EFEITO DO ULTRA-SOM SOBRE O REPARO DE FALHA ÓSSEA EXPERIMENTAL: AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOLÓGICA DO PARÂMETRO TEMPO DE ESTIMULAÇÃO

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1 Rev. bras. fisioter. Vol. 8, No. I (2004), 1-6 Associação Brasileira de Fisioterapia EFEITO DO ULTRA-SOM SOBRE O REPARO DE FALHA ÓSSEA EXPERIMENTAL: AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOLÓGICA DO PARÂMETRO TEMPO DE ESTIMULAÇÃO Albertin, L. M. Escola de Engenharia de São Carlos e Faculdade de Medicina de Ribeiriio Preto, da Universidade de São Paulo- Bioengenharia, Rua Dr. Carlos Botelho, 1465, São Carlos, SP Correspondência para: Lucélia Maria Albertin, Rua Coronel Quirino, 1193, Cambuí, Campinas, SP, dussa@terra.com.br Recebido: 19/2/03- Aceito: 9/2/04 RESUMO O presente trabalho teve por objetivo identificar o tempo de estimulação mais adequado na aceler.1ção do reparo ósseo, estabelecendo como tempos de aplicação a serem estudados: 5, 10, 20 e 40 minutos diários, comparando-os entre si e com grupo-controle submetidos a recuperação espontânea, e identificar se há relação positiva entre o tempo de exposição e o ciclo de trabalho proposto neste protocolo de intervenção, otimizando-se o método ultra-sônico proposto, tendo por base os estudos iniciados por L. R. Duarte, em No experimento, utilizou-se como instrumento estimulador um gerador de ondas ultra-sônicas, com o qual pode-se variar parâmetros, como largura de pulso, freqüência de repetição e amplitude da onda ultra-sônica. O estudo foi realizado em osteotomias experimentais do osso rádio de coelhos adultos da raça Nova Zelândia. O tempo de exposição ao ultra-som variou de 5, 10, 20 e 40 minutos diários por um período de 15 dias, tendo sido fixados os outros parâmetros, como largura de pulso em 50 ~ls, freqüência de repetição em 500Hz e amplitude em 30 v (pico a pico). Os resultados foram avaliados com base em análises radiológicas, exames histológicos e análise morfométrica do calo ósseo, dos grupos controle e experimental. Pode-se concluir que, com exceção do tempo de 5 minutos, a estimulação pelo ultra-som provocou aumento da ossificação do calo ósseo. O tempo mais longo utilizado, 40 minutos, foi o mais eficiente para a consolidação da falha óssea, considerados os parâmetros ultra-sônicos citados. Palavras-chave: ultra-som, osso, fratura, coelho, osteotomia. ABSTRACT This research is part of a wider project on the effect of treatment with ultrasound on the repair process in bones. Diaphyseal bone defects were created by experimental osteotomy in the radius of adult New Zealand rabbits. Different groups of test animais were exposed to 5, 10, 20 and 40 minutes of ultrasound stimulation daily for 15 days, while control animais had no stimulation. The ultrasound generator was set to operate at 30 V peak-peak amplitude, 50f.ls pulse-width and 500Hz pulse frequency in ali treatments. The bone defect was examined by X-ray, immediately after the osteotomy and 15 days!ater, when the animais were sacrificed. The bone callus was assessed on the day of the sacrifice, in both test and control groups, by histology, radiography and the Chalkley morphometric technique. It was shown that, with these ultrasound settings, ossification was greater in control animais, in ali groups except the one receiving 5 min. ultrasound a day, and the greatest regeneration occurred with 40 min. a day. Key words: ultrasound, bone, rabbit, osteotomy and repair. INTRODUÇÃO A necessidade de abreviar o tempo de consolidação das fraturas ósseas é evidente, visto que estas são fator incapacitante, que acarreta ao ser humano não só problemas relativos à saúde, como também problemas de caráter sacioeconômico. Essa necessidade levou vários pesquisadores a estudarem o osso, explorando suas propriedades biofísicaquímicas, com o intuito de ter uma resposta biológica acelerada, não patológica. Basset 1 iniciou em 1962 um estudo experimental da estimulação da consolidação de fraturas ósseas usando a eletricidade como estímulo, com base na propriedade piezoelétrica do osso, demonstrada por Yasuda quando obteve neoformação de tecido óss.eo usando cottente elétrica contínua como estímulo, demonstrando as constantes piezoelétricas

2 2 Albertin, L. M. Rev. brrl.\..fi'sio!ej: do osso. 2 Essa propriedade demonstra que o osso, como os materiais piezoelétricos, quando submetido a esforços (tensão mecânica) que produzam uma deformação, desenvolverá campos elétricos em sua superfície, o que promoverá a estimulação da divisão mitótica das células ósseas. O colágeno é o componente ósseo que possui essa propriedade física (piezoeletricidade), já que o osso desmineralizado em ácido continua a mostrar o efeito piezoelétrico. 2 Estudos sobre a piezoeletricidade óssea demonstraram que ela tem origem na aplicação de forças cizalhantes às fibras de colágeno, sendo que o osso manifesta o efeito piezoelétrico da mesma forma que alguns materiais cristalinos. Duarte 3 propôs um método não invasivo de consolidação de fraturas. O método constituiu-se do uso do ultra-som como estímulo em osteotomias experimentais de fêmur, fíbula e costela de 45 coelhos, acelerando a osteogênese. Xavier & Duarte 4 utilizaram em casos clínicos a estimulação ultra-sônica na consolidação de fraturas com anormalidade no processo de consolidação e obtiveram 70% de sucesso nos casos estudados. O uso do ultra-som pulsado colocará cargas na supetfície celular, mantendo a polarização elétrica média enquanto durar o estímulo. Essa polarização faz com que os osteoblastos alterem seus potenciais de membranas, permitindo um bombeamento de íons e a captação de nutrientes. As células atuam, então, como transdutor biológico, em que o estímulo elétrico produz maior atividade mitótica das células, promovendo, assim, o reparo ósseo. Os efeitos causados pelo ultra-som, como o efeito térmico, em que variações da temperatura são observadas no meio submetido à pressão acústica, não gerou mudanças importantes no presente estudo, já que as variações da temperatura foram da ordem de centésimos de graus centígrados, isto em razão da baixa intensidade (menor que 80 mw/cm 2 ) do ultra-som utilizado.' Em relação ao efeito cíclico, que causa movimentos nas partículas do meio quando submetido à pressão acústica e retornam a zero a cada ciclo, também não houve grande destaque no experimento, já que, em razão de o deslocamento ser pequeno, é pouco provável cair a zero ciclicamente, mesmo levando-se em conta a alta atenuação óssea, pois o osso não teria tempo suficiente para relaxar as tensões de cisalhamento a zero em cada ciclo. Isso faz com que a tensão de cisalhamento atue em uma ciclagem média, produzindo deformações. O processo de absorção de energia do ultra-som está relacionado à intensidade do ultra-som utilizado. 5 A absorção nos tecidos biológicos se dá em decorrência do conteúdo em proteínas, e pode ser descrita segundo o processo de relaxação, em que a energia acústica é atenuada para certas freqüências particulares, determinadas pelas propriedades moleculares do mate1ial. O que varia com a natureza do tecido é o coeficiente de absorção acústica, que intimamente depende da freqüência do ultra-som utilizado. No presente estudo propôs-se realizar a otimização do tempo de exposição ao ultra-som nos tratamentos de estimulação da consolidação de fraturas ósseas experimentais, estabelecendo-se como tempos de aplicação a serem estudados: 5, 10, 20 e 40 minutos diários. comparando-os entre si e com o grupo-controle, submetidos a recuperação espontânea, e identificar se há relação positiva entre o tempo de exposição e o ciclo de trabalho proposto neste protocolo de intervenção, tendo por base estudos iniciados por Duarte em METODOLOGIA Neste trabalho optou-se por utilizar como animal-teste o coelho da raça Nova Zelftndia, por ter sido o mesmo utilizado por Duarte em Foram submetidos a cirurgia 15 animais adultos, fêmeas, oriundos do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da USP, com peso corporal variando entre 2,5 e 3,5 kg. Os animais foram divididos em 5 grupos de 3 componentes, sendo um grupo-controle, com animais submetidos a osteotomia, nos quais não se realizou qualquer intervenção, sendo esperada a formação espontânea elo calo ósseo, e 4 grupos destinados à estimulação diária, estimulados por 5, 10,20 e 40 minutos, respectivamente, durante 15 dias ininterruptos. As osteotomias foram realizadas no Laboratório de Cirurgia Experimental da Faculdade ele Medicina de Ribeirão Preto, ela USP. Os animais foram anestesiados com pentobarbital sóclico por via intravenosa, na dose ele 33 mg/kg de peso, através ele punção da veia marginal ela orelha. Com o animal colocado em decúbito lateral, após a tricotomia, o membro foi então gmtoteaclo acima elo cotovelo, obtendo-se um campo exangue. A incisão retilínea, na face dorsal do antebraço, ele aproximadamente 3 em, foi feita longitudinalmente ao eixo do osso, utilizando-se bisturi com lâmina "22". A osteotomia incompleta foi feita no terço médio elo rádio, usando-se uma serra circular de 0,5 mm de espessura e 2,0 em ele diâmetro, adaptada a um equipamento odontológico de baixa rotação, funcionando a média velocidade. O periósteo foi mantido o mais intacto possível nas adjacências ela osteotomia, em razão de sua grande importância na osteogênese. A seguir, suturou-se os planos internos e a pele com fios ele algodão esterilizados, com sutura contínua e simples. Após a cirurgia, os animais foram mantidos no laboratório em gaiolas coletivas com I i vre acesso à ração balanceada e água. Após 24 horas ela cirurgia, iniciou-se a estimulação com ultra-som nas doses citadas a seguir, como recomendadas por Wells, 6 Dyson 5 e usadas por Duarte. 3 As ondas ultra-sônicas pulsadas possuíam características como: largura de pulso igual a 50,Lts, freqüência ele repetição de 500Hz e amplitude ele 30 v (pico a pico), intensidade média temporal de 80 mw/cm e freqüência de radiofreqüência ele 2 MHz.

3 Vol. 8 No.l, 2004 Ultra-som em Reparo de Falha Óssea Experimental A estimulação foi feita com o animal imobilizado com correias de couro que lhe circundavam o ventre e as patas traseiras. Como acoplante do transdutor utilizou-se gel hidrossolúvel. Após 15 dias de estimulações, o sacrifício era realizado utilizando-se éter. TÉCNICAS DE AVALIAÇÃO Para avaliar os resultados obtidos no presente estudo foram empregadas as seguintes técnicas: 1) Radiológica Com a finalidade de controle cirúrgico, foram feitas radiografias do membro osteotomizado imediatamente após a cirurgia. No dia do sacrifício os animais-controle e estimulados também foram radiografados A avaliação radiológica consistiu na análise do calo ósseo por exames das radiografias dos calos-controle e estimulados e, por comparação, dentro dos lotes estimulados. 2) Histológica A técnica de avaliação histológica seguiu a rotina do Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia e Biologia Celular da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, da USP. Os ossos foram dissecados, livres de partes moles e cartilagens, conservando-se o periósteo intacto. A seguir, as regiões do calo ósseo foram retiradas e sejtadas em metades longitudinais, fixadas e descalcificadas em solução de Bouin, segundo Gonçalves & Oliverio. 7 As peças foram, então, colocadas em solução de ácido tricloroacético a 5%, completando a descalcificação. Depois foram desidratadas em bateria de álcool com concentração crescente e incluídas em parafina. Foram realizados cortes de 7 micra de espessura e corados pela hematoxilina-eosina e pela técnica de azul de alcian mais fucsina. A avaliação morfológica do preenchimento da falha óssea foi realizada pela análise da presença de maior quantidade de tecido cartilaginoso maduro e osso neoformado na área do calo ósseo. Essa área foi fotografada em fotomicroscópio Zeiss (Carl Zeiss Oberkachen, Alemanha) com aumento de 4x, utilizando filme Kodacolor 11 (Kodak 100 ASA) com filtro azul. Também foi realizada avaliação morfométrica da área média relativa dos diferentes tecidos de preenchimento da falha óssea, utilizando o método de Chalkley, 8 que fornece uma porcentagem dessa área. RESULTADOS Estudo Radiológico Pós-operatório Os resultados radiológicos estão representados na Figura 1. Na Figura 1B, 1C, 1D e lf está caracterizada a evolução do calo ósseo a partir do osso não estimulado pelo ultra-som, após 15 dias de observação. A Figura 1B representa o aspecto mais comum observado nos animais-controle. que, após 15 dias de observação, apresentavam formação de calo ósseo pouco desenvolvido. A falha óssea ainda é evidente, embora já se observe um preenchimento de média intensidade. Nos animais estimulados durante 5, 10 e 20 minutos, respectivamente (Figura 1C, 1D, 1E), não se observa nítida diferença, embora todos difiram claramente do controle após 15 dias de estimulação. O calo ósseo é evidente, embora variável de animal para animal. A falha óssea aparece como uma sombra pouco nítida. O resultado mais evidente é observado nos animais estimulados por 40 minutos, nos quais, após 15 dias de estimulação, o calo ósseo é bem desenvolvido e a falha óssea, totalmente preenchida por tecido de média intensidade radio-opaco (Figura 1F). Estudo Histológico Observa-se no cmte hi.stológico da consolidação normal em animais-controle que a falha óssea é preenchida por tecido conjuntivo em grande parte fibroso, apresentando ainda cartilagem jovem e, em proporção menor, cmtilagem madura. Quase não se observa tecido ósseo neoformado (Figura 2). O resultado da estimulação da consolidação da fratura pelo ultra-som é apresentado na Figura 3. A Figura 3A representa um animal estimulado durante 5 minutos, diariamente, por 15 dias. A quantidade de tecido cartilaginoso calcificado é praticamente a mesma que no animal-controle (Figura 2). O tecido ósseo neoformado na falha óssea também não é expressivo. Esse mesmo aspecto pode ser observado nos animais estimulados por 10 e 20 minutos, na Figura 3B e 3C, respectivamente. Os animais estimulados por 40 minutos diários apresentam nítida evolução do calo ósseo, com maior presença de tecido ósseo neoformado, como pode ser observado na Figura 3D. Estudo Morfométrico A área do calo ósseo foi avaliada pela técnica morfométrica de Chalkley, 8 em que se avaliou a área média relativa dos vários tecidos que preenchem a falha óssea. A estimulação por 5 minuto:; não difere dos controles, isto é, a proporção de tecido de preenchimento da falha óssea é muito semelhante. A partir de 10 minutos de estimulação, o ultra-som produziu efeito positivo, havendo sempre maior quantidade de tecido cartilaginoso maduro e osso neoformado. A estimulação por 40 minutos diários produziu nítida evolução do calo ósseo, confirmando, assim, os achados radiológicos.

4 4 Albertin, L. M. Rev. bras. fisiore!: Figura 1. Radiografias da osteotomia incompleta do osso rádio (IA), da consolidação normal do animal-controle (JB), da consolidação nos animais estimulados 5, I O, 20 e 40 minutos, respectivamente (I C. 1 D, I E, I F). Figura 2. Fotomicrografia 4x da falha óssea do animal-controle. Apresenta, na falha óssea, após I 5 dias de osteotomia, tecido cartilaginoso jovem, tecido cartilaginoso maduro e tecido neoformado.

5 Vol. 8 No. I Ultra-som em Reparo de Falha Óssea Experimental 5 Figura 3. Fotomicrografia 4x das falhas ósseas estimuladas 5 minutos (3A), 10 minutos (3B), 20 minutos (3C) e 40 minutos (30). Apresentam, na falha óssea, após 15 dias da osteotomia, tecido cartilaginoso jovem (3A, 3B e 3C), tecido cartilaginoso maduro (3A, 3B, 3C, 30) e tecido ósseo neoformado (3A, 3B, 3C, 30). DISCUSSÃO A validade do método ultra-sônico foi estabelecida, quando Duarte o utilizou, em 1977, obtendo resultados positivos quanto à aceleração dos processos de osteogênese em aplicações transcutâneas. 3 Teve-se, a partir de então, a oportunidade de comprovar a inocuidade do método, evidenciada por Herrick, que utilizou intensidades variáveis entre 0,6 e 2 w/cm 2, com freqüências de 800kHz, em fêmures de cães sem fratura, expostos 2 vezes por dia, por I O minutos, durante uma média de 3 anos. Não se observou nenhum efeito na estrutura celular ou sistema vascular adjacente. 9 Tal resultado se fundamenta no fato de o osso apresentar, não havendo lesão, maior resistência aos estímulos, por não necessitar deles, como era esperado pela Lei de Wolff. 3 Outra grande vantagem do método ultra-sônico é a de não ser invasivo, quando comparado a outros métodos de aceleração do processo de consolidação óssea. Mesmo quando Basset propôs um método não-invasivo, constituído da aplicação de duas bobinas, cujo campo magnético induz uma corrente elétrica no sítio de fratura, as desvantagens aparecem quando há necessidade da colocação específica das bobinas, a fim de garantir alinhamento preciso entre elas, e, assim, assegurar a eficiência do método, além de requerer um tempo de 1 O a 16 h/dia durante 6 a 7 meses para induzir um calo ósseo em pseudoartroses. 10 De acordo com o método ultra-sônico usado neste trabalho, as cargas elétricas necessárias ao reparo ósseo são produzidas no osso por meio do efeito piezoelétrico, pois o ultra-som pulsado atinge a superfície do osso por uma sucessão de impulsos que deverão resultar em um sinal elétrico como resposta do osso, a cada pulso. Esse sinal elétrico deverá regular o processo de crescimento do osso, que estimulará o metabolismo bioelétrico ósseo. Fato importante, pois o processo ultra-sônico se assemelha ao processo natural de consolidação, em que sendo o osso um material piezoelétrico e estando sujeito a cargas mecânicas produzidas pelo peso do indivíduo, e mesmo à balística cardíaca, quando estiver em repouso, essas cargas produzirão uma onda de choque que atinge o osso, o qual responde eletricamente, ocasionando a divisão celular, mantendo o equilíbrio entre remodelamento e absorção. 8

6 6 Albertin. L. M. Hev. bras. {i.1ío!a Quanto à otimização dos resultados experimentais da ação do ultra-som na aceleração do reparo ósseo, obtevese melhor diferenciação do calo estimulado em comparação com o calo-controle utilizando-se estimulações com duração de 40 minutos diários por 15 dias. Essa melhor diferenciação também oconeu em relação aos outros tempos de estimulação utilizados, isto é, 10 e 20 minutos, em que não se tem uma nítida diferenciação na consolidação entre os diversos tempos utilizados, embora difiram positivamente dos calos-controle. O tempo de 5 minutos foi insatisfatório. Assim, o método ultra-sônico proposto não chegou a ser otimizado em relação ao tempo de exposição, embora com um tempo de 40 minutos tenha-se obtido melhores resultados dentre os parâmetros utilizados. Pois esse foi o tempo máximo utilizado, já que o uso de tempos maiores acarretaria não praticidade do método. O que deve ser compreendido do resultado obtido é a relação entre o tempo de exposição e o "ciclo de trabalho", pois este está diretamente ligado à intensidade do ultra-som utilizado. O "ciclo de trabalho" CO!Tesponde ao produto da largura de pulso pela freqüência de repetição dos pulsos. No presente estudo foram fixados parâmetros como a largura de pulso em 50 j.!s e a freqüência de repetição em 500 Hz, correspondente a um "ciclo de trabalho" de 0,025, que, comparado a 0,2 utilizado por Xavier & Duarte, 4 conesponde a uma largura de pulso de 200 j.!s e a uma freqüência de repetição de 1000Hz, em que foram obtidos resultados positivos na consolidação de pseudoartroses com menor tempo de exposição, ou seja, com 20 minutos diários de estimulação. Isso evidencia que, com um "ciclo de trabalho" maior, será necessário menor tempo de estimulação, porém o valor para "ciclo de trabalho" não deverá ultrapassar o valor 1, acima do qual pode haver cavitação. As radiografias evidenciaram o efeito do ultra-som sobre a calcificação do calo ósseo. O estudo morfológico comprovou os efeitos positivos do uso do ultra-som, e a técnica morfométrica permitiu avaliar quantitativamente a presença de tecidos maduros na falha óssea. Apenas os resultados correspondentes ao tempo de 5 minutos, nas condições utilizadas, não diferiram dos controles, o que evidencia ser este tempo insuficiente. CONCLUSÃO Neste estudo experimental pode-se concluir que, embora se tivesse tentado otimizar o tempo de exposição ao ultrasom, tendo sido fixados outros parâmetros, como largura de pulso, freqüência de repetição e amplitude nos tratamentos de falhas ósseas, isso não foi possível, já que o tempo de estimulação, considerado melhor, também foi o maior tempo utilizado, em que pode-se observar melhor diferenciação do calo ósseo, evidenciado pelas análises histológicas e radiológicas. Também com o aumento do "ciclo de trabalho", haverá possibilidade de diminuir consideravelmente o tempo de exposição ao ultra-som, obtendo a mesma resposta de aceleração do processo de consolidação óssea, o que incrementa consideravelmente as vantagens do método de estimulação ultra-sônica. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. BASSET. C. A. L. & BECKER. R Generation of electric potential by bone in response to mechanical strcss. Science. v. 137, pp FUKADA, E. & YASUDA , On the piezoclectric cffect ofbone. Journal ofthe Physica/ Society of.lapwz. v. 12. n DUARTE, L. R., 1977, Estimulaçâo ultra-sônica do calo ósseo. Tese de Livre-Docência. Escola de Engenharia de São Carlos. USP, São Carlos. 4. XAVIER. C. A. M. & DUARTE. L. R Treatamcnt oi non-unions by ultrasonic stimulation: first clinicai applications. Revista Brasileira de Ortopedia. v. 18, pp DYSON, M. & POND, J. B., 1970, Stimulation of tissue regeneration by pulsed plane-wave ultrasound. Transactions on Sonics and Ultrasonics, SU-17, v WELLS, P. N. T., Physical principies o( ultrasonic diagnosis. Academic Prcss, London. 7. GONÇALVES, R. P. & OLIVÉRlO. L. G Electrical decalcification of bone. Mickroslwpie. v. 20. pp. I 54- i CHALKLEY, H. W., 1943, Method for quantitative morphologic analysis of tissues. Joumal o f the National Cwzcer lnstitute. v. 4, pp HERRICK, J. F., 1960, Long term effect of ultrasonic energy on dog's femora. Proceedings of the Narional Electronics Conference, New York, v. 16, pp lo. BASSET, C. A. L Repair of non-unions by pulsing electromagnetic fields. Communication presented at Seminar on Perplexing Problems and Scienti fie Progress in Fracturc Management, University of Leuven-Belgium.