LUZ NATURAL NA MICROPROPAGAÇÃO DO ABACAXIZEIRO (Ananas comosus L. Merr)

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1 LUZ NATURAL NA MICROPROPAGAÇÃO DO ABACAXIZEIRO (Ananas comosus L. Merr) Adriano Bortolotti da Silva, Moacir Pasqual, Evaristo Mauro de Castro, Luzia Yuriko Miyata, Lucas Amaral de Melo e Francyane Tavares Braga RESUMO Brotações de Ananas comosus cv. Imperial, foram enraizadas in vitro em diferentes condições ambientais (luz artificial e natural) e após dois meses as plântulas foram transferidas para substrato comercial (Plantmax ) em casa de vegetação. O crescimento das plantas e anatomia foliar foram avaliados em diferentes tempos (0, 7, 15, 30 e 60 dias) do processo de aclimatização. O emprego de luz natural durante a fase de enraizamento in vitro proporciona melhor desempenho agronômico e anatômico das plantas de abacaxizeiro durante a fase de aclimatização, apresentando o benefício de economizar energia elétrica para iluminação artificial em laboratórios de cultura de tecidos vegetais. NATURAL LIGHT IN PINEAPPLE (Ananas comosus L) MICROPROPAGATION Adriano Bortolotti da Silva, Moacir Pasqual, Evaristo Mauro de Castro, Luzia Yuriko Miyata, Lucas Amaral de Melo and Francyane Tavares Braga SUMMARY Shoot tips of Ananas comosus Imperial were rooted in vitro under two environments (artificial and natural light) and after two months the plantlets were transferred to commercial substrate (Plantmax ) in a greenhouse. Plant growth and leaf anatomy were evaluated at 0, 7, 15, 30 and 60-days during acclimatization. The in vitro rooting under natural light provides better agronomic and anatomical performances of Ananas comosus plants, with the benefit of saving electric energy for artificial illumination in vegetal tissue culture laboratories. Introdução O estresse hídrico provocado durante o processo de aclimatização, tem sido relatado como a principal causa de mortalidade de plântulas durante essa etapa da micropropagação, tendo como resultado a perda excessiva de água pelas plântulas (Barboza et al., 2006). A alta umidade relativa do recipiente de cultivo (próxima de 100%) e a baixa irradiância são os principais fatores que provocam alterações na estrutura e funcionamento dos tecidos, causando a baixa capacidade das mudas produzidas in vitro de controlar a perda de água, quando submetidas às condições do ambiente natural, com aumento da demanda evaporativa (Albany et al., 2005; Barboza et al., 2006). Uma das formas de facilitar o processo de aclimatização de plântulas cultivadas in vitro seria aumentar a intensidade luminosa, promovendo a fotossíntese e melhorando as relações hídricas. Ibaraki & Nozaki (2005) afirmam, ainda, que se houver necessidade de desenvolver capacidade fotossintética nos tecidos, um dos fatores mais importantes que devem ser considerados é o ambiente de luz, especialmente a intensidade. O emprego de luz natural é uma forma de aumentar a irradiância no ambiente de cultivo in vitro. A alta irradiancia altera a divisão celular, diferenciação do mesofilo e desenvolvimento de estômatos na lamina foliar (Kozai & Kubota, 2001; Erig & Schuch, 2005). Estudos com aumento de irradiação tem sido relatados na micropropagação fotoautotrofica (Seko e Nishimura, 1996; Fischer e Alfermann, 1995; Kanechi et al., 1998; Borkowska, 2001; Khan et al., 2003). Plântulas crescidas neste sistema podem apresentar melhor desenvolvimento do sistema radicular, maior diferencia- ção do parênquima paliçádico, cutículas mais espessas, redução na densidade de estômatos e melhor funcionamento destes (Khan et al., 2003; Nelson e Sage, 2008), o que pode reduzir as perdas durante o processo de aclimatização. A luz natural ainda proporciona economia com os gastos relativos ao emprego de iluminação artificial em salas de crescimento, que podem gerar custos de até 65% dos gastos com energia elétrica em laboratório de micropropagação (Savangikar, 2004; Erig e Schuch, 2005). O presente trabalho teve por objetivo avaliar o crescimento PALAVRAS CHAVE / Abacaxi / Aclimatização / Bromeliaceae / Enraizamento in vitro / Irradiância / Recebido: 20/04/2007. Modificado: 09/09/2008. Aceito: 15/09/2008. Adriano Bortolotti da Silva. Doutor em Agronomia Fitotecnia, Universidade Federal de Lavras (UFLA), Brasil. Professor, Universidade José do Rosário Vellano, Brasil. Endereço: Universidade José do Rosário Vellano, Instituto de Ciências Agrárias, Rod. MG 179, Km 0, Alfenas, MG, Brasil. CEP: bortolot@bol.com.br Moacir Pasqual. Doutor em Agronomia/Genética e Melhoramento de Plantas, Universidade de São Paulo, Brasil. Professor, UFLA, Brasil. mpasqual@ufla.br Evaristo Mauro de Castro. Doutor em Agronomia/Fitotecnia, UFLA, Brasil. Professor, UFLA, Brasil. emcastro@ufla.br Luzia Yuriko Miyata. Graduanda em Agronomia, UFLA, Brasil. luziaym@yahoo. com.br Lucas Amaral de Melo. Graduando em Agronomia, UFLA, Brasil. Francyane Tavares Braga Mestre em Agronomia/Fisiologia Vegetal e doutoranda em Agronomia Fitotecnia, UFLA, Brasil. ftbraga@yahoo. com.br /08/11/ $ 3.00/0 839

2 LUZ NATURAL EN MICROPROPAGACIÓN DE LA PIÑA (Ananas comosus L. Merr) Adriano Bortolotti da Silva, Moacir Pasqual, Evaristo Mauro de Castro, Luzia Yuriko Miyata, Lucas Amaral de Melo y Francyane Tavares Braga RESUMEN Brotes de Ananas comosus cv. Imperial fueron enraizados in vitro en distintas condiciones ambientales (luz natural y artificial) y después de dos meses las plántulas fueron transferidas para el substrato comercial (Plantmax ) en invernadero. El crecimiento de las plantas y la anatomía de las hojas fueron avaluadas en distintos tiempos (0, 7, 15, 30 y 60 días) del proceso de climatización. EL empleo de luz natural durante la fase de emisión de raíces in vitro proporciona el mejor desarrollo agronómico y anatómico de las plantas de piña durante la fase de climatización, presentando el beneficio de ahorrar energía eléctrica para la iluminación artificial en laboratorios de cultivo de tejidos vegetales. e o desempenho anatômico de plantas de abacaxizeiro em aclimatização advindas de cultivo em sala de crescimento (micropropagação ) e em estufa (luz natural). Materiais e Métodos Estabelecimento e Multiplicação Gemas axilares de abacaxizeiro (Ananas comosus L. cv. Imperial) foram inoculadas n vitro em meio líquido contendo os sais de MS (Murashige e Skoog, 1962); 1,0mg l -1 BAP, 0,1mg l -1 ANA; 30g l -1 sacarose e ph ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121 o C e 1kg cm 1 por 20min. Os cultivos foram mantidos em sala de crescimento por 60 dias, sob lâmpadas brancas frias proporcionando 40μmol m 2 s -1, com 16h de fotoperíodo, a 27 ±1 o C. Enraizamento Plântulas com aproximadamente 1cm, obtidas na etapa anterior, foram transferidas para meio de enraizamento constituído pelos sais de MS; 0,25mg l -1 ANA; 30g l -1 sacarose; 5,0 g l - 1 agar e ph ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121 o C e 1kg cm 1 por 20min. Foram vertidos 30ml de meio por frasco com capacidade de 250ml. Após a inoculação, os recipientes foram vedados com filme de PVC (10μm) e mantidos em sala de crescimento com luz artificial (micropropagação ) e casa de vegetação (luz natural) por 60 dias. Aclimatização Após este período de enraizamento in vitro as plântulas foram transferidas para tubetes (19 5cm) contendo substrato comercial composto de casca de pínus (Plantmax ). Tratamentos Os tratamentos constaram de diferentes ambientes de enraizamento in vitro: (sala de crescimento e casa de vegetação) em combinação com diferentes tempos de aclimatização: 7, 15, 30 e 60 dias. Descrição ambiental do enraizamento in vitro 1) Micropropagação. As plântulas crescendo em condições de luz artificial foram mantidas em sala de crescimento sob luz branca fria proporcionando irradiância de 40W m -2, com 16h de fotoperíodo a 27 ±1 o C. 2) Micropropagação luz natural. O cultivo sob luz natural foi mantido em casa de vegetação, coberta com Sombrite 50% e revestida por plástico agrícola, apresentando temperatura máxima de 39,5 e mínima de 14ºC, umidade relativa do ar variando de 40 a 85% (dados coletados por termohigrógrafo), e irradiância com picos de 55 a 160W m -2. Avaliações Em função dos sistemas de cultivo foram feitas avaliações da temperatura e irradiância no ambiente externo e da umidade relativa e temperatura dentro do recipiente de cultivo (Figuras 1 Figura 1. Condições ambientes dentro do recipiente de cultivo, no sistema de micropropagação. Figura 2. Condições ambientes dentro do recipiente de cultivo, no sistema de micropropagação luz natural. Dados obtidos em dia claro dos meses de agosto e setembro em casa de vegetação. e 2). As medidas de irradiância foram obtidas utilizando-se quantômetro acoplado a um porômetro (modelo 1600M, LI-COR, Lincoln, Neb, EEUU). Para determinar a umidade relativa e a temperatura do ar utilizou-se um sensor (LI-104), adequadamente introduzido no recipiente de cultivo (LI 1400; LI-COR, Lincoln, Neb, EEUU). Para os dados de crescimento das plantas, as avaliações foram realizadas nos diferentes tempos de aclimatização para as seguintes características: comprimento da parte aérea e do sistema radicular, número de folhas, massa fresca da parte aérea e do sistema radicular e massa seca total. A massa seca foi medida após a secagem em estufa, por 15 dias a 50 o C. As características anatômicas foram analisadas em termos de: espessura da epiderme da face adaxial, parênquima aqüífero e clorofiliano, epiderme da face abaxial, espessura total, número de estômatos, diâmetro polar e equatorial de estômatos. Foi realizada a determinação da perda de água das plântulas crescendo em diferentes ambientes de enraizamento in vitro. Para observação de características anatômicas, as lâminas foram montadas em glicerina 50%, seguindo metodologia descrita por Kraus e Arduin (1997). A freqüência estomática foi obtida por meio do emprego de câmara clara, em microscópio Olympus CBB, de acordo com a técnica de Labouriau et al. (1961). Os diâmetros polar e equatorial do estômato foram obtidos com o emprego de ocular micrométrica. As fotomi- 840

3 crografias foram realizadas utilizando-se um fotomicroscópio Olympus BX-60. Para avaliação de perda de água do tecido foliar, após 60 dias em meio de enraizamento, as plântulas mantidas em sala de crescimento (micropropagação ) e em casa de vegetação (micropropagação em luz natural) foram retiradas dos recipientes e mantidas em ambiente com 40 a 50% de umidade relativa do ar. Em intervalos de 10 em 10min foram retirados discos foliares de 10mm e pesados, durante um período de 120min. No final deste período, os discos foram levados para secagem em estufa, a 60 0 C por 72h, para obtenção da massa seca (adaptado de Sciutti e Morini, 1995). Os valores de perda de água Figura 3. Altura de abacaxizeiro durante o processo de aclimatização, em função dos ambientes de enraizamento in vitro. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. Figura 4. Comprimento do sistema radicular de abacaxizeiro, durante o processo de aclimatização, em função dos ambientes de crescimento in vitro e tempo de aclimatização. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. Figura 5. Altura, número de folhas, massa fresca da parte aérea e do sistema radicular de abacaxizeiro, durante o processo de aclimatização, em função do tempo de aclimatização. Resultados A altura das plantas durante a aclimatização foi afetada pelos ambientes de enraizamento in vitro (Figura 3). Plantas advindas de micropropagação em luz natural apresentaram-se mais altas (5,6cm), quando comparadas com as oriundas de micropropagação (4,0cm). Houve influência do fator ambiente de enraizamento in vitro e tempo de aclimatização para o comprimento do sistema radicular (Figura 4). As plantas vindas da micropropagação apresentaram maior comprimento de raízes aos 7 dias de aclimatização. Entretanto, aos 15 dias foi observada redução de 25% no comprimento do sistema radicular das plantas obtidas pela micropropagação, podendo ser fator limitante para a aclimatização de mudas de abacaxizeiro. Isso pode estar relacionado à morte do sistema radicular, que é uma resposta característica das plantas em aclimatização advindas de cultura de tecidos. Aos 30 e 60 dias de aclimatização, não houve influência significativa dos fatores estudados, apresentando comprimento médio de raízes de 11,0cm aos 60 dias de enraizamento em casa de vegetação. Os dados referentes à altura, número de folhas, massa fresca da parte aérea e do sistema radicular, em função do tempo de aclimatização são mostrados na Figura 5. Ao longo do tempo, houve crescimento linear para todas as variáveis apresentadas, independente do sistema de cultivo in vitro. As plantas de abacaxizeiro apresentaram, aos 60 dias, as seguintes médias: altura de 8cm, 18 folhas, 7,3g Figura 6. Massa seca total de abacaxizeiro, durante o processo de aclimatização, em função dos ambientes de crescimento in vitro. MC ( ): micropropagação, MLN ( ): micropropagação sob luz natural. para massa fresca da parte aérea e 0,9g para massa fresca do sistema radicular. A massa seca de plantas (Figura 6) foi afetada pelos fatores estudados. Melhor comportamento foi observado nas plantas vindas da micropropagação sob luz natural, apresentando massa seca 14% superior em relação a micropropagação, aos 60 dias de aclimatização A perda de água pelas plântulas de abacaxizeiro, após serem retiradas do recipiente, foi superior naquelas advindas da micropropagação quando comparadas com aquelas micropropagadas sob luz natural (Figura 7). Aos 120min, as plântulas que cresceram in vitro sob luz natural apresentavam 18% a foram expressos em porcentagem do conteúdo total de água do tecido foliar. Delineamento experimental e análise estatística O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em esquema fatorial simples de ambiente de enraizamento in vitro (sala de crescimento e casa de vegetação) e tempo (7, 15, 30, 60 dias) de aclimatização. Para os estudos de anatomia foi adicionado o tempo zero. Foram quatro repetições para as características de crescimento e cinco para as anatômicas. O programa SISVAR 4.3 (Ferreira, 1999) da Universidade Federal de Lavras, Brasil, foi utilizado para a realização das análises de variância (ANAVA), sendo as médias comparadas pelo Teste de Scott e Knott a 5% de probabilidade e por regressão polinomial. Figura 7. Perda de água pelas plântulas retiradas do meio de enraizamento, em função dos ambientes de cultivo in vitro. MC ( ): micropropagação, MLN ( ): micropropagação sob luz natural. 841

4 Figura 8. Espessura da epiderme adaxial de plantas em diferentes tempos de aclimatização, em função dos ambientes de cultivo in vitro. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. Figura 10. Espessura foliar de plantas em diferentes tempos de aclimatização, em função dos ambientes de cultivos in vitro. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. Figura 9. Espessura do parênquima aqüífero e clorofiliano de plantas em diferentes tempos de aclimatização, em função dos ambientes de cultivo in vitro. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. Figura 12. Freqüência estomática (estômatos/mm 2 ) de plantas em diferentes tempos de aclimatização, em função dos ambientes de cultivo in vitro. MC: micropropagação, MLN: micropropagação sob luz natural. mais de água do que no sistema. A espessura da face adaxial da epiderme das plantas advindas do enraizamento sob luz natural apresentou-se muito similar, desde a retirada das plantas dos recipientes de cultivo até os 60 dias de aclimatização (Figura 8). Em contrapartida, houve aumento da espessura da epiderme adaxial das plantas vindas da micropropagação. Não houve efeito significativo para espessura da face abaxial da epiderme, apresentando média de 14µm aos 60 dias de aclimatização. A espessura dos parênquimas apresentou crescimento linear em função do tempo de aclimatização (Figura 9). O parênquima aqüífero em abacaxizeiro é responsável pelo armazenamento de água no mesofilo, sendo uma estrutura adaptativa das bromeliáceas a ambientes xéricos. Plantas advindas da micropropagação sob luz natural apresentaram maior espessura de parênquima aqüífero aos 60 dias de aclimatização em comparação com as Figura 11. Seções transversais de folhas de abacaxizeiro desenvolvidas durante os diferentes tempos de aclimatização, em função da micropropagação (MC) e da micropropagação sob luz natural (MLN). ad: adaxial, ab: abaxial, pa: parênquima aqüífero, pcl: parênquima clorofiliano, sv: sistema vascular. advindas da micropropagação. A espessura do parênquima clorofiliano, estrutura anatômica responsável pela fotossíntese, foi 15% superior aos 60 dias de aclimatização nas plantas vindas da micropropagação sob luz natural quando comparado a micropropagação. A espessura foliar, em todos os tempos de aclimatização, foi maior em plantas originadas do cultivo in vitro sob luz natural (Figuras 10 e 11), apresentando em média 108,58µm mais espessas do que a micropropagação. O número de estômatos por mm 2 das plantas vindas da micropropagação apresentou queda, até os 30 dias de aclimatização e posteriormente, houve aumento (Figura 12). As plantas enraizadas sob luz natural apresentaram crescimento linear no número de estômatos durante a fase de aclimatização. Entretanto, aos 60 dias de aclimatização, plantas em ambos sistemas de enraizamento in vitro, apresentaram valores semelhantes (80 estômatos/mm 2 ) para freqüência estomática. Discussão Raízes mal formadas e pouco funcionais é uma característica de plântulas micropropagadas. Durante a fase de aclimatização é necessário que haja emissão de novas raízes para que ocorra a absorção de água e sais minerais (Hazarika, 2006). Na micropropagação sob luz natural foi observada tendência de crescimento do sistema radicular durante os 15 primeiros dias de aclimatização (Figura 4), o que pode beneficiar o crescimento das plantas durante este processo (Figura 3). O enraizamento in vitro em casa de vegetação, em condições ambientais similares à fase de aclimatização, proporcionou menor estresse ao material vegetal e, conseqüentemente, maior desempenho das plantas (Figuras 3, 4 e 6 ). O enraizamento sob luz natural proporciona aumento na irradiância e queda da umidade relativa do ar dentro do recipiente de cultivo (Figura 2), aumentando a capacidade das plântulas em controlar as perdas de água durante os primeiros momentos da fase de aclimatização (Figura 7). 842

5 A umidade mais baixa sob luz natural do que na luz artificial ( 100%) no ambiente de cultivo aumentou a capacidade de controle de perda de água em plântulas de Prunus cerasifera e Malus domestica cultivadas in vitro (Sciutti e Morini, 1995). Capellades et al. (1990) afirmam que aumento da irradiância e redução da umidade relativa do ar durante o cultivo in vitro induzem a modificações anatômicas observadas nas plantas durante o período de aclimatização em casa de vegetação, como aumento no teor de cêra epicuticular e redução no tamanho e freqüência dos estômatos. Folhas de plantas abacaxi com seis e dez meses em aclimatação apresentaram epiderme recoberta por cutícula em toda sua extensão sendo está, uma característica determinada pela exposição das folhas a altos níveis de irradiãncia (Barboza et al., 2006). Modificações anatômicas de plântulas cultivadas in vitro sob luz natural foram observadas no presente trabalho. Chen et al. (2002), trabalhando com Ananas comosus, Kalanchoë daigremontiana e K. pinnata, também observaram mudanças anatômicas e níveis metabólicas devido a altas irradiâncias durante o período diurno. A estrutura das células da epiderme das plântulas, em cultivo sob luz natural, é similar àquelas crescendo em casa de vegetação durante a aclimatização (Figura 11). Entretanto, o aumento da irradiância melhora a estrutura da epiderme das plântulas cultivadas in vitro (Dimassi-Theriou e Bosabalis, 1996). Estudos em micropropagação fotoautotrófica (cultivo ausente de sacarose) sob alta irradiância têm mostrado maior organização dos tecidos do mesofilo de plântulas cultivadas nesse sistema (Khan et al., 2003; Serret et al., 1996) e menores perdas durante a fase de aclimatização (Serret et al., 1997). O crescimento dos parênquimas foi afetado pela interação dos ambientes de cultivo in vitro e tempos de aclimatização. De maneira geral, os parênquimas aqüífero e clorofiliano foram mais espessos em plântulas submetidas à luz natural (Figuras 9 e 11), mostrando a plasticidade das plântulas de abacaxizeiro cultivadas in vitro sob alta irradiância e sua capacidade adaptativa, na fase posterior de aclimatização, ou seja, possivelmente maior capacidade fotossintética e de acúmulo de água pelo parênquima clorofiliano e aqüífero, respectivamente. A capacidade de alterar a estrutura da folha em resposta ao ambiente, principalmente ao nível de irradiância, tem sido comumente observada em espécies cultivadas in vitro (Hazarika, 2006). Folhas mais espessas foram observadas em cultivo in vitro sob luz natural (Figura 10), sendo considerada resposta padrão em cultivo sob alta irradiância e sendo uma característica determinante para o sucesso da aclimatização (Lee, 2000). A freqüência estomática, sua estrutura e funcionalidade tem sido relatados como princinpal fator de perda de água durante o processo de aclimatização (Barboza et al., 2006; Hazarika, 2006). Folhas de Ananas comusus L. oriundas do cultivo in vitro, apresentaram número de estômatos por mm 2 inferior quando comparadas com folhas de casa de vegetação (Barboza et al., 2006). Conclusões O emprego de luz natural, durante a fase de enraizamento in vitro, proporciona melhor desempenho agronômico e anatômico das plantas de abacaxizeiro durante a fase de aclimatização, apresentando o benefício de economizar energia elétrica para iluminação artificial em laboratórios de cultura de tecidos vegetais. Agradecimentos Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FA- PEMIG) pelo apoio financeiro e ao CNPq pela concessão das bolsa. Referências Albany NR, Vílchez JA, García L, Jiménez E (2005) Comparative study of morphological parameters of Grand Nain banana (Musa AAA) after in vitro multiplication with growth retardants. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 83: Barboza SBSC, Graciano-Ribeiro D, Teixeira JB, Portes TA, Souza LAC (2006) Anatomia foliar de plantas micropropagadas de abacaxi. Pesq. Agropec. Bras, 41: Borkowska B (2001) Morphological and physiological characteristics of micropropagated strawberry plants rooted in vitro or ex vitro. Sci. Hort. 89: Capellades M, Fontarnau R, Carulla C, Debergh P (1990) Environment influences anatomy of stomata and epidermal cells in tissue culture Rosa multiflora. J. Am. Soc. Hort. Sci. 115: Chen L-S, Lin Q, Nose A (2002) A comparative study on diurnal changes in metabolite levels in the leaves of three crassulacean acid metabolism (CAM) species, Ananas comosus, Kalanchoë daigremontiana and K. pinnata. J. Exp. Bot. 53: Dimassi-Theriou K, Bosabalidis AM (1996) Effects of light, magnesium and sucrose on leaf anatomy, photosyntesis, starch and total sugar accumulation, in kiwifruit cultured in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 47: Erig AC, Schuch MW (2005) Micropropagação fotoautotrófica e o uso da luz natural. Ciência Rural 35: Ferreira DF (1999) SISVAR 4. 3 Sistema de análises estatísticas. UFLA. Lavras, Brasil. 92 pp. Fischer U, Alfermann AW (1995) Cultivation of phoautotrophic plant cell suspensions in bioreactor: influence of culture conditions. J. Biotechnol. 41: Hazarika BN (2006) Morpho-physiological disorders in in vitro culture of plants. Sci. Hort. 108: Ibaraki Y, Nozaki Y (2005) Estimation of light intensity distribution in a culture vessel. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 80: Kanechi M, Ochi M, Abe M, Inagaki N, Maekawa S (1998) The effects of carbon dioxide enrichment, natural ventilation, and light intensity on growth, photosynthesis, and transpiration of Cauliflower plantlets cultured in vitro photoautrophically and photomixotrophically. J. Am. Soc. Hort. Sci. 123: Khan SV, Kozai T, Nguyen OT, Kubota C, Dhawan V (2003) Growth and water relations of Paulownia fortunei under photomixotrophic and photoautotrophic conditions. Biol. Plant. 46: Kraus JE, Arduin M (1997) Manual básico de métodos em morfologia vegetal vegetal. Seropédica. Ed. Universidade Federal Rural. Rio de Janeiro, Brasil 198 pp. Kozai T, Kubota C (2001) Developing a photoautotrophic micropropagation system for woody plants. J. Plant Res. 114: Laboriau LG, Oliveira JG, Salgado- Laboriau ML (1961) Transpiração de Schizolobium parahyba (Vell) Toledo I. Comportamento na estação chuvosa, nas condições de Caeté, Minas Gerais. An. Acad. Bras. Ciên. 23: Lee DW (2000) Effects of irradiance and spectral quality on leaf structure and function in seedlings of two southeast asian Hopea (Dipeterocarpaceae) species. Am. J. Bot. 87: Murashige T, Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue culture. Physiol. Plant. 15: Nelson EA, Sage RF (2008) Functional constraints of CAM leaf anatomy: tight cell packing is associated with increased CAM function across a gradient of CAM expression. J. Exp. Bot. 59: Savangikar VA (2004) Role of low cost options in tissue culture. Em Low Costs Options for Tissue Culture Technology in Developing Countries. International Atomic Energy Agency. Viena, Austria. pp Sciutti R, Morini S (1995) Water loss and photosynthesis of plum plantlets by relative humidity during rooting in vitro. J. Hort. Sci. 70: Seko Y, Nishimura M (1996) Effect of CO 2 and light on survival and growth of rice regenerants growth in vitro on sugar-free medium. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 46: Serret MD, Trillas MI, Matas J, Araus JL (1996) Development of photoautotrophic and photoinhibition of Gardenia jasminoides plantlets during micropropagation. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 45: Serret MD, Trillas MI, Matas J, Araus JL (1997) The effect of different closure types, light and sucrose concentrations on Carbon isotope composition and growth of Gardenia jasminoides plantlets during micropropagation and subsequent acclimatization ex vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 47: