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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS Perfil de suscetibilidade antimicrobiana e relação epidemiológica de isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos e espécimes clínicos Andréa Lôbo Miranda SALVADORBA

2 Andréa Lôbo Miranda Perfil de suscetibilidade antimicrobiana e relação epidemiológica de isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos e espécimes clínicos Orientadora: Prof. Dra. Alaíse Gil Guimarães Coorientadora: Prof. Dra. Joice Neves Reis Pedreira Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciência de Alimentos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Ciência de Alimentos. SALVADORBA

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5 Agradecimentos Agradecer primeiramente a Deus pela vida e por tudo que conquistei, mostrandome sempre qual caminho deveria seguir. Aos meus pais pelo amor incondicional e por me ampararem nas dificuldades encontradas durante a aquisição desse título e ao longo da vida. A minha amiga, irmã de coração, Samantha Costa, que me ajudou muito nesse período, com sua compreensão e paciência, por estar sempre presente e me incentivar nos momentos de tristeza, angústias, indecisões, resultados, alegrias e conquistas. Aos meus familiares adquiridos e amigos, que também foram fundamentais nessa conquista, oferecendo todo apoio nas minhas decisões. A prof. Drª. Alaíse Gil Guimarães pela orientação, confiança e por me dar todo suporte estrutural, teórico, prático e emocional, permitindo a execução desse projeto de vida de forma muito mais tranquila. A prof. Drª. Joice Neves Reis Pedreira pela coorientação e por contribuir de forma significativa na aquisição de conhecimentos em uma área até então desconhecida. A prof. Drª. Soraia Machado Cordeiro pela disposição em ensinar, por me ajudar a resolver todos os problemas e auxiliar nas análises moleculares. A Daniela Benevides Melo pela imprescindível contribuição na obtenção das amostras, nos materiais oferecidos e pelos conhecimentos do projeto que me foram passados. A todos da Fiocruz que me ajudaram a entender a técnica de PFGE e utilizála, em especial a Quézia Moura da Silva, que me ensinou pela primeira vez a prática e Jailton por toda a disposição em possibilitar o uso do GelCompar. Aos colegas do LPMC (UFBA), a Carolzinha, Renata, João, Carol, Vinícius, Mira e a todos que indiretamente também me ajudaram na execução das análises, ressaltando Ana Paula Menezes e Milena Soares por facilitarem minhas análises, oferecendo todo apoio e conhecimento possível. 5

6 A estagiária Palloma de Souza Santos por ter me auxiliado no laboratório, principalmente nas análises de antibiograma. A todos do Laboratório de Pesquisa em Microbiologia de Alimentos (UFBA), principalmente Mariana Assis por me receber bem no laboratório e me fornecer os conhecimentos adquiridos durante a rotina das análises. Aos colegas do mestrado pela descontração nas aulas, com destaque para minhas amigas Lidia Moura e Luciana Argolo pelas boas conversas, viagens de volta para casa, conselhos e apoio que me foram doados, permitindo explorar o desconhecido de forma muito mais prazerosa. Aos hospitais por me doarem as cepas de amostras clínicas, ao LACEN e a Marília pela doação dos isolados de alimentos. A FAPESB e ao Ministério da Saúde por financiar meu projeto e conceder a bolsa de mestrado. E a todos que contribuíram de forma direta ou indiretamente para mais essa vitória. Obrigada! 6

7 SUMÁRIO Resumo Abstract Introdução Geral Objetivos Objetivo Geral Objetivos Específicos Referências Capítulo I Referencial Teórico Surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos Microorganismos em Alimentos Salmonella spp Caracterização Patogenicidade Tratamento e resistência a antimicrobianos Resistência a antimicrobianos Epidemiologia molecular Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis PFGE) Referências Capítulo II Resistência antimicrobiana e padrão de Pulsed Field Gel Electrophoresis de isolados de Salmonella spp. oriundos de alimentos e humanos Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Amostragem Coleta de dados

8 2.3. Identificação das cepas Sorologia Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) Análise de dados Considerações Éticas Resultados e Discussão Cepas de Salmonella spp Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) Conclusões Referências Considerações Finais APÊNDICES Apêndice A Termo de compromisso para utilização dos dados das cepas de origem humana empregadas na pesquisa Apêndice B Formulário utilizado na coleta de informações das cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos Apêndice C Formulário utilizado na coleta de informações das cepas de Salmonella spp. isoladas de amostras clínicas Apêndice D Informações das cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos utilizados no estudo Apêndice E Informações das cepas de Salmonella spp. isoladas de espécimes clínicos utilizadas no estudo Apêndice F Imagens representativas dos géis obtidos por eletroforese em campo pulsado das cepas utilizadas neste estudo

9 Lista de Tabelas Capítulo I Referencial Teórico Tabela 01: Espécie, subespécie e número de sorotipos de Salmonella spp Capítulo II Resistência antimicrobiana e padrão de Pulsed Field Gel Electrophoresis de isolados de Salmonella spp. oriundos de alimentos e humanos Tabela 01: Antibióticos testados e respectivos critérios de interpretação do CLSI (2011) Tabela 02: Critérios interpretativos para relação epidemiológica entre cepas Tabela 03: Sorotipo dos isolados de Salmonella spp. de origem de alimentos Tabela 04: Sorotipo dos isolados de Salmonella de origem clínica Tabela 05: Quantidade e percentual de cepas de Salmonella spp. resistentes isoladas de alimentos e espécimes clínicos para cada antibiótico analisado Tabela 06: Número de cepas multiresistentes por quantidade de antibióticos Tabela 07: Perfil de resistência e origem das cepas isoladas de alimentos Tabela 08: Perfil de resistência antimicrobiana de isolados de Salmonella de origem de alimentos e clínicas

10 Lista de Figuras Capítulo I Referencial Teórico Figura 01: Mecanismos de ação de antimicrobianos sobre uma célula bacteriana (COELHO, 2012) Figura 02: Mecanismos de resistência bacteriana aos antimicrobianos a) alteração da permeabilidade da membrana celular externa; b) alteração do sítio de ação do antimicrobiano; c) bomba de efluxo; d) degradação do antimicrobiano por enzimas Capítulo II Resistência antimicrobiana e padrão de Pulsed Field Gel Electrophoresis de isolados de Salmonella spp. oriundos de alimentos e humanos Figura 01: Fluxograma do protocolo padrão de difusão em disco do CLSI, Figura 02: Fluxograma do protocolo para Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) de Salmonella spp Figura 03: Percentual de susceptibilidade antimicrobiana para cepas de Salmonella spp. de alimentos e de espécimes clínicos Figura 04: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=91); *2 Grupo clonal com dois isolados; *3 Grupo clonal com três isolados; *5 Grupo clonal com 5 isolados; *9 Grupo clonal com nove isolados;*19 Grupo clonal com dezenove isolados Figura 05: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=20) Figura 06: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=11)

11 Figura 07: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=7); * Sensibilidade Intermediária Figura 08: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. provenientes de casos clínicos (n=9); * Sensibilidade Intermediária Figura 09: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos (n=6) Figura 10: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=9) Figura 11: Dendrograma gerado pelo software GelCompar II mostrando, pelo coeficiente de Dice, a relação entre os isolados de Salmonella spp. de origem diversa (n=29); * Sensibilidade Intermediária

12 Resumo A persistência de microorganismos resistentes a antimicrobianos no ambiente tem gerado uma crescente preocupação no que diz respeito à saúde pública. As bactérias patogênicas podem ser veiculadas aos humanos por meio de animais, utensílios, superfícies, água, alimentos e pelo próprio ser humano. Por isso, é importante a adoção de práticas de higiene pelos criadores de animais, produtores, comerciantes, transportadores e manipuladores de alimentos a fim de se evitar que rotas de contaminação sejam estabelecidas. Considerando que a Salmonella spp. é considerada um dos microorganismos mais prevalentes em surtos de origem alimentar, estudos para determinação da resistência de isolados de Salmonella conjugados com métodos moleculares para determinação da relação epidemiológica de amostras clínicas e de alimentos se faz necessária. Dessa forma é possível estabelecer estratégias para controle e prevenção de surtos ou casos esporádicos de Doenças Transmitidas por Alimentos. O perfil de resistência a 12 antimicrobianos foi realizado conforme metodologia indicada no protocolo padrão de disco de difusão em ágar do Clinical and Laboratory Standard Institute, enquanto a tipagem molecular para determinar a relação epidemiológica dos isolados foi realizada por meio da técnica de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE), descrito pelo Center for Diseases Control and Prevention (CDC Atlânta, EUA). Percebeuse que 63% dos isolados analisados foram susceptíveis aos antibióticos testados, sendo que aqueles de origem clínica apresentaram percentuais de resistência superiores aos de alimentos. Dentre as cepas resistentes de alimentos, 67% (8/12) foram de origem animal ou fabricado com produtos derivados. Foram identificados 15 perfis de resistência, nos quais o ácido nalidíxico e o de multiresistência (ampicilina, cefalotina, ceftriaxona, cefotaxima, tetraciclina e trimetoprim/sulfametazol, ácido nalidíxico) apareceram com maior frequência, em 33% (12/36) e 17% (6/36) dos isolados, respectivamente. Os antibióticos para os quais os isolados apresentaram maior resistência foram o ácido nalidíxico e a tetraciclina. Foram identificados 47 perfis eletroforéticos distintos, sendo encontrados 11 grupos clonais, variando de 2 a 19 em número de isolados. Os resultados encontrados sugerem que provavelmente os isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos e humanos persistiram no ambiente ao longo dos anos em diferentes cidades do estado da Bahia, mostrando que talvez eles possam ser provenientes de um ancestral comum. Apesar desse trabalho contribuir com o fornecimento de dados para melhoria da saúde pública no Estado, ainda se faz necessária a realização de outros estudos com essa mesma temática envolvendo a epidemiologia de isolados clínicos e de alimentos de Salmonella spp. a fim de englobar um maior número de cepas representando o Estado da Bahia como um todo. PALAVRASCHAVE: Resistência, patógenos, PFGE, antibiótico, multiresistência epidemiologia molecular, padrão clonal. 12

13 Abstract The persistence of microorganisms resistant to antibiotics in the environment has developed a growing concern in regard to public health. The pathogenic bacteria can be transmitted to humans by animals, utensils, surfaces, water, food and the human himself. It is important that livestock farmers producers, traders, transporters and food handlers to adapt hygienic practices to prevent contamination routes are established. Whereas Salmonella spp. is considered one of the most prevalent microorganisms in foodborne outbreaks, studies to determine the resistance of Salmonella isolates of clinical origin and food combined with molecular methods to determine the epidemiological relationship of these are necessary, since, this way, is possible to establish strategies to control and prevent outbreaks or sporadic cases of Foodborne Diseases. The profile of resistance to 12 antimicrobials was performed according to the methodology indicated in the protocol standard disk agar diffusion of the Clinical and Laboratory Standard Institute, while molecular typing to determine the epidemiological relationship of the isolates was performed according to standard protocol, with some modifications, to technique Gel Electrophoresis Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), described by the Center for Disease Control and Prevention (CDC Atlanta, USA). It was noticed that 63% of isolates were susceptible to the antibiotics tested, and those of clinical origin showed higher percentages of resistance to food. Among the resistant strains of food, 67% (8/12) were made from animal or products. Were identified 15 resistance profiles in which nalidixic acid and of multidrug resistance (ampicillin, cephalothin, ceftriaxone, cefotaxime, tetracycline, trimethoprim / sulfametazol, nalidixic acid) occurred more often in the 33% (12/36) and 17 % (6/36) isolates, respectively. The antibiotics for which the isolates showed greater resistance were nalidixic acid and tetracycline. We identified 47 distinct electrophoretic profiles, and found 11 clonal groups, ranging from 2 to 19 isolates. The results suggest that probably the Salmonella isolates from foods and humans persisted in the environment over the years, in different cities, in the state of Bahia, showing that perhaps they might be from a common ancestor. Although this work contribute to the provision of data to improve public health in the state, yet it is necessary to carry out further studies with this same issue involving the epidemiology of food and clinical isolates of Salmonella spp. to encompass a greater number of strains, in a way that represents entirely the state of Bahia as a whole. KEY WORDS: Resistance, pathogens, PFGE, antibiotic, multiresistance, molecular epidemiology, pattern clonal. 13

14 Introdução Geral A crescente demanda da população por alimentos de qualidade tem gerado a necessidade de criar alternativas que garantam alimentos livres de contaminação por agentes biológicos, físicos e químicos com potencial de causar danos à saúde. Assim, os órgãos de saúde têm buscado progressos na ciência e tecnologia de alimentos a fim de propor estratégias para controle de surtos associados à ingestão de alimentos contaminados capazes de causar Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA). A falta de condições higiênicosanitárias de alguns produtores e estabelecimentos comerciais de alimentos e a poluição ambiental, principalmente nos países em desenvolvimento, junto ao aumento de viagens e negócios interregionais e internacionais são alguns fatores que favorecem a disseminação de patógenos no ambiente. Temse, ainda, que as mudanças nos sistemas de produção de alimentos podem provocar adaptações da população microbiana, levando ainda à evolução de novos microorganismos, com o desenvolvimento de novos fatores de virulência e resistência a antimicrobianos (KÄFERSTEIN e ABDUSSALAM, 1999; SCHLUNDT et al., 2004). Além disso, o uso indiscriminado de antibióticos na criação de animais e também de outros agentes químicos na produção agrícola e na desinfecção nas indústrias processadoras de alimentos acabam induzindo a resistência de algumas cepas de microorganismos patogênicos a antibióticos. A transferência de genes de resistência entre procariotos é bastante comum, sendo que quando alimentos contaminados com microorganismos resistentes são ingeridos, danos a saúde humana podem acontecer e interferir no tratamento de possíveis enfermidades, impedindo a eficiência do uso de alguns medicamentos. Dentre os agentes mais envolvidos em toxinfecções alimentares, têmse as bactérias do gênero Salmonella, bacilos Gram negativos, que compõem o grupo mais complexo das enterobacteriaceae (WINN et al., 2008). A salmonelose é uma das principais zoonoses para a saúde pública em todo o mundo (LOURENÇO et al., 2004), exteriorizandose pela suas características de endemicidade, alta 14

15 morbidade e, sobretudo, pela dificuldade da adoção de medida no seu controle (GUERIN et. al., 2005). Além da importância das medidas preventivas para evitar o risco de infecção da salmonelose na população humana, o controle dessa doença é de grande interesse para a economia mundial, uma vez que o custo com despesas médicas para seu tratamento é bastante elevado, principalmente em países em desenvolvimento, onde a deficiência de saneamento básico, pobreza e superpopulação são predominantes. O uso de técnicas moleculares permite identificar cepas de patógenos associados a surtos de DTA e relacionálas epidemiologicamente a fim de que a aquisição de informações como a origem e fonte da contaminação, agentes e circunstâncias de veiculação, possa auxiliar na prevenção das DTA e na definição de estratégias capazes de identificar rapidamente os surtos, bem como minimizar os prejuízos causados à saúde pública. As técnicas da biologia molecular tornamse cada vez mais integradas na prática da epidemiologia das doenças infecciosas. Os progressos no domínio da biologia molecular e genética estão modificando a prática da medicina e da saúde pública por meio do desenvolvimento de diagnóstico molecular e intervenções orientadas com base nas susceptibilidades individuais (DORMAN, 2000; FOXMAN e RILEY, 2001). As técnicas moleculares não substituem os métodos convencionais, contudo, podem elucidar problemas epidemiológicos que não são possíveis de serem resolvidos por métodos convencionais ou que necessitariam de um trabalho intensivo, caro e/ou demorado para ser efetuado por técnicas convencionais (FOXMAN e RILEY, 2001). Dentre as técnicas moleculares, a Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis PFGE) tem sido bastante utilizada para tipagem de microorganismos em estudos epidemiológicomoleculares. A técnica de PFGE é utilizada na investigação epidemiológica de surtos dada sua rápida detecção e por sua eficiência ser comprovada, sendo considerada como padrão ouro em epidemiologia molecular. 15

16 Assim, devido a poucas informações relativas à resistência microbiana, determinar a relação entre a resistência a antimicrobianos e o padrão clonal dos isolados, poderá ajudar nas investigações sobre a origem dos mesmos e as formas de disseminação. 16

17 Objetivos Objetivo Geral Determinar o perfil de resistência a antimicrobianos e o padrão clonal de cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos e espécimes clínicos para determinação da relação epidemiológica entre elas. Objetivos Específicos 1. Determinar o perfil de resistência a antimicrobianos de cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos e humanos; 2. Realizar tipagem molecular de cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos e espécimes clínicos, com o uso da técnica de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE); 3. Determinar por meio de perfis clonais a relação epidemiológica dos isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos e espécimes clínicos. 17

18 Referências DORMAN, J. S. Molecular epidemiology: The impact of molecular biology in epidemiology research. Revista Médica de Chile, v. 128, n. 11, p , FOXMAN B.; RILEY, L. Molecular epidemiology: focus on infection. American Journal of Epidemiology, Oxford, v. 153, n. 12, p , GUERIN, P. J.; VOLD, L. A. A.; VILTSLAND, P. Communicable disease control in a migrant seasonal workers population: a case study in Norway. Eurosurveillance, v. 10, n. 13, p. 4850, KÄFERSTEIN, F; ABDUSSALAM, M. Food safety in the 21st century. Bulletin of World Health Organization, v. 77, n. 4, p , LOURENÇO, M. C. S.; REIS, E. F. M.; VALLS, R. Salmonella entérica subsp houtenae sorogrupo O:16 em um paciente HIV positivo: relato de caso. Revista Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. v. 46, n. 3, p , SCHLUNDT, J.; TOYOFUKU, H.; JANSEN, J.; HEBST, S. A. Emerging foodborne zoonoses. Revue Scientifique Et Technique, Paris, v. 23, n. 2, p , WINN, W. JR.; ALLEN, S.; JANDA, W.; KONEMAN, E.; PROCOP, G.; SCHRECKENBERGER, P.; WOODS, G. Koneman Diagnóstico microbiológico: texto e atlas colorido. 6. ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1760p.,

19 Capítulo I Referencial Teórico 19

20 1. Surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos Doença transmitida por alimento (DTA) é aquela causada pela ingestão de um alimento contaminado por um agente infeccioso específico, ou pela toxina por ele produzida, por meio da transmissão desse agente ou de seu produto tóxico (BRASIL, 2001). Os índices crescentes das DTA têm gerado grande interesse na comunidade acadêmica quanto às estratégias a serem utilizadas para o seu controle e, consequentemente, na garantia da comercialização de produtos inócuos no mercado consumidor (MATHEUS et al., 2003). Em geral, surtos de DTA ocorrem devido a uma série de fatores relacionados ao desenvolvimento microbiano, à contaminação ou à sobrevivência do microorganismo no alimento (FORSYTHE, 2002). As DTA são resultados predominantemente do ciclo de contaminação fecal/oral e seu controle tem recebido atenção cada vez maior em todo o mundo (TAKAYANAGUI et al., 2000). Alguns pesquisadores estimam que E. coli O157:H7, Salmonella spp., Listeria monocytogenes sejam a causa de 3,5 milhões de casos de DTA com hospitalizações e mortes a cada ano, nos Estados Unidos, onde as DTA são reconhecidas e bastante divulgadas como relevante problema de saúde pública (TAUXE, 2002; SUN e OCKERMAN, 2005). Embora os programas estabelecidos para controle de Salmonella spp. de diferentes fontes de contaminação na cadeia alimentar tenham sido satisfatórios na redução da ocorrência de salmoneloses, esse patógeno ainda é a causa mais comum de gastroenterites em humanos, sendo, por este motivo, necessária uma vigilância constante (RODRIGUE et al., 1990). De acordo com dados do Ministério da Saúde (BRASIL, 2011), no período de 1999 a 2008 ocorreram, no Brasil, surtos de doenças transmitidas por alimentos, com pessoas acometidas e 64 óbitos. A Salmonella spp. foi o principal agente implicado no desencadeamento destas enfermidades, sendo responsável por 42,9% dos surtos registrados no país, nos quais ovos e maionese 20

21 foram os principais alimentos responsáveis por surtos de doenças transmitidas por alimentos, no Brasil, nesse mesmo período (RODRIGUES, 2005). 2. Microorganismos em Alimentos A microbiota de um alimento é constituída por microorganismos associados à matériaprima e por contaminantes que foram introduzidos durante o processamento e por aqueles que tiveram condições de sobreviver aos processos aplicados durante o seu preparo e acondicionamento. A maior parte dos alimentos está sujeita a várias fontes potenciais de microorganismos, porém, podese controlar os níveis de contaminação e manter a microbiota em um número aceitável, por meio do manuseio adequado, do conhecimento dos fatores que influenciam o desenvolvimento desses microorganismos nos alimentos, dentre outras ações (LIMA e SOUSA, 2002) Salmonella spp Caracterização As bactérias pertencentes ao gênero Salmonella são bacilos Gram negativos com diâmetro em torno de 0,7 1,5 x 2,0 2,5 μm, em geral móveis com flagelos peritríquios, com exceção dos sorovares S. Gallinarum e S. Pullorum. São anaeróbios facultativos e não formadores de esporos. A temperatura ótima de crescimento no alimento é de 37 C, sendo que se multiplicam numa faixa de ph entre 4,5 e 9,5 e em uma atividade de água acima de 0,93. Pertencem à família Enterobacteriaceae e formam colônias que medem cerca de 2 a 4 mm de diâmetro, apresentam os testes da oxidase e VogesProsKauer negativos, reduzem nitrato a nitrito, não produzem citocromo oxidase, fermentam glicose e outros carboidratos com produção de ácidos, produzem sulfeto de hidrogênio (H 2 S), utilizam o citrato como única fonte de carbono e, geralmente, são lisina e 21

22 ornitina descarboxilase positivas (BOPP et al., 1999; MACFADDIN, 2000; D AOUST, 2001; FORBES et al., 2002; WINN et al., 2008). Salmonella spp. são sensíveis à luz solar, aos desinfetantes mais utilizados nas indústrias, tais como fenóis, clorados e iodados e também são destruídas a 60 C por cinco minutos (OLIVEIRA, 2000). O uso inadequado de agentes químicos para limpeza das linhas de produção nas indústrias de alimentos, porém, favorece a manutenção de patógenos em toda cadeia produtiva, dificultando a eliminação do microorganismo e permitindo a ocorrência de surtos de infecções alimentares causadas pelo consumo de produtos contaminados. Além disso, pode também resultar em aumento da resistência de bactérias aos antibióticos e possivelmente causar falhas em esquemas terapêuticos, já que os desinfetantes, ao contrário dos antibióticos, não têm um alvo específico e podem conter diversas substâncias antimicrobianas, propiciando o surgimento de resistência cruzada (CERF et al., 2010). Essas bactérias estão amplamente dispersas na natureza e podem ser encontradas no trato gastrointestinal de mamíferos, répteis, pássaros e insetos (MILLER et al., 1995; HOFER et al., 1997; BAUDART et al., 2000; RABSCH et al., 2002; WINN et al., 2008). A infecção em humanos geralmente decorre da ingestão de água e alimentos contaminados, tais como temperos e principalmente alimentos de origem animal, como ovos e derivados, carne de aves ou bovina, crua ou mal cozida; em menor proporção leite e queijo não pasteurizados (GILLIGAN et al., 1992; MILLER et al.,1995; GOMEZ et al., 1997; KAYE, 2000; EDWARDS et al., 2002). Os ovos normalmente são contaminados com fezes que penetram por pequenas quebras, entretanto a infecção do oviduto de aves permite a incorporação de Salmonella diretamente no interior do ovo (KAYE, 2000). Como Salmonella spp. apresenta a habilidade de persistir no intestino de animais e de invadir tecidos, muitos alimentos podem servir como veículos para sua transmissão, o que representa um desafio maior à segurança alimentar (HUMPHREY, 2004; WIGLEY et al., 2005). 22

23 O gênero Salmonella compreende as espécies Salmonella enterica e Salmonella bongori. Salmonella enterica é subdividida em seis subespécies, que apresentam diferenças bioquímica e genômica entre si e são designadas por nomes ou números romanos, totalizando em 2610 sorotipos (Tabela 01) (GUIBOURDENCHE et al., 2009). Tabela 01: Espécie, subespécie e número de sorotipos de Salmonella spp. Nº de sorotipos por Espécie Subespécie Algarismo Romano subspécie S. enterica enterica I 1547 S. enterica salamae II 513 S. enterica arizonae IIIa 100 S. enterica diarizonae IIIb 341 S. enterica houtenae IV 73 S. enterica indica VI 13 S. bongori V 23 Total 2610 Fonte: Guibourdenche et al., As subespécies IIIa e IIIb pertenciam anteriormente ao gênero Arizonae. Salmonella bongori foi originalmente designada como S. enterica subespécie V e, posteriormente, considerada como uma espécie separada. Entretanto, essas estirpes são comumente referidas como subespécie V para o propósito de designação de sorotipo (POPOFF, 2001; CDC, 2004). Essas espécies e subespécies podem ser distinguidas com base em características bioquímicas e genéticas. Nomes foram mantidos somente para os sorotipos mais frequentes de Salmonella enterica. Esses nomes não devem ser indicados em itálico, e a primeira letra deve ser maiúscula. Na prática, o nome da subespécie não precisa ser indicado, uma vez que somente os sorotipos da subespécie enterica têm nome. Assim, as designações Salmonella enterica subespécie enterica sorotipo Typhimurium ou Salmonella Typhimurium podem ser usadas. Sorotipos de outras subespécies de Salmonella enterica e aqueles de Salmonella bongori são designados somente pelas suas fórmulas antigênicas (POPOFF, 2001; CDC, 2004). 23

24 Patogenicidade Dentre o total de sorovares de Salmonella conhecidos, cerca de 150 são considerados causadores de doenças em humanos pelo consumo de alimentos contaminados. Tais sorovares apresentam ampla diversidade de reservatórios animais e uma especial capacidade de sobrevivência em ambientes adversos, o que lhes confere um elevado potencial de disseminação (POPOFF et al., 2003). Alguns sorotipos têm uma ampla faixa de hospedeiros e causam doença gastrointestinal e doença sistêmica, enquanto os sorotipos Typhi e Paratyphi A são restritos aos humanos e causam doença sistêmica (GILLIGAN et al., 1992; MILLER et al., 1995; BÄUMLER et al., 1998; RODRIGUEZ et al., 1998; DUIJKEREN et al., 2002; RABSCH et al., 2002; VAAGLAND et al., 2004; BOUALLÈGUEGODET et al., 2005; GUERIN et al., 2005). São necessárias de 10 5 a UFC para iniciar uma infecção, mas a quantidade varia conforme a estirpe, o alimento consumido e o estado geral do hospedeiro. Um inóculo grande é necessário para superar a barreira da acidez do estômago e competir com a microbiota do intestino. Mas a dose infecciosa é reduzida quando Salmonella é consumida com alimentos que atravessam o estômago rapidamente, como líquidos, ou com alimentos que neutralizam a acidez estomacal, como queijo e leite. Indivíduos com ph gástrico mais elevado são mais suscetíveis à infecção (DARWIN e MILLER, 1999). Algumas vezes a doença pode ser fatal em crianças, idosos ou imunocomprometidos, devido a menor resistência às infecções (PINTO et al., 2004). As gastroenterites apresentam quadros clínicos curtos causados por Salmonella nãotyphi, com período de incubação de 12 a 72 horas, indicando que a ativação da resposta imune adaptativa contribui para o término dos sintomas, que podem ser dores abdominais, diarréia, febre baixa e vômito, sendo raros os casos clínicos fatais (RAFFATELLU et al., 2008). O sorotipo predominante causador de infecções alimentares mudou nas últimas décadas de Salmonella Agona, Salmonella Hadar e Salmonella Typhimurium para Salmonella Enteritidis, sendo este último a causa predominante 24

25 de salmoneloses em diversos países (SILVA e DUARTE, 2002; SURESH et al., 2006), sobretudo na Europa, onde representa 85% dos casos de salmonelose, na Ásia e na América Latina e Caribe onde são responsáveis por 38% e 31% das infecções causadas por esse microorganismo, respectivamente. Alterações nos sorotipos refletem mudanças na criação do animal e a disseminação de novos sorotipos devido ao grande fluxo do comércio mundial. A principal grande preocupação na atualidade é o aparecimento de sorotipos do gênero Salmonella multiresistentes a antibióticos (D AOUST, 1994; TRABULSI e ALTERTHUM, 2004) Tratamento e resistência a antimicrobianos O tratamento para os casos de febre tifóide e entérica é, preferencialmente, ambulatorial, sendo que o antibiótico de escolha dependerá do quadro clínico da doença e do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. Dessa forma, o tratamento com antimicrobianos deve ser iniciado tão logo seja diagnosticada a febre tifóide ou a febre entérica e o tratamento deve ser mantido pelo menos uma semana após a temperatura ter voltado ao normal, para que possa atingir a Salmonella em sua localização intracelular (MIMS et al., 2005). Para outros sorotipos de salmonela, geralmente os infectados apresentam quadro clínico autolimitante com reversão espontânea em 48 horas, sendo a administração de antibióticos no tratamento das gastroenterites não recomendado, pois prolonga o período de excreção do agente, caracterizando o portador assintomático, além de promover o aparecimento de salmonelas multiresistentes (TRABULSI e ALTERTHUM, 2004; SURESH et al., 2006). Cepas de Salmonella spp. isoladas de diferentes fontes, multiresistentes aos antibióticos foram relatados no Brasil e em diversos países (EDRINGTON et al.,2004; FONSECA et al., 2006; FIGUEIRÊDO, 2008; LUNDIN et al, 2008; BACCI et al., 2012), constituindo um problema sério para a saúde pública, pois dificulta ou mesmo inviabiliza o tratamento de doenças causadas por estas cepas resistentes. 25

26 3. Resistência a antimicrobianos Segundo CODEX (2008), antimicrobiano ou agente antimicrobiano é qualquer substância de origem natural, semisintética ou sintética que em concentrações in vivo elimina ou inibe o crescimento de microorganismos devido à interação com um alvo específico. Os antimicrobianos podem ser classificados como bactericidas que eliminam microorganismos, ou ainda como bacteriostático que inibe o seu desenvolvimento. Os antimicrobianos devem ser capazes de alcançar os alvos moleculares, que são primariamente intracelulares. Para isso, o antimicrobiano, em quantidades suficientes, precisa ultrapassar a membrana celular bacteriana, interagir com uma moléculaalvo de modo a desencadear a morte da bactéria, evitar a ação das bombas de efluxo, que jogam os antimicrobianos para o meio extracelular e evitar a inativação por enzimas capazes de modificar o fármaco no ambiente extracelular ou no interior da célula bacteriana. A atuação dos antimicrobianos ocorre por meio da inibição de processos essenciais a multiplicação da célula bacteriana e, em última instância, a sua sobrevivência. Podem ser classificados em diferentes grupos em função da sua estrutura alvo na célula bacteriana, diferenciandose em inibidores da membrana citoplasmática, inibidores da síntese de ácidos nucléicos, da síntese proteica ou da síntese da parede celular (MURRAY et al., 2005). Alguns mecanismos de ação de antimicrobianos sobre células bacterianas estão ilustrados na Figura

27 Figura 01: Mecanismos de ação de antimicrobianos sobre uma célula bacteriana (COELHO, 2012). O termo resistente se refere à aqueles microorganismos que não são inibidos pelas concentrações habitualmente alcançadas no sangue ou tecidos do correspondente antimicrobiano, ou àqueles que apresentam mecanismos de resistência específicos para o agente estudado ao qual não havia uma resposta clínica adequada quando usado como tratamento (RODRIGUEZ, 2000). Os principais mecanismos de resistência de bactérias aos antimicrobianos são (Figura 02): 27

28 Fonte: ANVISA, Figura 02: Mecanismos de resistência bacteriana aos antimicrobianos a) alteração da permeabilidade da membrana celular externa; b) alteração do sítio de ação do antimicrobiano; c) bomba de efluxo; d) degradação do antimicrobiano por enzimas. a) Alteração da permeabilidade da membrana celular externa, uma vez que a permeabilidade dessa membrana depende da sua constituição, conforme a bactéria seja Grampositiva ou Gramnegativa, impedindo ou não a passagem dos fármacos para o meio intracelular (TAVARES, 1996; TRABULSI & ALTERTHUM, 2008); b) Alteração do sítio de ação do antimicrobiano, onde a ocorrência de qualquer efeito inibitório ou bactericida é inibida, sejam pela alteração da ligação dos antimicrobianos, ou pela inativação dos alvos, que geralmente são proteínas, quase sempre enzimas, importantes para o metabolismo da célula bacteriana ((SILVERMAN, 1992; STROHL et al. 2004); c) Bomba de efluxo (resistência a tetraciclinas e fluoroquinolonas), em que ocorre o bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular para o extracelular, fazendo com que a retirada do antibiótico para o meio extracelular seja mais rápida que a sua difusão pela membrana bacteriana, mantendo uma concentração insuficiente para atuar como bloqueador de funções celulares (SILVERMAN, 1992); 28

29 d) Obtenção da habilidade de destruir ou modificar o antibiótico (resistência a penicilinas) por enzimas específicas, que alteram estruturas importantes para ação do antibiótico (STROHL et al. 2004). Os dois principais fatores envolvidos no desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias são a pressão seletiva devido ao uso indiscriminado de antimicrobianos na criação animal, no tratamento de enfermidades humanas e na agricultura e a presença de genes de resistência, que podem ser transferidos de um microorganismo para outro. Os genes que codificam resistência aos antimicrobianos podem estar localizados no cromossomo ou nos plasmídeos. O DNA cromossômico é relativamente mais estável, enquanto que o DNA plasmidial é facilmente transportado de uma linhagem para outra por conjugação bacteriana, permitindo uma transferência de genes em conjunto, incluindo os de resistência a antimicrobianos (WINN et al., 2008). A resistência bacteriana pode ser transferida por mecanismos diversos, podendo se estabelecer entre microorganismos de uma mesma população ou de diferentes populações, como da microbiota animal para humana e viceversa (NIJTEN et al., 1993), o que gera um sério problema em nível mundial, uma vez que a resistência a antimicrobianos tem aumentado devido ao mau uso ou uso exagerado de agentes antimicrobianos não somente em medicina humana, mas também em medicina veterinária e agricultura (WHO, 2011). Somente 50% dos antibióticos produzidos são utilizados na terapia humana; a outra metade é empregada na profilaxia, tratamento ou como promotores de crescimento animal e no extermínio de pragas na agricultura (RODRIGUES, 2001). Reis et al. (1995) relataram ainda que o emprego de antibióticos em rações para promover o crescimento tem contribuído para potencializar a distribuição de salmonelas resistentes presentes nas aves, havendo assim um risco maior nas doenças transmissíveis por alimentos (DTA) em humanos quando causadas por estas bactérias. Os alimentos são um importante veículo para o incremento de patógenos gastrintestinais resistentes a antibióticos como, por exemplo, Campylobacter jejuni 29

30 e Salmonella enterica. Em relação à S. enterica, os produtos avícolas são os mais implicados na transmissão deste patógeno (RIANO et al., 2006). Gebreyes et al. (2009) observaram uma maior prevalência de resistência antimicrobiana entre cepas de Salmonella spp. isoladas de suínos do que aquelas isoladas de amostras clínicas. No que tange as cepas de Salmonella spp. resistentes, um dos principais problemas é o aumento na freqüência de cepas que apresentam multiresistência a fármacos (TASSIOS et al., 2000). As infecções causadas por cepas de Salmonella multiresistentes podem levar a falhas no tratamento, podendo aumentar o período deste, ou ainda resultar em sintomas clínicos mais severos. Nesses casos, há uma maior freqüência de hospitalizações e óbitos quando comparados com aqueles resultantes de cepas susceptíveis a antimicrobianos, confirmando o grande impacto dessa questão na saúde pública e também na economia mundial (HOELZER et al., 2010). A recente aparição de resistências a antimicrobianos em patógenos transmitidos por alimento tem sido motivo de grande preocupação para a saúde pública. Dessas resistências temse: (i) a resistência transferível de baixo nível, como as fluoroquinolonas em Enterobacteriaceae, (ii) a presença de Staphylococcus aureus resistente à meticilina em animais e (iii) o aparecimento em todo o mundo de isolados humanos e animais de Escherichia coli e Salmonella spp. com betalactamases de espectro estendido (ESBL) (INFOSAN, 2008). Algumas espécies de bactérias, principalmente as Gramnegativas, são produtoras de betalactamases, que são enzimas (cromossômicas ou plasmidiais) capazes de hidrolisar o anel betalactâmico de penicilinas, cefalosporinas e outros antimicrobianos relacionados, tornandoos inativos (FRANCISCO, 2009). As ESBL constituem um grupo de enzimas derivadas das betalactamases clássicas TEM1, TEM2 e SHV1 (SILVA e SALVINO, 2000). As enzimas foram denominadas de ESBL devido ao fato da maioria dessas enzimas serem codificadas por genes localizados em plasmídeos, que geralmente carregam genes de resistência a outros antimicrobianos, tais como aminoglicosídeos, 30

31 trimetoprim, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol. As cepas produtoras de ESBL são geralmente multiresistentes (JUNIOR et al., 2004). A produção de betalactamases é o principal mecanismo de resistência das bactérias Gramnegativas que inativam antibióticos de forma específica, como o imipenem, as quais são resistentes à ação da maior parte das outras enzimas (WINN et al., 2008). O tubo digestivo atua como reservatório potencial destes microorganismos multiresistentes; além disso, é ele o habitat adequado para que a resistência se transmita a outras espécies bacterianas (SILVA, 1999). O aparecimento de surtos nosocomiais devido a estes microorganismos depende tanto das condições ambientais (elevado consumo de cefalosporinas de terceira geração, manipulação dos pacientes, dentre outros), como das características especiais do microorganismo (fatores de virulência, aderência e outros) (SILVA e SALVINO, 2000). A detecção de genes de resistência em microorganismos isolados de amostras clínicas permite orientar a terapia e estabelece um prognóstico após sucessivas culturas positivas. Os testes genéticos podem ser usados como referência para avaliar novas técnicas que determinam a referida resistência (TENOVER et al., 1995). 4. Epidemiologia molecular A epidemiologia molecular por meio do uso de técnicas da biologia molecular é capaz de identificar características semelhantes entre cepas microbianas que as relacionem em regiões geográficas diferentes e em períodos distintos. Além disso, é possível determinar a causa da ocorrência e disseminação de enfermidades entre seres humanos. A comparação de cepas para estabelecer sua identidade se baseia no fato de que aquelas relacionadas epidemiologicamente provêm da expansão clonal de um precursor único (MATTAR, 2000). 31

32 Estudos epidemiológicos moleculares buscam conhecer a base molecular para o comportamento de virulência e predileções de hospedeiros pelos patógenos e identificar relevantes reservatórios e vias de transmissão, informações que são necessárias para o desenvolvimento de estratégias de gerenciamento e prevenção de infecções (JOHNSON e RUSSO, 2005). As técnicas tradicionais de microbiologia de alimentos fundamentamse na utilização de testes morfológicos e bioquímicos para tipagem, subtipagem e identificação de gêneros, espécies e subespécies microbianas (GANDRA et al., 2008). Os principais métodos de identificação de Salmonella spp. são a caracterização bioquímica, as sorotipagens e a sorologia. Estes métodos são confiáveis, porém requerem longo tempo para a identificação do microorganismo além dos custos envolvidos (RALL et al., 2005). A utilização de ferramentas da biologia molecular permite uma identificação mais precisa e com custos reduzidos. Dentre as ferramentas moleculares mais usadas estão a reação em cadeia da polimerase (PCR), a ribotipagem, a clonagem e a análise de restrição (BARON et al., 1994). As propriedades fenotípicas pelas quais as bactérias são identificadas podem não ser expressas e quando são, podem ser difíceis de serem interpretadas e classificadas, além da possibilidade de existência de células viáveis, porém nãocultiváveis (MARIN et al., 2006). Os novos métodos de análise baseados em componentes genéticos têm aumentado a possibilidade de diferenciar as cepas bacterianas e investigar surtos de forma mais rápida e abrangente quando comparados à utilização única de métodos clássicos (MATTAR, 2000) Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (Pulse Field Gel Electrophoresis PFGE) A eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) é uma técnica altamente efetiva para muitas espécies bacterianas. O 32

33 genoma é digerido com uma enzima de restrição para a qual contém poucos sítios de reconhecimento, gerando cerca de 10 a 30 fragmentos. Esses fragmentos podem ser revelados como um padrão de bandas distinto, usando uma cuba especialmente projetada que posiciona o gel de agarose entre três conjuntos de eletrodos, os quais formam um hexágono ao redor do gel. O campo elétrico é fornecido em pulsos que se alternam a partir de cada conjunto de eletrodos, permitindo um alto nível de resolução. Todas as espécies são tipáveis por PFGE. É uma das técnicas mais reprodutíveis e discriminatórias e, atualmente, é o método de escolha para a tipagem de muitas espécies (FARBER, 1996; TENOVER et al., 1997; ARBEIT, 1999). O uso de PFGE na investigação de surtos de origem alimentar, sobretudo aqueles causados por E. coli O157:H7, Salmonella spp., Shigella spp., Listeria monocytogenes e Campylobacter jejuni, fornecem dados que podem ser reunidos em um sistema de informação, o PulseNet, por meio do qual é possível estabelecer relações epidemiológica entre isolados de diversos Estados americanos e outros países (CDC, 2010). A técnica de PFGE é bastante complexa com um poder discriminatório muito elevado. É considerado padrão ouro em epidemiologia molecular, uma vez que os fragmentos resultantes são estáveis, de boa resolução e representam todo o genoma do microorganismo analisado (OLIVE e BEAN, 1999), porém, é importante ressaltar que métodos de tipagem não substituem dados epidemiológicos, somente auxiliam e, se utilizados isoladamente, podem levar a conclusões equivocadas (MAGALHÃES et al., 2005). A técnica de PFGE tem sido utilizada para buscar evidências da relação epidemiológica entre bactérias isoladas de animais, de alimentos e de humanos. Ramchandani et al. (2005), avaliando 495 cepas de E. coli provenientes de animais e do ambiente, encontraram 128 (26%) cepas com perfil eletroforético indistinguível em relação ao grupo clonal A, que foi previamente identificado como agente causal de infecção do trato urinário em humanos. Já Xia et al. (2009), analisando 35 isolados de Salmonella enterica sorovar Enteritidis na China, encontraram 10 perfis eletroforéticos distintos. Chandel e Chaudhry (2006) 33

34 encontraram um único clone entre amostras de S. Typhi isoladas na Índia durante cinco anos. Destro et al. (1996), avaliando 115 cepas de Listeria monocytogenes isoladas de amostras de equipamentos, ambiente e camarões de uma planta de processamento de camarão congelado em Santos SP, perceberam que o perfil de DNA das áreas de recepção de matériaprima era distinto do perfil das demais áreas, sugerindo um tipo de contaminação originária da matériaprima e outro de contaminação persistente nas áreas de produção. Leite et al. (2005), comparando o perfil genotípico de 94 cepas isoladas de amostras de queijo e 15 de amostras clínicas de pacientes com listeriose em Portugal, identificaram 25 perfis eletroforéticos distintos. Os autores identificaram similaridade entre os perfis originários de amostras de queijo, sugerindo contaminação persistente e não houve relação de similaridade entre cepas de origem alimentar e de origem clínica, não ficando estabelecida relação causal entre os casos de listeriose e a ingestão dos alimentos analisados. A técnica de PFGE é útil não somente como uma ferramenta importante em investigações epidemiológicas, mas também na determinação de possíveis fontes de contaminação na indústria de alimentos, pois permite o monitoramente de fontes e rotas de contaminação (AVERY et al., 2004; CAMPOS et al., 2009). A disponibilidade dos dados detalhados e exatos relativos à epidemiologia das salmoneloses é crucial para que se tenha uma fiscalização eficaz e para se desenvolver estratégias racionais de controle desta importante doença humana (MERINO et al., 2003). 34

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44 Capítulo II Resistência antimicrobiana e padrão de Pulsed Field Gel Electrophoresis de isolados de Salmonella spp. oriundos de alimentos e humanos 44

45 CAPÍTULO II Resistência antimicrobiana e padrão de Pulsed Field Gel Electrophoresis de isolados de Salmonella spp. oriundos de alimentos e humanos Resumo Alimentos contaminados com bactérias patogênicas, como Salmonella spp., representam um problema significativo para a saúde pública, sendo este o agente biológico mais prevalente em surtos de Doenças Transmitidas por Alimentos (DTA) registrados no Brasil. O uso indiscriminado de antibióticos na criação de animais e outros agentes químicos na produção agrícola e na desinfecção nas indústrias de alimentos induzem a resistência de microorganismos patogênicos. Assim, os surtos de DTA sugerem a possibilidade de transmissão de eventuais linhagens resistentes pela cadeia alimentar, o que pode interferir no tratamento de enfermidades. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi determinar o perfil de resistência a antimicrobianos e pesquisar por meio de método molecular o padrão clonal de cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos e espécimes clínicos para determinação da relação epidemiológica das mesmas. Foram testados 12 antimicrobianos conforme o protocolo padrão de disco de difusão em ágar do Clinical and Laboratory Standard Institute (Atlânta, EUA). A tipagem molecular foi realizada conforme protocolo para técnica de Eletroforese em Gel de Campo Pulsado. Analisando 91 isolados de Salmonella, 55 clínicos e 36 de alimentos, foi possível identificar como sorotipo predominante S. Enteritidis para espécimes clínicos e S. Infantis para de alimentos. Do total, 63% (57/91) apresentaram sensibilidade a todos os antimicrobianos testados, 1% (1/91) apresentou sensibilidade intermediária e 36% (33/91) foram resistentes a pelo menos um dos 12 antibióticos testados. Além disso, foi possível perceber a formação de 15 perfis de resistência a antimicrobianos, sendo o ácido nalidíxico e a tetraciclina os antibióticos sobre os quais as cepas apresentaram maior resistência. Do total das cepas resistentes, 33% dos isolados de alimentos e 64% dos isolados clínicos apresentaram resistência múltipla, revelando um problema significativo para a saúde pública. Foram identificados 47 perfis eletroforéticos distintos, sendo encontrados 11 grupos clonais, variando de 2 a 19 isolados. O principal grupo clonal foi composto por 19 isolados, alguns com mais de 15 anos em circulação no Estado, entre cidades geograficamente distantes, e a maior parte com resistência ao ácido nalidíxico. Foram encontrados ainda 29 isolados não relacionados geneticamente. Os resultados encontrados possibilitaram concluir que isolados de Salmonella spp. provenientes de alimentos e humanos persistiram no ambiente ao longo dos anos, em diferentes cidades do estado da Bahia, o que confirma a hipótese de que eles possam ser provenientes de um ancestral comum. PALAVRASCHAVE: Epidemiologia molecular, multiresistência, PFGE, Padrão clonal. 45

46 Antimicrobial resistance and pattern of Pulsed Field Gel Electrophoresis of Salmonella s spp. strains isolated from human and food Abstract The food contaminated with pathogenic bacteria, such as Salmonella spp., represent a significant problem for public health, since this is the most prevalent biological agent in outbreaks of Foodborne Diseases (FD) registered in Brazil. The indiscriminate use of antibiotics in animal husbandry and other chemicals in agricultural production and disinfection in food induce resistance of pathogenic microorganisms. Thus, outbreaks of FD suggest the possibility of transmission of resistant strains possible through the food chain, which may interfere with the treatment of diseases. Thus, the aim of this study was to determine the antimicrobial resistance profile and search through molecular method genotypic profile of strains of Salmonella spp. isolated from food and clinical specimens to determine the epidemiological relationship of them. Twelve antimicrobials were tested according to the protocol standard disk agar diffusion of the Clinical and Laboratory Standards Institute. (Atlanta, USA). Molecular typing was performed according to protocol technique Gel Electrophoresis Pulsed Field. Analyzing 91 Salmonella isolates, 55 clinical and 36 food, was identified as the predominant serotype S. Enteritidis for clinical specimens and S. Infants for foods. Of the total, 63% (57/91) were susceptible to all antimicrobials tested, 1% (1/91) had intermediate sensitivity and 36% (33/91) were resistant to at least one of 12 antibiotics tested. Furthermore, it was revealed the formation of 15 antimicrobial resistance profiles, and nalidixic acid and tetracycline antibiotics on which the strains showed higher resistance. Of the total drugresistant strains, 33% of isolates from food and 64% of clinical isolates showed multidrug resistance, revealing a significant problem for public health. We identified 47 distinct electrophoretic profiles, and found 11 clonal groups, ranging from 2 to 19 isolates. The main group was composed of 19 isolates, some with over 15 years in circulation in the State, between geographically distant cities, where most of them were resistant to nalidixic acid. Were still found 29 twentynine isolates genetically unrelated. The results permit to conclude that Salmonella isolates from foods and humans persisted in the environment over the years in different cities, of the State of Bahia, which confirms the hypothesis that they may be derived from a common ancestor. KEY WORDS: Molecular epidemiology, multiresistance, PFGE pattern clonal. 46

47 1. Introdução A Salmonella é uma bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, conhecida mundialmente como o agente causador de infecções alimentares em seres humanos (LAN et al., 2009), sendo um dos principais agentes envolvidos em surtos registrados em vários países (PENA et al., 2001; TESSARI et al., 2003; MAIJALA et al., 2005; MREMA et al., 2006; SURESH et al., 2006; BRASIL, 2011a). Nos últimos anos, um aumento na resistência a antimicrobianos tem sido observado em sorotipos de salmonela isolados de alimentos, principalmente aqueles de origem animal. Além disso, percebese também um incremento na incidência de salmoneloses em humanos devido a cepas multiresistentes presentes em um grande número de espécies animais (BRIGGS e FRATAMICO, 1999; BOYD et al., 2001; RABSCH et al., 2001; THRELFALL, 2002; GYLES, 2008; LARKIN et al., 2004), o que representa um sério problema do ponto de vista clínico e da saúde pública. A resistência se deve principalmente ao uso abusivo de antimicrobianos como agentes terapêuticos e profiláticos na medicina humana e veterinária e como promotor de crescimento na produção animal (GRAZIANI et al., 2008). A salmonelose ocorre, principalmente, pelo consumo de alimentos de origem animal, como carnes, aves, ovos e leite, contaminados com Salmonella spp. (WHO, 2012). O reservatório natural desta bactéria é o trato gastrointestinal de animais de sangue quente, que pode hospedar uma variedade de sorotipos com diferentes graus de virulência, tanto para animais, como para humanos (PATTON et al., 2009). Tendo em vista que a maioria dos indivíduos com gastroenterites não apresenta quadros clínicos graves, sem a necessidade de internamento, observase que o isolamento do agente causal envolvido, a identificação da fonte de contaminação e investigação de surtos, se torna mais difícil, uma vez que os casos de salmoneloses proporcionados por alimentos contaminados são subestimados no Estado da Bahia. 47

48 Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo determinar o perfil de resistência a antimicrobianos e pesquisar, por meio de método molecular, o padrão clonal de cepas de Salmonella spp. isoladas de alimentos e espécimes clínicos para determinação da relação epidemiológica das mesmas, como forma de fornecer informações quanto a salmoneloses para permitir que haja maior controle e prevenção dessa doença. 2. Material e Métodos 2.1. Amostragem Foram avaliadas 91 cepas de Salmonella spp., sendo 36 isoladas de alimentos provenientes da bacterioteca do laboratório de Pesquisa em Microbiologia de Alimentos da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia (UFBA) e do Laboratório Central de Saúde Pública Prof. Gonçalo Moniz (LACEN/BA), isoladas de diversos alimentos (carne bovina, peixe, frango e suínos, queijos, saladas, arroz, alimentos prontos para o consumo e sobremesas), de acordo com APHA (2001) e outras 55 de amostras clínicas oriundas de isolados de coproculturas e hemoculturas realizadas por quatro hospitais da cidade de BA, no período de setembro/1996 a fevereiro/2012, de diferentes localidades no Estado da Bahia (Barreiras, Barro Alto, Camaçari, Euclides da Cunha, Feira de Santana, Ilhéus, Itapetinga, Jaguarari, Lauro de Freitas, Luis Eduardo Magalhães, Mairi,, São Gonçalo dos Campos, Vitória da Conquista). As cepas obtidas foram armazenadas em criotubos contendo caldo Infusão Cérebro Coração (Acumedia ) com 20% de glicerol e mantidas em temperaturas inferiores a 20ºC para posterior análise. 48

49 2.2. Coleta de dados Dois formulários foram empregados na coleta de dados dos isolados utilizados na pesquisa, visando obter informações relevantes sobre estes dados a fim de subsidiar discussões futuras com base nos resultados encontrados. As informações relativas às cepas isoladas de humanos foram obtidas pelos funcionários dos hospitais e transmitidas à equipe executora do projeto sem que os pesquisadores tivessem acesso a qualquer informação do paciente além daquelas previstas no formulário Identificação das cepas Todas as cepas analisadas foram encaminhadas ao laboratório de referência de Enterobactérias do Departamento de Bacteriologia da Fundação Instituto Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro (FIOCRUZ RJ), para a tipificação sorológica, em tubos contendo ágar Tripticase de Soja (Acumedia ) inclinado, devidamente identificados Sorologia A tipificação sorológica foi realizada no laboratório de referência de Enterobactérias do Departamento de Bacteriologia da Fundação Instituto Oswaldo Cruz no Rio de Janeiro (FIOCRUZ RJ) Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos A caracterização do perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das 91 amoostras foi executada conforme o protocolo padrão de disco difusão do CLSI Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI, 2011). 49

50 Foram realizados dois repiques de cada isolado em ágar Tripticase de Soja (Acumedia ) que foram incubados por 18h a 35 C. Em seguida foi preparada uma suspensão bacteriana em solução salina 0,85% (Quimex ) estéril, a qual foi ajustada com auxílio de um densitômetro (Biosan ) ao padrão 0,5 da escala Mac Farland (1,5x10 8 UFC/mL). As suspensões foram inoculadas em placas de ágar MüellerHinton (Acumedia ), utilizando swab estéril (Absorve ). Posteriormente, os discos de antibióticos foram dispostos sobre a superfície do ágar inoculado e as placas, então, foram incubadas invertidas a 35 C por 18h. Após o período de incubação, os halos de inibição formados foram medidos com auxílio de régua milimetrada (Figura 01). Foram utilizados discos comerciais (Laborclin ) dos seguintes antibióticos: ampicilina 10 µg (AMP), cefalotina 30 µg (CFL), cefotaxima 30 µg (CTX), gentamicina 10 µg (GEN), tetraciclina 30 µg (TET), cloranfenicol 30 µg (CLO), trimetoprim/sulfametoxazol 1,25/23,75 µg (TMS), ciprofloxacina 5 µg (CIP), amoxicilina/clavulanato 20/10 µg (AMC), ácido naladíxico 30 µg (NLX), levofloxacina 5 µg (LEV) e cefotriaxona 30 µg (CRO). A cepa Escherichia coli ATCC foi utilizada como referência, e os critérios interpretativos do CLSI (2013) foram utilizados para determinar o perfil de susceptibilidade de cada isolado, sendo classificados como sensíveis, de sensibilidade intermediária ou resistentes (Tabela 01). 50

51 Figura 01: Fluxograma do protocolo padrão de difusão em disco do CLSI,

52 Tabela 01: Antibióticos testados e respectivos critérios de interpretação do CLSI (2011). Antibiótico Abreviação Concentração Diâmetro do halo de inibição em mm R I S Ampicilina AMP 10µg Cefalotina CFL 30µg Cefotaxima CTX 30µg Gentamicina GEN 10µg Tetraciclina TET 30µg Cloranfenicol CLO 30µg Trimetoprim/Sulfametazol TMS 1,25µg/ 23,75µg Ciprofloxacina CIP 5µg Amoxicilina/Clavulanato AMC 20/10µg Ácido Nalidíxico NLX 30µg Levofloxacina LEV 5µg Cefotriaxona CRO 30µg Resistente ( R ), Intermediário ( I ), Sensível ( S ) 2.6. Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) Os 91 isolados de Salmonella spp. foram avaliados pela técnica de eletroforese em gel de campo pulsado. Esta técnica foi realizada em um sistema CHEF Dr II (BioRad ) a 13º C em TBE 0,5x, conforme proposto pelo protocolo padrão para PFGE, com algumas modificações (Figura 02), descrito pelo Center for Diseases Control em Atlânta, EUA (CDC) (2010). Foram realizados dois repiques de cada cepa em ágar Tripticase de Soja (Acumedia ) e incubados por 18h24h a 35 C. Em seguida, foi preparada a suspensão bacteriana em 500 µl de Cell Suspension Buffer (CSB, 100 mm Tris, 100 mm EDTA [ph 8,0]), ajustando com o auxílio de um densitômetro (Biosan ) ao padrão 3,0 da escala Mac Farland (9,0x10 8 UFC/mL). A cada tubo eppendorf foram adicionados 20µL de proteinase K (Promega ) (20mg/mL). Para o preparo dos plugs adicionouse 500µL de agarose Low Melting Point (Sigma ) a 2% a 56 C à suspensão bacteriana. Em seguida, a mistura foi dispensada no molde de plugs (BioRad ) e deixada por 10min à 4ºC para solidificação. Posteriormente, os plugs foram transferidos para tubos eppendorf contendo 1mL de Cell Lysis Buffer (CLB 50 mm Tris, 50 mm EDTA [ph 8,0], 1% Sarcosyl, 0,1 mg/ml proteinase K) e incubados por 2 horas a 54 C em banhomaria com agitação (Nova Ética ). Após esse período, os plugs foram submetidos 52

53 a quatro lavagens sucessivas com água miliq estéril e 24 lavagens sucessivas com soluções estéreis de TE (10 mm Tris, 1 mm EDTA [ph 8,0]) préaquecidos a 50 C com intervalo de 30 minutos sob constante agitação. Para a digestão do DNA microbiano de Salmonella spp., um plug inteiro foi transferido para um eppendorf contendo 200µL de tampão da enzima diluído 1 X, sendo este submetido a prérestrição com a incubação por 15 minutos a 37ºC. Em seguida, o plug foi submetido a digestão enzimática, utilizando 200 µl do mix de reação da enzima de restrição: 172µL de água estéril (Promega ), 20 µl do tampão para a enzima (Promega ), 2µL de BSA (Promega ) e 6 µl de XbaI (Promega ) (10U/ µl) incubando os plugs a 37 C overnight, conforme indicado por Tenover et al., (1995). O molde para o gel de agarose foi colocado sobre uma superfície plana e ajustado até que estivesse perfeitamente nivelado. Em seguida, o suporte do pente foi disposto de forma que os dentes tocassem na plataforma do gel. Com cuidado e a uma temperatura que variava entre 55 e 60ºC, o gel foi disposto sobre o molde onde foi mantido até a polimerização do mesmo. Atingida a temperatura ambiente, removeuse o pente, havendo a formação dos poços e introduzido o marcador Pulse Marker kb (Sigma ) como padrão de peso molecular e os plugs. Os fragmentos obtidos foram separados em gel de agarose para PFGE (Sigma ) a 1,2%, em tampão TBE 0,5X, nas seguintes condições de eletroforese: tempo inicial de 2,2seg, tempo final de 63,8seg, voltagem de 6v/cm e tempo de corrida de 18h. Transcorrido o período de corrida, o gel foi corado em solução de brometo de etidio (0,5µg/mL) por 30 minutos e descorado em 500mL de água Mili Q por 60min, havendo a troca desta a cada 20 minutos. A imagem foi capturada no sistema BioRad Gel Doc 1000, software Quantity One. 53

54 Figura 02: Fluxograma do protocolo para Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE) de Salmonella spp. 54

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