Análise dos efeitos biológicos e genômicos em amostras de sangue submetidas a níveis controlados de radiação emitida por sistemas de telefonia celular

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1 Análise dos efeitos biológicos e genômicos em amostras de sangue submetidas a níveis controlados de radiação emitida por sistemas de telefonia celular Antônio Marini de Almeida *, Cássia de Lourdes Campanho **, Raquel Mary Rodrigues **, Vanessa Cristina Franco **, Bruno Peres dos Santos **, Juliana K. R. Heinrich ** Este trabalho apresenta a investigação dos efeitos biológicos da radiação eletromagnética produzida por sistemas CDMA e AMPS de telefonia celular, em culturas de células expostas durante 72 horas a taxas de absorção específica (SAR) variando de 0,8 a 10 W/kg. Foram investigadas instabilidades genômicas pela técnica de citogenética convencional e FISH (hibridização in situ por fluorescência) em amostras de sangue de 10 doadores. A instabilidade genômica é um dos primeiros eventos que ocorrem na iniciação de tumores e, por essa razão, foram analisadas: a frequência e o tipo de anomalias cromossômicas, a frequência de micronúcleos, a aneuploidia e o status dos genes TP53, HER-2/neu e C-MYC em linfócitos submetidos a campos de RF em um sistema de exposição controlado e altamente monitorado. Nossos resultados demonstram um efeito dose-dependente para a ocorrência de anomalias no DNA e resultados positivos relevantes foram encontrados apenas acima dos limites de SAR estabelecidos pelas regulamentações. Palavras-chave: Radiação não ionizante. Efeitos biológicos. Campos eletromagnéticos. Introdução Estudos in vitro são importantes para delinear possíveis danos causados pela radiação não ionizante ou campos de radiofrequência (RF) e suas interações com os sistemas biológicos tais como células, tecidos e organismos. A principal vantagem desses estudos é a possibilidade de controlar quase todas as variáveis e condições dos testes para descartar interferências e delinear os alvos da investigação para serem explorados por estudos in vivo e clínicoepidemiológicos. Instabilidade genômica (IG) tem sido encontrada principalmente em células tumorais e é caracterizada por acúmulo de múltiplas trocas que convertem o genoma de uma célula normal em um genoma instável (SMITH et al., 2003). Essa instabilidade é caracterizada por alterações genéticas, como rearranjos cromossômicos, aneuploidia, aumento da frequência de micronúcleos, instabilidade de microssatélite, mutações, amplificações gênicas, trocas na transcrição de genes, transformação e morte celular na primeira e nas subsequentes gerações de células após o insulto inicial (HUANG; SNYDER; MORGAN, 2003). Investigações in vitro em diferentes sistemas celulares demonstraram associações tanto positivas quanto negativas para danos à célula, levando à IG após exposição à RF, embora muitos desses resultados tenham sido atribuídos a efeitos térmicos. Esses grupos sugeriram que a RF não é mutagênica em si e que os efeitos adversos dessa exposição devem-se ao aquecimento causado pela exposição das células à alta frequência ou a campos de alta intensidade (IVASHUCK et al., 1997; BRUSICK et al., 1998; MOULDER et al., 1999; BLETTNER; BERG, 2000). Por outro lado, a aneuploidia do cromossomo 17 foi observada em vias dose-dependentes com alterações relacionadas à segregação cromossômica, sugerindo que a RF pode interferir no ciclo celular e causar danos cromossômicos e IG em experimentos com a temperatura do ambiente controlada (MASHEVICH et al., 2003). Outros eventos foram observados e associados com a exposição à RF dose-dependente como: efluxo de moléculas transmembrana, erros de transcrição, transformação celular, mudanças na atividade enzimática, fosforilação da hsp27 (proteína heat shock 27) e aumento dos níveis de mrna do gene FOS (GOSWANI et al., 1999; PRABHAT et al., 1999; FRENCH et al., 2001; LESZCYNSKI et al., 2002; DI CARLO et al., 2002). Há uma grande preocupação considerando exposição à RF e tumorigênese e, como a instabilidade genômica é um dos primeiros eventos ocorridos na formação do tumor, foi investigada a frequência de danos * Autor a quem a correspondência deve ser dirigida: amarini@cpqd.com.br ** Laboratórios Clínicos Especializados Citogenética CAISM Universidade Estadual de Campinas Unicamp Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p , jan./jun. 2009

2 cromossômicos, a formação de micronúcleos e a aneuploidia em linfócitos submetidos a campos de RF em um sistema de exposição controlado e altamente monitorado. 1 Materiais e métodos para análise 1.1 Amostra A população do estudo consistiu em 10 indivíduos saudáveis, homens e mulheres, não fumantes, que não haviam sido submetidos a exames de raio-x nos últimos 12 meses. O estudo foi aprovado pela Universidade e pelo Comitê de Ética Nacional (CONEP). Os participantes foram informados dos objetivos do estudo e foi solicitada a assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido. Amostras de sangue venoso foram coletadas em tubos heparinizados codificados e divididas para serem utilizadas em diferentes técnicas como amostras teste, sham-exposed e controle. 1.2 Análises citogenéticas Citogenéticas: culturas de curta duração foram estabelecidas utilizando 0,5 ml de sangue periférico em meio de cultura HAM F-10 (Nutricell) suplementado com fitohemaglutinina (Invitrogen) e 10% de soro fetal bovino (Nutricell). As células foram coletadas após 72 horas de estímulo e colcemid (Invitrogen) foi adicionado às culturas aproximadamente uma hora antes da fixação e processamento finais. As culturas foram submetidas ao choque hipotônico em solução de KCl 0,075 M por 10 minutos a 37 o C e fixadas em metanol: ácido acético (3:1) em três lavagens sucessivas. Para a análise citogenética convencional, os linfócitos foram corados em corante Giemsa-Wright a 5% por 6 minutos. Foram analisadas aberrações estruturais como: quebras e gaps cromossômicos e cromatídicos, fragmentos acêntricos e dicêntricos, double minutes e aumento de satélites. Cada anomalia foi registrada como um evento diferente. As frequências médias foram obtidas para cada tipo de exposição. Para cada doador, 200 células foram analisadas. Para a análise FISH, foram utilizadas sondas gene específicas e para o respectivo centrômero do cromossomo de origem, para os genes TP-53, HER-2/neu e C- MYC (Qbiogene), de acordo com as instruções do fabricante, em forma de minipreparação. Células com mais de dois sinais de hibridização foram reportadas com amplificação. Para os ensaios de aumento da frequência de micronúcleos, as culturas de linfócitos de curta duração foram estabelecidas como descritas anteriormente para a análise citogenética convencional. No entanto, adicionou-se citocalasina B (Sigma) após 44 horas do estímulo inicial. As células foram submetidas ao choque hipotônico e fixadas apenas em metanol, em três lavagens sucessivas. As células foram coradas em Giemsa-Wright a 5% por 6 minutos. Para cada doador, células foram analisadas e as frequências médicas para cada tipo de exposição foram obtidas. 1.3 Sistema de exposição O setup de exposição foi especialmente desenvolvido para este projeto. Uma TEM Cell (Transverse Electromagnetic Cell) foi utilizada para irradiar amostras em uma incubadora a 37 o C (Figura 1A) por 72 horas, que é o tempo preconizado para obtenção de metáfases para análise citogenética. A temperatura foi corrigida pela insuflação de ar, quando necessária, especialmente em níveis altos de SAR. Todos os parâmetros de exposição foram controlados e as condições para obtenção dos níveis desejáveis de SAR foram medidas e estabelecidas anteriormente, em experimentos conduzidos no equipamento robótico Dasy4 (Figura 1B). As culturas foram submetidas a níveis de 0,8; 2,0; 5,0 e 10,0 W/kg, nas tecnologias AMPS e CDMA. Amostras do tipo sham-exposed (nas mesmas condições de transporte e armazenamento, mas sem exposição à radiação) e amostras-controle (controle do paciente, sem as mesmas condições de transporte e armazenamento e sem exposição à radiação) foram incluídas. A. B. Figura 1 Setup de exposição: (A) Diagrama do sistema de exposição (B) Sistema robótico Dasy 4 utilizado para caracterização das calibrações do sistema 64 Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p , jan./jun. 2009

3 2 Resultados Com relação aos resultados obtidos com a técnica FISH (hibridização in situ por fluorescência), foram obtidas frequências máximas para cada caso, dadas pela porcentagem de células alteradas, para um dos genes, para cada uma das classes de amostra, conforme resumido na Tabela 1. Apesar de as frequências máximas obtidas e observadas na Tabela 1 terem se apresentado sensivelmente maiores que os controles, observou-se que os resultados eram confirmados em um número maior de casos apenas acima do limite de 5 W/kg, tendo chegado à totalidade de casos alterados quando as células foram submetidas ao limite de 10 W/kg, conforme Tabela 2. Os resultados obtidos com o teste da frequência de micronúcleos revelou porcentagens de 4,07%, 8,93%, 13,36% e 8,74% respectivamente para: controles, 0,8 W/kg AMPS, 10 W/kg AMPS e sham-exposed. As frequências de micronúcleos aumentaram em níveis de SAR de 10 W/kg enquanto os resultados observados com o nível de SAR de 0,8 W/kg realisticamente próximo ao nível de exposição a que uma pessoa é submetida foram muito similares à frequência obtida com as amostras do tipo sham-exposed, podendo demonstrar algum efeito técnico e não da radiação propriamente dita. Um efeito dose-dependente foi claramente notado em todos os parâmetros investigados, uma vez que as anomalias tornavam-se mais frequentes de forma proporcional aos valores de SAR a que foram submetidas as amostras. Entre as anomalias citogenéticas mais frequentemente observadas, notaram-se quebras cromatídicas (envolvendo as cromátides dos cromossomos) e outros eventos como deleção de fragmentos e amplificação, assim como cromossomos em anel, conforme Figura 2. Tabela 1 Frequências máximas das alterações Gene CDMA AMPS 2 W/kg 5 W/kg 10 W/kg 2 W/kg 5 W/kg 10 W/kg Controle CMYC 0 1,97 % 2,32 % 3,97 % 4,82 % 4,97 % 1,33 % HER2 4,13 % 2,54 % 2,86 % 3,81 % 2,57 % 18,87 % 2,00 % TP53 6,61 % 5,40 % 6,98 % 9,52 % 3,93 % 14,24 % 2,33 % Tabela 2 Número de casos alterados acima dos resultados dos controles Gene CDMA AMPS 2 W/kg 5 W/kg 10 W/kg 2 W/kg 5 W/kg 10 W/kg CMYC 0 de 6 4 de 7 7 de 7 4 de 7 4 de 7 7 de 7 HER2 0 de 6 1 de 7 5 de 7 1 de 7 2 de 7 5 de 7 TP53 0 de 6 2 de 7 5 de 7 1 de 7 4 de 7 7 de 7 A B C D E F G H Figura 2 Anomalias cromossômicas: (A) Aumento de satélite, (B/C) Quebras cromossômicas, (D) Gap cromatídico, (E) Deleção, (F) Cromossomo em anel, (G) Fragmento acêntrico, (H) Amplificação Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p , jan./jun

4 3 Análise e discussão dos resultados Uma preocupação geral para as pessoas que são submetidas a campos de radiofrequência, especialmente com o aumento drástico do número de usuários da tecnologia celular, é a conexão entre radiação e câncer. A instabilidade genômica é largamente encontrada em células tumorais e existe uma evidência forte de que altos níveis de SAR, muito acima dos limites preconizados pelas legislações vigentes, possam ter um efeito genotóxico e induzir dano ao DNA em algum nível. É interessante notar que a aneuploidia e as anomalias cromossômicas têm sido consideradas dois dos eventos mais notórios relacionados aos processos de tumorigênese iniciação tumoral, uma vez que precede a transformação maligna em muitos tumores. A aneuploidia no câncer e outras anomalias afetam a dosagem gênica e um grande número de proteínas, incluindo aquelas envolvidas no aparato do fuso mitótico, necessário para os processos de divisão celular, fazendo com que essas anomalias tornem-se perpetuáveis (BIALY, 2001). Mesmo detectando anomalias genômicas em células de sangue submetidas a níveis diferentes de SAR, ainda resta identificar se essas células são capazes de escapar para uma via apoptótica, de morte celular programada, para exterminar os clones desbalanceados e preservar a integridade tecidual. Foram observados muito mais eventos relacionados a translocações e cromossomos marcadores do que a fragmentos dicêntricos, acêntricos e cromossomos em anel, estes últimos considerados menos estáveis e com rápido desaparecimento in vivo (JOHNSON et al., 1998; LALIC et al., 2001). Em resposta ao efeito genotóxico da radiação, várias moléculas químicas, metabólitos celulares reativos e checkpoints de controle do ciclo celular podem ser ativados, permitindo que uma célula se autorrepare ou evite a transmissão de cromossomos anormais. O equilíbrio entre os eventos de ciclo celular, reparo de danos e início da morte celular programada são eventos que podem determinar se o dano à célula ou ao DNA é compatível com a sobrevivência da célula ou se requer eliminação por via apoptótica. Defeitos nesses processos podem levar à hipersensibilidade ao estresse celular e susceptibilidade ao dano ao DNA, defeitos genômicos e resistência à apoptose, características marcantes das células tumorais. Quando indivíduos expostos à radiação em um ambiente de trabalho foram avaliados, foi demonstrado que outros fatores podem potencializar os efeitos clastogênicos da radiação como a deprivação de luz, resultando em um distúrbio na secreção de melatonina (CASSONE et al., 1993). Essas observações podem explicar o fato de que nossas amostras do tipo shamexposed demonstraram médias maiores de anomalias quando comparadas às amostrascontrole. É necessário considerar também que fatores epigenéticos e ambientais podem atuar fortemente como potencializadores dos efeitos no DNA. Nossos achados apoiam os resultados de outros grupos, uma vez que foi possível demonstrar um efeito dose-dependente, particularmente com níveis de SAR acima de 5 W/kg (TICE et al., 2002). O sistema de exposição utilizado nesses ensaios foi cuidadosamente proposto para atender às necessidades descritas no Projeto EMF Internacional da Organização Mundial da Saúde. Parâmetros como temperatura, potência e a caracterização da TEM Cell foram estudados em testes de dosimetria, para que resultados confiáveis pudessem ser atingidos em condições isotermais. Nossos resultados demonstram a importância da análise genômica, especialmente através de técnicas de citogenética convencional e molecular e sugerem a utilização da análise citogenética contínua, especialmente para os profissionais submetidos à irradiação ocupacional (LALIC et al., 2001). Conclusão O efeito genotóxico da radiação no DNA das células do sangue somente pôde ser verificado quando estas foram submetidas a limites muito superiores aos preconizados nas legislações e literatura técnica. A análise citogenética de rotina pode ser uma ferramenta importante para o acompanhamento da saúde do trabalhador envolvido em operações com altas doses de RF. Referências BRUSICK, D. et al. Genotoxicity of radiofrequency radiation. Environmental and Molecular Mutagenesis, 1998; 32: HUANG, L.; SNYDER, A.R.; MORGAN, W. F. Radiation-induced genomic instability and its implications for radiation carcinogenesis. Oncogene, 2003; 22: IVASCHUK, O. L. et al. Exposure of nerve growth factor-treated PC12 rat pheochromacytoma cells to a modulated radiofrequency field at MHz: effects on c-jun and c-fos expression. Bioelectromagnetics, 1997; 18: MOULDER, J. E. et al. Cell phones and cancer: what is the evidence for a connection?. Radiation Research, 1999; 151: SMITH, L. E. et al. Radiation-induced genomic instability: radiation quality and dose response. Health Phys (1): Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p , jan./jun. 2009

5 Abstract In this work we have investigated the biological effects in cultured cells exposed to electromagnetic radiation produced by mobile systems with CDMA and AMPS technologies during 72 hours with a SAR ranging from 0.8 to 10 W/kg. Using conventional and molecular cytogenetics (FISH Fluorescent in situ hybridization) techniques we investigated the genomic instability in cultured blood samples from 10 donors. The samples were exposed to RF fields in a controlled and monitored system. Genomic instability is frequently related to tumorigenesis and in that way we analyzed: the frequency and type of chromosomal abnormalities, micronuclei frequency, aneuploidy and gene status of the TP53, HER-2/neu and C-MYC genes. Our results have shown a dose-dependent effect on those DNA abnormalities and relevant positive results were found only above the regulatory SAR limits. Key words: Non ionizing radiation. Biological effects. Electromagnectics fields. Cad. CPqD Tecnologia, Campinas, v. 5, n. 1, p , jan./jun

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