Monitoramento do Quimerismo Linfo-hematopoético após Transplante de Células-tronco Hematopoéticas

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1 Monitoramento do Quimerismo Linfo-hematopoético após Transplante de Células-tronco Hematopoéticas 5 Rocio Hassan Martin H. Bonamino Ilana Zalcberg Renault INTRODUÇÃO O conceito de que a capacidade curativa do transplante de células-tronco hematopoéticas (TCTH) é baseada na eliminação de uma medula óssea doente e a sua posterior substituição física por outra sadia foi largamente superado pelo reconhecimento do papel terapêutico dos efeitos imunológicos mediados pelo transplante. A pega do enxerto e sua funcionalidade posterior demandam o estabelecimento de uma tolerância bilateral do hospedeiro-contra-enxerto (HCE) e do enxerto-contra-hospedeiro (ECH). Quando este balanço imunológico falha, acontece a rejeição do enxerto ou a imunorreatividade deste contra os tecidos do hospedeiro, conhecido como doença do ECH (DECH). Por outro lado, no tratamento de neoplasias hematológicas, o principal efeito terapêutico do transplante é a indução de alorreatividade para superar o estado de ignorância patológica do sistema imune do receptor em relação às células tumorais. Isto requer um enxerto imunologicamente competente. Entretanto, a alorreatividade também se associa a uma alta incidência de DECH, que é a causa mais importante de morbidade do transplante. Nesta aparente contradição a necessidade da estabilidade do enxerto e dos efeitos terapêuticos positivos da alorreatividade é que se baseiam as estratégias combinadas de manipulação imunológica do enxerto no transplante e, como consequência, do monitoramento da dinâmica das populações hematopoéticas do doador e do receptor no pós-transplante. Na medida em que as terapêuticas se tornam mais específicas, métodos acurados para monitorar prospectivamente os efeitos ECH e HCE se fazem necessários para sustentar a tomada de decisões clínicas. No TCTH para tratamento de doenças malignas e autoimunes, o alvo principal de estudo é a dinâmica das populações de relevância imunológica no pós-transplante. A abordagem mais amplamente utilizada é o estudo do quimerismo em populações hematopoéticas, a caracterização de uma cinética diferencial associada à DECH ou ao efeito ECL e a determinação dos níveis de quimerismo necessários para quebrar a barreira da tolerância na aplicação das imunoterapias.

2 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH MONITORAMENTO DO QUIMERISMO LINFO-HEMATOPOÉTICO APÓS TCTH ALOGÊNICO Métodos de Avaliação do Quimerismo Células do doador e do receptor podem ser distinguidas por marcadores genéticos determinados antes do transplante. Essa distinção é baseada na presença de diferenças genéticas herdadas existentes na população, chamadas polimorfismos, que podem ser seguidos após o transplante para determinar a pega e o estado do quimerismo no compartimento hematopoético. 1 O quimerismo pode ser total (QT), somente com a presença de células do doador ou misto (QM), com coexistência de células do doador e do receptor. O termo QT refere-se à detecção exclusiva de células do doador, sendo, portanto, importante considerar a sensibilidade da técnica utilizada, que, em última análise, definirá o limite de detecção da subpopulação minoritária. Para a maioria dos estudos, o QT é definido na presença de células do doador em proporção maior que 95%, já que grande parte das técnicas tem sensibilidade entre 1 e 5%. 2 O estudo da cinética do QM após o alo-tcth visa o estabelecimento de parâmetros precoces para a antecipação da rejeição do enxerto e/ou da recaída da doença. Neste contexto, pode-se ainda determinar a rejeição do enxerto quando menos de 5% das células T têm o padrão do doador. 2 A Tabela 5.1 representa as principais definições dos estados de quimerismo encontrados após o transplante e destaca algumas considerações importantes sobre o significado e TABELA 5.1 Definições para a detecção e análise do quimerismo Tipo de quimerismo Definição Comentários Quimerismo total (QT) 100% células do doador Quimerismo misto (QM) Quimerismo crescente /decrescente Quimerismo split Rejeição do enxerto Microquimerismo 5 a 95% de células do doador Aumento/diminuição da porcentagem de células do doador Uma linhagem é de origem do doador e a outra do receptor < 5% de células T do doador < 1% de células do receptor QT indica substituição da hematopoese do receptor pela do doador (> 95% de células do doador consolidação do enxerto) Dependendo da doença e do compartimento analisado, a detecção de células do doador em qualquer porcentagem pode ser considerada QM. Requer avaliação frequente para detectar mudanças dinâmicas. Valor diferente em doenças neoplásicas x nãoneoplásicas e condicionamentos ablativos x não-ablativos. Requer avaliação frequente (p. ex.: semanal, dentro dos primeiros 200 dias pós-transplante), 5% é considerado limiar para definir dinâmica em amostras consecutivas. Depende de análise de subpopulações celulares. Pode definir eventos de rejeição precoce x DECH Eventos precoces podem ser detectados por monitoramento da subpopulação T/NK Valor no alo-tcth não definido, não recomendável seu uso no acompanhamento da reconstituição. Pode servir como marcador auxiliar de DRM se detectado especificamente na linhagem comprometida pela doença. Nota: Valores de 3 a 5% são aceitos como o cutoff da maioria dos métodos atuais para aferir quimerismo. Fonte: Adaptado de Baron & Sadmaier, e Antin et al.,

3 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas aplicação de cada um dos resultados que podem ser encontrados. O valor destes resultados será discutido neste capítulo. Historicamente, a avaliação do estado de quimerismo pós-transplante foi baseada em polimorfismos de proteínas, antígenos eritrocitários ou na citogenética convencional. 3 A partir da década de 1980, testes mais sensíveis e específicos foram disponibilizados pela aplicação de métodos de citogenética e biologia molecular. Uma sinopse dos principais métodos, suas limitações e potencialidades é apresentada na Tabela 5.2. A escolha dos métodos para avaliação do quimerismo não depende somente de questões técnicolaboratoriais; outros parâmetros, como o tipo de transplante e a etapa a ser avaliada, também são importantes. Em casos de sexos diferentes do doador e receptor, os métodos aplicados para discriminar as células de ambos podem basear-se na análise de marcadores associados aos cromossomos sexuais. Entretanto, em transplantes do mesmo sexo, a utilização de marcadores genéticos autossômicos é a única possibilidade. Nas primeiras semanas do pós-tcth, em TABELA 5.2 Comparação dos métodos utilizados para avaliação de quimerismo Métodos Sensibilidade Quantificação Aplicações Dificuldades Citogenética convencional FISH Sondas do cr. Y Sondas X/Y PCR gene Amelogenina (sequências específicas do Y) 10% Baixa exatidão Transplante entre sexos diferentes 1 a 5% 0,5% Alta exatidão 0,001% Média Semiquantitativo RFLP 1 a 10% Média Semiquantitativo PCR VNTR/STR 1 a 5% Média Semiquantitativo STR fluorescente STR fluorescente em populações hematopoéticas PCR Real-Time Indels* PCR Real-Time SNPs Transplante sexos diferentes. Análise rápida em núcleos em interfase Transplante entre sexos diferentes Independe de sexo de doador/ paciente Independe de sexo Simples e rápido 0,5 a 5% Alta exatidão Independe de sexo Quantificação precisa 0,01 a 0,001% Alta exatidão Alta sensibilidade e especificidade 0,001% Alta exatidão Independe de sexo Alta sensibilidade 0,001 a 0,1% Baixa exatidão, sobretudo para macroquimerismo Detecção de baixos níveis de células residuais (DRM) Depende da presença de metáfases. Análise demorada Baixa sensibilidade Alto custo Baixa reprodutibilidade Combinação com VNTR/STR Trabalhoso e demorado Quantificação imprecisa Requer infraestrutura especializada. Stutter Requer separação de populações celulares Requer infraestrutura especializada. Marcadores ainda em investigação Requer infraestrutura especializada. Não acurado para quimerismo em altas proporções (10 a 90% da população estudada) *Recentemente descrita sua aplicação na quantificação do quimerismo misto pós-tcth por PCR Real-time. 3

4 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH que a contagem leucocitária é muito baixa (< 0,1 106/mL, fase citopênica), ou em situações de aplasia por rejeição do enxerto ou pós-dli, os métodos moleculares baseados na detecção de polimorfismos de DNA (RFLPs, VNTR, STR etc.) são superiores aos citogenéticos, pois a análise molecular não necessita de grande quantidade de material biológico. A citogenética convencional, além de informativa em casos de sexos diferentes, é também utilizada quando a doença de base apresenta um marcador cromossômico detectável. A sensibilidade do teste depende da quantidade de metáfases analisadas. Assim, 30 metáfases devem ser analisadas para detectar 10% de quimerismo com um grau de confiança de 95%.3 Este é um método trabalhoso e requer um número alto de células em divisão, o que, muitas vezes, é dificultado pelos tratamentos associados ao transplante. Os métodos de hibridização in situ fluorescente (FISH), nos quais sondas moleculares marcadas com corantes fluorescentes são utilizadas para detectar uma região cromossômica de interesse, têm a grande vantagem de que a detecção pode ser realizada diretamente em células em interfase. A aplicação mais importante do FISH é o acompanhamento de transplantes de sexos diferentes, utilizando sondas para os cromossomos X e Y. 4 Os polimorfismos do DNA são variantes herdadas na sequência de DNA, que apresentam segregação mendeliana. 5 Para sua utilização na avaliação da reconstituição hematopoética, o marcador precisa ser altamente polimórfico, ou seja, ter vários alelos ou variantes moleculares, o que determina uma porcentagem de heterozigosidade alta nessa população. 5 Uma sinopse dos principais marcadores moleculares aplicados ao estudo do quimerismo hematopoético pós-transplante é apresentada na Tabela 5.3. Os polimorfismos de tamanho de fragmento de restrição ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) permitem distinguir padrões diferentes pela criação ou eliminação de sítios específicos de corte por enzimas de restrição. 6 Sua detecção é realizada por Southern Blot, demandando grande quantidade de DNA e detecção radioisotópica. Devido à baixa sensibilidade (5 a 10%) e a complexidade técnica, esse método não é adequado para aplicação rotineira na avaliação de quimerismo pós-tcth. A amplificação pelo método de PCR de sequências repetitivas que se encontram dispersas no genoma, utilizando iniciadores que flanqueiam as repetições, tornou-se, nos últimos anos, o método de escolha para determinação do estado de quimerismo. 7,8 As sequências de DNA repetidas em sequencia ( em tandem ) podem ser do tipo VNTR (número variável de repetições em sequencia ou variable number of tandem repeats), também chamados minissatélites, ou STR (repetições curtas em sequencia ou short tandem repeats), conhecidos também como microssatélites. VNTRs, e STRs apresentam diferentes tamanhos, estruturas e características genéticas, conforme se observa na Tabela 5.3. Esses métodos apresentam sensibilidades para detecção de populações minoritárias de 2 a 5%. A amplificação de VNTRs foi a primeira abordagem baseada em PCR utilizada no estudo do quimerismo. 7 Esses marcadores apresentam algumas desvantagens, tais como: as repetições de tamanho menor podem ser amplificadas preferencialmente e alguns alelos podem não ser amplificados com muita fidelidade devido à complexidade repetitiva do VNTR. A quantificação é trabalhosa, consistindo na preparação de curvas para cada par doador/receptor e pela determinação, após amplificação, de uma curva densitométrica utilizada como padrão para comparação dos resultados obtidos no pós-tcth. Isso possibilita apenas um nível semiquantitativo, estando sujeito a variações interlaboratoriais. A heterozigosidade desses marcadores é variável, com a consequente limitação na informatividade do sistema, o que se torna um problema no acompanhamento dos transplantes aparentados, em que o par doador/receptor é relacionado. A amplificação de STRs é o método standard na genotipagem forense, devido ao alto grau de polimorfismo destes loci. A sua maior informatividade permite superar os problemas dos VNTRs na avaliação do quimerismo no pós-transplante. 8,9 Além disso, devido ao tamanho relativamente pequeno das regiões amplificadas, PCRs utilizando primers marcados com corantes fluorescentes possibilitam uma quantificação acurada utilizando programas específicos dos sequenciadores automáticos. O maior problema do método é a aparição de bandas stutter, que podem interferir com a análise de 4

5 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas TABELA 5.3 Marcadores genéticos polimórficos Marcador N o Alelos/loci Tamanho da repetição RFLP 2 Mudança em uma base VNTR (minisatélites) STR (microsatélites) SNP/ Polimorfismo de simples nucleotídeo Polimorfismos bialélicos de inserção/ deleção (Indel)* 2-50 Sequência consensus 8 a 50 pb > 10 Sequência consensus 2 a 8 pb 2 Mudança em uma base 2 Mudança em uma curta sequência Heterozigoto (%) N o loci no genoma Exemplos 30 a 50 > 10 4 APOE Fator V Leiden 30 a 90 > , 33.1 H-Ras, YNZ22 > 90 > 10 4 [CAn] [AAT n ] [GATA n ] TH01, vwa TPOX 30 a 50 > 10 6 Citocromo P a 50 Alto (ND) S 01 a S 11 *Recentemente descrita sua aplicação na quantificação do quimerismo misto pós-tcth por PCR Real-time. Heterozig = Heterozigosidade; ND = Não determinado. quimerismo. Estas são artefatos da amplificação que surgem por deslizamento da Taq polimerase durante a amplificação e que se manifestam no esferograma como picos de uma unidade de repetição mais curta (ou menos frequentemente mais longa) que o produto principal, correspondendo a 5 a 10% da área deste. 9 Este fenômeno é muito mais marcado na amplificação de STR de repetições dinucleotídicas, fazendo com que os STRs tetra- e pentanucleotídeos representem uma melhor opção para os estudos de quimerismo. Este problema pode ser melhorado pelo uso de Taq polimerases de alta processividade e por modificações no perfil térmico da reação de PCR. Mais recentemente, métodos comerciais originalmente empregados nos estudos forenses vêm sendo adaptados para sua aplicação no acompanhamento do quimerismo. Estes kits contêm primers fluorescentes para 10 a 16 loci STR, permitindo a determinação de informatividade em 1 a 3 reações (PCR multiplex), e fornece resultados quantitativos reprodutíveis, com uma baixa variabilidade interlaboratorial. 8,10 A grande desvantagem deste método ainda é o custo e o fato de utilizar o kit completo em análises pós-transplante, quando a análise apenas dos loci informativos seria suficiente. Além disso, e, principalmente, a informatividade de um marcador necessária para os estudos de quimerismo é diferente da almejada no estudo forense ou de paternidade, sendo alguns marcadores dos kits comerciais pouco informativos para o estudo do quimerismo. 11 A análise do quimerismo global em sangue periférico ou medula óssea muitas vezes não é suficientemente sensível para permitir a detecção precoce de uma possível recaída e, mais ainda, não facilita a distinção entre esta e uma situação de rejeição iminente. Para superar essas limitações, o estudo de subpopulações hematopoéticas ou linfoides (células progenitoras, granulócitos, células T, NK e B) parece ser relevante nas situações do pós-tcth. 12 A separação de populações celulares é usualmente baseada na reatividade celular específica com anticorpos monoclonais (AcMos), seguida por separação por meio de FACS-sorting ou pela sua adsorção a colunas ou microesferas magnéticas associadas a AcMos. O painel 5

6 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH mínimo de ACMos para separar populações relevantes para o acompanhamento pós-transplante é composto de anti-cd34, -CD3, -CD19 e -CD15. Com esses métodos, é possível isolar frações representando 1% da população leucocitária total, aumentando assim a sensibilidade da análise em 2 log 10. Essa abordagem permite determinar a cinética do quimerismo nas diferentes subpopulações, discriminando duas situações: o estado do quimerismo na população T, indicativo de pega ou rejeição, e o estado do quimerismo na linhagem de origem da leucemia, indicativo de remissão ou expansão do clone maligno. 10,12 As células Natural Killer (NK, população CD56+/CD3-) também podem ser importantes em determinados contextos, como será discutido adiante. Estudos recentes, baseados na determinação de quimerismo em subpopulações, propõem o QM em linhagens relacionadas com a doença de base como indicador sensível e precoce de recaída, principalmente em leucemias agudas. 12 Esses estudos detectam a persistência ou ressurgimento de uma população específica com uma sensibilidade de 10-3 a 10-4, similar à obtida por métodos moleculares para detecção da doença residual mínima (DRM), com a vantagem de ser uma metodologia independente da existência de uma alteração genética específica da leucemia ou clono-específica. Com este mesmo objetivo, a aplicação de métodos de maior sensibilidade, como a quantificação do quimerismo por PCR em tempo real para SNPs, pode ser muito importante para a detecção do QM no compartimento hematopoético comprometido pela doença. Recentemente, foi demonstrado que, quando comparado com o método de PCR-STR fluorescente, o PCR quantitativo para SNPs pode prever uma recidiva em média 119 dias antes da manifestação clínica, contra apenas 29 dias para os ensaios com STRs. 13 Embora menos precisa, acurada e reprodutível para a detecção do quimerismo, essa metodologia tem cerca de 2 log 10 mais sensibilidade. 14 No contexto da DRM, especialmente nas leucemias agudas, em que a alteração de 1 log 10 da carga tumoral é relevante, a implementação dessas técnicas pode ser importante. Sua aplicação, no entanto, ainda deve ser validada em novos estudos. Fundamentos para a análise do quimerismo (VNTR e STR) Tipicamente, vários marcadores situados em diferentes cromossomos são utilizados para avaliar o DNA do doador e do receptor antes do TCTH. Cada fragmento amplificado tem um tamanho, representando o número de repetições em cada alelo, que é definido após separação por eletroforese em géis de poliacrilamida de alta resolução e detectados por coloração com prata ou por métodos fluorescentes. Estabelece-se, assim, um padrão pré-transplante do receptor e do doador, que pode ser, em cada caso, homozigoto (dois alelos iguais) ou heterozigoto (dois alelos diferentes) para cada marcador. Essa diferença alélica, representada pela amplificação de segmentos de tamanho diferente, permite a identificação de um o padrão informativo. A informatividade é a propriedade de um marcador de identificar um padrão diferente no doador e no receptor. Dois fatores influem na informatividade de um marcador: O primeiro, o número de alelos do sistema, reflete-se no grau de heterozigosidade encontrado na população. O segundo é a utilização alélica balanceada, isto é, que não haja alelos com frequência muito diferente de outros; característica esta que parece ser mais relevante no desempenho de um par de primers para quantificação do quimerismo hematopoético. Na análise por amplificação de STRs, os alelos informativos do receptor devem ser escolhidos levando em consideração a não-superposição com uma banda stutter do doador, devido à dificuldade de distinguir entre a presença de uma pequena proporção de células do receptor e essas bandas espúrias. Sendo assim, a análise dos padrões do doador (D) e receptor (R) pode identificar as seguintes configurações: doador e receptor com a mesma configuração; doador heterozigoto e receptor homozigoto, sendo que um dos alelos do doador é igual ao do receptor e o outro alelo é específico do doador; doador homozigoto e receptor heterozigoto, sendo que um dos alelos do receptor é igual ao do doador e o outro alelo é específico do receptor; doador e receptor são heterozigotos e dividem um alelo, mas possuem um alelo próprio cada um; 6

7 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas doador e receptor são homozigotos ou heterozigotos e não possuem alelo em comum. dois marcadores foram escolhidos para sua introdução na rotina de monitoramento do quimerismo. Somente os padrões 4 e 5 fornecem informação quantitativa confiável sobre a presença e quantidade de células do doador e receptor no pós-tmo. Os demais padrões podem levar a interpretações errôneas e devem ser evitados sempre que possível. A análise dos STR deve também incluir uma avaliação de se o tamanho do(s) alelo(s) distintivo(s) do receptor coincide com a região de stutter do/s alelos do doador. Assim, dentro dos padrões informativos descritos anteriormente, é importante fazer essa avaliação, sendo que somente é considerada acurada a quantificação caso o alelo distintivo do receptor tenha o tamanho de, pelo menos, n + 2 repetições (8 a 10 pb para STR com repetições tetra e pentanucleotídeo, respectivamente) em relação aos alelos do doador, ou seja, ao menos duas repetições mais curto ou mais longo. Este critério foi denominado como constelação de tipo 5 por Thiede e cols. 11. É aceitável que o alelo do receptor possa ter uma repetição mais longa ( constelação de tipo 4 ), já que o stutter após o alelo é muito menos frequente. A Figura 5.1 mostra as características da análise quantitativa de microssatélites amplificados com oligonucleotídeos fluorescentes. As proporções relativas de células do doador e do receptor são calculadas a partir das áreas sob os picos dos fragmentos respectivos a cada alelo. De maneira importante, os padrões descritos podem ser relacionados com fórmulas específicas para a determinação quantitativa do quimerismo 8,9 e é sugerido que seu valor quantitativo em cada ponto do acompanhamento represente a média dos valores de determinações de pelo menos dois diferentes marcadores STR com configuração de tipo 5 ou 4. 9,11 Um uso adicional das classificações da informatividade é a possibilidade de se avaliar o desempenho de um marcador STR quanto sua aplicação específica na monitoramento do quimerismo. Na Tabela 5.4 é apresentada uma avaliação, de quatro marcadores STR em 100 pares doador/receptor aparentados do CEMO/ INCA, quanto a parâmetros genéticopopulacionais e específicos do quimerismo. Seguindo o conceito de que um bom marcador para análise de quimerismo deve mostrar >20% de configurações de tipo 5, 11 somente Uniformização Nos últimos anos, as técnicas moleculares permitiram um estreito acompanhamento do enxerto nas situações pós-transplante. No entanto, o significado clínico do QM nas diferentes doenças e em relação aos diferentes protocolos de transplante é ainda controverso, fato este que se deve, em parte, à falta de padronização das técnicas e de uma nomenclatura unificada nos estudos existentes. Em 2002, foi criado um consórcio de 12 centros de diagnóstico na Europa (Eurochimerism consortium. eurochimerism.org) visando o desenvolvimento de padrões laboratoriais, a unificação da metodologia utilizada e a definição do calendário de avaliação do quimerismo. 2,9,15,16 O estabelecimento desses padrões visa validar o conceito de intervenção terapêutica baseada no status do quimerismo. O método comercial multiplex STR fluorescente foi escolhido como método padrão; 8,10 entretanto, devido a seu alto custo e à necessidade de instrumental específico, sua aplicação em cada laboratório é objeto de uma avaliação entre custo e benefício particular à realidade local. Na América Latina, propõe-se a utilização de métodos semiquantitativos ou quantitativos de amplificação de VNTRs ou STRs ao alcance de cada laboratório, utilizando o kit comercial como standard na etapa de padronização dos métodos escolhidos. A partir disto, é possível desenvolver abordagens de monitoramento longitudinal por métodos de STR-PCR qualitativo, seguido de quantificação por STR-PCR fluorescente em caso de quimerismo misto. 17 Nomenclatura Recentemente, o consórcio europeu desenvolveu um código para unificação da nomenclatura das configurações alélicas no acompanhamento do quimerismo por STR-PCR. 18 Essa nomenclatura considera tanto o tamanho dos alelos do par receptor/doador como a área de stutter de cada um. O código é fácil de aplicar e usar na análise de rotina e cada configuração alélica pode ser armazenada em uma base de dados. 7

8 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH A. C. R-paciente a b D-doador b Pós-TMO Quantificação do quimerismo no pós-tmo ALGORITMOS B. R-paciente a b 1 D/R não compartilham alelos (área c + área d) % D = 100 x (área a + área b) + (área c + área d) D-doador c d 2 D/R heterozigotos, 1 alelo compartilhado (área c) % D = 100 x (área a + área c) Pós-TMO 3 d ou R homozigoto, 1 alelo de D ou R heterozigoto compartilhado. % D = 100 x (área b) (área a - área b) / 2 + área b Figura 5.1 Análise do quimerismo por PCR para STRs utilizando iniciadores fluorescentes e algoritmos para quantificação do quimerismo misto (QM). Após eletroforese, a análise e quantificação do quimerismo são realizadas com o programa GeneScan 2.1 do sequenciador automático ABI Prism 277. Configurações de STR: A. Paciente/receptor (R) heterozigoto, sendo que um dos alelos é idêntico ao padrão homozigoto do doador (D). Configuração não-informativa, uma vez que, no acompanhamento pós-tcth, o quimerismo misto (QM) não pode ser diferenciado acuradamente do padrão do paciente; eventualmente, poderia ser aplicado o algoritmo 3. B. Configuração informativa, R e D heterozigotos não compartilham alelos. No pós-tcth, é detectado um QM com 5% de células do paciente, utilizando o algoritmo 1. Nos casos mais frequentes, em que R e D são heterozigotos, mas compartilham um alelo, a quantificação é baseada no algoritmo 2. C. Configuração alélica de um paciente mostrando picos stutter (sombreados). Em caso deste artefato comigrar com um dos alelos do doador, o marcador não pode ser utilizado para quantificação do quimerismo. Sua principal aplicação é a análise de informatividade caso a caso, mas não dispensa a análise dos tipos de configurações informativas. A Figura 5.2 mostra exemplos da aplicação do código RSD e sua comparação com os tipos informativos descritos por Thiede e cols. 11 8

9 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas TABELA 5.4 Avaliação do desempenho de quatro marcadores STR para o acompanhamento do quimerismo hematopoético em 100 pares doador/receptor do CEMO-INCA (RJ) Marcador STR D10520 D10691 D10620 D10722 Número de alelos Tamanho (pb) 148 a a a a 184 Heterozigosidade 0,88 0,73 0,62 0,87 Constelação Tipo 23* 11 2,6 58** 5 (%)* *Constelação Tipo 5 corresponde à situação em que o receptor possui ao menos um alelo distintivo de tamanho > n + 2 comparado aos alelos do doador. ** Marcadores que foram considerados aceitáveis (> 20% Tipo 5) para a monitoramento do quimerismo. Os principais pontos na pauta da uniformização da análise do quimerismo são: escolha dos métodos e determinação da sua sensibilidade e reprodutibilidade, incluindo a extração de DNA em situações de poucas células (período da pega e análise de subpopulações); coleta de amostras e seleção das populações em que o quimerismo pode fornecer respostas em relação às situações pós-transplante; tempo da avaliação do quimerismo após o TCTH. VALOR CLÍNICO DA ANÁLISE DO QUIMERISMO O grande desenvolvimento farmacológico observado nas últimas décadas, somado ao melhor entendimento dos processos imunológicos subjacentes aos fenômenos de pega e consolidação de um aloenxerto hematopoético tiveram como resultado a expansão das fronteiras da aplicação clínica de novas modalidades de transplante de progenitores hematopoéticos, como os transplantes de sangue de cordão, haploidênticos e não relacionados, associados com diferentes regimes de condicionamento, desde os mieloablativos do TMO convencional aos regimes de intensidade reduzida e não-mieloablativos. Com a disponibilidade dessas novas modalidades, surge a necessidade de abordagens laboratoriais sensíveis e com valor clínico, para subsidiar a tomada de decisões terapêuticas. Assim, um interesse crescente é observado na literatura médica em relação ao estudo molecular da dinâmica do quimerismo hematopoético no momento da pega do enxerto, na recaída da doença e como parâmetro para intervenções terapêuticas. Entretanto, o significado clínico do QM é ainda controverso e sua análise precisa ser correlacionada aos regimes de condicionamento, tipos de transplante e as etapas-pós TCTH a serem avaliadas. 19 É necessário estabelecerse o valor e a metodologia de análise nos seguintes períodos: entre o transplante e a pega hematológica, da pega até a consolidação do enxerto e o acompanhamento tardio, pois esses períodos representam situações clínico-biológicas diferenciadas, cuja análise em relação aos padrões do quimerismo possui um significado clínico diferente. Quimerismo no pós-transplante precoce A avaliação do quimerismo tem grande utilidade na janela imunológica de definição da pega, falha ou rejeição precoce do enxerto. Sabe-se que, durante as primeiras semanas após o TCTH mieloablativo, células do receptor podem ainda ser encontradas no compartimento hematopoético, a maioria, células T sobreviventes ao condicionamento. Por outro lado, as células infundidas contêm uma mistura de células maduras, progenitores comprometidos e progenitores pluripotentes cujos papeis fisiológicos e temporais são diferentes. Em um estudo importante, Dubovsky e cols. descreveram, em 1999, a cinética da pega nas primeiras 9

10 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH A. Código RSD Código R s D d s Especificação Alelo do receptor fora da área de stutter dos alelos do doador (> 1 unidade de repetição) Alelo do receptor dentro da área de stutter dos alelos do doador (> 1 unidade de repetição) Alelo do doador fora da área de stutter dos alelos do doador (> 1 unidade de repetição) Alelo do doador dentro da área de stutter dos alelos do doador (> 1 unidade de repetição) Alelo compartilhado entre doador e receptor A sequência das letras é ordenada por tamanho alélico, começando com o alelo menor Os números entre as letras indicam o número de nucleotídeo separando alelos vizinhos B. S 16 D 16 R C. S 4 r 8 D R R D D D. R 12 D 4 D 16 R Figura 5.2 Aplicação do código RSD para unificação da nomenclatura de configurações alélicas no acompanhamento do quimerismo por análise de STRs. A. Descrição do código (Fonte: adaptado de Watzinger et al., ). B. e C. Configurações alélicas do receptor (R) e doador (D) na investigação de informatividade pré-transplante com STRs tetranucleotídeos descritos na Tabela 5.4. Nesses casos, R/D compartilham um alelo, mas em B, o alelo distintivo do receptor está situado fora da área do stutter do doador, representando uma configuração informativa para a quantificação (Tipo 5). Já em C, o alelo distintivo do receptor encontrase dentro da área de stutter do doador, representando uma configuração limitada para quantificação acurada (Tipo 3). A nomenclatura RSD é registrada em cada figura, de acordo ao descrito em A. D. Configuração alélica em um caso de quimerismo misto pós-transplante. Setas indicam os alelos do doador. Neste caso, R/D não compartilham alelos e os alelos do receptor encontram-se a uma distância > n+2 dos alelos do doador, correspondendo a uma configuração informativa de Tipo 5. Note-se que os gráficos não estão na mesma escala. 10

11 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas semanas pós-tcth em pacientes pediátricos submetidos a TMO convencional. 20 O quimerismo foi avaliado no sangue periférico por PCR-STR, com uma frequência de 1 a 3 dias. Na maioria dos pacientes, um padrão de QM foi gradualmente substituído pelo padrão do doador (QT), que se tornou predominante aproximadamente no dia +14 (mediana +8). Esse estudo introduz o termo pega molecular, entendido como a primeira documentação de predominância do padrão alélico do doador em preparações leucocitárias totais de sangue periférico.20 Importante para esta definição é a documentação de uma dinâmica de incremento do padrão de doador, indicando a predominância da função hematopoética por progenitores, e não a persistência de células maduras do doador. Nesse estudo, a pega molecular precedeu à hematológica por uma mediana de 7 dias (1 a 15 dias) e um estado de QT foi documentado em 80% dos casos antes da pega hematológica. Os pacientes que não apresentaram pega molecular no dia +14 também falharam em apresentar pega hematológica. Um ponto importante para futuros estudos será determinar o valor prognóstico do quimerismo no dia +14, em relação à falha do enxerto nas diferentes doenças, podendo se tornar um parâmetro útil para o desenho de estratégias de intervenção precoce visando o resgate do enxerto e evitar a aplasia. A rejeição do enxerto está relacionada com um incremento de populações de células T do receptor com especificidade imunológica contra as células do doador. Sua dinâmica pode ser muito rápida, demandando métodos sensíveis para a detecção precoce das mudanças indicativas de rejeição, isto é, um aumento progressivo ou uma mudança completa para o padrão do receptor no compartimento T (CD3+). Aqui, surge a importância de se monitorar a dinâmica do quimerismo para diferenciar a persistência de células T de longa vida do receptor, do aparecimento de clones responsáveis pela rejeição do enxerto. 16,21 Da mesma maneira, quando o QM não pode ser atribuído a uma população particular, os eventos imunológicos dando lugar a DECH ou rejeição podem ser confundidos. Embora o fenômeno de rejeição possa ser detectado como um incremento do padrão autólogo no compartimento de células T, há controvérsias sobre a associação de QM na população CD3+ com um risco maior de recaída. Entretanto, em um estudo recente por STR quantitativo, foi observado, em alguns casos, que o aumento de QM na população T foi o único sinal que antecipou precocemente a recaída, indicando a necessidade de se correlacionar os fenômenos imunológicos da reação HCE (rejeição) com a falta de controle imunológico da população leucêmica. 21 Recentemente, foi sugerida a importância da subpopulação de células NK na reconstituição de pacientes submetidos a protocolos não-mieloablativos. Nesta série de pacientes, a presença de menos de 25% de células NK ou T do doador no dia +14 após o TCTH foi associada à perda do enxerto. Para a DECH aguda, a presença de mais que 50% de células T no dia +28 pós- TCTH foi associada à incidência de DECHa de grau II a IV. Por outro lado, a presença de mais de 50% de células T do doador no dia +28 e maiores percentuais de células NK do doador foram associadas a um menor risco de recidiva da doença hematológica maligna de base. 2,22 Esses dados devem ainda ser corroborados por novos estudos, considerando diferentes regimes de condicionamento e profilaxias para DECH. Embora o estado de QT não seja mandatório para a obtenção do efeito alogênico de enxerto-contra-leucemia (ECL), podendo este ocorrer inclusive em pacientes com quimerismo na população T, resultados recentes sugerem que maiores percentuais de células T/NK do doador estão relacionados a menores taxas de recidivas, indicando que a busca por um estado de QT após o TCTH não mieloablativo pode ser um objetivo válido e relevante. Quimerismo durante a consolidação do enxerto: importância da dinâmica enxerto/leucemia Em termos gerais, o QM persistente não é um achado comum após o TCTH convencional não manipulado para doença neoplásica, em períodos mais tardios do acompanhamento. Em contraste, uma taxa maior de QM é descrita nos protocolos com depleção de linfócitos T e nos não-mieloablativos. Embora a presença de QM não seja um indicador absoluto de recaída, vários relatos associam uma maior recorrência da doença nos 11

12 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH pacientes com QM ou quimerismo instável com incremento do padrão do receptor, em comparação aos pacientes com QT persistente ou com uma cinética com tendência à consolidação do enxerto (QM QT). Um estudo retrospectivo incluindo 80 pacientes com várias neoplasias hematológicas submetidos a alo-tcth não manipulado analisou o QM global nos dias +30, +90 e +12 meses, mostrando que pacientes com QM no dia +90 possuíam um risco de recaída significativamente maior que aqueles com QT, assim como uma sobrevida global mais curta. 23 Nesse sentido, um estudo de um grupo de 49 pacientes com LMC submetidos à TCTH mieloablativo HLA-idêntico no CEMO/INCA mostrou que a presença do QM no dia +90 esteve associada com uma probabilidade maior de recaída. A sobrevida livre de doença (SLD) foi de 14 meses (9 a 23, IC 95%) para pacientes com QM, comparado com 25 meses (22 a 35 meses, IC 95%) para pacientes com QT no dia +90 (p = 0,001), respectivamente. Pacientes com QM no dia +90 mostraram também uma tendência a recair precocemente (8 vs. 15 meses, p = 0,07). 24 A importância deste tipo de estudos está na possibilidade de identificar um marcador nos primeiros 100 dias do transplante, que possa indicar a necessidade de monitoramento especial, visando intervenções precoces. Entretanto, a padronização de técnicas quantitativas para a monitoramento do quimerismo possibilita a avaliação longitudinal, ou seja, sequencial de amostras de pacientes transplantados, visando acompanhar e comparar as flutuações nos níveis do QM ao longo do tempo e inferir considerações clínicobiológicas sobre o enxerto. 25 Essa abordagem é similar à utilizada para monitoramento da doença residual mínima (DRM). Embora a visão moderna da abordagem laboratorial da DRM sustenta o conceito de que esta deve, quando possível, ser avaliada com marcadores clono- ou tumorespecíficos, o estudo do quimerismo após TCTH pode ser de interesse particular em neoplasias hematológicas que carecem de marcadores específicos de doença. Estudos prospectivos sobre o significado do quimerismo em subpopulações leucocitárias antecedendo a recaída mostraram que, após o TCTH mieloablativo, a detecção de QM por STR quantitativo na população celular de origem da leucemia precedeu a recaída por 3 a 6 meses. 21 Além disso, a detecção precoce de QM na população stem cell CD34+ também se mostrou relevante. 12 A cinética da recaída das neoplasias hematológicas pode apresentar alta variabilidade, sendo que, nas leucemias agudas e na crise blástica da LMC, esta pode ocorrer em um curto período de tempo. Nessas situações, seria necessária a utilização de métodos mais sensíveis combinados a um intervalo menor de acompanhamento. Na LMC, a presença de QM crescente parece estar bem correlacionada com recaída da doença, 24 tendo sido descrito que a detecção do QM na subpopulação mieloide pode antecipá-la. 24 Enquanto isso, nas leucemias agudas (LA), existe uma controvérsia sobre o valor clínico do QM. Nessas doenças, o diagnóstico precoce da recaída é um aspecto prognóstico importante, uma vez que a estreita correlação entre carga tumoral e possibilidade de cura é bem estabelecida. As escolhas terapêuticas para um paciente com leucemia aguda (LA) em recaída são limitadas e as respostas gerais às imunoterapias, como suspensão da imunosupressão ou infusão de linfócitos do doador (DLI), são pobres. Alguns estudos não encontram correlação entre QM e recaída nas LA, 27,28 enquanto outros encontram uma correlação positiva quando as amostras são tomadas em intervalos menores ou correspondem a subpopulações específicas Não obstante a heterogeneidade dessas doenças, um aparente consenso na literatura médica é que a análise quantitativa a intervalos curtos do quimerismo linhagem-específico é muito mais sensível que a do quimerismo global e pode predizer precocemente a ocorrência de recaída nas LLAs, LMAs e SMDs. 12,16,30,31 Nesse contexto, abordagens por PCR quantitativo em tempo real em linhagens específicas pode ser relevante, especialmente nas LMAs e SMDs, que não possuem marcadores moleculares leucemiaespecíficos para monitoramento molecular. 13 Análise do quimerismo nas subpopulações hematopoéticas A análise do quimerismo nas diferentes subpopulações leucocitárias permite aumentar a sensibilidade e a especificidade da monitoramento póstransplante. Contudo, a complexidade técnica faz com que sua implementação como prática rotineira 12

13 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas seja difícil, devendo ser orientada pela doença de base e o tempo do transplante a ser monitorado (Figura 5.3 e Tabela 5.5). Em pacientes com LA de alto risco ou em casos apresentando uma cinética de QM crescente ou QM com uma taxa de decrescimento lenta, esse método pode fornecer informação adicional, principalmente por meio do estudo dos linfócitos T, dos leucócitos de origem da doença e da fração de stem cells, podendo-se antecipar em semanas ou meses o observado nas células totais do sangue periférico ou da medula óssea. 9,12,16,21 Estudos recentes nas diferentes subpopulações, com uma sensibilidade entre 0,1% e 0,01% sugerem que a detecção de uma cinética crescente de QM em pequenas populações tem valor prognóstico em relação à recaída. Isto indica que, de forma similar ao que ocorre com os métodos utilizados na avaliação de DRM, é preciso se determinar um limiar de correlação entre os achados laboratoriais e a evolução clínica dos pacientes. 25 Variações nas cinéticas de reconstituição e no significado clínico do quimerismo nas diferentes subpopulações são evidenciadas quando se comparam Compartimento T/NK Rejeição/ DECH Doenças nãomalignas Quimerismo misto Compartimento origem do clone leucêmico Recaída Doenças malignas Intervenção terapêutica precoce Figura 5.3 Papel do monitoramento do quimerismo misto em subpopulações hematopoéticas nas doenças malignas vs. não-malignas (p. ex.: anemia aplástica). diferentes protocolos clínicos e centros diferentes. Isso gera grande dificuldade para a determinação de diretrizes sólidas para a análise do quimerismo após o TCTH, sendo um aspecto amplamente discutido na literatura médica. 2,9 Monitoramento da resposta às imunoterapias A análise do quimerismo é também útil para monitorar os resultados da modulação da imunosupressão e da administração de DLIs, principalmente na indução de um potente efeito ECL para tratar a recaída da LMC pós-tmo. Essa doença é extremamente sensível à imunomodulação 32 e sua eficácia pode ser monitorada pela conversão de um padrão autólogo ou de QM a um padrão de QT. 33 As principais complicações são a ocorrência de DECH e a mielosupressão severa. O monitoramento molecular pelo PCR quantitativo para BCR-ABL tem caracterizado dois grupos de pacientes em relação ao tempo médio para atingir remissão molecular pós-dli: os respondedores rápidos (4 a 10 meses) e os lentos (11 a 16 meses). Esses padrões de resposta estão relacionados com alguns fatores específicos, como a administração da imunoterapia em recaída citogenética ou molecular vs. hematológica, presença ou indução de DECH e tipo de doador e de transplante. 35 Na experiência da equipe do CEMO/ INCA na avaliação da cinética do quimerismo global quantitativo após intervenção imunoterapêutica, uma curva decrescente de QM pode ser observada nos primeiros quatro meses nos casos com resposta e o monitoramento mensal parece ser o mais adequado. Apesar da extensa aplicação das imunoterapias, o mecanismo e a cinética da resposta ECL após DLI são pouco caracterizados. O estudo do quimerismo em diferentes populações hematopoéticas parece ter utilidade para o desenvolvimento de marcadores precoces em relação à resposta e ao desenvolvimento de aplasia pós-dli. O estabelecimento rápido de QT na fração de linfócitos T do sangue periférico parece ser um bom indicador de resposta posterior à DLI, 21 sugerindo a reação de ECL estar precedida pelo estabelecimento de um limiar de linfócitos T capaz de superar o estado de tolerância, ou, alternativamente, pela expansão de linfócitos T específicos levando a 13

14 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH TABELA 5.5 Análise do quimerismo misto (QM) em subpopulações hematopoéticas Detecção do QM em sangue total vs. subpopulações linfocitárias Exemplo do impacto na sensibilidade e interpretação Situação hipotética Paciente com LMC no dia+100 pós-tcth mieloablativo, com 20% de células T do receptor. Resto das linhagens 100% doador (QM split). Situação hematológica do paciente: Células T: ~10% sangue periférico (SP) / ~3% medula óssea (MO) Sensibilidade método STR: 1% - 5% Resultados do quimerismo nas diferentes amostras e compartimentos Interpretação Valor preditivo do Quimerismo Misto Evento Células NK (CD56) 90% Células T CD3 70% Rejeição do enxerto (D+14 - D+100) Recaída MO (3 de 20%): QM 0.6% SP (10-15 de 20%): QM 2-3% dentro do limite de sensibilidade do método (não é possível definir compartimento envolvido) Células T: QM 20% A análise de subpopulações permite a detecção precoce de um evento de rejeição / recaída decisão de aumento da frequência de avaliação, investigação do compartimento T e do compartimento de origem da leucemia (CD33+, CD34+) e incorporação da avaliação frequente de doença residual mínima no fluxograma de manejo laboratorial. Monitoramento longitudinal em subpopulações: QM estável (doença maligna) ou crescente (aumento >5% entre duas amostras sequenciais) Reaparição de QM após período de quimerismo total Diagnóstico <5% células T do doador QM crescente /padrão do receptor na subpopulação de origem do clone leucêmico QM crescente precoce /padrão do receptor no compartimento T/NK Diminuição de GvL, risco (?). Frequente em crianças com LAg antecipando recaída; adultos (?) QM crescente no subset CD34+, prognóstico recaída LLA e LMA um desvio do balanço de linfócitos T. Isso indica que o monitoramento do quimerismo T como um marcador precoce de resposta à DLI pode ser útil na avaliação de novos protocolos, particularmente em estudos de escalonamento de dose, onde uma resposta precoce pode eliminar a necessidade de uma nova infusão de células T. Em estudos recentes, um risco maior de desenvolver aplasia severa após DLI foi relacionado com menos de 5% de células CD34+ do doador antes da infusão, como um indicador da reserva hematopoética mínima, necessária para repopular a medula após o efeito ECL. 21,34 Recentemente, foi proposto que baixos percentuais de células T do doador estão relacionados a menores chances de progressão QM QT, tendo sido proposta a utilização de pentostatina antes da DLI para diminuir o efeito do hospedeiro contra o enxerto. Houve um aumento do percentual de quimerismo do doador em seis dos dez pacientes tratados, o que indica que pacientes com baixos percentuais de células T ou NK do doador podem se beneficiar dessa abordagem. 2 14

15 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas Monitoramento do quimerismo no pós-transplante tardio O significado da presença de QM persistente no acompanhamento tardio após o TCTH é outro ponto controverso. Alguns estudos mostram que a presença de células do receptor pode representar hematopoiese normal sem evidência de recorrência da doença, sendo o fator mais significativo a manipulação do enxerto pré-tcth. Mediante a utilização de métodos altamente sensíveis, foi demonstrada a persistência de baixos níveis de células do paciente coincidente com sobrevida livre de doença (SLD). 35 Schaap e cols. (2002), em estudo realizado com 231 pacientes com SLD maior que 2 anos após TMO HLA-idêntico aparentado, depletado de células T, encontraram uma proporção diminuta de pacientes (19/231) com QM estável, não correlacionado a recaídas. 36 A maioria dos pacientes apresentava neoplasias linfoides, menor incidência de DECH e tinha sido condicionada com menor intensidade (sem antraciclinas). Outro evento a ser considerado no acompanhamento de longo prazo após o TCTH é a rejeição tardia seguida por reconstituição autóloga ou recaída. Esse fato foi caracterizado primeiramente para as AAS e LMC, 37 para as quais se mostrou que a rejeição tardia pode ser gradual, acontecer em pacientes com enxerto consolidado (QT) e se desenvolver sem uma fase de pancitopenia prévia. A possibilidade de sua detecção precoce reside, portanto, somente na avaliação rotineira do quimerismo. O sinal de alerta para rejeição do enxerto é representado por uma mudança para um padrão de QM. Nas neoplasias hematológicas, principalmente na LMC, esta mudança de padrão deve ser diferenciada da recaída, através da definição da população leucocitária envolvida e de marcadores moleculares da doença. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Blume KG, Beutler E, Bross KJ, Schmidt GM, Spruce WE, Teplitz RL. Genetic markers in human bone marrow transplantation. Am J Hum Genet 1980;32: Baron F, Sandmaier BM. Chimerism and outcomes after allogeneic hematopoietic cell transplantation following nonmyeloablative conditioning. Leukemia 2006;20: McCann SR, Lawler M. Mixed chimaerism: detection and significance following BMT. Bone Marrow Transplant 1993;11: Najfeld V, Burnett W, Vlachos A, Scigliano E, Isola L, Fruchtman S. Interphase FISH analysis of sex-mismatched BMT utilizing dual color XY probes. Bone Marrow Transplant 1997;19: Housman D. Human DNA polymorphism. New Eng J Med 1995;5: Blazar BR, Orr HT, Arthur DC, Kersey JH, Filipovich AH. Restriction fragment length polymorphism as markers of engraftment in allogeneic marrow transplantation. Blood 1985;66: Ugozzoli L, Yam P, Petz LD, Ferrara GB, Champlin RE, Forman SJ, et al. Amplification by the polymerase chain reaction of hypervariable regions of the human genome for evaluation of chimerism after bone marrow transplantation. Blood 1991;77: Thiede C, Lion T. Quantitative analysis of chimerism after stem cell transplantation using multiplex PCR amplification of short tandem repeat markers and fluorescence detection. Leukemia 2001;15: Lion T, Watzinger F. Chimerism analysis following nonmyeloablative stem cell transplantation. Methods Mol Med 2006;125: Thiede C, Bornhäuser M, Oelschlägel U, Brendel C, Leo R, Daxberger H, et al. Sequential monitoring of chimerism and detection of minimal residual disease after allogeneic blood stem cell transplantation (BSCT) using multiplex PCR amplification of short tandem repeat-markers. Leukemia 2001;15: Thiede C, Bornhäuser M, Ehninger G. Evaluation of STR informativity for chimerism testing comparative analysis of 27 STR systems in 203 matched related donor recipient pairs. Leukemia 2004;18: Lion T, Daxberger H, Dubovsky J, Filipcik P, Fritsch G, Printz D, et al. Analysis of chimerism within specific leukocyte subsets for detection of residual or recurrent leukemia in pediatric patients after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia 2001;15:

16 Transplante de Medula Óssea Seção I História e bases científicas do TCTH 13. Koldehoff M, Steckel NK, Hlinka M, Beelen DW, Elmaagacli AH. Quantitative analysis of chimerism after allogeneic stem cell transplantation by realtime polymerase chain reaction with single nucleotide polymorphism, standard tandem repeats, and Y-chromosome-specific sequences. Am J Hematology 2006;81: Alizadeh M, Bernard M, Danic B, Dauriac C, Birebent B, Lapart C, et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99: Lion T, Muller-Berat N. Chimerism testing after allogeneic stem cell transplantation: importance of timing and optimal technique for chimerism testing in different clinico-biological situations. Leukemia 1999;13: Bader P, Niethammer D, Willasch A, Kreyenberg H, Klingebiel T. How and when should we monitor chimerism after allogeneic stem cell transplantation? Bone Marrow Transplant 2005; Hassan R, Bonamino MH, Braggio E, Lobo AM, Seuanez HN, Tabak DG, et al. A systematic approach to molecular quantitative determination of mixed chimaerism following allogeneic bone marrow transplantation: an analysis of its applicability in a group of patients with severe aplastic anaemia. Eur J Haematol. 2004;73: Watzinger F, Lion T, Steward C. The RSD code: proposal for a nomenclature of allelic configuration in STR- PCR-based chimerism testing after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia 2006;20: Shimoni A, Nagler A. Non-myeloablative stem cell transplantation (NST): chimerism testing as guidance for immune-therapeutic manipulations. Leukemia 2001;15: Dubovsky J, Daxberger H, Fritsch G, Printz D, Peters C, Matthes S, et al. Kinetics of chimerism during the early post-transplant period in pediatric patients with malignant and non-malignant hematologic disorders: implications for timely detection of engraftment, graft failure and rejection. Leukemia 1999;13: Gardiner N, Lawler M, O Riordan JM, Duggan C, De Arce M, McCann SR. Monitoring of lineagespecific chimaerism allows early prediction of response following donor lymphocyte infusions for relapsed chronic myeloid leukemia. Bone Marrow Transplant 1998;21: Baron F, Baker JE, Storb R, Gooley TA, Sandmaier BM, Maris MB, et al. Kinetics of engraftment in patients with hematologic malignancies given allogeneic hematopoietic cell transplantation after nonmyeloablative conditioning. Blood 2004;104: Lamba R, Abella E, Kukuruga D, Klein J, Savasan S, Abidi MH, et al. Mixed hematopoietic chimerism at day 90 following allogenic myeloablative stem cell transplantation is a predictor of relapse and survival. Leukemia 2004;18: Zalcberg IR, Braggio E, Scholl V, Lobo AM, Borges AP, Maiolino A, et al. Mixed haematopoietic chimaerism at day +90 following allogenic myeloablative stem cell transplantation is predictor of relapse in patients with chronic myeloid leukemia. Eur J Haematol, 2008 (Submetido). 25. Kristt D, Stein J, Yaniv I, Klein T. Assessing quantitative chimerism longitudinally: technical considerations, clinical applications and routine feasibility. Bone Marrow Transplant 2007;39: Serrano J, Roman J, Sanchez J, Jimenez A, Castillejo JA, Herrera C, et al. Molecular analysis of lineage-specific chimerism and minimal residual disease by RT- PCR of p210(bcr-abl) and p190(bcr-abl) after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia: increasing mixed myeloid chimerism and p190(bcr-abl) detection precede cytogenetic relapse. Blood 2000;95: Molloy K, Goulden N, Lawler M, Cornish J, Oakhill A, Pamphilon D, et al. Patterns of hematopoietic chimerism following bone marrow transplantation for childhood acute lymphoblastic leukemia from volunteer unrelated donors. Blood 1996;87: Choi S-J, Lee K-H, Lee J-H, Kim S, Chung H-J, Lee J-S, et al. Prognostic value of hematopoietic chimerism in patients with acute leukemia after allogeneic bone marrow transplantation: a prospective study. Bone Marrow Transplant 2000;26: Bader P, Beck J, Frey A, Schlegel PG, Hebarth H, Handgretinger R, et al. Serial and quantitative analysis of mixed hematopoietic chimerism by PCR in patients with acute leukemias allows the prediction of relapse after allogeneic BMT. Bone Marrow Transplant 1998;21:

17 Capítulo 5 Monitoramento quimerismo após transplante de células-tronco hematopoéticas 30. Zetterquist H, Mattsson J, Uzunel M, Näsman-Björk I, Svengberg P, Tammik L. et al. Mixed chimerism in the B cell lineage is a rapid and sensitive indicator of minimal residual disease in bone marrow transplant recipients with pre-b cell acute lymphoblastic leukemia. Bone Marrow Transplant 2000;25: Mattsson J, Uzunel M, Tammik L, Aschan J, Ringdén O. Leukemia lineage-specific analysis with acute myeloid leukemia and myelodysplastic syndrome after allogeneic stem cell transplantation. Leukemia 2001;15: Dazzi F, Goldman JM. Adoptive immunotherapy following allogeneic bone marrow transplantation. Annu Rev Medicine 1998;49: Formankova R, Honzatkova L, Moravcova J, Sieglova Z, Dvorakova R, Nadvornikova S, et al. Prediction and reversion of post-transplant relapse in patients with chronic myeloid leukemia using mixed chimerism and residual disease detection and adoptive immunotherapy. Leuk Res 2000;24: Keil F, Haas AO, Fitsch G, Kalhs P, Lechner K, Mannhalter C, et al. Donor leukocyte infusions for leukemic relapse after allogeneic bone marrow transplantation: lack of residual donor hematopoiesis predicts aplasia. Blood 1997;83: Mangioni S, Balduzzi A, Rivolta A, Rovelli A, Nesi F, Rossi V, et al. Long-term persistence of hemopoietic chimerism following sex-mismatched bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1997; 20: Schaap N, Schattenberg A, Mensik E, Preijers F, Hillegers M, Knops R. et al. Long-term follow-up of persisting mixed chimerism after partially T cell-depleted allogeneic stem cell transplantation. Leukemia 2002;16: Huss R, Deeg HJ, Gooley T, Bryant E, Leisenring W, Clift R, et al. Effect of mixed chimerism on graft-versus-host-disease, disease recurrence and survival after HLA-identical marrow transplantation for aplastic anemia or chronic myelogenous leukemia. Bone Marrow Transplant 1996;18: Antin JH, Childs R, Filipovich AH, Giralt S, Mackinnon S, Spitzer T, et al. Establishment of complete and mixed donor chimerism after allogeneic lymphohematopoietic transplantation: recommendations from a workshop at the 2001 Tandem Meetings of the International Bone Marrow Registry and the American Society of Blood and Marrow Transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2001;7:

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