Poliana Bergamin Athayde de Souza¹, Wilmer Edgard Luera Peña², Keilane Fiorotti Poltronieri 3

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1 MODELAGEM PROBABILÍSTICA PARA CRESCIMENTO/NÃO CRESCIMENTO DE Byssochlamys nívea COMO FUNÇÃO DO PH, DA TEMPERATURA DE ESTOCAGEM E CONCENTRAÇÃO DE SÓLIDOS SOLÚVEIS Poliana Bergamin Athayde de Souza¹, Wilmer Edgard Luera Peña², Keilane Fiorotti Poltronieri 3 1.Graduanda em Engenharia de Alimentos da Universidade Federal do Espírito Santo (polianabergamin@hotmail.com) 2.Professor Dr. Departamento de Tecnologia de Alimentos/Universidade Federal de Viçosa. 3.Graduanda em Engenharia de Alimentos da Universidade Federal do Espírito Santo. Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias, caixa postal 16, Alegre Brasil Data de recebimento: 07/10/ Data de aprovação: 14/11/2011 RESUMO Byssochlamys nívea é um fungo termorresistente usualmente relatado como deteriorador de sucos de frutas tropicais. Os ascósporos destes fungos podem sobreviver à pasteurização comercial aplicada aos sucos de frutas, causando sua deterioração, gerando grandes perdas econômicas. Estudos que gerem critérios alternativos para controlar o desenvolvimento de Byssochlamys nívea podem ser feitos com a aplicação da microbiologia preditiva. O presente trabalho objetivou modelar, mediante enfoque probabilístico, o crescimento/não crescimento de Byssochlamys nívea em função do ph, concentração de sólidos solúveis e temperatura de estocagem, em meios sintéticos pré-inoculados. O modelo de regressão logística foi gerado a partir de um fatorial completo aplicado aos parâmetros estudados. As respostas de crescimento foram avaliadas ao longo do tempo em termos de mudanças na densidade óptica por um período de 26 dias. O desempenho do modelo matemático foi testado por ensaios não utilizados na construção do modelo e os resultados apresentados indicaram seu bom ajuste com 95,07% de concordância. Os ensaios que se mostraram mais eficazes no controle de Byssochlamys nívea e conseqüente extensão da vida de prateleira foram os preparados com ph 3 e estocados a 5 c. O Brasil tem um panorama promissor em relação à produção de sucos tropicais, desta forma, o modelo implementado auxiliará no controle e estabilidade microbiológica desses produtos. PALAVRAS CHAVE: Fungos termorresistentes, microbiologia preditiva, suco de frutas. PROBABILISTIC MODELING FOR GROWTH/ NO GROWTH OF Byssochlamys nívea AS A FUNCTION OF PH, STORAGE TEMPERATURE AND SOLUBLE SOLIDS CONCENTRATION ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 769

2 ABSTRACT Byssochlamys nívea is a thermal resistant fungus usually reported as damaging of tropical fruit juices. The ascospores of these fungi can survive commercial pasteurization applied to fruit juices, causing its deterioration, resulting in huge economic losses. Studies that generate alternative criteria to control the development of Byssochlamys nívea can be made with the application predictive microbiology. This work aimed to model, by probabilistic approach, the growth/no growth of Byssochlamys nívea in function of ph, soluble solids concentration and temperature of storage, in synthetic media pre-inoculated. The logistic regression model was generated from a full factorial applied to the parameters studied. The growth responses were assessed over time in terms of changes in optical density over a period of 26 days. The performance of the mathematical model was tested by trials not used in construction of the model and results presented indicated their good fit with 95.07% agreement. The tests that have proven most effective in controlling Byssochlamys nívea and consequent extension of shelf life were prepared at ph 3 and stored at 5 C. Brazil has a promising outlook for the tropical juices production, thus the model implemented will help in the control and microbiological stability of those products. KEYWORDS: Thermal resistant fungi, predictive microbiology, fruit juice. INTRODUÇÃO Segundo o Instituto Brasileiro de frutas a fruticultura brasileira vem se expandido nos últimos dez anos, com saldos positivos crescentes e impacto favorável na economia do país. O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, ficando atrás apenas da China e da Índia, sendo que cerca de 50% da produção é destinada ao mercado de frutas processadas e 47% ao mercado de frutas frescas (IBRAF, 2010). O estado do Espírito Santo se destaca em relação à produção de frutas, principalmente as tropicais como abacaxi, mamão, maracujá e goiaba. Com uma produção anual estimada em 1,28 milhão de toneladas, a fruticultura já ocupa a terceira colocação no agronegócio capixaba. Proporciona uma renda superior a R$ 500 milhões por ano e gera aproximadamente 200 mil empregos diretos e indiretos (ESPÍRITO SANTO, 2009) O processamento de frutas na forma de sucos ocupa papel relevante na indústria agrícola e está em constante crescimento, incentivando o aumento da produção e a qualidade das frutas. Estudos que busquem a melhoria da qualidade e durabilidade desses produtos são de vital importância diante de um mercado altamente competitivo e exigente. Os fungos filamentosos termorresistentes são importantes organismos deteriorantes e têm representado contínuo problema para a indústria de sucos e derivados de frutas. Seus ascósporos são capazes de resistir aos tratamentos térmicos normalmente aplicados a estes produtos. O uso de altas temperaturas ativa os ascósporos dormentes, que germinam e crescem no produto final, ocasionando a sua deterioração e, consequentemente, resultando em grandes perdas econômicas (BEUCHAT, 1986; TOURNAS & TRAXLER, 1994; KOTZEKIDOU, 1997). As espécies de fungos filamentosos termorresistentes mais importantes em processamento de frutas e hortaliças são Byssochlamys nívea, Byssochlamys fulva, ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 770

3 Neosartorya fischeri e Talaromyces flavus (MAGGI et al., 1994; TOURNAS, 1994). Os referidos fungos também são conhecidos pela produção de várias micotoxinas durante seu desenvolvimento nos produtos de frutas, o que representa grave problema de saúde pública (KING JUNIOR & WHITEHAND, 1990; PIECKOVÁ & JESENSKÁ, 1997). A microbiologia preditiva é uma importante ferramenta capaz de avaliar a probabilidade de um microrganismo crescer e se reproduzir em diferentes condições de temperatura, ph, atividade de água, entre outros. Modelos matemáticos são gerados à partir do estudo da cinética de crescimento microbiano, permitindo predizer a segurança microbiológica e a vida de prateleira de diferentes produtos sob condições comerciais. (ZWIETERING et al., 1991; WHITING, 1995; CHEROUTRE-VIALETE et al., 1998; GIANNUZZI et al., 1998). A utilização de tais modelos preditivos pode reduzir a necessidade de analises laboratoriais dispendiosas (DAVEY, 1994). Com a utilização da microbiologia preditiva é possível modelar mediante enfoque probabilístico a interface de crescimento/não-crescimento de fungos termorresistentes em sucos de frutas processados termicamente, auxiliando no controle e estabilidade microbiológica desses produtos. A modelagem probabilística enfoca a atenção abrangente entre crescimento e não crescimento microbiano e os modelos probabilísticos podem ser usados para definir as combinações das diferentes condições dos fatores envolvidos no processo (fatores ou barreiras) que influenciam na probabilidade do microrganismo crescer e se reproduzir (LOPEZ-MALO et al., 2000; LOPEZ-MALO & PALOU, 2000). Determinar essas combinações de fatores extrínsecos e do próprio alimento usando trabalho experimental laboratorial e modelagem/otimização, permite determinar novos critérios de processamento, visando obter um produto seguro onde os fungos, principalmente os termorresistentes como Byssochlamys nívea, usualmente relatado como deteriorador de sucos de frutas tropicais, sejam incapazes de se desenvolver, constituindo assim um novo processo que assegure ao alimento uma vida de prateleira estável. O objetivo desta pesquisa foi estudar a interface de crescimento/não crescimento do Byssochlamys nívea mediante enfoque probabilístico como função do efeito do ph, concentração de sólidos solúveis e temperatura de armazenamento. Preparo de suspensão de microrganismo METODOLOGIA O experimento foi conduzido no laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal do Espírito Santo. Uma cepa de esporos de Byssochlamys nívea cedida pelo laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal do Espírito Santo foi ativada em caldo nutriente por 24 horas a 33 C-35 C. Após esse período a cultura foi inoculada nos ensaios no nível de 10 3 UFC/mL. Desenho experimental Quatro diferente fatores foram estudados, ph (3, 4, 5 e 6), temperatura de estocagem (10, 17, 25 e 35ºC) e concentração de sólidos solúveis (10, 12, 15 e 20 ºBrix). Um planejamento fatorial completo foi aplicado aos fatores. A carga inicial de ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 771

4 células de Byssochlamys nívea inoculada em cada ensaio foi de aproximadamente 10 3 UFC/mL. Todos os ensaios do planejamento fatorial foram preparados em tubos de ensaio contendo caldo nutriente. O desenvolvimento microbiano foi verificado através do aumento da densidade populacional medindo a densidade óptica (DO) em um espectrofotômetro de bancada UV-VIS a 600 nm (MEMBRE et al., 2005). O crescimento microbiano foi acompanhado diariamente por até 26 dias. Avaliação do crescimento e não crescimento A densidade óptica dos ensaios foi medida diariamente e ao longo do tempo foram classificados como positivos para crescimento aqueles ensaios que apresentassem uma leitura de densidade óptica acima do valor medido no tempo zero (indicando aumento da turbidez) e negativo para crescimento aqueles que não apresentassem esse aumento. Este critério também foi usado por MEMBRE et al. (2005). As respostas de crescimento/ não crescimento obtidas nos diferentes ensaios foram ajustadas ao modelo de regressão logística que descreve a probabilidade de crescimento de microrganismos condicionados à combinações de diferentes fatores. O modelo de regressão logística descreve a probabilidade de um determinado evento Y ocorrer, condicionado a um vetor X. Segue o modelo de regressão logística (HOSMER & LEWESHOW, 2000). exp [ βixi P x) = ] 1+ exp[ βixi] ( (1) Onde P(x) é a probabilidade de crescimento ou não crescimento. A transformação logit de P(x) é definida como: p( x) Logit P) = g( x) = Ln = βixi 1 p( x) ( (2) O ph, concentração de sólidos solúveis, temperatura e tempo de incubação são as variáveis independentes, sendo a variável dependente a probabilidade de crescimento de Byssochlamys nívea. As respostas foram codificadas como 1 para crescimento e 0 para não crescimento sobre as condições avaliadas. Assim, o seguinte modelo logit (P) foi escolhido: (3) Onde β 0...β 6 são os coeficientes do modelo estimado para o ajuste dos dados experimentais com a probabilidade de 0,05, T= temperatura em C, C= concentração de sólidos solúveis e ph= potencial hidrogeniônico. Para tanto, foi utilizado o procedimento de regressão logística do programa SPSS 8.0. Depois de ajustado o modelo de regressão logística, predições de interface de crescimento/ não crescimento com a probabilidade de 0,05 foram realizadas. O valor de uma variável independente foi calculado mantendo as outras variáveis independentes fixas. Validação do modelo probabilístico O modelo encontrado foi validado estatisticamente pelo teste do qui-quadrado e testado frente a oito combinações diferentes daquelas utilizados no planejamento experimental. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 772

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO Crescimento microbiano Na Tabela 1 são apresentados os resultados do crescimento do Byssochlamys nívea em função dos parâmetros estudados. TABELA 1 - Resposta de crescimento do Byssochlamys nívea Ensaios ph T ( C) Brix R1 R2 Ensaios ph T ( C) Brix R1 R RI - Tempo de incubação em dias para ocorrer crescimento nos ensaios da primeira repetição. R2- Tempo de incubação em dias para ocorrer crescimento nos ensaios da segunda repetição. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 773

6 De acordo com os dados apresentados na Tabela 1 é possível observar que o ph, concentração de sólidos solúveis e temperatura de estocagem influenciaram na resposta de crescimento microbiano durante todo o período de estocagem das amostras. Segundo GIANNUZ et al. (1998), a temperatura no qual o meio de crescimento é submetido é o fator mais importante na resposta microbiana, uma vez que a velocidade máxima de crescimento e a fase lag são altamente dependentes desse parâmetro. Byssochlamys nívea é um fungo termorresistente mesófilo, sua temperatura ótima de crescimento se encontra entre 30 C e 37 C (TOURNAS, 1994; PITT & HOCKING, 1999, OLLIVER & RENDLE,1934). Neste estudo a mudança de temperatura influenciou fortemente na resposta microbiana, indicando que a baixas temperaturas o tempo de positividade das amostras foi maior do que em altas temperaturas. Assim, o crescimento de B. nívea pode ser controlado estocando os produtos em temperaturas reduzidas. O ph foi outra variável que se mostrou relevante na resposta microbiana. Os ensaios com maior ph (ph 6) obtiveram os menores tempos de estocagem quando comparados aos outros ensaios de menor ph submetidos a mesma temperatura, tal fato indica que o abaixamento de ph auxilia em prolongar a vida de prateleira. De acordo com TOURNAS (1989), espécies de Byssochlamys são capazes de se desenvolver em uma ampla faixa de ph crescendo em substratos com ph entre 2,0 e 9,0. A concentração de sólidos solúveis ( Brix) foi a va riável que influenciou de forma menos intensa na resposta microbiana. Os resultados deste estudo mostraram que ao se utilizar a maior concentração de sacarose testada (20%), o crescimento microbiano pôde ser retardado. A sacarose em altas concentrações é capaz de reduzir a água livre do meio, tornando-a indisponível para o crescimento microbiano, favorecendo a conservação dos alimentos. A aw mínima necessária varia para cada microrganismo e é influenciada por fatores do meio, ROLAND & BEUCHAT (1984) encontraram que a mínima aw para crescimento de B. nívea foi 0,89 a 30 C e 0,87 a 37 C. OBETA & UGWUANYI (1997) avaliaram o crescimento de Neosartorya sp. em ágar contendo sucos de manga, laranja e abacaxi. A adição de sacarose nas concentrações de 10% para o suco de abacaxi, 11,5% para o suco de laranja e 9% para o suco de manga aumentou o número de colônias. Entretanto, a adição de sacarose nas concentrações iguais ou superiores a 30 % para suco de abacaxi, 31,5% para suco de laranja e 29% para suco de manga, diminuíram o número de colônias produzidas. Ajuste do modelo probabilístico Utilizando os resultados de crescimento/não crescimento do Byssochlamys nívea foi ajustado um modelo de regressão logística para descrever a probabilidade de crescimento do fungo como resposta aos fatores estudados. As variáveis que se mostraram significativas são apresentadas na tabela 2. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 774

7 TABELA 1 - Variáveis significativas para o modelo probabilístico de Byssochlamys nívea Variável estimada Coeficiente Desvio padrão p-valor Constante -0,0624 0,0317 0,0490 Brix (C) 2,0072 0,2429 0,0000 ph -0,2968 0,0847 0,0005 Temperatura (T) 0,077 0,0407 0,0507 Tempo(t) 0,077 0,0162 0,0000 ph*t 0,0782 0,0071 0,0000 T*t -15,2811 1,549 0,0000 Todas as variáveis em estudos se mostraram significativas a um nível de probabilidade de 0,05. Como o efeito das interações ph*tempo e temperatura*tempo foram significativas, os efeitos principais devem ser interpretados conjuntamente. Assim, elevando a temperatura de 5,0 para 35ºC o tempo para observar o crescimento do microrganismo diminui de onze dias para um dia, para um ph de 6,0, mas essa diminuição foi mais pronunciada para um ph de 3,0 em que o tempo máximo para manter o fungo inibido passou de 26 dias para 5 dias aproximadamente. Os maiores tempos para manter o microrganismo inibido (26 dias aproximadamente) foram obtidos com o ph de 3,0 e uma temperatura de 5ºC. O modelo probabilístico implementado resultou na equação 4: A classificação da porcentagem ajustada pelo modelo mostrou que este foi capaz de prever corretamente a resposta microbiana em 95,07% dos ensaios, indicando seu bom ajuste aos dados (Tabela 3). Os casos de crescimento erroneamente preditos foram 10,09% de falsos positivos e 3,18% de falsos negativos. TABELA 2 - Porcentagem de dados corretamente preditos pelo modelo para Byssochlamys nívea Resposta Observada Não crescimento Crescimento % correto Não crescimento (0) ,91 Crescimento (1) ,82 Global 95,07 Com o modelo implementado foram realizadas predições para o cálculo do tempo de estocagem com probabilidade de 0,05, 0,1 e 0,5. Tais predições foram obtidas substituindo todos os termos da equação 4 deixando somente o tempo em evidência. Os dados são apresentados na tabela 4. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 775

8 TABELA 3 - Tempo de estocagem crítico em dias predito pelos modelos para ocorrência de crescimento de Byssochlamys nívea ºBrix Ph T( C) P t (dias) P t (dias) P t (dias) 11,5 3,5 15 0,05 5 0,1 5 0, ,5 15 0,05 5 0,1 5 0,5 7 11,5 4,5 15 0,05 2 0,1 3 0, ,5 15 0,05 2 0,1 3 0,5 5 11,5 5,5 15 0,05 <1 0,1 <1 0, ,5 15 0,05 <1 0,1 <1 0,5 2 11,5 3,5 20 0,05 4 0,1 4 0, ,5 20 0,05 4 0,1 4 0,5 5 11,5 4,5 20 0,05 1 0,1 2 0, ,5 20 0,05 1 0,1 2 0,5 3 11,5 5,5 20 0,05 <1 0,1 <1 0, ,5 20 0,05 <1 0,1 <1 0,5 1 11,5 3,5 30 0,05 2 0,1 3 0, ,5 30 0,05 2 0,1 3 0,5 4 11,5 4,5 30 0,05 1 0,1 1 0, ,5 30 0,05 1 0,1 1 0,5 2 11,5 5,5 30 0,05 <1 0,1 <1 0,5 <1 14 5,5 30 0,05 <1 0,1 <1 0,5 <1 Os tempos de estocagem até crescimento microbiano apresentados na tabela 4 revelam a importância de um modelo probabilístico na determinação da vida de prateleira de alimentos. Tal ferramenta de modelagem pode ser utilizada tanto para predizer a vida de prateleira e a segurança microbiológica de alimentos sob condições comerciais como também para auxiliar na redução da necessidade de análises laboratoriais dispendiosas e na geração de novos critérios de processamento. Existem hoje poucos estudos referentes à modelagem da interface de crescimento/não crescimento de Byssochlamys nívea em função de parâmetros extrínsecos e intrínsecos, no entanto, sabe-se a importância de realizar tais estudos mediante o fato desses microrganismos resistirem à pasteurização usualmente empregada em produtos de frutas, provocando a deterioração dos mesmos durante o período de estocagem. ZIMMERMANN (2008) estudou a influência da atividade de água e da idade de formação dos esporos para modelar o crescimento de Byssochlamys nívea e Byssochlamys fulva em sucos de frutas armazenados à 30 C. Os resultad os desse estudo mostraram que a idade não influencia o crescimento em praticamente nenhuma das condições testadas e que o fator aw foi estatisticamente significativo na grande maioria casos. Os resultados mostraram que ao aumentar a aw dos sucos de abacaxi e mamão de 0,90 para 0,99, a fase lag tende a diminuir para ambos os fungos. Estes dados são úteis para estabelecer a vida de prateleira de sucos prontos para beber, estocados a temperatura ambiente. PANAGOU (2010) modelou o efeito da temperatura e da atividade de água sobre a taxa de crescimento/não crescimento de Byssochlamys fulva e Byssochlamys nívea em meio sintético Ágar Extrato de Malte. Em seu estudo as temperaturas mínima, máxima e ótima para o crescimento de Byssochlamys nívea ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 776

9 foram de 10,5 C, 43,2 C e 32,1, já para os valores de aw mínimo, máximo e ótimo de crescimento foram respectivamente 0.892, e A figura 1 mostra o efeito do ph e da temperatura no tempo crítico de estocagem para inibir o crescimento do B. nívea. Observa-se que o microrganismo fica inibido por até 14 dias em baixas temperaturas e ph próximo de três. À medida que o ph e temperatura aumentam esse tempo crítico de não crescimento do microrganismo diminui. Observa-se também que um mesmo tempo crítico de estocagem pode ser mantido para várias combinações dos fatores. Estas informações podem ser de grande ajuda no controle do crescimento deste microrganismo ,1 d Temperatura (ºC) ,7 d 3,2 d 1,6 d 6,3 d 10 9,5 d 7,9 d 12,5 d 11,0 d 5 14 d 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 ph Figura1. Tempos críticos em dias (d) para inibição do crescimento do B. nívea em função do ph e temperatura. Validação do modelo implementado O modelo probabilístico da equação 4 foi verificado pela condução de 8 experimentos de combinações aleatórias de Brix, ph e temperatura (Tabela 5). TABELA 4 Comparativo entre os tempos (dias) para crescimento microbiano preditos pelo modelo e observados experimentalmente Brix ph T( C) Predito Observado* 14 5, , ,5 20 < , ,5 30 < , ,5 30 < , * Média de cinco observações ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 777

10 Todos os experimentos verificaram a validez do modelo indicando que as predições de crescimento ocorrem antes do observado experimentalmente. De acordo com os resultados apresentados na tabela 5 é possível observar que os tempos preditos pelo modelo para ocorrência de crescimento se aproximaram dos observados e que nenhuma previsão subestimou o crescimento microbiano, tal fato demonstra que o modelo é seguro e conservador. CONCLUSÕES As menores temperaturas de estocagem associadas a baixos valores de ph se mostraram eficazes em inibir significativamente o crescimento microbiano, sendo dessa forma as condições preferíveis para se estender a vida de prateleira de sucos tropicais contaminados por B. nívea. Os ensaios preparados com ph 3 e estocados a 5 C a presentaram os maiores tempos para manter esse microrganismo inibido (26 dias aproximadamente). A microbiologia preditiva é uma poderosa ferramenta que auxilia na prevenção da contaminação de alimentos. Modelos matemáticos podem ser aplicados para predizer o tempo de estocagem e a ocorrência de crescimento microbiano. O desenvolvimento, formulação e implementação de processos baseados em tecnologia de barreiras podem encontrar grandes benefícios na utilização prática de modelos probabilísticos para avaliar o efeito da combinação de fatores capazes de interferir o desenvolvimento microbiano. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BEUCHAT, L.R. Extraordinary heat resistance of Talaromyces flavus and Neosartorya fischeri ascospores in fruit products. Journal of Food Science, v.51, n.6, p , CHEROUTRE-VIALETE, M.; LEBERT, I.; HEBRAUD, M.; LABADIE, J.C.; LEBERT, A. Effects of ph or aw stress on growth of Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology, v.42, p DAVEY, K.R. Review Paper. Modeling the combined effect of temperature an ph on the rate coefficient for bacterial growth. International Journal of Food Microbiology, v.23, p , GIANNUZZI, L.; PINOTTI, A.; ZARITZKY, N. Mathematical modeling of microbial growth in packaged refrigerated beef stored at different temperatures. International Journal of Food Microbiology, v.39, p , GOVERNO DO ESPÍRITO SANTO. Produção de frutas no Estado migra para áreas de cultivo não tradicionais. [online], Disponível em: < Acesso em: 29 de abril ENCICLOPÉDIA BIOSFERA, Centro Científico Conhecer - Goiânia, vol.7, N.13; 2011 Pág. 778

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