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1 Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation System For the identification of Chlamydia in cell culture by direct fluorescence. For in vitro diagnostic use 0197 Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/ Léxico/Leksikon/Ordlista... page 3 English... page 5 Français... page 15 Español... page 27 Deutsch... page 39 Italiano... page 51 Português... page 63 Dansk... page 75 Svenska... page 86 References/Bibliographie/Referencias/Literatur/ Bibliografia/Bibliografia/Referencer/Referenser... page 97 FOR REFERENCE USE ONLY: DO NOT USE in place of package inserts provided with each test kit.

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3 Lexicon/Lexique/Glosario/Glossar/Definizione dei simboli/léxico/leksikon/ordlista English Français Español Deutsch Italiano Português Dansk Svenska European Conformity Conformité aux normes européennes Conformidad europea CE-Konformitätskennzeichnung Conformità europea Conformidade com as normas europeias Europæis k overensstemmelse Use by Utiliser avant le For In Vitro Diagnostic Use Dispositif médical de diagnostic in vitro Fecha de caducidad Para uso diagnóstico in vitro Batch code Code du lot Código de lote Europeisk överensstämmelse Verwendbar bis För in vitrodiagnostik Chargenbezeichnung Utilizzare entro il In-vitro- Diagnostikum Per uso diagnostico in vitro Codice del lotto Manufacturer Fabricant Fabricante Hersteller Fabbricante Utilizar até Holdbar til Använd före Para utilização no diagnóstico in vitro Código do lote Medicinsk udstyr til in vitrodiagnostik Lotnummer Partinummer Fabricante Producent Tillverkare

4 English Français Español Deutsch Italiano Português Dansk Svenska Consult Instructions for Use Consulter les instructions d utilisation Consulte las instrucciones de uso Gebrauchsanweisung beachten Consultare le istruzioni per l'uso Consulte as instruções de utilização Se brugsanvisning Temperature Limitation Limites de température Límites de temperatura Xn. Harmful Xn. Nocif Xn. Nocivo Xn. Gesundheitsschädlich Authorized Representative in the European Community Monoclonal Antibody Représentant agréé dans la Communauté Européenne Anticorps monoclonal Representante autorizado en la Comunidad Europea Anticuerpo monoclonal Bevollmächtigter in der Europäischen Union Monoklonaler - Antikörper Limite de temperatura Xn. Nocivo Xn. Nocivo Xn. Sundhedsskad elig Mandatario autorizzato per l'unione Europea Representante autorizado na Comunidade Europeia Anticorpo Monoclonal Se bruksanvisningen Zulässiger Temperaturbereich Limiti di temperatura Temperaturbegrænsning Temperaturbegränsning Xn. Hälsoskadligt Repræsen tant i det Europæis ke Fællesskab Auktoriserad representant i Europeiska gemenskap en Anticorpo monoclonale Monoklonalt antistof Monoklonal antikropp

5 INTENDED USE The Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation Assay is a direct fluorescent procedure for the identification of chlamydia in cell culture. SUMMARY AND EXPLANATION Chlamydia organisms are the suspected causative agents in a wide variety of health problems. Two species of Chlamydia have been identified: Chlamydia trachomatis and Chlamydia psittaci. Chlamydia psittaci mainly infects birds, however humans can develop diseases such as pneumonia or a generalized systemic infection due to exposure to infected species. Chlamydia trachomatis generally infects only humans. The clinical syndromes most often associated with Chlamydia trachomatis include inclusion conjunctivitis; trachoma; urethritis, cervicitis and other urogenital disorders; and lymphogranuloma venereum (LGV) (1). Transmission of Chlamydia trachomatis may occur via sexual contact with an infected person, passage of a fetus through an infected birth canal, or as in the case of trachoma in developing countries, primarily through non-sexual personto-person contact (2). Chlamydia trachomatis is currently recognized as the leading cause of sexually transmitted disease. Unfortunately many infected individuals remain asymptomatic allowing the organism to go undetected (3). In women, undiagnosed genital infections may lead to permanent reproductive damage due to complications such as salpingitis or pelvic inflammatory disease (4,5). Chlamydia trachomatis is also the causative agent of trachoma, the world s leading cause of preventable blindness (6). Early diagnosis of these chlamydial infections can lead to timely treatment of the disease, thereby reducing the possibility of complications and the risk of further transmission. Early methods of chlamydia isolation included growth in mice or chick embryo yolk sacs. As tissue culture methods improved, they replaced these more cumbersome techniques (7,8). The use of immunofluorescence and monoclonal antibody technology to detect organisms in tissue culture has further increased the sensitivity of chlamydia culture and reduced the need to perform passage on all specimens (9). The Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation System uses a fluorescein-conjugated monoclonal antibody to identify chlamydial inclusions in inoculated cell cultures. This assay combines the specificity and reproducibility of monoclonal antibodies with the speed and simplicity of a direct fluorescent test. For the detection of chlamydial organisms in culture, this test offers a simple, sensitive alternative to other culture stains. PRINCIPLES OF THE PROCEDURE This test uses a fluorescein-conjugated monoclonal antibody to identify chlamydia in culture. The antibody reacts with the lipopolysaccharide portion of the elementary bodies and reticulate bodies within the inclusion. 5

6 This assay will detect all known serovars of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, and Chlamydia pneumoniae. It will not differentiate between species or serovars. The monoclonal antibody reacts with chlamydial antigens, if present, in the cell culture. A washing step removes unbound antibody. When viewed under the fluorescent microscope, cell culture specimens infected with chlamydia show a characteristic apple-green fluorescence of inclusions against a red counterstained background. KIT REAGENT For In Vitro Diagnostic Use. Store the Antibody at 2-8ºC. The Monoclonal Antibody is stable to the expiration date stated on the label, when stored as recommended. Once open, the Monoclonal Antibody is stable to the expiration stated on the label, when stored as recommended. 1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody The vial contains 4.2 ml of fluorescein-conjugated murine monoclonal antibody to chlamydia (genus-specific) with a protein stabilizer, Evans' blue counterstain, and 0.1% sodium azide. The liquid antibody is at the working dilution. Diluting the antibody will reduce the sensitivity of the test. Signs of possible deterioration are: Increased green background on control specimens. Change in expected reactivity with positive and negative controls. WARNINGS AND PRECAUTIONS For Professional Use Only Reagents Containing Sodium Azide The reagent contains 0.1% sodium azide. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal of liquids, flush with a large volume of water to prevent azide buildup. For further information, please refer to the Manual Guide issued by the Centers for Disease Control (10). Xn. Harmful R: 21/22 Harmful in contact with skin and if swallowed. S: 24/ /37/39 Avoid contact with skin and eyes. After contact with skin, wash immediately with plenty of water. Wear suitable protective clothing, gloves and eye/face protection. 6

7 Patient Specimens When collecting and processing patient specimens, handle them as potentially infectious according to universal precautions and good clinical laboratory practices, regardless of their origin, treatment, or prior certification. Use an appropriate disinfectant for decontamination. Store and dispose of these materials and their containers in accordance with local regulations and guidelines. SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Specimen collection is a critical step in the detection of chlamydia (11). Personnel collecting chlamydia specimens should be well-trained to minimize the possibility of inadequate specimens. A recommended procedure for collecting cervical and male urethral specimens follows. CAUTION: Follow routine biosafety procedures when collecting and processing specimens for chlamydia testing. Consider specimens and all materials they contact as potentially infectious, and dispose of them in an appropriate manner. Do not pipette by mouth. Avoid generation of aerosols. See Reference 12 for more information on the prevention of laboratory infections. Specimen Collection (cervical and male urethral specimens) Materials Required 1. Large swab to clean exocervix of female prior to endocervical sampling. 2. Sterile Swabs Use swabs which do not inhibit the growth of chlamydia or cells in culture. 3. Transport Medium Use transport medium which does not inhibit the growth of chlamydia or cells in culture. Procedure for Collection of Specimens 1. Urethral Specimens NOTE: For an accurate diagnosis, the specimen must contain epithelial cells from the lining of the urethra. These cells are the most susceptible to infection by chlamydia. (The exudate is not an appropriate specimen for laboratory testing of chlamydia.) (13) Instruct the patient to refrain from urinating for 1 hour prior to sampling. a. Insert small swab 2-4 cm into the urethra. (Rotate swab slightly to aid in insertion.) b. Gently rotate swab using enough pressure to obtain epithelial cells. c. Allow swab to remain inserted for 1-2 seconds. d. Withdraw swab, immediately place into transport medium and send to the laboratory. Store specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For longer storage, freeze at -70ºC until inoculated into culture. 7

8 2. Cervical Specimens NOTE: The columnar epithelial cells of the cervical mucosa are most susceptible to infection by the chlamydia (13). These columnar epithelial cells are located just inside the cervical opening. In some cases, the location of the transitional zone, where the stratified epithelium ends and the columnar epithelium begins, may vary (14). Adhering to the following procedure will ensure that specimens are adequate and appropriate. a. Use a large swab to remove excess mucus and exudate from the exocervix. Dispose of swab. b. Insert sterile swab into endocervical canal about 1 to 1-1/2 cm until most of the tip is inside the cervical opening. c. Rotate swab for 5-10 seconds using enough pressure to obtain cells from all surfaces of the endocervical canal. d. Withdraw swab avoiding contact with vaginal surfaces. Immediately place into transport medium and send to the laboratory. Store specimen at 2-8ºC for up to 24 hours. For longer storage freeze at -70ºC until inoculated into cell culture. Processing of Cell Culture Specimens Materials Required 1. Cell culture line: Use a cell culture line susceptible to chlamydia - e.g.: McCoy cells. NOTE: The choice and condition of the cell culture line can influence the sensitivity of chlamydia detection by the culture confirmation technique. 2. Cell culture controls: Negative Control - cell culture inoculated with transport medium. Positive Control - cell culture inoculated with a sample known to be positive for chlamydia. 3. Other supplies and equipment for cell culture: Culture media, culture vials or microtiter plates, centrifuge, CO 2 incubator, etc. Cell Culture Procedure 1. Following an established method, inoculate specimen onto appropriate cell monolayer. 2. Incubate monolayer for 48 hours. 3. If desired, pass monolayer and incubate for an additional 48 hours. 8

9 ASSAY PROCEDURE Materials Provided 1. Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody Materials Required, But Not Provided 1. Methanol fixative - Histological grade or ACS 2. Deionized water 3. Pathfinder Mounting Medium - Bio-Rad Cat. No Microtiter plate cover and coverslips (5 mm round), or clean glass microscope slides, and forceps (depending on culture technique) 5. Sterile pipets 6. Humidified chamber 7. Fluorescent microscope - To view specimens stained with fluorescein isothiocyanate, use a filter system which provides an excitation wavelength of nm and an emission wavelength of 510 nm or greater. The type and condition of microscope filters and light source can affect the intensity of the fluorescent reaction. Procedure for Fluorescent Staining of Cell Culture A. Microtiter Plate Technique 1. Fixing the cell monolayer a. Carefully aspirate culture medium from each well. b. Add enough methanol to cover the monolayer in each well. Allow to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC). c. Aspirate the liquid from each well with a pipet, or invert and blot the plate onto an absorbent paper to remove the methanol. Stain immediately. If staining is not performed immediately, store the plates at -70ºC. 2. Staining the cell monolayer NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water before staining. (Invert the plate and blot to remove excess liquid.) a. Add 1 drop (approximately 30 µl) of the Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody to each well. The antibody must completely cover the monolayer. b. Cover the plate and incubate at room temperature (23ºC ± 3ºC) for 30 minutes. Protect the plate from intense light during incubation. c. Uncover the plate and remove Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody from each well by aspirating the liquid with a pipet, or by inverting and blotting the plate onto an absorbent paper. Rinse with deionized water to remove residual anti- 9

10 body. Invert and blot plate onto absorbent paper to remove excess water. d. Add 1 drop of mounting medium to each well and apply coverslips. NOTE: Use only Pathfinder Mounting Medium - Bio-Rad Cat. No Invert the microtiter plate and examine the wells through a fluorescent microscope with a long focal length objective. Look at entire monolayer using a minimum magnification of 100X. If inclusion appears questionable, confirm at a higher magnification. If necessary, store the microtiter plates in the dark at 4ºC and read them within 24 hours. B. Shell Vial Technique 1. Fixing the cell monolayer a. Carefully aspirate culture medium from each vial. b. Add enough methanol to cover the monolayer in each vial. Allow to fix for 10 minutes at room temperature (23ºC ± 3ºC). c. Remove methanol by aspirating with a pipet. If staining is not performed immediately, store the vials at -70ºC. 2. Staining the cell monolayer a. Using forceps, carefully remove the coverslip with the monolayer from the vial and place on an appropriately labeled, clean glass slide with the cells facing up. Stain immediately. NOTE: If cells are dry, moisten with deionized water. (Remove excess liquid.) b. Add 1 drop (approximately 30 µl) of the Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody to the monolayer. The antibody must completely cover the monolayer. c. Incubate in a humidified chamber at room temperature (23ºC ± 3ºC) for 30 minutes. Protect the coverslips from intense light during incubation. d. Rinse coverslip with deionized water to remove residual antibody. (Blot excess water.) e. Place one drop of mounting medium on another appropriately labeled, clean glass slide. Apply the coverslip carefully to avoid trapping air bubbles, with the monolayer of cells facing down. 10

11 3. Examine the slides through a fluorescent microscope. Scan entire monolayer using a minimum total magnification of 100X. If inclusions look questionable, confirm at a higher magnification. If necessary, store the slides in the dark at 4ºC and read them within 24 hours. NOTE: Use only Pathfinder Mounting Medium - Bio-Rad Cat. No QUALITY CONTROL To verify the performance of the culture system, the fluorescent procedure, and the microscope, include positive and negative cell culture controls with each batch of patient cultures. INTERPRETATION OF RESULTS Read control specimens first. Cell culture controls aid in interpretation of results by showing positive and negative reactions on the cell line used for patient specimens. If controls exhibit proper reactivity, interpret patient specimens. Repeat test if controls do not react properly. Descriptions of positive and negative results follow. Positive Results A positive control or patient sample will exhibit characteristic fluorescence of cytoplasmic inclusions which will be visible at 100X magnification. The inclusion appears as a well-defined, apple-green, fluorescent mass, located in the cytoplasm of the infected cell near the nucleus. The presence of one or more inclusions per culture is considered positive. Uninfected cells and the background of infected cells stain red due to counterstain. Non-specific staining can be distinguished by a yellow, white or dull-green color rather than the expected apple-green. Negative Results A negative sample will display no specific apple-green fluorescence. All cells stain red due to counterstain. Non-specific staining is minimal. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE 1. If antibody dries on the monolayer, visualization of the inclusion may be difficult. 2. The performance of this test on patient specimens collected during antimicrobial therapy is unknown. 3. For the detection of chlamydia, proper specimen collection is critical. Personnel collecting specimens should be well trained to minimize inadequate and inappropriate specimens. 4. Use of the Chlamydia Culture Confirmation Monoclonal Antibody on direct clinical specimens is not recommended. (Bio-Rad has a Chlamydia Direct Specimen Kit available - Cat. No ) 11

12 EXPECTED VALUES Expected values may vary depending on the population tested. Bio-Rad evaluated 402 specimens from patients in high and low risk populations with the Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation Test and the MicroTrak Culture Confirmation Test. Any discrepancies remaining after passage were resolved with Ortho Diagnostics' Chlamydia Cell Culture Assay. The overall agreement between the tests was 99.5% on initial culture and 100.0% after passage. Only 1 specimen testing negative on initial culture was positive after passage. When compared to the competitor tests, both the sensitivity and specificity of this test after primary and passage culture were 100.0%. (See Specific Performance Characteristics Section for details.) SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS Three independent laboratories evaluated the ability of the Pathfinder reagents to detect chlamydia in cell culture. The independent study sites included laboratories in the East, South and West. Syva's MicroTrak Culture Confirmation Test was used as the reference method and Ortho Diagnostics' kit was used to resolve any discrepancies after passage. The investigators collected one endocervical or urethral swab from each patient, and placed it into transport medium for inoculation into culture. Two of the investigators inoculated 5 McCoy cell monolayers for each patient. After incubating the cultures for 48 hours, they stained 2 of those monolayers, one with the Pathfinder reagent and one with the MicroTrak reagent. For those cultures with negative or discrepant results on the primary culture, the remaining 3 cultures were disrupted and passed onto another 3 monolayers. After the next 48 hour incubation, the investigators again stained 2 of these monolayers, one with the Pathfinder reagent and the other with the MicroTrak reagent. When necessary the remaining passage culture was tested with Ortho's reagent to resolve any discrepancies. The third investigator inoculated 3 monolayers per patient and proceeded as above with the exception that, when necessary, the remaining initial monolayer was disrupted and passed onto another 3 monolayers. Cultures with 1 or more inclusions present after primary incubation, or after disruption and passage, were considered positive. Investigators collected specimens from 2 populations - high risk and low risk. The high risk population included males and females attending sexually transmitted disease clinics who presented with urogenital symptoms or who were asymptomatic contacts of persons with a sexually transmitted disease. The overall prevalence of chlamydia in this population was 23.5%. The low risk population included females who were visiting clinics for routine obstetric or gynecological exams, or who met the following criteria: 1) over the age of 25; 2) no sign of purulent cervical discharge, cervical ectopy or cervical friability; and 3) no contact with a sexually transmitted 12

13 disease syndrome or pathogen. The overall prevalence of chlamydia in this population was 10.0% The performance characteristics of the Pathfinder Culture Confirmation Test compared to the competitor assays after primary and passage culture are detailed in Table 1. Table 1 - Comparison of Pathfinder Culture Confirmation Test to Competitor Assays after Primary and Passage Culture Sensitivity Specificity Positive Predictive Value Negative Predictive Value High Risk Population Low Risk Population Cumlative (High and Low Risk Population) n TP TP + FN TN TN + FP TP TP + FP 100.0% 100.0% 100.0% TN 231 TN + FN 100.0% % 100.0% 100.0% 100.0% NOTE: TP = true positive, FP = false positive, FN = false negative, TN = true negative. Table 2 summarizes the data comparing the Pathfinder Culture Confirmation Reagent to the MicroTrak Reagent after primary culture only % 100.0% 100.0% Table 2 - Comparison of the Pathfinder Culture Confirmation Reagent to the MicroTrak Assay after Primary Culture Only High Risk Population Low Risk Population 100.0% Cumlative (High and Low Risk Population) Sensitivity Specificity Positive Predictive Value Negative Predictive Value n TP TP + FN TN TN + FP TP TP + FP 100.0% 99.6% 98.6% * * 70 TN 232 TN + FN 100.0% % 98.9% 90.0% 100.0% * Two specimens positive on primary culture by the Pathfinder test and negative by the MicroTrak test were positive by either the MicroTrak or Ortho method on passage. When considering these specimens true positives, the specificity and positive predictive value for the high risk, low risk, and cumulative populations become 100% * 91 9* % 99.4% 97.5% 100.0% * *

14 The performance characteristics for the high risk male and female populations were comparable. Table 3 details the numbers of positive results after primary culture and after primary culture and passage. The Pathfinder reagent detected 2.5% more positive results on primary culture than the MicroTrak reagent. Use of the Pathfinder assay on a passage culture resulted in 1.2% more positive results than a primary culture alone. Table 3 - Chlamydia Detection on Primary Culture and After Primary Passage Culture Primary Culture Passage Culture Positives by Pathfinder Positives by MicroTrak CROSS-REACTIVITY Bio-Rad tested the organisms in Table 4 for possible cross-reactivity in the Pathfinder Chlamydia Culture Confirmation Assay. The organisms listed were tested on fixed substrate slides and showed no cross-reactivity with the Pathfinder Monoclonal Antibody. Table 4 - Cross-Reactivity Studies with Potential Cell Culture Contaminants Organism Reactivity with the Chlamydia Culture Confirmation Antibody Herpes viruses Cytomegalovirus Herpes simplex Type I Herpes simplex Type II Varicella zoster Virus Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative Negative 14

15 Pathfinder Chlamydia Système de Confirmation sur Culture Pour l identification de Chlamydia dans les cultures cellulaires par fluorescence directe. DOMAINE D APPLICATION Le Pathfinder Chlamydia système de confirmation sur culture est un test d identification de Chlamydia dans les cultures cellulaires par fluorescence directe. RESUME ET EXPLICATION Le Chlamydia est un organisme pouvant être soupçonné d être l agent causal d un vaste éventail de problèmes de santé. Deux espèces de Chlamydia ont été identifiées : Chlamydia trachomatis et Chlamydia psittaci. Cette dernière espèce de Chlamydia infecte principalement les oiseaux, toutefois les humains peuvent développer des maladies telles que la pneumonie ou une infection généralisée suite à une exposition à une espèce aviaire infectée. Chlamydia trachomatis n infecte généralement que l homme. Les syndromes cliniques les plus fréquemment associés à une infection à Chlamydia trachomatis comprennent la conjonctivite à inclusions; le trachome; l urétrite; la cervicite et d autres troubles des voies uro-génitales; et le lymphogranulome vénérien (LGV) (1). Chlamydia trachomatis peut se transmettre par contact sexuel avec une personne infectée, par passage au fœtus lors de l accouchement, ou dans le cas du trachome dans les pays en développement, principalement par contact non sexuel entre deux personnes (2). Chlamydia trachomatis est actuellement reconnu comme étant la première cause de maladie sexuellement transmissible. Malheureusement, de nombreux individus infectés restent asymptomatiques, ce qui permet à l organisme de passer inaperçu (3). Chez la femme, les infections génitales non diagnostiquées peuvent compromettre de façon définitive les capacités reproductrices en raison de complications telles que la salpingite ou la pelvipéritonite (4,5). Chlamydia trachomatis est également l agent causal du trachome, la première cause de cécité dans le monde, une cécité qu il est possible de prévenir (6). Le diagnostic précoce de ces infections à 15

16 Chlamydia peut permettre de traiter la maladie à temps, ce qui réduit le risque de complications et de transmission future. Les premières méthodes d isolement du Chlamydia reposaient sur la culture dans des vésicules vitellines d embryons de souris ou de poule. Avec l amélioration des méthodes de culture tissulaire, ces dernières ont remplacé les techniques antérieures, moins commodes (7,8). L utilisation de la technologie de l immunofluorescence et des anticorps monoclonaux dans la détection des organismes dans les cultures de tissu a encore amélioré la sensibilité des tests du Chlamydia et réduit le besoin de réaliser un passage sur tous les échantillons (9). Le Système Pathfinder fait appel à un anticorps monoclonal conjugué à la fluorescéine pour identifier les inclusions chlamydiales dans des cellules en culture inoculées avec des échantillons potentiellement infectés. Ce test allie la spécificité et la reproductibilité des anticorps monoclonaux à la rapidité et la simplicité d un test par fluorescence directe. Pour la détection du Chlamydia dans les cultures de cellules, ce test offre une alternative simple et sensible à d autres méthodes de coloration. PRINCIPES DE LA METHODE Ce test utilise un anticorps monoclonal conjugué à la fluorescéine dans le but d identifier le Chlamydia dans des cultures cellulaires. L anticorps réagit avec le fragment lipopolysaccharidique des corps d inclusion et des corps réticulés qui sont présents dans les inclusions. Ce test détecte tous les sérovars connus de Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci et Chlamydia pneumoniae. Il ne fait pas la différence entre les espèces ou les sérovars. Le cas échéant, l anticorps monoclonal réagit avec les antigènes chlamydiens qui sont présents dans la culture cellulaire. Une étape de rinçage permet d éliminer l anticorps non lié. Visualisés au microscope à fluorescence, les échantillons de culture cellulaire infectés par le Chlamydia présentent une fluorescence vert pomme caractéristique des inclusions, sur un fond contre-coloré en rouge. TROUSSE DE REACTIFS Pour usage diagnostique in vitro. Conserver l anticorps entre 2 C et 8 C. Quand il est stocké conformément aux recommandations, l Anticorps Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette. Une fois ouvert, quand il est stocké conformément aux recommandations, l Anticorps Monoclonal est stable jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette. 16

17 1. Anticorps Monoclonal pour confirmation de la présence de Chlamydia dans les cultures cellulaires Le flacon contient 4,2 ml d une solution d anticorps monoclonal murin anti-chlamydia (spécifique du genre) conjugué à la fluorescéine. La solution contient en outre un agent stabilisant les protéines, un contrecolorant Bleu Evans, et 0.1% d azoture de sodium. La solution d anticorps est prête à l emploi. Toute dilution supplémentaire réduirait la sensibilité du test. Les signes d une détérioration possible du produit sont les suivants : Intensification du fond vert des échantillons témoins. Altération de la réactivité nominale des témoins positifs et négatifs. MISES EN GARDE ET PRECAUTIONS D EMPLOI Réservé à un usage professionnel uniquement Réactifs contenant de l azoture de sodium Le réactif contient 0,1% d azoture de sodium. L azoture de sodium est susceptible de réagir avec le plomb et le cuivre des canalisations et former ainsi des azotures métalliques hautement explosifs. Lors de la mise au rebut des liquides, rincer abondamment à l eau afin d éviter l accumulation d azotures. Pour de plus amples informations, se référer au Manuel édité par les CDC (Centers for Disease Control) (10). Xn. Nocif R: 21/22 Nocif en cas de contact avec la peau et par ingestion. S: 24/ /37/39 Éviter le contact avec la peau et les yeux. Après contact avec la peau, se laver immédiatement et abondamment avec de l'eau. Porter un vêtement de protection approprié, des gants et un appareil de protection des yeux/du visage. Échantillons patients Lors du recueil et du traitement des échantillons patients, ces produits doivent être considérés comme potentiellement infectieux et donc manipulés en respectant les précautions d'usage et les bonnes pratiques du laboratoire clinique, quels que soient leur origine, leur traitement ou leur certification antérieur. Utiliser un désinfectant approprié pour la décontamination. Ces produits et leurs récipients doivent être stockés et mis au rebut conformément à la législation et aux directives en vigueur. RECUEIL ET PREPARATION DES SPECIMENS Le recueil des échantillons est une étape critique pour la détection du Chlamydia (11). Le personnel procédant au recueil des échantillons doit être pleinement qualifié afin de minimiser le risque de prélever des échantillons insuffisants ou inadéquats. Une procédure recommandée pour le prélèvement des échantillons du col utérin et de l urètre chez l homme est décrite ci-dessous. 17

18 ATTENTION : Suivre les règles de sécurité biologique habituelles lors du recueil et du traitement des échantillons destinés à la détection de Chlamydia. Considérer les échantillons et tous les matériels avec lesquels ils entrent en contact comme potentiellement infectieux, et les mettre au rebut suivant les procédures établies. Ne pas pipeter à la bouche. Eviter la production d aérosols. Consulter la référence 12 pour de plus amples informations sur la prévention des infections au laboratoire. Recueil des échantillons (échantillons du col utérin et de l urètre masculin) Matériels requis 1. Tampon de grande taille destiné à nettoyer l exocol avant le prélèvement d un échantillon endocervical. 2. Tampons stériles Utiliser des tampons qui n inhibent pas la prolifération du Chlamydia ou des cellules en culture. 3. Milieu de transport Utiliser un milieu de culture qui n inhibe pas la prolifération du Chlamydia ou des cellules en culture. Recueil des échantillons : mode opératoire 1. Échantillons urétraux REMARQUE : Pour un diagnostic précis, l échantillon doit contenir des cellules épithéliales provenant de la muqueuse de l urètre. Ces cellules sont les plus sensibles à l infection par le Chlamydia. (L exsudat ne constitue par un échantillon approprié pour le test du Chlamydia en laboratoire.) (13) Donner pour instruction au patient de s abstenir d uriner pendant l heure qui précède le prélèvement. a. Insérer un petit tampon à l intérieur de l urètre, à une profondeur de 2 à 4 cm. (L insertion sera facilitée en imprimant un léger mouvement de rotation au tampon.) b. Imprimer un mouvement de rotation au tampon en exerçant une pression suffisante pour obtenir des cellules épithéliales. c. Laisser le tampon en place pendant 1 à 2 secondes. d. Retirer le tampon, le placer immédiatement dans le milieu de transport et l envoyer au laboratoire. L échantillon peut être conservé à 2-8 C pendant 24 heures maximum. Pour une conservation plus longue, congeler à 70 C jusqu à l inoculation. 2. Échantillons cervicaux REMARQUE : Les cellules épithéliales cylindriques de la muqueuse cervicale sont les plus sensibles à l infection par le Chlamydia (13). Ces cellules cylindriques se situent juste à l intérieur de l orifice du col. 18

19 La situation de la zone de transition, où se termine l épithélium stratifié et commence l épithélium cylindrique, peut varier dans certains cas (14). Le respect de la procédure suivante garantira que les échantillons sont suffisants et appropriés. a. A l aide d un tampon de grande taille, débarrasser l exocol de l excès de mucus et d exsudat. Mettre le tampon au rebut. b. Insérer un tampon stérile dans le canal endocervical, sur une profondeur d environ 1 à 1,5 cm jusqu à ce que la majeure partie du tampon ait franchi l orifice du col. c. Imprimer une rotation au tampon pendant 5 à 10 secondes en exerçant suffisamment de pression pour obtenir des cellules provenant de toutes les faces du canal endocervical. d. Retirer le tampon en évitant tout contact avec les muqueuses vaginales. Placer immédiatement dans le milieu de transport et envoyer au laboratoire. L échantillon peut être conservé à 2-8 C pendant 24 heures maximum. Pour une conservation plus longue, congeler l échantillon à 70 C jusqu à son inoculation dans la culture cellulaire. Traitement des échantillons en vue de la culture cellulaire Matériels requis 1. Lignée de cellules Utiliser une lignée de cellules sensible au Chlamydia par exemple, des cellules McCoy. REMARQUE : Le choix et l état des cellules de culture peuvent influencer la sensibilité de la technique de détection du Chlamydia par culture de confirmation. 2. Cultures cellulaires témoins Témoin négatif cellules inoculées avec le milieu de transport seul Témoin positif cellules inoculées avec un échantillon positif pour le Chlamydia. 3. Autres fournitures et équipements de culture cellulaire Milieux de culture, flacons, plaques de microtitration, centrifugeuse, incubateur à atmosphère contrôlée en CO 2, etc. Procédure de mise en culture 1. Suivant une méthode établie, inoculer l échantillon sur une couche de cellules confluentes. 2. Incuber la couche monocellulaire pendant 48 heures. 3. Si désiré, réaliser un passage et incuber pendant 48 heures de plus. 19

20 PROCEDURE DE TEST Matériels fournis 1. Anticorps monoclonal anti-chlamydia Matériels requis mais non fournis 1. Fixateur : méthanol de qualité histologique ou analytique 2. Eau désionisée 3. Milieu de montage Pathfinder N de catalogue Bio-Rad : Plaque de microtitration pour microscopie avec lamelles adaptées (diamètre 5 mm), ou lames de microscope en verre et pinces (selon la technique de culture utilisée) 5. Pipettes stériles 6. Chambre d humidification 7. Microscope à fluorescence Pour visualiser les échantillons colorés à l isothiocyanate de fluorescéine, utiliser un système de filtres qui donne une longueur d onde d excitation de nm et une longueur d onde d émission égale ou supérieure à 510 nm. Le type et l état des filtres et de la source lumineuse peuvent affecter l intensité de la réaction fluorescente. Procédure de coloration fluorescente de la culture cellulaire A. Technique de culture sur plaque de microtitration 1. Fixation de la couche de cellules a. Aspirer avec précaution le milieu de chaque puits. b. Ajouter suffisamment de méthanol pour couvrir la couche monocellulaire dans chaque puits. Fixer pendant 10 minutes à température ambiante (23 C ± 3 C). c. Aspirer le liquide de chaque puits à l aide d une pipette, ou renverser la plaque et l éponger sur un papier absorbant afin d éliminer le méthanol. Colorer immédiatement. Si la coloration n est pas réalisée immédiatement, conserver les plaques à 70 C. 2. Coloration de la couche monocellulaire REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter à l eau désionisée avant la coloration. (Renverser la plaque et éponger afin d éliminer l excès de liquide.) a. Déposer 1 goutte (environ 30 µl) d anticorps monoclonal anti- Chlamydia dans chaque puits. La solution d anticorps doit recouvrir la totalité de la couche monocellulaire. b. Couvrir la plaque et incuber à température ambiante (23 C ± 3 C) pendant 30 minutes. Protéger la plaque de la lumière intense durant l incubation. 20

21 c. Découvrir la plaque et éliminer l anticorps monoclonal des puits en aspirant le liquide à la pipette, ou en renversant la plaque et en l épongeant sur du papier absorbant. Rincer à l eau désionisée afin d éliminer les anticorps résiduels. Renverser la plaque et éponger sur du papier absorbant afin d éliminer l excès d eau. d. Déposer 1 goutte de milieu de montage dans chaque puits et recouvrir d une lamelle. REMARQUE : Utiliser uniquement le milieu de montage Pathfinder, N de catalogue Bio-Rad Inverser la plaque de microtitration et examiner les puits au microscope à fluorescence à l aide d un objectif à longue focale. Examiner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement minimum de 100 X. Si la présence de corps d inclusion est douteuse, confirmer à un grossissement plus fort. Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être conservées à l obscurité à 4 C. Elles doivent toutefois être examinées dans les 24 heures qui suivent. B. Technique de culture en flacon 1. Fixation de la couche monocellulaire a. Aspirer avec précaution le milieu de culture dans chaque flacon. b. Ajouter dans chaque flacon une quantité suffisante de méthanol pour couvrir la couche de cellules. Fixer pendant 10 minutes à température ambiante (23 C ± 3 C). c. Eliminer le méthanol par aspiration à la pipette. Si la coloration n est pas réalisée immédiatement, conserver les flacons à 70 C. 2. Coloration de la couche monocellulaire a. A l aide de pinces, retirer avec précaution la lamelle portant la couche de cellules confluentes du flacon et la déposer sur une lame de verre propre, convenablement étiquetée, les cellules étant dirigées vers le haut. Colorer immédiatement. REMARQUE : Si les cellules sont sèches, humecter avec de l eau désionisée. (Eliminer ensuite l excès de liquide.) b. Déposer 1 goutte (environ 30 µl) de la solution d anticorps monoclonal Pathfinder sur la couche de cellules. La solution d anticorps doit recouvrir complètement la couche de cellules. c. Incuber dans une chambre d humidification à température ambiante (23 C ± 3 C) pendant 30 minutes. Protéger les lamelles des sources de lumière intense durant l incubation. d. Rincer la lamelle à l eau désionisée afin d en éliminer les anticorps non liés. (Eponger l excès d eau.) 21

22 e. Placer une goutte de milieu de montage sur une lame de verre propre, convenablement étiquetée. Y déposer la lamelle avec précaution, en évitant de piéger des bulles d air, la couche de cellules étant dirigée vers le bas. 3. Examiner la totalité de la couche monocellulaire à un grossissement minimum de 100 X. Si la présence de corps d inclusion est douteuse, confirmer à un grossissement plus fort. Si nécessaire, les plaques de microtitration peuvent être conservées à l obscurité à 4 C. Elles doivent toutefois être examinées dans les 24 heures maximum. REMARQUE : Utiliser exclusivement le milieu de montage Pathfinder de Bio-Rad N de Catalogue CONTROLE DE QUALITE Un témoin positif et un témoin négatif seront joints à chaque lot de cultures patients afin de vérifier la performance du système de culture, de la technique fluorescente et du microscope. INTERPRETATION DES RESULTATS Examiner d abord les échantillons témoins. Les cultures cellulaires témoins facilitent l interprétation des résultats en illustrant les réactions positive et négative sur la lignée de cellules utilisée pour les échantillons patients. Si la réactivité des témoins est conforme, passer à l interprétation des échantillons patients. En cas de réaction inappropriée des témoins, répéter le test. Les réactions positive et négative sont décrites de manière détaillée ci-dessous. Résultats positifs Un témoin ou un échantillon patient positif présentera des inclusions cytoplasmiques fluorescentes caractéristiques qui seront visibles à un grossissement de 100 X. L inclusion apparaît comme une masse fluorescente bien définie, de couleur vert pomme, dans le cytoplasme de la cellule infectée, à proximité du noyau. La présence d une ou de plusieurs inclusions dans une culture détermine un résultat positif. Les cellules non infectées et le fond des cellules infectées sont colorés en rouge par le contre-colorant. La coloration non spécifique se distingue par une teinte jaune, blanche ou verte terne plutôt que vert pomme. Résultats négatifs Un échantillon négatif ne présentera aucune fluorescence vert pomme spécifique. Toutes les cellules seront colorées en rouge par le contre-colorant. La coloration non spécifique est minime. 22

23 RESTRICTIONS 1. La visualisation des inclusions peut s avérer difficile si l anticorps sèche sur la couche monocellulaire. 2. La performance de ce test sur des échantillons prélevés chez des patients sous traitement antimicrobien est inconnue. 3. Pour détecter le Chlamydia, il est impératif que le prélèvement des échantillons soit effectué dans les règles. Le personnel chargé du recueil des échantillons doit être pleinement qualifié afin de minimiser le risque d obtenir des échantillons insuffisants ou inappropriés. 4. L utilisation de l anticorps monoclonal anti-chlamydia destiné à tester les cultures de confirmation sur des échantillons cliniques directs est déconseillée. (Bio-Rad propose une trousse spécifiquement conçue pour la détection du Chlamydia dans les échantillons directs N de catalogue ) VALEURS PREVISIBLES Les valeurs prévisibles peuvent varier selon la population testée. Bio-Rad a soumis 402 échantillons provenant de patients issus de populations à haut et à bas risque aux tests de confirmation par culture Pathfinder et MicroTrak. Les discordances restant après un passage ont été tranchées en utilisant le test du Chlamydia sur culture cellulaire de Ortho Diagnostics. La concordance globale entre les deux tests était de 99,5% pour les cultures primaires et de pour les cultures secondaires. Seul 1 échantillon ayant donné un résultat négatif pour la culture primaire s est avéré positif après un passage. Par comparaison avec les tests concurrents, la sensibilité et la spécificité du test Pathfinder étaient toutes deux de pour les cultures primaires et secondaires. (Se reporter à la section Caractéristiques de performance spécifiques pour de plus amples informations.) CARACTERISTIQUES DE PERFORMANCE SPECIFIQUES Trois laboratoires indépendants ont évalué la capacité du réactif Pathfinder de détecter le Chlamydia dans les cultures cellulaires. Les trois sites d étude indépendants étaient situés l un dans l Est, l autre dans le Sud et le troisième dans l Ouest des Etats Unis. Le test de confirmation sur culture MicroTrak de Syva a été utilisé comme méthode de référence et la trousse commercialisée par Ortho Diagnostics a servi à résoudre les discordances éventuelles entre les résultats après un passage. Les investigateurs ont recueilli un frottis endocervical ou un frottis urétral chez chaque patient, placé le tampon dans le milieu de transport en vue de son inoculation dans une culture cellulaire. Deux des investigateurs ont inoculé 5 couches de cellules McCoy à confluence pour chaque patient. Après 48 heures d incubation, deux des cultures ont été colorées, l une avec le réactif Pathfinder, l autre avec le réactif MicroTrak. Pour les cultures donnant des résultats négatifs ou discordants pour les cultures pri- 23

24 maires, les 3 cultures restantes ont été fractionnées et transférées sur 3 autres cultures de cellules. Après 48 heures d incubation supplémentaires, les investigateurs ont à nouveau coloré 2 des cultures monocouches, l une avec le réactif Pathfinder, l autre avec le réactif MicroTrak. Le cas échéant, la culture secondaire restante a été testée à l aide du réactif de Ortho Diagnostics afin de résoudre les discordances éventuelles. Le troisième investigateur a inoculé 3 monocouches par patient et procédé comme ci-dessus, à l exception du fait que, le cas échéant, la couche monocellulaire restante était fractionnée en trois nouvelles couches monocellulaires. Les cultures comportant au moins 1 inclusion après l incubation primaire ou après le fractionnement et le premier passage étaient considérées comme positives. Les échantillons provenaient de deux populations distinctes, une population à haut risque et une population à bas risque. La population à haut risque se composait d hommes et de femmes consultant dans des cliniques spécialisées dans les maladies sexuellement transmissibles et présentant des symptômes uro-génitaux ou d hommes et de femmes asymptomatiques en contact avec des patients porteurs d une maladie sexuellement transmissible. La prévalence globale du Chlamydia dans cette population était de 23,5%. La population à bas risque se composait de femmes consultant en vue d examens obstétriques ou gynécologiques de routine, ou qui répondaient aux critères suivants : 1) âge supérieur à 25 ans ; 2) aucun signe de pertes cervicales purulentes, d ectopie cervicale ou de friabilité cervicale ; et 3) aucun contact avec un patient porteur d un syndrome ou d un pathogène associé à une maladie sexuellement transmissible. Dans cette population, la prévalence globale du Chlamydia était de 10,0%. Les caractéristiques de performance du Test de Confirmation sur Culture Pathfinder après culture primaire et secondaire sont détaillées dans le Tableau 1, par comparaison avec le test concurrent. 24

25 Tableau 1 - Comparaison du Test de Confirmation sur Culture Pathfinder et du test concurrent après culture primaire et secondaire Sensibilité Spécificité Valeur prédictive positive Valeur prédictive négative Population à haut risque Population à bas risque Cumulée (Population à haut et à bas risque) n VP 71 VP + FN 71 VN VN + FP VP VP + FP VN 231 VN + FN 231 REMARQUE : VP = vrai positif, FP = faux positif, FN = faux négatif, VN = vrai négatif Le Tableau 2 résume les données comparant le Réactif Pathfinder et le Réactif MicroTrak sur les cultures primaires uniquement Tableau 2 - Comparaison du Réactif Pathfinder et du Réactif MicroTrak sur les cultures primaires uniquement Population à haut risque Population à bas risque Cumulée (Population à haut et à bas risque) Sensibilité Spécificité Valeur prédictive positive Valeur prédictive négative n VP VP + FN VN 232* 99,6% VN + FP 233 VP VP + FP 98,6% 69* 70 VN 232 VN + FN ,9% 90,0% * Deux échantillons positifs d après le test Pathfinder et négatifs d après le test MicroTrak après la culture primaire ont donné des résultats positifs après le premier passage aussi bien avec le test MicroTrak qu avec la méthode Ortho Diagnostics. En considérant que ces échantillons sont des positifs vrais, la spécificité et la valeur prédictive positive du test Pathfinder atteignent 100% pour les populations à haut risque, à bas risque et cumulée. Les caractéristiques de performance étaient comparables pour les hommes et les femmes de la population à haut risque * 91 9* ,4% 97,5% * *

26 Le Tableau 3 détaille les nombres de résultats positifs obtenus après les cultures primaires et secondaires. Le réactif Pathfinder a permis de détecter 2,5% de résultats positifs de plus que le réactif MicroTrak parmi les cultures primaires. L utilisation du test Pathfinder sur les cultures secondaires a donné 1,2% de résultats positifs de plus que sur les cultures primaires. Tableau 3 -Détection du Chlamydia dans des cultures primaires et secondaires Culture primaire Culture secondaire Positives avec Pathfinder Positives avec MicroTrak REACTIVITE CROISEE Bio-Rad a testé la réactivité croisée des organismes repris dans le Tableau 4 avec le réactif Pathfinder. Les organismes cités ont été testés sur des lames à substrat fixé et n ont manifesté aucune réactivité croisée vis-à-vis de l anticorps monoclonal Pathfinder. Tableau 4 - Etudes de la réactivité croisée de contaminants potentiels des cultures cellulaires vis-à-vis de l anticorps Organisme Réactivité croisée avec l anticorps monoclonal anti-chlamydia Herpes viruses Cytomegalovirus Herpes simplex Type I Herpes simplex Type II Varicella zoster Virus Acholeplasma laidlawii Mycoplasma arginini Mycoplasma hominis Mycoplasma hyorhinis Mycoplasma orale Mycoplasma salivarium Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif Négatif 26

27 Pathfinder Chlamydia Sistema de Confirmación en Cultivos Para la identificación de Chlamydia en los cultivos celulares por fluorescencia directa. CAMPO DE APLICACIÓN El Pathfinder Chlamydia Sistema de Confirmación en Cultivos es una prueba de identificación de Chlamydia en los cultivos celulares por fluorescencia directa. RESUMEN Y EXPLICACIÓN Chlamydia es un organismo sospechoso de ser el agente causal de una amplia gama de problemas de la salud. Se han identificado dos especies de Chlamydia: Chlamydia trachomatis y Chlamydia psittaci. Esta última especie de Chlamydia infecta principalmente a los pájaros, pero los humanos pueden desarrollar enfermedades como la neumonía o una infección generalizada tras su exposición a una especie aviar infectada. Generalmente Chlamydia trachomatis sólo infecta al hombre. Los síndromes clínicos que con mayor frecuencia se asocian a una infección por Chlamydia trachomatis incluyen las conjuntivitis de inclusiones, el tracoma, la uretritis, la cervicitis y otras afecciones de las vías urogenitales, y el linfogranuloma venéreo (LGV) (1). Chlamydia trachomatis puede transmitirse por contacto sexual con una persona infectada, por paso al feto durante el parto, o, en el caso del tracoma en países en vías de desarrollo, principalmente por contacto no sexual entre dos personas (2). Actualmente, Chlamydia trachomatis se conoce por ser la primera causa de enfermedades de transmisión sexual. Desgraciadamente, muchos individuos infectados son asintomáticos, lo que permite al organismo pasar desapercibido (3). En la mujer, las infecciones genitales sin diagnosticar pueden comprometer de forma definitiva sus capacidades reproductoras debido a ciertas complicaciones como la salpingitis o la pelviperitonitis (4,5). Chlamydia trachomatis también es el agente causal del tracoma, la primera causa de ceguera en el mundo, una ceguera que se puede prevenir (6). El diagnóstico precoz de estas infecciones por Chlamydia tra- 27