Molecular Humana. Orientadora: Profª. Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura Porto Velho 2010 ii

3 ROGER ASEVEDO DOS SANTOS VARIABILIDADE DO GENE NAT2 HUMANO E PERFIL DE ACETILAÇÃO EM HANSÊNICOS DO ESTADO DE RONDÔNIA Dissertação de mestrado apresentada à Coordenação do Programa de Pós- Graduação em Biologia Experimental, da Universidade Federal de Rondônia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental Área de concentração: Genética Molecular Humana. Aprovado em: BANCA EXAMINADORA Profª. Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura Universidade Federal de Rondônia-UNIR Assinatura: Profª. Drª. Rubiani de Cassia Pagotto Universidade Federal de Rondônia-UNIR Assinatura: Prof. Dr. Ricardo G. M. Ferreira Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais-IPEPATRO Assinatura: iii

4 FICHA CATALOGRÁFICA Biblioteca Central Professor Roberto Duarte Pires Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Ozelina Saldanha CRB-11/947 S2373v Santos, Roger Asevedo dos Variabilidade do gene NAT2 humano e perfil de acetilação em hansênicos do Estado de Rondônia. / Roger Asevedo dos Santos. Porto Velho, Rondônia, f.: il. Dissertação (Mestrado em Bio.Experimental), Fundação Universidade Federal de Rondônia / UNIR, Porto Velho, Rondônia, Orientador: Profª. Dr. Maria Manuela da Fonseca Moura. 1. Farmacogenética 2. NAT2 3. Acetilação I. Moura, Maria Manuela da Fonseca. II. Título. CDU: 575(811.1) iv

5 Dedicatória À minha família e aos meus amigos, por acreditarem em mim, pela compreensão, pelo carinho e por estarem ao meu lado v

6 Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, o autor e doador da vida, sem o qual eu nada seria Á minha orientadora, Profª. Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura, pela valiosa orientação, por acreditar no meu potencial, e, acima de tudo, pela amizade. Ao Dr. Adalberto Rezende Santos, pela valiosa colaboração para a realização deste trabalho. Por ceder seu laboratório, todo material necessário para o desenvolvimento da parte prática da pesquisa e pela co-orientação. À minha família, em especial minha mãe, Sonia, e minhas irmãs, Sandra, Dirlaine e Greice, por estarem sempre torcendo por mim. À tia Clarinda e Kamilla pela hospedagem durante todo este tempo e por toda a ajuda nos momentos difíceis. A todos os meus amigos, que direta ou indiretamente me apoiaram durante a fase do mestrado. Em especial: Hellon, Tácia, Thame, Ulisses, Tainá, Leonardo Leite, Max, Jomara, Ivan, Leonardo Coletti e Luan por me apoiarem e estarem sempre cobrando a minha dissertação. À minha querida amiga Denise Rezende pelos momentos compartilhados no Rio de Janeiro e pela torcida. À M.Sc. Kazue Narahashi, pelo apoio com as coletas e parceria no trabalho. A todos os colegas e amigos do CIBEBI, em especial a M. Sc. Cleoni Mendes, quem me colocou em contato com a Fiocruz. À Profª. Drª. Rubiani de Cassia Pagotto, pela orientação no início do mestrado. A toda equipe do Laboratório de Biologia Molecular Aplicada a Micobactérias, da Fiocruz RJ. Em especial: Philip Suffis, Harrison, Amanda, Márcia, Lizânia e Rafael. À CAPES, pela bolsa. Ao PGBIOEXP e UNIR pelo apoio com as passagens. Às unidades de saúde que forneceram as amostras para a realização da pesquisa. Aos pacientes que concordaram em participar do estudo. vi

7 É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida passar; é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar, que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz, embora louco, que em conformidade viver. (Martin Luther King) vii

8 RESUMO SANTOS, R. A.; VARIABILIDADE DO GENE NAT2 HUMANO E PERFIL DE ACETILAÇÃO EM HANSÊNICOS DO ESTADO DE RONDÔNIA. Porto Velho/RO, Mestrado em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia. Os polimorfismos genéticos que influenciam na resposta a drogas podem existir em genes codificadores de enzimas metabolizadoras de drogas e tais polimorfismos podem influenciar a atividade biológica final da enzima levando ao aparecimento de desfechos desfavoráveis. A enzima N-acetiltransferase2 humana (NAT2), codificada pelo gene NAT2 é primordial na acetilação de diversas drogas, como a dapsona, usada no tratamento da hanseníase. Até o momento, já foram identificados 53 alelos para este gene, os quais consistem na combinação de até quatro SNPs na região codificante. Dependendo dos polimorfismos presentes no gene, três fenótipos são possíveis: acetiladores lentos, acetiladores intermediários e acetiladores rápidos. Os acetiladores lentos seriam mais suscetíveis a reações adversas a drogas metabolizadas pela enzima N-acetiltransferase2. A população brasileira, miscigenada, se distribui no território nacional de modo diverso nas diferentes regiões. Tendo em vista a diversidade alélica do gene NAT2 de acordo com a etnia, supõe-se que o padrão de resposta às drogas metabolizadas pela enzima NAT2 deve ser diferente dependendo da população estudada. O objetivo desta pesquisa foi descrever os SNPs do gene NAT2 existentes na população de Rondônia, bem como os fenótipos de acetilação presentes e realizar estudo de associação entre o fenótipo de acetilação lenta e ocorrência de reações adversas a dapsona. A identificação de SNPs foi realizada a partir do seqüenciamento direto da região codificante do referido gene, que contém 1093 pb ( intronless 873pb). Foram utilizadas amostras de sangue de pacientes do estado de Rondônia em tratamento para hanseníase com esquemas contendo dapsona. A análise do DNA de 62 indivíduos mostrou que 10 SNPs mais freqüentemente relatados na literatura estavam presentes na população estudada. Dentre os SNPs associados com acetilação lenta, os mais freqüentes foram: G191A; T341C; G590A e G857A. Foram identificados 12 alelos na população, sendo 89 relacionados ao fenótipo de acetilação lenta. O resultado do estudo de associação não foi significante, mostrando não haver relação entre o fenótipo lento e a ocorrência de reações adversas, porém, estudos com um maior número amostral tornam-se necessários antes de se descartar a hipótese de associação. viii

9 ABSTRACT SANTOS, R. A.; VARIABILITY OF HUMAN NAT2 GENE AND ACETYLATION PROFILE IN PACIENTS WITH LEPROSY FROM RONDONIA STATE. Porto Velho, RO, Master Degree in Experimental Biology, Federal University of Rondonia. The genetic polymorphisms that influence drug response may exist in genes encoding drug metabolizing enzymes and these polymorphisms may influence the final biological activity of the enzyme leading to the appearance of unfavorable outcomes. The human N-acetiltransferase 2 enzyme (NAT2), encoded by the gene NAT2 is paramount in the acetylation of various drugs such as dapsone, used to treat leprosy. To date, 53 alleles have been identified for this gene, which consist of a combination of up to four SNPs in the coding region. Depending on the polymorphisms in the gene, three phenotypes are possible: slow acetylators, intermediate acetylators and fast acetylators. The slow acetylators are more susceptible to adverse reactions to drugs metabolized by the enzyme N-acetiltransferase 2. The Brazilian population is mixed and spread on the territory differently in different regions. Considering the allelic diversity of the NAT2 gene according to ethnicity, it is assumed that the pattern of response to drugs metabolized by NAT2 enzyme should be different depending on the studied population. The objective of this research was to describe the SNPs of NAT2 gene existing in the population of Rondonia, as well describe the phenotype of acetylation present in the population and conduct an association study between the slow acetylation phenotype and occurrence of adverse reactions to dapsone. The identification of SNPs was performed from the direct sequencing of the coding region of the gene, which contains 1093 bp ("intronless - 873pb). Samples of blood were obtained from patients from Rondonia state in leprosy treatment with regimens containing dapsone. DNA analysis of 62 individuals showed that 10 SNPs more frequently reported in the literature were present in the population. Among the SNPs associated with slow acetylation, the most frequent were: G191A, T341C, G590A and G857A. We identified 12 alleles in the population, including 8 related to the phenotype of slow acetylation. The result of association study was not significant, showing no relationship between the slow phenotype and the occurrence of adverse reactions, but studies with a larger sample size are necessary before excluding the hypothesis of association. ix

10 SUMÁRIO INTRODUÇÃO A HANSENÍASE NO BRASIL E NO MUNDO CLASSIFICAÇÃO FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE Hanseníase Indeterminada Hanseníase Tuberculóide Hanseníase Virchoviana Hanseníase Dimorfa DIAGNÓSTICO Diagnóstico clínico Diagnóstico laboratorial Intradermoreação de Mitsuda Baciloscopia Exame histopatológico Outros métodos de diagnóstico TRATAMENTO DA HANSENÍASE Reações adversas no tratamento da hanseníase FARMACOGENÉTICA Variações genéticas e a variabilidade da resposta farmacológica a drogas CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E HIPÓTESES JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAIS E MÉTODOS CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE Critérios de Inclusão Critérios de Exclusão PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Extração de DNA Genômico PCR Purificação do Produto de PCR para Seqüenciamento SEQUENCIAMENTO DE DNA Precipitação da Reação de Seqüenciamento Análise das Seqüências x

11 5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA ASPECTOS LEGAIS E DE BIOÉTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO PCR PARA A REGIÃO CODIFICANTE DE NAT SEQUENCIAMENTO DE DNA E ANÁLISE DOS SNPs DESCRIÇÃO DAS MUTAÇÕES DO GENE NAT2 EM PACIENTES DE PORTO VELHO Distribuição Interétnica dos SNPs Presente no Gene NAT CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE NAT DETERMINAÇÃO DOS ALELOS E GENÓTIPOS DE NAT2 NA POPULAÇÃO DE PORTO VELHO Caracterização dos Alelos de NAT Caracterização Genotípica ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE O FENÓTIPO NAT2 E A OCORRÊNCIA DE REAÇÕES ADVERSAS A DAPSONA CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS xi

12 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Gel de agarose 0,8% com amostras de DNA extraídas com utilização do kit FlexiGene DNA da Qiagen Figura 2 Gel de agarose 1,2% contendo produtos amplificados pelo sistema TD-PCR Figura 3 Gel de agarose 1,2% corado por brometo de etídio, contendo produtos de PCR purificados pelo kit Chargeswitch PCR Clean-up (Invitrogen) Figura 4 - Estratégia de amplificação e seqüenciamento de NAT Figura 5.- Ilustração da utilização do software SeqScape v Figura 6 - Identificação de SNP através da visualização do cromatograma pelo software SeqScape Figura 7- Interface gráfica do servidor web para determinação dos fenótipos NAT2, referente à página de entrada de dados Figura 8 - Interface gráfica do servidor web para identificação dos fenótipos NAT. Página referente aos resultados xii

13 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 Fenótipos de Acetilação NAT2 na população de Porto Velho Gráfico 2 Comparação entre os perfis de acetilação nas populações de Porto Velho, Rio de Janeiro e Goiás xiii

14 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Freqüência dos SNPs NAT2 identificados na população de Porto Velho RO Quadro 2 Comparação entre as freqüências dos 7 principais SNPs entre as populações brasileiras e demais populações mudiais Quadro 3 Freqüências alélicas, considerando apenas indivíduos homozigotos para todos os SNPs Quadro 4 - Freqüências alélicas após estratégia de combinação dos SNPs em face do conhecimento do fenótipo NAT Quadro 5.- Freqüências dos genótipos NAT2 na população de Porto Velho xiv

15 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Comparação genotípica entre as populações de Porto Velho, Rio de Janeiro e Goiás Tabela 2 Associação entre o fenótipo NAT e a ocorrência de reações adversas a dapsona durante o tratamento Tabela 3 Associação entre o fenótipo NAT2 e a ocorrência de reações adversas a dapsona no sexo feminino... Tabela 4 - Associação entre o fenótipo NAT2 e a ocorrência de reações adversas a dapsona no sexo masculino xv

16 INTRODUÇÃO A hanseníase é uma doença infecto-contagiosa crônica, cujo agente etiológico é o bacilo Mycobacterium leprae. Geralmente afeta a pele e os nervos periféricos e, ocasionalmente, outros órgãos e sistemas, sendo assim, pode haver um agravamento progressivo do quadro, com comprometimento gradual da pele, nervos, mucosas nasais e orofagolaríngea, testículos e ovários, causando sérias incapacidades físicas e sociais (WHO, 2005; COURA et al., 2005). A doença é considerada um problema de saúde pública, principalmente nos países em desenvolvimento. Dentre seus fatores predisponentes estão o baixo nível sócio-econômico, a superpopulação doméstica, e alguns fatores genéticos (SANTOS et. al., 2002; MORAES et. al., 2004). O modo de transmissão do bacilo da hanseníase permanece incerto, mas admite-se que o M. leprae seja transmitido de pessoa a pessoa, primariamente pela infecção por uma gotícula nasal. O período de incubação é longo, geralmente de 5-7 anos. O pico de instalação é na faixa etária de anos; a doença é raramente vista em crianças com menos de cinco anos de idade (WHO, 2005). 1 A HANSENÍASE NO BRASIL E NO MUNDO Os novos casos de hanseníase são atualmente encontrados principalmente em regiões tropicais, mas a distribuição dentro dessas regiões não é uniforme. Sessenta e oito por cento dos novos casos detectados em 2005 foram no Sudeste da Ásia, 80% dos quais foram detectados na Índia. No mesmo ano, outros 13% de todos os casos mundiais foram registrados no Brasil. A região do sudeste da Ásia e o Brasil juntos tiveram 81% de todos os casos de hanseníase detectados em 2006 (WHO, 2008). Em regiões altamente endêmicas, a ocorrência da hanseníase também não é uniformemente distribuída (OPROMOLLA et. al, 2006 ). No Brasil, a distribuição da doença no estado do Ceará reflete as diferenças socioeconômicas no estado (MONTENEGRO, 2004 & KERR-PONTES, 2004) enquanto acredita-se que a explicação para a distribuição irregular em São Paulo deve-se ao movimento migratório para as áreas urbanas e desenvolvidas do centro do estado (OPROMOLLA et. al, 2006). 15

17 No início de 2008, a prevalência de hanseníase registrada mundialmente foi ; o número de novos casos detectados durante 2007 foi Em 2007 houve uma redução de 4% na detecção global de novos casos, o que representa cerca de menos casos comparado com Ainda no início de 2008, a República do Congo e Moçambique alcançaram a meta de eliminação da hanseníase (definida como uma taxa de prevalência registrada <1caso/ habitantes). Brasil, Nepal e Timor Leste são três países com população com mais de 1 milhão de habitantes que ainda precisam atingir a meta de eliminação. Juntos, esses 3 países respondem por cerca de 17% dos novos casos detectados durante 2007 e 23% dos casos registrados (WHO, 2008). Já em 2009, a prevalência da doença registrada mundialmente foi e o número de novos casos detectados durante 2008 foi Globalmente, a detecção anual de novos casos diminuiu de em 2002 para em A detecção de novos casos diminuiu cerca de > 9126 casos (3.54%) durante 2008 comparado com 2007 (WHO, 2009). Existe uma grande variação em todas as regiões em se tratando da proporção de novos casos detectados com a forma multibacilar da doença, de crianças e mulheres. Na região da África, a proporção da forma multibacilar varia de 19,70% em Camarões a 91,62% no Kênia. Na região das Américas, esta proporção varia de 38,76% na Bolívia a 78, 32% no México. No Sudeste da Ásia, Bangladesh relatou que 44,72% dos novos casos detectados tinham a forma multibacilar da hanseníase e a Indonésia relatou 82,15%. No Mediterrâneo Oriental, a proporção com a forma multibacilar da doença varia de 30,40% na Somália a 89,46% no Egito. Na região do Pacífico Ocidental a variação é de 58,06% na Micronésia a 98,27% nas Filipinas. A proporção de mulheres com hanseníase entre os novos casos detectados apresenta a seguinte variação: Na Região Africana é de 22,75% em Madagascar a 64,52% no Congo. Nas Américas, 22,16% na Argentina a 46,35% em Cuba. No Sudeste da Ásia, varia de 35,17% no Nepal a 41,65% na Tailândia. No mediterrâneo oriental, há uma variação de 32,27% no Iêmen a 52% na Somália. No Pacífico Ocidental, a variação é de 12,01% nas Filipinas a 43,55% Micronésia (WHO, 2009). 16

18 A proporção de crianças entre os novos casos detectados na África varia de 0,82% na Nigéria a 30,95% em Comoros. Nas Américas, vai de 0,52% na Argentina a 7,46% no Brasil. No Sudeste da Ásia, a variação é de 2,99% na Tailândia a 11,40% na Indonésia. Na região do Mediterrâneo Oriental, varia de 4% na Somália a 15,50% no Iêmen. (WHO, 2009). 1.2 CLASSIFICAÇÃO De acordo com a resposta imunológica específica do hospedeiro frente ao M. leprae, a infecção pode evoluir de maneiras diversas, constituindo esta resposta imune, um espectro que expressa as diferentes formas clínicas da doença. Quando há uma resposta imunológica competente, a doença evolui para uma forma clínica localizada e não-contagiosa; se a resposta não é efetiva, desenvolve-se uma forma difusa e contagiosa. Encontram-se ainda, as formas intermediárias entre estes dois extremos, as quais refletem variações graduais da resistência ao bacilo (SOUZA, 1997). Com base nessas variadas formas de expressão, são feitas as classificações da doença. As mais usadas no Brasil são as de Madri (Congresso Internacional, 1953) e de Ridley e Jopling, proposta em A classificação de Madri utiliza critérios de polaridade, sendo dois pólos estáveis e opostos (virchoviano e tuberculóide) e dois grupos instáveis (indeterminado o grupo transitório e inicial da doença; e dimorfo o grupo instável e intermediário). A classificação de Ridley e Jopling adota subgrupos dentro de um espectro de resistência do hospedeiro, obedecendo a critérios clínicos e bacteriológicos, enfatizando assim, os aspectos imunológicos. Esta não inclui a forma indeterminada e torna necessário o exame histopatológico para sua utilização (ARAÚJO, 2003). Segundo essa classificação, são descritas as formas tuberculóide (TT); borderline ou dimorfa que são subdivididos em dimorfa-tuberculóide (DT), dimorfa-dimorfa (DD) e dimorfa-virchoviana (DV); virchoviana-subpolar (VVs) e virchoviana (VV) (HASTINGS, 1994; NERY et. al., 1999; ARAÚJO, 2003). Em 1982, foi proposta pela Organização Mundial de Saúde (OMS) uma classificação operacional mais simplificada, que se baseia na provável população bacilar, estando esta relacionada às formas clínicas. De acordo com 17

19 a baciloscopia, realizada em vários pontos definidos, como lóbulos de orelhas, cotovelos, joelhos e lesões, associada aos critérios clínicos da classificação de Madri, os pacientes podem ser agrupados em paucibacilares (PB) pacientes que apresentam poucos bacilos e multibacilares (MB) aqueles que apresentam muitos bacilos, indicando assim, dois diferentes grupos de tratamento (WHO, 1982; BRASIL, 1994; SOUZA, 1997). Os casos considerados paucibacilares, são os que apresentam baciloscopia negativa com 2-5 lesões ou PB com lesão única e sem acometimento de nervos periféricos. Já os multibacilares, são pacientes que apresentam baciloscopia positiva e/ou que possuem mais de 5 lesões cutâneas (MS, 2000; MARTELLI et. al., 2002; WHO, 2005). 1.3 FORMAS CLÍNICAS DA HANSENÍASE Hanseníase Indeterminada (HI) Segundo Jopling & Mc Dougall (1991), esta forma é um estágio inicial e transitório da hanseníase, podendo ser encontrado em indivíduos de resposta imune não definida diante do M. leprae. As lesões da HI surgem após um período de incubação que varia em média de dois a cinco anos e são caracterizadas como manchas que variam de hipopigmentadas a discretamente eritematosas, mais secas do que a pele circundante, medindo em geral poucos centímetros de diâmetro, com alteração da sensibilidade (tátil, térmica, dolorosa). Não ocorre comprometimento de troncos nervosos e a baciloscopia revela-se negativa. Geralmente, a HI é a primeira forma clínica da doença, que pode evoluir para cura ou para uma das formas polares, segundo a capacidade de resposta imune contra o bacilo (ARAÚJO, 2003) Hanseníase Tuberculóide (HT) A HT é uma forma de alta resistência do hospedeiro, caracterizada por lesões cutâneas bem delimitadas, e/ou neural única ou em pequeno número, 18

20 anestésicas e de distribuição assimétrica. Ocorre a formação de granulomas epitelióides rodeando os elementos neurovasculares, com um denso infiltrado linfocítico que se estente até a derme. As lesões são em placas ou anulares, com bordas papulosas e áreas da pele eritematosas ou hipocrômicas, com anidrose e/ou queda de pêlos. Pode acorrer o espessamento do tronco neural próximo a lesão. Esse, às vezes, é o único sinal da doença, não se encontrando lesões cutâneas, caracterizando a hanseníase tuberculóide neural pura, que apresenta alteração da sensibilidade na área de trajeto do nervo. Pode haver dano neural precoce e grave, em especial, quando atinge nervos sensitivo-motores. A avaliação da resposta imune ao M. leprae, através da intradermoreação de Mitsuda, apresenta reação fortemente positiva, sempre maior que 5 mm, atingindo até 5 a 15mm de diâmetro, podendo haver ulceração central. A baciloscopia resulta negativa; em alguns casos, são encontrados bacilos na histopatologia de cortes de pele. A hanseníase tuberculóide, juntamente com a indeterminada representam as formas paucibacilares da doença (SOUZA, 1997; FOSS, 1999; ARAÚJO, 2003; WALTER & LOCKWOOD, 2007) Hanseníase Virchoviana (HV) Esta é a forma correspondente ao pólo de alta suceptibilidade dentro do espectro imunológico da doença, se manifestando em indivíduos que apresentam imunidade celular deprimida para o Mycobaterium leprae. Trata-se de uma forma multibacilar, ocorrendo assim, excessiva multiplicação bacilar e disseminação da doença para víceras e tecido nervoso. A doença inicia-se com máculas simétricas, ligeiramente eritematosas, mal delimitadas, que progridem para uma infiltração generalizada de toda a pele, sendo maior nas áreas mais frias, como face e membros. A pele apresenta xerose, com áreas de descamação fina, devida à anidrose associada à desnervação das glândulas sudoríparas e torna-se com aspecto apergaminhado de tonalidade semelhante ao cobre. Há rarefação dos pelos nos membros, cílios e supercílios. A infiltração da face, com a formação de nódulos, incluindo os pavilhões auriculares, forma o quadro conhecido como fácies leonina. A evolução crônica caracteriza-se pela infiltração progressiva e difusa da pele, mucosas 19

21 das vias aéreas superiores, olhos, testículos, nervos, afetando também linfonodos, fígado e o baço. Há acometimento de múltiplos nervos periféricos, que se tornam espessados à palpação, geralmente os nervos auriculares, radiais, ulnares, medianos, fibulares comuns e tibiais posteriores (FOSS, 1999; ARAÚJO, 2003; CONCHA R, et. al, 2008). A HV é a forma mais importante do ponto de vista epidemiológico, pois estima-se que os bacilos estejam presentes nas lesões cutâneas na proporção de 10 9 a bacilos/g de tecido e 10 5 organismos/mm 3 de sangue; logo, a baciloscopia é francamente positiva em vários pontos pesquisados. A resposta na reação de Mitsuda é negativa (SOUZA, 1997; FOSS, 1999) Hanseníase Dimorfa (HD) Este grupo caracteriza-se por sua instabilidade imunológica, dentro do espectro da doença, fazendo com que haja grande variação em suas manifestações clínicas. Na HD, são observados aspectos clinicodermatológicos que se aproximam do pólo virchoviano ou tuberculóide, até no mesmo indivíduo, refletindo assim, essa aparência dimorfa, a instabilidade imunológica. As lesões da pele são numerosas e sua morfologia possui aspectos de HV e HT. A hanseníase dimorfa-tuberculóide (DT) é semelhante à tuberculóide, mas as lesões são mais numerosas. Surgem significativas lesões neurais, freqüentemente graves, atingindo mais de um tronco nervoso com padrão assimétrico. A forma dimorfa-virchoviana (DV) se diferencia da virchoviana, no formato das lesões, que naquela são mais definidas, assimétricas e com áreas de pele normal entre elas. A infiltração assimétrica da face, dos pavilhões auriculares e a presença de lesões no pescoço e nuca são sugestivas desta forma clínica. Há ainda, a forma clínica dimorfa-dimorfa (DD), sendo esta a mais instável dentro do espectro. Em geral, ocorrem várias lesões cutâneas no mesmo indivíduo, que tendem à distribuição simétrica, de diversos tipos e dimensões. Nota-se a presença de placas de bordas elevadas em declive, com ilhas de pele aparentemente saudável, de bordas bem definidas (SOUZA, 1997; ARAÚJO, 2003; WALTER & LOCKWOOD, 2007). 20

22 No grupo dimorfo, pode-se observar desde reação de Mitsuda positiva e baciloscopia negativa, na forma dimorfa-tuberculóide, até ausência de resposta à reação de Mitsuda e baciloscopia francamente positiva na forma dimorfavirchoviana (SOUZA, 1997). 1.4 DIAGNÓSTICO O diagnóstico da hanseníase é realizado através do exame clínico, no qual se busca sinais dermatológicos e neurológicos da doença; e através de exames laboratoriais. O Ministério da Saúde (2000) define como caso de hanseníase quando uma ou mais das seguintes características encontram-se presentes: lesão de pele com alteração de sensibilidade; acometimento de nervo (s) com espessamento neural; baciloscopia positiva na pele Diagnóstico Clínico O diagnóstico clínico é realizado através da anamnese e através do exame físico do paciente, no qual se procede uma avaliação dermatológica e neurológica, buscando-se identificar sinais da doença. O roteiro de diagnóstico clínico preconizado pelo Ministério da Saúde constitui-se das seguintes atividades: Obtenção da história clínica e epidemiológica do paciente (anamnese); Avaliação dermatológica, na qual se identifica as lesões na pele com alteração de sensibilidade; Avaliação neurológica, sendo identificadas possíveis neurites, incapacidades e deformidades; Diagnóstico dos estados reacionais; Diagnóstico diferencial, no qual se exclui a possibilidade de outras doenças de pele ou neurológicas que apresentam sinais e sintomas semelhantes aos da hanseníase; Classificação do grau de incapacidade física (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). 21

23 1.4.2 Diagnóstico Laboratorial Os métodos laboratoriais servem como confirmação do diagnóstico da hanseníase, porém nenhum exame laboratorial atualmente utilizado pode ser considerado completo, isto é, capaz de diagnosticar e classificar a forma da doença. Sendo assim, ratifica-se que o diagnóstico da hanseníase é clínico, não necessitando do diagnóstico laboratorial para o início do tratamento (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). Os atuais recursos utilizados na rotina para o diagnóstico e classificação da hanseníase são descritos a seguir: Intradermoreação de Mitsuda O antígeno lepromina é produzido com Mycobacterium leprae íntegro, que pode ser extraído de tecido humano infectado ou de fígado de tatu infectado. A emulsão de bacilos é injetada por via intradérmica na face flexora do antebraço. A reação de Mitsuda é um teste de leitura ultratardia, realizada entre 21 e 28 dias, quando se observa a formação de um granuloma do tipo tuberculóide. O resultado é expresso em milímetros, tomando-se média das medidas longitudinal e transversal da induração, e é considerada positiva quando ultrapassa 5mm. Nos pacientes multibacilares, essa reação é negativa, demonstrando a incapacidade em formar granuloma tuberculóide específico. A reação de Mitsuda é utilizada, portanto, na classificação da doença e na definição do prognóstico, mas não possui valor para o diagnóstico (YAMASHITA et. al., 1996; SANTOS et. al., 2005) Baciloscopia A baciloscopia é o exame microscópico onde se observa o Mycobacterium leprae diretamente nos esfregaços de raspados intradérmicos das lesões hansênicas ou de outros locais de coleta selecionados: lóbulos auriculares e/ ou cotovelos, e lesão quando houver (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). A coloração do esfregaço é feita pelo método de Ziehl-Neelsen evidenciando a presença do bacilo ácool-ácido resistente (BAAR) e o resultado é apresentado sob a forma de índice baciloscópico (IB), numa escala que vai 22

24 de 0 a 6 +. A baciloscopia mostra-se negativa (IB=0) nas formas tuberculóide e indeterminada (formas paucibacilares), fortemente positiva na forma virchoviana e revela resultado variável na forma dimorfa (formas multibacilares) (SANTOS et. al., 2005). Por nem sempre evidenciar o Mycobacterium leprae nas lesões hansênicas ou em outros locais de coleta, um resultado negativo não afasta o diagnóstico da hanseníase. Mesmo sendo a baciloscopia um dos parâmetros integrantes da definição de caso, não se espera o resultado para iniciar o tratamento do paciente. O tratamento tem início após o diagnóstico clínico e a classificação em pauci ou multibacilar é baseada no número de lesões de pele (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002) Exame histopatológico Esse exame pode ser praticado na lesão cutânea ou neural, sendo coletados fragmentos de pele ou nervo. É utilizada a coloração de hematoxilina-eosina complementada pela coloração de Faraco-Fite ou uma de suas variantes, para se evidenciar o BAAR. O aspecto histopatológico típico da forma tuberculóide é o granuloma do tipo tuberculóide com células epitelióides e gigantes de Langerhans, acometendo principalmente terminações nervosas. A forma virchoviana caracteriza-se pela presença de granuloma macrofágico, composto por células espumosas ricas em bacilos, denominadas células de Virchow. As formas intermediárias apresentam características próprias, situadas entre as formas polares da doença (YAMASHITA et. al., 1996). O exame histopatológico de pele é geralmente indicado nos casos em que há dúvidas no diagnóstico ou na classificação, e indica-se a biópsia do nervo em casos especiais, quando há dúvida no diagnóstico diferencial com outras neuropatias (SANTOS et. al., 2005; ANDERSON, et. al., 2007) Outros métodos de diagnóstico O antígeno glicolípide fenólico-1 (PGL-1) é específico do M. leprae e leva à formação de anticorpos das classes IgG e IgM. Os títulos de IgM 23

25 correlacionam-se com a forma clínica e a atividade da doença. Níveis aumentados do anti PGL-1 têm sido descritos na hanseníase virchoviana e tendem a decrescer com o tratamento específico. Por outro lado, na hanseníase tuberculóide não há resposta desses anticorpos. Há estudos inconclusivos que procuram estabelecer uma relação entre a positividade ao anti-pgl-1 e o risco de adoecer ou de identificar infecção subclínica (ARAÚJO, 2003; SANTOS et. al., 2005). Tem se demonstrado que a reação em cadeia da polimerase (PCR) é capaz de detectar de 1 a 10 microorganismos. A reação é positiva em praticamente todos os casos virchovianos e dimorfo-virchovianos. Sua utilidade em formas paucibacilares, entretanto, é controversa. A PCR tem sido muito estudada em centros de pesquisa, mas ainda não é realizada rotineiramente no diagnóstico da hanseníase (ANDERSON et. al., 2007). 1.5 TRATAMENTO DA HANSENÍASE A detecção e o tratamento dos casos são ainda, os principais métodos usados para combater a hanseníase visando à interrupção da cadeia de transmissão da doença. Diversos tipos de tratamento já foram utilizados, sendo que no final da década de 1940, estudos utilizando sulfona-mãe (diaminodifenil-sulfona) demonstraram bons resultados terapêuticos e baixo custo financeiro. A dapsona (DDS) firmou-se então, como a principal droga para o controle da hanseníase na década de No entanto, a monoterapia apresentava-se como a causa mais freqüente de desenvolvimento da resistência ao medicamento, dessa forma, em 1981 a Organização Mundial da Saúde (OMS) introduziu um esquema de poliquimioterapia, que consiste no uso de três drogas (dapsona, clofazimina e rifampicina). A dapsona (DDS; 4, 4 Diamino-Difenil-Sulfona) encontra-se no centro de toda terapêutica antihansênica e age através da competição com o ácido para-aminobenzóico (PABA), diminuindo ou bloqueando a síntese do ácido fólico bacteriano (GOULART, et. al., 2002). 24

26 1.5.1 Reações Adversas no Tratamento da Hanseníase As Reações Adversas a Drogas (ADRs) são causas comuns de hospitalização e cursam com um alto custo financeiro para a sociedade. Esses custos incluem as despesas no tratamento da doença causada pelas ADRs e as despesas para que se evite que esses efeitos colaterais ocorram durante a administração do fármaco (LUNDKVIST & JOHNSSON, 2004). A ocorrência de ADRs graves e fatais tem sido extensivamente analisada em pacientes hospitalizados. Uma meta-análise com aproximadamente quarenta estudos prospectivos em hospitais dos Estados Unidos da América (EUA), sugere que 6-7% dos pacientes internados sofrem de ADRs graves e que 0,32% dos pacientes apresentem ADRs fatais. Isso resulta em aproximadamente mortes por ano nos EUA, e num custo anual de mais de 100 bilhões de dólares para a sociedade norte-americana (HUNG et. al., 2003). Além disso, foi estimado que as ADRs são responsáveis por mais de 7% das internações nos hospitais do Reino Unido e 13% das admissões em clínicas médicas na Suécia (INGELMAN-SUNDBERG, 2001), mostrando que constituem um problema ainda maior do que se pensava no contexto da quimioterapia e do desenvolvimento de novos fármacos. No Brasil, a poliquimioterapia composta por dapsona, clofazimina e rifampicina é utilizada para o tratamento da hanseníase desde O tratamento poliquimioterápico é recomendado pelo Minestério da Saúde para todos os casos de hanseníase (GOULART, et. al., 2002). Todavia, sua administração chegou a ser questionada pelos centros de saúde espalhados pelo país, em função dos muitos casos de efeitos adversos (GALLO, 1995). A dapsona constitui-se como a principal droga no esquema terapêutico de poliquimioterapia e vários tipos de reação adversa têm sido atribuídos a esta droga, mais comumente na síndrome de hipersensibilidade a dapsona, envolvendo sintomas tais como: gastrite, cefaléia, fotodermatite, metahemoglobulinemia, anemia hemolítica, agranulocitose, hepatite, síndrome sulfona, neuropatia periférica e síndrome nefrótica. As ADRs na hanseníase predominam entre os pacientes multibacilares e a maioria das reações ocorre antes da sexta dose quando do tratamento com dapsona levando posteriormente à clínica de dermatite esfoliativa, choque, edema generalizado, 25

27 insuficiências renal e hepática, pancitopenia, sangramento intestinal, peneumonia, infecção urinária e bacteremia (JOPLING, 1985; GOULART, et. al., 2002). 1.6 FARMACOGENÉTICA A farmacogenética é o estudo das variações genéticas que causam respostas variáveis aos medicamentos incluindo diferenças na eficácia, interações droga-droga e o risco relativo de reações adversas. Isso envolve então estudos de mutações e polimorfismos que podem afetar a expressão ou atividade de receptores farmacológicos, proteínas transportadoras, sinalizadoras e de enzimas metabolizadoras (INGELMAN-SUNDBERG, 2001; ROSES, 2002, PROWS & PROWS, 2004). O papel dessa ciência, é estudar as bases genéticas das diferenças inter-individuais na resposta as drogas, sendo o objetivo desses estudos, identificar os fatores genéticos que levam ao desenvolvimento de reações adversas e através disso, desenvolver testes laboratoriais preditivos para reduzir os danos causados pelos medicamentos (ALFIREVIC, 2007). A observação de que existem diferenças individuais na resposta ao tratamento farmacológico não é um conceito novo. No início do século XX ( ) o médico britânico Archibald Garrod desenvolveu o conceito de individualidade química para descrever que certos indivíduos apresentam toxicidade com uma dose de fármaco que era inócua para a maioria. O conceito de farmacogenética se originou mais tarde, nos anos de 1950 (LUBOMIROV et. al., 2008). Em 1957, Arno Motulsky propôs que a herança deveria explicar porque muitos indivíduos diferem na eficácia do tratamento com drogas e em apresentarem reações adversas (MOTULSKY, 1957). Pouco tempo depois, Friedrich Vogel foi o primeiro a usar o termo farmacogenética e o definiu como o estudo do papel da genética na resposta a drogas (VOGEL, 1959). Polimorfismos genéticos ocorrem na forma de mudanças estruturais grosseiras, incluindo substituição de nucleotídeos, completa deleção do gene, duplicação gênica, e translocação gênica, onde porções de genes similares são combinadas criando um novo gene híbrido. Cada uma dessas mudanças na 26

28 estrutura do gene introduz uma forma variante do gene no pool gênico da população e é designado como um alelo do gene original. Os vários tipos de polimorfismos genéticos geralmente podem ser classificados por sua influência resultante na expressão da proteína (receptor de droga ou enzima metabolizadora) ou fenótipo. Os polimorfismos genéticos resultando em deleção gênica invariavelmente levam a perda de função e a não produção do produto gênico. Em contraste, a duplicação gênica e a multi duplicação mais comumente leva a expressão melhorada de produto gênico e um fenótipo de hiperatividade. Uma exceção para isso é a duplicação de uma alelo que inclui variação estrutural adicional levando a perda de função. Translocações gênicas geralmente produzem um gene não funcional (AL-GHOUL & VALDES, 2008). Os SNPs são o tipo de variação genética mais comum; atualmente se estima que exista por volta de 10 milhões de SNPs no genoma humano. São o resultado da variação de um só nucleotídeo (adenina [A], timina [T], citosina [C] ou guanina [G]) na sequência de DNA entre membros de uma mesma espécie. Os SNPs podem classificar-se em SNPs não-sinônimos, quando trocam o aminoácido quer formará a proteína, e SNPs sinônimos, quando não trocam o aminoácido dentro de uma proteína. O SNPs também podem ser classificados em funcionais, quando alteram a expressão do gene ou a função da proteína e não funcionais, quando não têm nenhum efeito. Os estudos farmacogenéticos se têm centrado principalmente nos SNPs (VALDES, 2008). Os genes polimórficos que codificam enzimas metabolizadoras de drogas, proteínas transportadoras, receptoras e outras proteínas, podem servir como marcadores preditivos das respostas adversas ao medicamento. Estas proteínas determinam a distribuição, eliminação, bem como a resposta à maioria das drogas e são muito utilizadas para caracterizar as bases genéticas e moleculares das respostas normais e alteradas a drogas e para documentar a diversidade de diferentes populações humanas, principalmente as enzimas metabolizadoras de drogas (WEBER, 2008). As variações presentes em genes que codificam enzimas envolvidas na biotransformação de fármacos podem resultar em uma diminuição na atividade enzimática. Isso favoreceria o aparecimento de reações adversas por toxicidade devido a uma baixa metabolização e conseqüente acúmulo do princípio ativo ou de metabólitos intermediários tóxicos (metabolizadores 27

29 lentos). A presença de variantes que não afetam a atividade enzimática (metabolizadores rápidos) ou com múltiplas cópias (metabolizadores ultrarápidos) podem estar associadas a concentrações séricas subterapêuticas da droga (INGELMAN-SUNDBERG, 2001). Na maioria dos casos, a presença de heterozigose proveniente de indivíduos homozigotos lentos e rápidos origina metabolizadores intermediários (KALOW, 1997) Variações Genéticas e a Variabilidade da Resposta Farmacológica a Drogas Os polimorfismos presentes nos genes que codificam para enzimas metabolizadoras de drogas desempenham um papel fundamental no desfecho da utilização das mesmas em terapia, principalmente em relação à má absorção, a biotransformação ou ainda a excreção, podendo também representar fatores de risco para algumas doenças humanas (CASCORBI et. al., 1999; INGELMAN-SUNDBERG, 1998). Dentre os inúmeros polimorfismos com estas caracteríscas, os presentes no gene que codifica para a enzima Arilamina N acetiltransferase 2 humana (NAT2) estão entre os mais estudados. As Arilaminas N- acetiltransferases (NATs) são enzimas metabolizadoras que catalisam a conjugação de um grupo acetil Coa em uma fração amina, hidrazina ou hidroxilamina de um composto aromático (WEBER, et. al., 1985). Em humanos, genes duplicados codificam para duas enzimas (NAT1 e NAT2) com especificidades ao substrato distintas, mas com sobreposição parcial e com diferente distribuição tissular: NAT1 é virtualmente ubíqua, enquanto NAT2 é expressa em altos níveis apenas no intestino e no fígado (HUSAIN, et. al., 2007; LUCA, et. al., 2008). A enzima NAT 2 humana é codificada pelo gene NAT2, o qual está localizado no braço curto do cromossomo 8 (8p ) e contém uma região codificante de 870 pares de bases (pb) (BLUM et al. 1990; STRAKA et al. 2006). Vários polimorfismos genéticos foram descritos no gene NAT2 humano. 28

30 Até o momento, 53 alelos foram registrados no banco de dados disponível no site (YULIWULANDARI et. al., 2008). A dedução dos fenótipos NAT2 é realizada baseada na expressão codominante de alelos ou haplótipos de acetilação rápida e lenta de NAT2. Indivíduos homozigotos para os alelos de acetilação rápida são deduzidos como sendo acetiladores rápidos, da mesma forma, os indivíduos homozigotos para alelos de acetilação lenta, são considerados acetiladores lentos e indivíduos heterozigotos, possuindo um alelo de acetilação rápida e outro de acetilação lenta, são chamados de acetiladores intermediários (HEIN, 2006). Ainda não há um consenso sobre os efeitos funcionais de todos os alelos de NAT2. Os mecanismos moleculares por trás do fenótipo lento estão sendo estudados e os resultados de estudos nos sistemas de expressão de bactérias e amebas mostram que geralmente, a substituição de nucleotídeo na região codificante de NAT2 resulta em baixa atividade, expressão diminuída e proteínas instáveis com o alelo acetilador lento (HEIN et al., 1994; LEFF et al. 1999; YULIWULANDARI et. al., 2008). A variabilidade de fenótipos NAT2 foi primeiramente identificada como uma modificadora de efeitos colaterais tóxicos em pacientes tratados com a droga anti-tuberculose isoniazida (WEBER & HEIN, 1979). Em adição ao metabolismo de muitas drogas aminas e hidrazinas (WEBER & HEIN, 1985), NAT2 modifica a predisposição ao câncer com papeis na bioativação e desintoxicação de aminas carcinogênicas aromáticas e heterocíclicas (HEIN, et. al., 2000). No esquema metabólico para essas drogas e carcinógenos, NAT2 catalisa não somente a N-acetilação, mas seguindo a N-hidroxilação e catalisa a subseqüente O-acetilação e N,O-acetilação (HANNA, 1994). Os alelos ou haplótipos de NAT2 em humanos possuem uma combinação de SNPs, alguns dos quais estão associados com fenótipos de acetilação lenta. NAT2* 4 é considerado o tipo selvagem ou alelo/haplótipo referência sem SNPs. Alelos ou haplótipos variantes de NAT2 possuindo combinações de SNPs são separados em clusters possuindo uma nomenclatura para o SNP sozinho ou em combinação com outros. Um comitê internacional de nomenclatura publica um website acessível para atualizações em (WALRAVEN, 2008). 29

31 As relações entre genótipo e fenótipo em NAT2 foram extensivamente pesquisadas. No entanto, esta relação não é realmente compreendida. Muito embora a maioria das pesquisas tenha mostrado uma alta concordância entre genótipos e fenótipos, nenhuma delas mostrou 100% de concordância. (BUTCHER et al., 2002; CASCORBI et al., 1995; HICKMAN & SIM, 1991; RIHS et al., 2007). A maior discordância (86%) entre genótipos e fenótipos foi relatada na população Hmong (Imigrantes do sudeste da África, Laos, desde 1975) em Minnesota (STRAKA et al. 2006). Os efeitos da dieta, condições fisiológicas, infecções bacterianas ou virais afetando a atividade metabólica de NAT2 e polimorfismos presentes em regiões regulatórias não codificantes de NAT2 foram deduzidas como fontes potenciais dessa discordância (STRAKA et al. 2006; YULIWULANDARI et. al., 2008). Estudos funcionais já demonstraram a existência de diferentes mecanismos que podem resultar no fenótipo de acetilação lenta dependendo dos polimorfismos presentes no gene NAT2. Dentre os quais: (i) diminuição da quantidade de proteína sintetizada (SNPs C190T, T341C, A434C, G590A); (ii) diminuição da atividade enzimática (SNPs C190T, G191A, T341C, A434C e G59A) e (iii) dimuinuição da estabilidade da enzima NAT2 (SNPs G191A, A85C e G857A (FRETLAND, et. al., 2001). Por outro lado, outras mutações descritas na literatura, como por exemplo, T111C, C282T, C481T, C759T e A803G, não exercem nenhum efeito na atividade biológica da proteína, caracterizando um alelo funcional (acetilador rápido). Estudos adicionais que avaliaram a relação entre diferentes haplótipos e o desfecho de metabolização, baseados na expressão da atividade enzimática realizados com os alelos mais freqüentes de NAT2, possibilitaram a caracterização dos mesmos quanto ao perfil de acetilação. Os alelos dos clusters NAT2 *5, *6, *7, *14 e *19 conferem um fenótipo de acetilação lenta, enquanto os alelos NAT2 *4 e dos clusters *12 e *13 conferem um fenótipo de acetilação rápida (HEIN, et. al., 2000; HEIN, 2002). Os genótipos formados por um alelo funcional e um defeituoso caracterizam o fenótipo de acetilação intermediária, sendo este de expressão co-dominante. Diferenças étnicas nas freqüências de SNPs são responsáveis pelas diferenças étnicas correspondentes na freqüência de alelos ou haplótipos NAT2 de acetilação rápida ou lenta (PATIN, 2006) e conseqüentemente dos 30

32 fenótipos. Por exemplo, o SNP G191A comum ao alelo cluster NAT2*14 é freqüente em africanos e afro-americanos, mas virtualmente ausente em caucasóides, indianos e coreanos. Similarmente, o cluster NAT2* 7 possuindo é muito mais freqüente no sul da Índia e Coréia do que em outras populações enquanto o cluster NAT2* 5 contendo o SNP T341C é muito menos freqüente na Coréia do que na Europa, América do Norte, Índia e África (WALRAVEN, 2008). Em um estudo realizado recentemente no Brasil, foram avaliados os perfis de acetilação de indivíduos residentes no Rio de Janeiro e Goiás em tratamento para tubercolose com isoniazida. A identificação de diferentes SNPs mostra claramente a diversidade alélica para o gene NAT2 encontrada nas duas regiões, o que provavelmente deve-se ao fato de diferentes grupos étnicos terem participado na construção da nossa população na época da colonização (TEIXEIRA, et. al., 2007). 31

33 2. CARACTERIZAÇÃO DO PROBLEMA E HIPÓTESES Os polimorfismos presentes em genes metabolizadores de drogas podem influenciar em diversos níveis a atividade biológica final da enzima levando ao aparecimento de desfechos desfavoráveis. Outro fator fundamental relacionado à diversidade genética é a etnia da população. A freqüência dos principais polimorfismos funcionais varia amplamente dependendo da etnia predominante numa determinada população e, portanto, os padrões e resposta a uma determinada droga provavelmente também variam. O Brasil, devido a sua característica parental tri híbrida com participação das etnias caucasiana, negróide e ameríndia, possui uma grande mistura de etnias, as quais se distribuem por todo o território nacional com predomínio de alguns grupos étnicos dependendo da região. Em humanos, a enzima N-acetiltransferase2, codificada pelo gene NAT2 é primordial para a biotransformação (acetilação) de diversas drogas, dentre as quais a dapsona, usada no tratamento da hanseníase. Tendo em vista a diversidade alélica deste gene de acordo com a etnia, é de se esperar que os perfis fenotípicos de acetilação variem o que significa que o padrão de resposta às drogas metabolizadas pela enzima NAT2 deve ser diferente dependendo da população estudada. Sendo assim, nossas hipóteses são que: (1) Pacientes com hanseníase, em tratamento específico com esquemas contendo dapsona em Porto Velho - RO, possuem padrões fenotípicos diferentes de pacientes de outras regiões do pais e poderão responder diferentemente ao tratamento com a mesma droga e posologia. (2) A ocorrência de reações adversas decorrentes do tratamento com esquemas contendo dapsona está associada ao fenótipo de acetilação lenta. 32

34 3. JUSTIFICATIVA Atualmente, os critérios empregados para definir a posologia mais adequada ignoram a informação genética do indivíduo se fundamentando principalmente em dados clínicos e laboratoriais identificados sempre após o aparecimento de efeitos adversos. Sendo a hanseníase uma doença endêmica, tratada com um esquema cuja posologia é padronizada para todo o território nacional, a avaliação dos perfis genéticos da população brasileira é de fundamental relevância, visto a ausência de dados disponíveis. O conhecimento sobre a relação genótipo/fenótipo versus eficácia e segurança do tratamento da hanseníase poderá orientar novos procedimentos (posologia mais adequada e periodicidade de testes laboratoriais) a serem implantadas na rede SUS, pois levará em conta a pré-disposição genética do indivíduo a efeitos adversos. Sendo assim, futuramente, a aplicação da metodologia deste projeto poderá permitir a previsão do risco de aparecimento desse efeito, o que poderá contribuir para a diminuição da taxa de abandono do tratamento e para evitar a seleção de bactérias resistentes decorrente da descontinuidade do tratamento. 33

35 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GERAL Comparar, através da caracterização genética de NAT2 o perfil de acetilação predominante em pacientes com hanseníase na Cidade de Porto Velho - RO com o do Rio de Janeiro - RJ e Goiânia - GO e avaliar em um desenho epidemiológico do tipo caso-controle, a possível associação do perfil genotípico que caracteriza acetilação lenta com a ocorrência de reações adversas. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Descrever a freqüência das mutações presentes no gene NAT2 em pacientes com hanseníase residentes em Porto Velho, RO; Comparar as freqüências alélicas e genotípicas encontradas em Porto Velho - RO com as do Rio de Janeiro - RJ e Goiânia GO, incluindo variações étnicas; Investigar a presença de SNPs novos no gene NAT2 na população estudada através de seqüenciamento; Realizar estudo de associação na população de Porto Velho para avaliar o desfecho de reações adversas em relação aos perfis genotípicos envolvidos com acetilação lenta. 34

36 5. MATERIAIS E MÉTODOS Para os três primeiros objetivos específicos, o desenho de estudo foi do tipo observacional descritivo, para o quarto objetivo, tivemos um estudo do tipo caso-controle, no qual foi realizada uma comparação entre os perfis genotípicos e fenotípicos dos pacientes em tratamento ou já tratados que desenvolveram, ou não, reações adversas à dapsona. A pesquisa foi de caráter tanto quantitativo, visto a presença das hipóteses indicadas e as variáveis de associação que foram analisadas estatisticamente, quanto qualitativa, já que os três primeiros objetivos específicos se valeram da observação e descrição (NEVES, 1996). Foram utilizadas amostras biológicas (sangue) de pacientes em tratamento ou já tratados com poliquimioterapia contendo dapsona, atendidos na Policlínica Oswaldo Cruz e no Hospital Marcelo Cândia, em Porto Velho - RO. O período de recrutamento foi de 12 meses, entre jullho de 2007 e junho de 2008 abrangendo todos os casos neste período, desde que atendessem os critérios de inclusão. Foram coletados 1,5 ml de sangue por punção venosa em tubos vaccuntainer contendo EDTA. Posteriormente, o sangue foi armazenado em freezer a -20ºC. 5.1 CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE Foram considerados elegíveis para o estudo, todos os pacientes atendidos em consultório ou internados que receberam o diagnóstico de hanseníase (independente da forma clínica) em qualquer etapa do tratamento com esquema contendo dapsona. O médico assistente fez o convite ao paciente para a participação no projeto. Os pacientes incluídos responderam a um questionário próprio para inclusão no estudo e aceitaram participar da pesquisa através da assinatura de um termo de consentimento livre e esclarecido 35

37 5.1.2 Critérios de Inclusão Foram incluídos na pesquisa, os pacientes que atenderam aos seguintes critérios: Pacientes portadores de hanseníase, com ou sem confirmação bacteriológica, de qualquer cor ou gênero que estivessem em tratamento com o esquema contendo Dapsona; Pessoas com idade igual ou superior a 18 anos Critérios de Exclusão Não fizeram parte desta pesquisa: Pacientes infectados pelo vírus HIV; Pacientes menores de 18 anos; Aqueles que se recusaram a fornecer amostra de sangue e/ou a assinatura do termo de consentimento; Pacientes que apresentaram problemas de alcoolismo ou com história pregressa de hepatite B e/ou C. 5.2 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS Foi feita a coleta de 1,5 ml de sangue periférico por punção venosa em tubo vaccuntainer contendo EDTA. Após a homogeneização por inversão as amostras foram congeladas a -20 ºC e posteriormente encaminhadas ao Laboratório de Biologia Molecular Aplicada à Micobactérias na Fiocruz/RJ para posterior extração de DNA e análise genética Extração de DNA Genômico A extração de DNA genômico foi realizada a partir do sangue total congelado através da utilização do kit comercial FlexiGene (Qiagen), seguindo protocolo de acordo com o fabricante. Trata-se de um método 36

38 comercial utilizado para extração de DNA de células do sangue periférico que consiste basicamente na adição de um tampão de lise às amostras. Os núcleos celulares e as mitocôndrias são sedimentados por centrifugação e ressuspensos em tampão de desnaturação o qual contém um sal caotrópico (Guanidina hidroclorídrico) e uma protease. Esta etapa remove os contaminantes tais como proteínas e açúcares. Após a digestão protéica, o DNA é precipitado por adição de isopropanol, recuperado por centrifugação, lavado em etanol a 70%, e seco a temperatura ambiente. O DNA é finalmente ressuspenso em um tampão de hidratação e está pronto para uso direto em ensaios ou para o armazenamento a -20 º C. A quantificação do DNA foi realizada através da eletroforese em gel de agarose a 0,8% corado por brometo de etídio no qual foi utilizada uma amostra padrão (λ) com concentração de 50 ng/ μl. Desta forma foi possível estimar a quantidade de DNA entre 50 e 100 ng/ μl (figura 1) PCR A reação de PCR para amplificação de NAT2 já estava padronizada no Laboratório de Biologia Molecular aplicada a Micobactíerias Fiocruz. Para a reação foram utilizados os iniciadores NAT2EF e NAT2ER capazes de gerar um fragmento de 1093 pares de bases (pb) contendo toda a região codificante do referido gene ( intronless 873pb) (TEIXEIRA, et. al., 2007). Para a obtenção de fragmentos amplificados de boa qualidade, sem bandas inespecíficas, foi utilizada uma reação Touchdown PCR (TD-PCR) a qual emprega uma temperatura acima da temperatura de pareamento inicial (TA) dos primers, em seguida, progressivamente ocorre a transição para uma temperatura de pareamento menor e mais permissiva ao longo dos sucessivos ciclos (KORBIE & MATTICK, 2008). A PCR foi realizada no termociclador The Veriti Thermal Cycler da Applied Biosystems. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1,2% corado por brometo de etídio, como mostra a figura 2. 37

39 5.2.3 Purificação do Produto de PCR para Seqüenciamento Para a purificação do produto de PCR, utilizou-se o kit comercial ChargeSwitch PCR Clean-Up Kit da empresa Invitrogen. O procedimento foi realizado conforme instruções do fabricante. Trata-se de um kit que permite a purificação dos produtos de PCR de sais, primers, dntps, e outros reagentes, através de micro esferas magnéticas. Em condições de baixo ph, as micro esferas magnéticas têm uma carga positiva e ligam-se ao DNA com carga negativa. As proteínas e outros contaminantes não são ligados e são lavados usando-se um tampão de lavagem. Para eluição dos ácidos nucléicos, a carga elétrica na superfície é neutralizada elevando-se o ph para 8,5 como o uso de um tampão de eluição.o DNA purificado é eluido instantaneamente neste tampão. 5.3 SEQÜENCIAMENTO DE DNA Para a reação de seqüenciamento a partir do produto amplificado na PCR foi utilizado o kit ABI PRISM Big Dye Terminator v3. 1 (PE Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante. Para cada amostra foram utilizadas quatro reações de seqüenciamento, ou seja, foram utilizados dois primers externos e dois internos, a fim de obter-se seqüência de boa qualidade em toda a extensão da região codificante. Em cada reação (10 µl de volume final), foram utilizados aproximadamente 20 ng de produto amplificado; 3,2 pmol do primer; 0,5 µl de Big Dye e 1,5 µl de tampão 5X. (TEIXEIRA et. al., 2007). As reações foram analisadas no seqüenciador de capilar ABI PRISM 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) Precipitação da Reação de Seqüenciamento Antes da análise no seqüenciador, o produto da reação de seqüenciamento foi precipitado conforme o seguinte protocolo: foram adicionados 30μL de isopropanol 75% e a placa contendo a reação foi agitada por 10 segundos. O produto foi então precipitado por 15 minutos em temperatura ambiente. A placa foi centrifugada a rpm por 45 minutos a 38

40 20ºC e logo após invertida em papel toalha para retirada do líquido. A seguir, foram adicionados 50 μl de etanol a 75% em cada poço da placa e logo após foi feita uma centrifugação a rpm por 15 minutos a 20ºC. Inverteu-se novamente a placa em papel toalha, para retirada de toda a parte líquida. O pellet foi seco a 60ºC por 10 minutos no termociclador. Finalmente, foram adiconados 10 μl de formamida para ressuspender a reação. A placa foi então incubada por 3 minutos a 95 ºC e logo após, colocada imediatamente no gelo para choque térmico, permitindo assim a desnaturação do DNA Análise das Seqüências As seqüências foram obtidas pelo seqüenciador de 96 capilares ABI PRISM 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) e depois analisadas pelo programa SeqScape da Applied Biosystems, o qual permite dois tipos de análise: (i) identificação de variantes nucleotídicas e aminoacídicas (o software identifica posições que diferem da seqüência referência e as classifica como variantes conhecidas ou desconhecidas) e (ii) identificação de genótipos, alelos ou haplótipos de uma biblioteca (além da identificação de variantes, o software busca em bibliotecas e bases de dados de genótipos, alelos ou haplótipos e identifica o alelo que mais rigorosamente se iguala com a seqüência consenso). 5.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA As freqüências alélicas e genotípicas foram estimadas pelo método de contagem gênica. Para os cálculos estatísticos foi realizado o teste quiquadrado e tabelas de contingência, utilizando os programas Microsoft Excel e Bioestat ASPECTOS LEGAIS E DE BIOÉTICA Toda a proposta inerente à parte genética, tanto do ponto de vista teórico como das propostas experimentais foram realizadas de acordo com as Diretrizes e Normas que regem a Pesquisa em Seres Humanos, Resolução nº 39

41 196/96, 251/97 e 292/99 do Conselho Nacional de Saúde/ Comitê Nacional de Ética em Pesquisa e da Agência Nacional de Vigilância Sanitária. O projeto de pesquisa foi apreciado pelo Comitês de Ética em Pesquisa do Núcleo de Saúde da Universidade Federal de Rondônia (protocolo nº /2008) e Fundação Oswaldo Cruz RJ (protocolo nº 449/08), tendo parecer favorável (documento em anexo). 40

42 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO A utilização do kit FlexiGene DNA da Qiagen possibilitou a obtenção de boa quantidade de DNA (cerca de 100ng/µL) em um curto espaço de tempo. O método apresenta ainda, a vantagem de não utilizar solventes orgânicos. A figura 1 mostra um gel de agarose a 1% com amostras de DNA extraídas pelo kit. λ λ Figura 1. Gel de agarose 0,8% com amostras de DNA extraídas com utilização do kit FlexiGene DNA da Qiagen. 6.2 PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DA REGIÃO CODIFICANTE DE NAT2 Nesta pesquisa, foi feita uma adaptação do protocolo estabelecido anteriormente por (TEIXEIRA, et. al., 2007) para a utilização de um sistema Touchdown PCR (TD-PCR). Segundo Korbie & Mattick, (2008) a TD-PCR é particularmente útil para trechos de DNA difíceis de amplificar, além disso, pode ser utilizada para melhorar a especificidade do produto amplificado. Como pode ser observada na figura 2, a aplicação deste método permitiu a obtenção de produto amplificado de ótima qualidade, sem fragmentos inespecíficos, ideal para o seqüenciamento direto do produto de PCR. 41

43 DNA Ladder 100pb (Invitrogen) Produto amplificado 1093pb Figura 2. Gel de agarose 1,2% contendo produtos amplificados pelo sistema TD-PCR. Fragmentos de 1093 pb, contendo a região codificante do gene NAT SEQÜENCIAMENTO DE DNA E ANÁLISE DOS SNPS Para identificação dos SNPs presentes na região codificante do gene NAT2 foi realizado o seqüenciamento direto do produto de PCR após purificação. A figura 3 mostra os produtos purificados através do kit comercial Chargeswitch PCR Clean-up (Invitrogen) em gel de agarose a 1,2% corado por brometo de etídio. Para o seqüenciamento foram utilizados dois pares de iniciadores (primers), um par interno e outro externo, visando à obtenção de uma seqüência integral e de boa qualidade. A estratégia de desenho dos primers e a seqüência referência (NAT*4 alelo tipo selvagem) utilizada para a identificação dos SNPs na população estudada são mostradas na figura 4. Observou-se após o seqüenciamento, que cerca de pb iniciais eram perdidos em cada reação devido à má qualidade das seqüências obtidas. No entanto, a utilização de quatro reações, cada uma com um iniciador diferente, possibilitou a obtenção da seqüência de toda a região de interesse em todas as amostras, o que representou um aproveitamento de pb de cada reação. 42

44 Produto de PCR purificado (1093pb) DNA Ladder 100pb (Invitrogen) Figura 3. Gel de agarose 1,2% corado por brometo de etídio, contendo produtos de PCR purificados pelo kit Chargeswitch PCR Clean-up (Invitrogen). aagggattcatgcagtagaaatactaacaaaagaattactatgacagatacttataacca ttgtgtttttacgtatttaaaatacgttatacctataattagtcacacgaggaaatcaaa tgctaaagtatgatatgtttttatgttttgtttttcttgcttaggggatcatggacattg aagcatattttgaaagaattggctataagaactctaggaacaaattggacttggaaacat taactgacattcttgagcaccagatccgggctgttccctttgagaaccttaacatgcatt gtgggcaagccatggagttgggcttagaggctatttttgatcacattgtaagaagaaacc ggggtgggtggtgtctccaggtcaatcaacttctgtactgggctctgaccacaatcggtt ttcagaccacaatgttaggagggtatttttacatccctccagttaacaaatacagcactg gcatggttcaccttctcctgcaggtgaccattgacggcaggaattacattgtcgatgctg ggtctggaagctcctcccagatgtggcagcctctagaattaatttctgggaaggatcagc ctcaggtgccttgcattttctgcttgacagaagagagaggaatctggtacctggaccaaa tcaggagagagcagtatattacaaacaaagaatttcttaattctcatctcctgccaaaga agaaacaccaaaaaatatacttatttacgcttgaacctcgaacaattgaagattttgagt ctatgaatacatacctgcagacgtctccaacatcttcatttataaccacatcattttgtt ccttgcagaccccagaaggggtttactgtttggtgggcttcatcctcacctatagaaaat tcaattataaagacaatacagatctggtcgagtttaaaactctcactgaggaagaggttg aagaagtgctgaaaaatatatttaagatttccttggggagaaatctcgtgcccaaacctg gtgatggatcccttactatttagaataaggaacaaaataaacccttgtgtatgtatcacc caactcactaattatcaacttatgtgctatcagatatcctctctaccctcacgttatttt gaagaaaatcctaaacatcaaatactttcatccataaaaatgtcagcatttattaaaaaa caataactttt Produto da PCR (1093 pb) Iniciadores externos usados para amplificação e seqüenciamento sseqüenciamento Iniciadores internos usados somente para seqüenciamento Figura 4: Estratégia de amplificação e seqüenciamento de NAT2 (Seqüência parcial do gene de NAT2 retirada da seqüência referência AY331807). O esquema mostra a região de pareamento dos primers utilizados para amplificação e/ou seqüenciamento bem como a região de interesse (negrito) mostrando os códons de iniciação (ATG) e terminação (TAG) em vermelho. 43

45 A utilização do programa de bioinformática SeqScape v. 2.5 (Applied Biosystems) possibilitou a análise das seqüências de 62 amostras. Utilizando a seqüência AY (alelo NAT2*4 tipo selvagem) como referência para o alinhamento das seqüências obtidas foi possível a identificação de 10 SNPs na população estudada. A figura 5 mostra a ilustração de uma janela de utilização do software SeqScape. Seq. ref. mostrando em azul os 10 SNPs encontrados nesse estudo Seqüência Rdaslçfjkçasldkjfçla Seqüência skdfrrrreferência referência Seqüência Rconsenso de a.a. Alinhamento das seqüências de diferentes amostras Figura 5: Ilustração da utilização do software SeqScape v Nessa janela pode ser observado o alinhamento das amostras bem como a seqüência referência, seqüência consenso e a seqüência de aminoácidos de NAT2. O referido software, além de identificar mutações pontuais em uma determinada seqüência, mostra quando uma amostra é homozigota ou heterozigota para determinado SNP, uma vez que o seqüenciamento a partir do produto de PCR possibilita a análise de dois alelos para cada SNP. O programa SeqScape permite a visualização do cromatograma e a identificação do (s) pico (s) referente (s) a (s) base (s) nitrogenada (s) em determinada localização. A figura 6 mostra os três possíveis genótipos a serem encontrados quando se detecta um SNP em uma determinada amostra. 44

46 (A) (B) (C) Um pico azul referente a citosina (CC) Dois picos (azul e vermelho) referentes a citosina e timina (CT) Um pico vermelho referente a timina (TT) Figura 6: Identificação de SNP através da visualização do cromatograma pelo software SeqScape. A figura mostra três amostras diferentes e os possíveis genótipos para o SNP T341C. (A) Amostra mutante homozigota, (B) amostra mutante heterozigota e (C) amostra tipo-selvagem para o SNP T341C. 6.4 DESCRIÇÃO DAS MUTAÇÕES DO GENE NAT2 EM PACIENTES DE PORTO VELHO No total, 62 amostras foram analisadas através de seqüenciamento da região codificante de NAT2, o que permitiu a identificação de 10 SNPs dos 27 já descritos na literatura e cadastrados no site oficial de nomenclatura de NAT2 ( Dentre os 10 SNPs encontrados na população de Porto Velho, sete são os mais freqüentemente encontrados na população mundial, sendo estes: G191A; C282T; T341C; C481T; G590A; A803G e G857A. Quatro destes (G191A, T341C, G590A, G857A) estão relacionados com o fenótipo de acetilação lenta, e, três (C282T, C481T e A803G) não interferem no fenótipo de acetilação. O quadro 1 mostra as freqüências absolutas e alélicas para cada SNP encontrado. Observa-se que as mutações com maior freqüência na população estudada foram C282T, T341C, C481T e G590A. 45

47 Quadro 1: Freqüência dos SNPs NAT2 identificados na população de Porto Velho RO. SNP Nº de Amostras (N=62) Nº de Homozigotos Nº de Heterozigotos Freqüência Absoluta (%) Freqüência Alélica (%) Efeito da Mutação* G191A ,45 4,03 missen C282T ,90 37,90 silent T341C ,84 32,26 missen C481T ,77 27,42 silent G590A ,94 25,81 missen T622C 1-1 1,61 0,81 missen A766G 1-1 1,61 0,81 missen A803G ,13 12,90 missen G838A 1-1 1,61 0,81 missen G857A ,19 12,10 missen *Dados obtidos de: se se se se se se se se Ao se comparar os resultados obtidos neste trabalho com os descritos por TEIXEIRA et. al., (2007) nas populações do Rio de Janeiro e Goiânia, observa-se uma diferença significante na freqüência alélica dos SNPs A803G e G857A, sendo o primeiro mais freqüente nessas duas populações (p< 0,0000) e o último com maior freqüência em Porto Velho (p= 0,0023). Para os demais SNPs as diferenças não foram significantes, entretanto, seis SNPs detectados na população do Rio de Janeiro e Goiânia não foram observados em Porto Velho (G70A, C345T, C345T, A403G, C609T e C683T), todos com freqüência entre zero e 1%. Em Porto Velho, foram detectados dois SNPs não encontrados nas outras duas populações, T622C e A766G, ambos com freqüências abaixo de 1%. 46

48 A maior quantidade de SNPs detectados nas populações do Rio de Janeiro e Goiás quando comparado a Porto Velho, pode ser devida ao maior tamanho amostral nestas duas populações (298 e 106 amostras respectivamente). Essa diferença também pode estar relacionada ao processo de povoamento dessas regiões, sendo que cada uma recebeu diferentes contribuições genéticas no que diz respeito à etnia, o que se reflete nas diferenças entre as freqüências dos SNPs nessas populações. A presença de dois SNPs (282 C>T e 481 C>T, ambos mutações silenciosas) em altas freqüências em nossa população, corrobora com o encontrado por vários autores (como os abaixo citados) em várias regiões do mundo. As razões pelas quais estes SNPs silenciosos pertencem ao grupo dos mais freqüentemente distribuídos pelo mundo não são bem conhecidas Distribuição Interétnica dos SNPs Presentes no Gene NAT2 Ainda fazendo uma comparação com o trabalho de Teixeira et. al., (2007) e com diversos trabalhos publicados que demonstram uma variação na freqüência das mutações presentes no gene NAT2 de acordo com a etnia, chegamos aos seguintes resultados (quadro 2): O SNP G191A, identificado principalmente em populações africanas (DELOMENIE et. al., 1996 & CAVACO et. al., 2003) e G857A de origem asiática (XIE et. al., 1997 & SEKINE et. al., 2001), mas também prevalente em populações ameríndias (JORGE-NEBERT et. al., 2002) foram encontrados em nossa população, assim como no Rio de Janeiro e Goiânia. A freqüência do SNP G191A foi a mesma em Porto Velho e nas outras duas populações do Brasil (p= 0,3347), sendo significantemente maior quando comparada a descendentes europeus, alemães e poloneses e significantemente menor quando comparada com populações africanas (TEIXEIRA, et. al., 2007). A freqüência do polimorfismo G857A foi significantemente maior no Brasil do que em descendentes europeus, alemães e espanhóis; e significantemente menor quando comparada a chineses e ameríndios (TEIXEIRA et. al., 2007). No entanto, para este SNP, Porto Velho apresentou freqüência maior quando comparado ao Rio de Janeiro e Goiânia (p= 0,0023). Os SNPs T341C, C481T e A803G, todos com alta prevalência em populações 47

49 européias e africanas, foram também observados com altas freqüências no Brasil, no entanto, o SNP A803G apresentou uma freqüência significantemente menor na população de Porto Velho em relação ao Rio de Janeiro e Goiânia (p< 0,0000). Para os SNPs T341C e C481T as freqüências não demonstraram diferenças significantes entre as três populações (p= 0,1133), embora tenham sido mais baixas em Porto Velho. Finalmente, os SNPs C282T (p= 0,5774) e G590A (p=0,7952) não apresentaram diferenças significantes em suas freqüências na população de Porto Velho e nas outras duas populações brasileiras, sendo que a freqüência de C282T foi maior em nossa população do que em descendentes europeus e espanhóis, enquanto a do SNP G590A só foi maior quando comparada com ameríndios (TEIXEIRA, et., al., 2007). A alta freqüência do SNP G857A, característico de ameríndios, na população de Porto Velho pode ser interpretado como uma das conseqüências da influência de ameríndios na constituição da população local. Já a baixa freqüência do polimorfismo A803G, característico de europeus, quando comparada ao Rio de Janeiro e Goiás, mostra uma menor contribuição de descendentes europeus para a formação da população de Porto Velho, quando comparado a as outras duas populações. 6.5 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE NAT2 A utilização do software disponível no site tornou possível a caracterização fenotípica de todos os indivíduos arrolados no estudo a partir do perfil de SNPs. Trata-se de um servidor web que utiliza uma abordagem de reconhecimento supervisionado de padrões para inferir o fenótipo acetilador NAT2 diretamente a partir das combinações de SNPs observados, sem passar pela etapa de determinação dos haplótipos para cada indivíduo. A acurácia do método é de 99,99%, sendo os valores de sensibilidade e especificidade entre 99,6 e 100% (KUZNETSOV et. al., 2009). As figuras 7 e 8 mostram a interface gráfica de utilização do servidor web. O gráfico 1 mostra a freqüência dos fenótipos de acetilação lenta, rápida e intermediária na população de Porto Velho. Do total de 62 amostras analisadas, 30 apresentaram o fenótipo de acetilação intermediária, o que representa 48,38%. Quanto aos acetiladores lentos, foram observados 28 48

50 indivíduos na população, representando 45,16% do total, enquanto os acetiladores rápidos foram observados com uma freqüência de 6,45%, representados por 4 indivíduos na população. Porto Velho apresentou uma alta freqüência de acetiladores lentos, semelhante ao encontrado no Rio de Janeiro (46,6%) e Goiás (55,4%) não ocorrendo diferenças estatísticas entre as três populações. Quanto ao fenótipo de acetilação intermediária, Porto Velho (48, 38%) apresentou freqüência semelhante a encontrada no Rio de Janeiro (42,5%) e uma diferença significante quando comparada a Goiânia (p= 0,0032) (25%). Em relação ao fenótipo de acetilação rápida, Porto Velho apresentou freqüência abaixo das demais populações brasileiras estudadas (gráfico 2). Quadro 2. Comparação entre as freqüências dos 7 principais SNPs entre as populações brasileiras e demais populações mundiais. População Brasil (Rio de Janeiro e Goiás) SNP (%) G191 A C282T T341C C481T G590 A A803 G G857 A 4,1 36,8 37,7 35,4 26,4 40,3 4,5 Porto Velho 4 37,9 32,3 27,4 25,8 12,9 12,1 Descendente 1 25,8 45,9 45,6 26,4 47 1,2 s Europeus Alemanha 0,1 30,8 46,5 42,5 27,8 42,4 1,3 Polônia 0 33,5 44,4 38, ,3 3,4 Espanha , , ,2 1,2 Tailândia ND 47,4 ND 3,8 32,5 ND 20,4 Japão 0 37,3 1,6 1,6 28,3 7,4 11,3 China ND 30, ,5 ND 11,2 Ameríndios Ngawbe ND 25,2 2,4 2,4 0 1,9 23,3 Embera ND 29 9,9 9,2 3,7 9,9 22,8 África 6,8 32,5 35,9 29,5 27,4 46,5 2,2 Fonte: Modificado de Teixeira et. al., (2007). 49

51 Perfil de Acetilação da População de Porto Velho 50,00% 40,00% 30,00% 48,38% 45,16% 20,00% 10,00% 6,45% 0,00% Acetiladores Rápidos Acetiladores Intermediários Acetiladores Lentos Gráfico 1. Fenótipos de Acetilação NAT2 na população de Porto Velho. 60,00% 50,00% Comparação do Perfil de Acetilação 55,40% 48,38% 42,50% 46,60% 45,16% 40,00% 30,00% 20,00% 10,00% 19,60% 10,90% 6,45% 25% Porto Velho Rio de Janeiro Goiânia 0,00% Acetiladores Rápidos Acetiladores Intermediários Acetiladores Lentos Gráfico 2. Comparação entre os perfis de acetilação nas populações de Porto Velho, Rio de Janeiro e Goiânia. Dados sobre as populações do Rio de Janeiro e Goiânia obtidos de Teixeira et. al., (2007). 50

52 Figura 7. Interface gráfica do servidor web para determinação dos fenótipos NAT2, referente à página de entrada de dados. 51

53 Figura 8. Interface gráfica do servidor web para identificação dos fenótipos NAT. Página referente aos resultados. 52